Nghiên cứu đặc điểm của gen mã hóa chalcone isomerase phân lập từ cây đậu tương

1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN THỊ THANH VÂN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN MÃ HÓA CHALCONE ISOMERASE PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƢƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2016 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN THỊ THANH VÂN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN MÃ HÓA CHALCONE ISOMERASE PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƢƠNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa ho ̣c: GS TS Chu Hoàng Mâ ̣u Thái Nguyên - 2016 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc họ đậu (Fabaceae), trồng quan trọng không Việt Nam xuất gần 200 quố c gia giới Đậu tương trồng cạn ngắn ngày , có giá trị dinh dưỡng giá trị kinh tế cao Đối với nông nghiệp, đậu tương trồng thân thiện với môi trường thúc đẩy phát triển kinh tế nông nghiệp Đậu tương ví nhà máy sản xuất đạm tự nhiên nhờ nốt sần rễ giúp cải thiện chất lượng đất thông qua khả hấp thụ nitơ tự nhiên Các sản phẩm từ đậu tương sử dụng rộng rãi toàn giới Nhiều nghiên cứu cho thấy đậu tương tốt cho sức khỏe người nhờ có chứa thành phần isoflavone Isoflavone dươ ̣c chất có nguồn gốc thảo mộc , làm giảm xuất số loại ung thư, giảm triệu chứng mãn kinh, ngăn ngừa bệnh tim mạch, béo phì, loãng xương, ngăn chặn gia tăng cholesterol máu Bên cạnh isoflavone giúp phụ nữ tăng cường chất lượng da, giảm nếp nhăn, giảm độ sâu nếp nhăn mắt, làm cho da săn nhờ tăng cường kết nối collagen, đồng thời cải thiện màu sắc giữ ẩm cho da Con đường sinh tổng hợp isoflavone ở đâ ̣u tương biết nhánh đường phenylpropanoid với hai enzyme chìa khóa chalcone synthase (CHI) isoflavone synthase (IFS) để tổng hợp isoflavone genistein daidzein có khả chống oxi hóa mạnh Chúng tìm thấy chủ yếu đậu tương loại họ đậu khác Tuy nhiên, hàm lượng isoflavone đậu tương rấ t thấ p, khoảng từ 50 – 3000 µg/g tồn hai dạng glycoside aglucone Dạng glycoside có trọng lượng phân tử lớn, chiếm tới 90% isoflavone tổng số cho hấp thụ hạn chế hệ tiêu hóa người, Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn đó, dạng aglucone hấp thụ nhanh , hàm lươ ̣ng la ̣i thấp , chiếm từ 1% – 5% isoflavone tổng số Chính nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen vào việc cải thiện theo hướng nâng cao hàm lượng isoflavone hạt đậu tương cần thiết Kỹ thuật biể u hiê ̣n gen ở thực vâ ̣t cho phép tạo các dòng có khả tổng hợp isoflavone với hàm lượng cao , tạo nguyên liê ̣u phu ̣c vụ sản xuất các chế phẩ m sinh ho ̣c đáp ứng nhu cầu ngày tăng của công tác chăm sóc và bảo vêsư ̣ ́ c khỏe người nước ta Xuất phát từ lý , đề tài luận văn thạc sĩ lựa chọn thực là: “Nghiên cứu đặc điểm gen mã hóa chalcone isomerase phân lập từ đậu tương” Mục tiêu nghiên cứu Phân tích đặc điểm gen mã hóa chalcone synthase đường sinh tổ ng hơ ̣p isoflavone phân lâ ̣p từ hai giống đâ ̣u tương khác hàm lượng isoflavone Nội dung nghiên cứu 3.1 Phân tích hàm lượng isoflavone hạt nảy mầm ba giống đậu tương Viê ̣t Nam là ĐT51, DT90 DT84 3.2 Nghiên cứu thông tin gen mã hóa chalcone isomerase (CHI), thiế t kế că ̣p mờ i PCR nhân gen CHI, tách dịng xác định trình tự gen CHI 3.3 Phân tích sự đa da ̣ng về trình t ự nucleotide trình tự amino acid suy diễn gen CHI Ý nghĩa khoa học thực tiễn đậu tƣơng Kế t quả phân tić h đă ̣c điể m của gen CHI xác định điểm sai khác về trình tự nucleotide của gen CHI trình tự amino acid suy diễ n giữa c ác giố ng đâ ̣u tương khác về hàm lươ ̣ng daidzein và genistein sở để giải thích mối liên quan gen CHI với hoa ̣t đô ̣ng tổ ng hơ ̣p isoflavone ở đâ ̣u Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn tương Đồng thời cũng sở sử dụng đoạn mã hó a của gen CHI viê ̣c thiế t kế vector chuyể n gen mu ̣c đić h nâng cao hàm lươ ̣ng isoflavone đâ ̣u tương bằ ng kỹ thuâ ̣t chuyể n gen Kế t quả xác đinh ̣ hàm lươ ̣ng daidzein và genistein của các giố ng đâ ̣u tương nghiên cứu cung c ấp liệu cho chọn giống đậu tương theo định hướng nâng cao hàm lươ ̣ng isoflavone của đâ ̣u tương Kết nghiên cứu luận văn tư liệu khoa học phục vụ cho mục đích nghiên cứu giảng dạy cơng nghê ̣ sinh ho ̣c Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại đặc điểm thực vật học đậu tƣơng Cây đậu tương hay gọi đậu nành có tên khoa học Glycine max (L.) Merrill, loại ăn hạt, thân thảo thuộc họ đậu (Fabaceae), đậu tương mang nhiễm sắc thể 2n=40 Cây đâ ̣u tương đươ ̣c xế p ̣ thố ng sau: Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Fabales Họ: Fabaceae Phân họ: Faboideae Giống: Glycine Loài: Max Cây đậu tương xuất từ 1100 năm trước Công nguyên vùng Đông Bắc Trung Quốc Theo nhiều tài liệu nghiên cứu đậu tương có nguồn gốc từ vùng Mãn Châu phía Bắc Trung Quốc từ thời triều đại Phong kiến, sau có nhiều tài liệu cho đậu tương hoá triều đại Shang, hay gọi triều đại nhà Thương, vào khoảng kỉ XVII đến kỉ XI trước Công Nguyên, sau lại lan truyền sang Nhật Bản, Triều Tiên vào khoảng kỷ thứ VIII, tiếp tục lan truyền sang nước châu Á khác Thái Lan, Malaysia, Hàn Quốc, Việt Nam [1] Đến kỷ XVII, đậu tương giới thiệu vào Châu Âu nhà thực vật học đặt tên Glycine max Sau đến kỷ XVIII đậu tương du nhập vào Mỹ, có nhiều kết cho thấy có phù Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn hợp điều kiện khí hậu đất đai nên việc trồng trọt đậu tương Mỹ phát triển mạnh mẽ cho sản lượng đậu tương tăng lên nhanh chóng, đến đậu tương coi trồng đem lại giá trị kinh tế cao Mỹ nhiều quốc gia khác giới: Trung Quốc, Brazil [3], [5] Hiện nay, đậu tương trồng phổ biến nhiều quốc gia giới đậu tương công nghiê ̣p, thực phẩ m đem lại giá trị kinh tế cao nhờ sự vượt trội hẳn so với trồng khác hàm lượng chất dinh dưỡng protein, lipid cao, chứa nhiều vitamin, khoáng chất nhiều hoạt chất thảo mộc có lợi cho sức khoẻ người Tại Việt Nam đậu tương ví “vàng mọc từ đất” đậu tương cho sản lượng cao, cải tạo đất trồng xen canh gối vụ với nhiều loại trồng, chứa nhiều hàm lượng protein đem lại nhiều giá trị kinh tế Cây đậu tương loại thân thảo, bụi nhỏ năm Thân mảnh, cao khoảng từ 0,8m đến 0,9 m, có lơng, cành hướng lên phía Một đậu tương hoàn chỉnh bao gồm rễ, thân, lá, hoa, hạt Rễ đâụ tương Rễ đậu tương rễ cọc, rễ bao gồm rễ (rễ chính) nhiều rễ bên hay cịn gọi rễ phụ, rễ mọc nhiều rễ phụ rễ phụ cấp rễ phụ cấp Trong điều kiện bình thường rễ ăn sâu vào đất khoảng 20-30 cm có ăn sâu đến 15oCm; thông thường rễ tập trung nhiều độ sâu 6-2oCm Bộ rễ phát triển chia thành thời kỳ chính: (i) Thời kỳ thứ nhất: rễ rễ phụ phát triển mạnh sinh nhiều rễ con, thời kỳ kéo dài từ 30-40 ngày sau mọc (ii) Thời kỳ thứ hai: lớp rễ phát triển chậm dần, rễ khơng phát triển có rễ phụ nhỏ kéo dài phát triển gần thu hoạch Trên rễ rễ phụ có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum sinh sống, loại vi khuẩn có dạng hình gậy hình cầu quan sát Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn kính hiển vi điện tử, vi khuẩn Rhizobium japonicum sống lòng đất, có khả cố định đạm từ khí trời, họ đậu có vài trăm nốt sần phân bố đồng rễ, ban đầu hình thành nốt sần có màu sữa sau phát triển có màu hồng Q trình hình thành nốt sần kéo dài 16-21 ngày, phát triển nhiều mạnh vào lúc đậu tương hoa làm Giữa vi sinh vật nốt sần với đậu tương chúng có mối quan hệ cộng sinh, cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn hoạt động ngược lại vi khuẩn lại tích hợp nitơ tự khơng khí chuyển sang đạm hữu để sử dụng Cây đậu tương nhiều chất dinh dưỡng cho vi sinh vật hoạt động vi sinh vật phát triển tích lũy đạm nhiều cho sinh trưởng phát triển tốt Thân, cành đâụ tương Thân đậu tương thuộc thân thảo có hình trịn, chia đốt, phân cành, thân có nhiều lơng nhỏ Thân đậu tương thường đứng có thân bị hay nửa bị, cịn non thân có màu xanh tím, già chuyển sang màu nâu nhạt, màu sắc thân non có liên quan chặt chẽ với màu sắc hoa sau Nếu thân lúc cịn non có màu xanh hoa màu trắng cịn non thân có màu tím hoa màu tím đỏ Thân cao trung bình 0,5- 1,2 m cũng có cao đến 1,5m, thân mang 14-15 lóng, lóng phía thường ngắn, lóng phía thường dài Tùy theo giống thời vụ gieo mà chiều dài lóng có khác thường biến động từ 3-10 cm Cây đậu tương vụ hè có lóng dài vụ xn vụ đơng Chiều dài lóng góp phần định chiều cao thân Thân đậu tương thường cao từ 0,3-1,0m Giống đậu tương dại cao từ 2-3m Thực tế cũng có giống khơng có lơng tơ Những giống có mật độ lơng tơ dày, màu sẫm có sức kháng bệnh, chịu hạn chịu rét khỏe giống lơng tơ thường sinh trưởng khơng bình thường, sức chống chịu Thân có lơng tơ nhiều hay ít, dài hay ngắn, dày hay Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn thưa đặc điểm phân biệt giống với Đốt thân mang hai mầm, đốt thứ hai lại mang hai đơn mọc đối diện nhau, sau kể từ đốt thứ ba trở đốt mang kép có chét, kép mọc đối diện Dựa vào sinh trưởng đặc điểm mà thân có loại sau: Loại mọc thẳng: thân cứng, đường kính thân lớn, thân cao trung bình, đốt ngắn, nhiều Loại bị: thân phân cành nhỏ, mềm, phủ bề mặt đất thành đám dây, thân dài, đốt dài, nhỏ Loại nửa bò: loại trung gian hai loại mọc thẳng mọc bò Loại mọc leo: thân nhỏ dài, mọc bò đất hay leo lên giá thể khác Thân đậu tương có khả phân cành từ nách đơn kép Dựa vào đặc tính sinh trưởng thân cành đặc điểm hoa nên chia giống đậu tương làm hai loại: Sinh trưởng hữu hạn: Khi thân cành hoa khơng tiếp tục sinh trưởng hay cành không cao lên nữa, loại chủ yếu trồng lấy để lấy hạt Sinh trưởng vô hạn: Khi đậu tương hoa kết chín thân cành tiếp tục sinh trưởng, thường loại mọc bò Từ lúc mọc đến có thật (3 kép) khoảng 25 – 30 ngày sau gieo, thân sinh trưởng với tốc độ bình thường Khi có 6-7 thật thân bắt đầu phát triển mạnh Điểm khác biệt đậu tương với trồng khác hoa rộ lại lúc thân cành phát triển mạnh Đây giai đoạn hai trình sinh trưởng, sinh dưỡng cần cung cấp đầy đủ dinh dưỡng tạo điều kiện cho rễ phát triển thuận lợi Cành mọc từ đốt thân, hướng lên trên, số cành thân nhiều hay phụ thuộc vào loại giống đậu tương, đất đai, kỹ thuật canh tác, điều kiện gieo Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 10 trồng, có giống đậu tương có 1-2 cành có giống khơng có cành, cành thân kết hợp với tạo thành tán đậu tương [7], [15] Lá đậu tương Cây đậu tương có mọc cách có loại chính: mầm, đơn kép có nhiều hình dạng khác hình trái xoan, trứng, trịn, dài, van, mũi gần nhọn, khơng gốc Mặt thường có nhiều lông trắng Lá mầm (lá tứ diệp): mầm mọc có màu vàng hay xanh lục tiếp xúc với ánh sáng chuyển sang màu xanh Hạt giống to mầm chứa nhiều dinh dưỡng ni mầm, hết chất dinh dưỡng mầm khô héo Lá nguyên (lá đơn): xuất sau mọc từ 2-3 ngày mọc phía mầm Lá đơn mọc đối xứng nhau, đơn to xanh bóng biểu sinh trưởng tốt, đơn to xanh đậm biểu giống có khả chịu rét, đơn nhọn gợn sóng biểu sinh trưởng khơng bình thường Lá kép: Mỗi kép có chét, cũng có 4-5 chét Lá kép mọc so le, có màu xanh tươi, già biến thành màu vàng nâu Cũng có giống chín giữ màu xanh Phần lớn có nhiều lơng tơ Lá có nhiều hình dạng khác tùy theo giống Những giống nhỏ dài chịu hạn khỏe thường cho suất thấp, giống to chịu hạn thường cho suất cao Nếu hai kép đầu to dày thường biểu giống có khả chống chịu rét Số lượng kép nhiều hay ít, diện tích to hay nhỏ chi phối nhiều đến suất phụ thuộc vào thời vụ gieo trồng Các nằm cạnh chùm hoa giữ vai trò chủ yếu cung cấp dinh dưỡng cho chùm hoa Nếu điều kiện làm cho bị úa vàng vị trí thường bị rụng lép Số nhiều to khoẻ vào thời kỳ hoa rộ Khi phiến phát triển to, rộng, mỏng, phẳng, có màu xanh tươi biểu sinh trưởng khoẻ có khả cho suất cao Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 46 2,7 kb  Hình 3.6 Kết kiể m tra sản phẩ m cắt vector pBT-GmCHI că ̣p enzyme NcoI NotI; M: thang DNA kb; giếng 1: pBT-GmCHI cắt; giếng 2: pBT-GmCHI chưa cắt Theo lý thuyế t vector pBT có kić h thước 2705 bp, gen GmCHI có kích thước 677 bp và tở ng số nucleotide của vector tái tổ hơ ̣p pBT-GmCHI 3382 bp Kế t quả ở hin ̀ h 3.6 cho thấ y, giếng vector pBT-GmCHI chưa cắ t thu đươ ̣c băng điê ̣n di DNA có kích thước khoảng 3,0 kb, giếng có băng điê ̣n di DNA có kić h thước khoảng 2,7 kb và 0,6 kb Băng DNA có kić h thước khoả ng 2,7 kb là kić h thước của vector tách dòng pBT , cịn băng DNA có kích thước khoảng 0,6 kb là kić h thước của gen GmCHI Như vâ ̣y, kế t quả điê ̣n di kiể m tra sản phẩm cắt vector tái tổ hợp pBT -GmCHI că ̣p enzyme giới ̣n NcoI NotI đúng tính toán lý thuyế t Do đó có thể kế t luâ ̣n rằ ng , gen GmCHI đã đươ ̣c nhân dòng thành công vector pBT ở E.coli plasmid tái tổ hợp pBT-GmCHI đươ ̣c sử du ̣ng giải trình tự nucleotide của gen GmCHI Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 47 3.2.3 Trình tƣ̣ gen GmCHI phân lâ ̣p tƣ̀ hai giố ng đâ ̣u tƣơng ĐT51 DT84 Đoa ̣n mã hóa của gen GmCHI đươ ̣c xác đinh ̣ trình tự nucleotide từ plasmid tái tổ hơ ̣p pBT-GmCHI thiế t bi ̣giải trình tự nucleotide tự đô ̣ng , kết đươ ̣c thể hiê ̣n ở hin ̀ h 3.7 Kế t quả ở hin ̀ h 3.7 cho thấ y đoa ̣n mã hóa của gen GmCHI có 657 nucleotide Bằ ng chương triǹ h phân tić h BLAST NCBI cho kế t quả về đô ̣ tương đồ ng 98,9% so với trình tự gen CHI mang mã số NM _001248290 Ngân hàng Gen Như vâ ̣y kế t quả phân tić h đã khẳ ng đinh ̣ đoạn gen phân lâ ̣p từ mRNA của hai giống đậu tương ĐT51, DT84 gen GmCHI Gen GmCHI có kích thước 657 nucleotide, mã hóa cho 218 amino acid Tuy nhiên, giữa các triǹ h tự nucleotide của gen GmCHI giống đậu tương khác ở mô ̣t số vi ̣trí nucleotide (Bảng 3.2) Bảng 3.2 cho thấ y giữa các trình tự nucleotide có 14 vị trí nulceotide sai khác So với trình tự gen CHI mang mã sớ NM_001248290, trình tự gen GmCHI giố ng ĐT51 sai khác vị trí nucleotide, đó là các vi ̣trí 23, 24, 33, 37, 60, 74, 115; giống DT84 sai khác ở vị trí nucleotide 12, 91, 140, 244, 598, 635, 639 Trình tự gen GmCHI hai giống ĐT51 DT84 có sai khác 14 vị trí, đó là: 12, 23, 24, 33, 37, 60, 74, 91, 115, 140, 244, 598, 635, 639 Những sai khác có liên quan đế n hoa ̣t ̣ng của enzyme CHI hay không cầ n phải có sự nghiên cứu và phân tích sâu Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 48 Hình 3.7 Trình tự nucleotide của gen GmCHI phân lâ ̣p từ hai giố ng đâ ̣u tương ĐT51 DT84 so với triǹ h tự gen CHI giống đậu tương mang mã số NM_001248290 Ngân hàng Gen Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 49 Bảng 3.2 Các vị trí sai khác trình tự nucleotide ba trình tự gen CHI TT Vị trí nucleotide NM_001248290 ĐT51 DT84 12 C C G 23 A G A 24 G T G 33 C G C 37 G C G 60 A G A 74 A T A 91 G G A 115 A T A 10 140 C C G 11 244 G G C 12 598 T T A 13 635 T T G 14 639 C C G Tiế p tu ̣c so sánh trình tự amino acid suy diễn từ gen GmCHI hai giống đậu tương nghiên cứu với với trình tự amino acid của protein CHI suy diễn từ gen mang mã số NM _001248290, kế t quả thể hình 3.8 Kế t so sánh cho thấy trình tự amino acid s uy diễn từ gen GmCHI các giống đậu tương có tương đồng từ 96,8% đến 97,7% Tuy nhiên, giữa các trin ̀ h tự amino acid suy diễn có 12 vị trí sai khác về amino acid So với trình tự amino acid suy diễn từ gen CHI mang mã sớ NM _001248290, trình tự amino acid suy diễn ở giống đâ ̣u tương ĐT 51 có vị trí amino acid sai khác , đó là các vi ̣trí 8, 11, 13, 25, 39; cịn giống DT84 có vị trí sai khác, cụ thể vị trí số 4, 31, 47, 82, 200, 212, 213 (Bảng 3.3) Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 50 Hình 3.8 Trình tự amino acid suy diễn từ gen GmCHI phân lâ ̣p từ hai giố ng đâ ̣u tương ĐT51, DT84 từ gen CHI mang mã số NM_001248290trên Ngân hàng Gen Bảng 3.3 Các vị trí sai khác trình tự amino acid suy diễn từ gen GmCHI giữa các giố ng đâ ̣u tương TT Vị trí amino acid NM_001248290 ĐT51 DT84 I I M Q R Q 11 F L F 13 E Q E 25 K M K 31 G G S 39 I F I 47 T T R 82 D D H 10 200 L L I 11 212 L L W 12 213 S S R Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 51 Đậu tương có 2n = 40, n = 20 họ gen GmCHI đậu tương gồm gen GmCHI, GmCHI1B1 GmCHI2-A thuô ̣c nhiễm sắ c thể số 20 Trong đó gen GmCHI có vị trí GLYMA_20G241500, xế p trước gen GmCHI1B1, tiế p đế n GmCHI2-A (Hình 3.9A) Hai trình tự gen GmCHI mRNA của hai giố ng đâ ̣u tương ĐT51 DT84 mà phân lập thuộc nhiễm sắc thể số 20, có vị trí khoảng từ 46120K đế n 46130K (Hình 3.9B) A B Hình 3.9 Vị trí gen GmCHI, GmCHI1B1, GmCHI2-A đâ ̣u tương [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?LinkName=nuccore_gene&from_uid=35172 3088] Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 52 3.3 SƢ̣ ĐA DẠNG VỀ TRÌ NH TƢ̣ NUCLEOTIDE VÀ TRÌ NH TƢ̣ AMINO ACID SUY DIỄN CỦ A GEN GmCHI 3.3.1 Sƣ̣ đa da ̣ng về trin ̀ h tƣ̣ nucleotide của gen GmCHI Tiến hành phân tích so sánh trình tự nucle otide và trình tự amino acid suy diễn của gen GmCHI phân lâ ̣p từ mô ̣t số giố ng đâ ̣u tương Viê ̣t Nam với các trình tự công bố Ngân hàng Gen (Bảng 3.4) để xác định hệ số tương đồng hệ số phân ly (Bảng 3.5), thiết lập sơ đồ hình về m ối quan hệ di truyền giớ ng đâ ̣u tương (Hình 3.10) Bảng 3.4 cho thấ y trình tự gen GmCHI sử du ̣ng phân tić h có trình gen phân lập từ hai giống đậu tương Việt Nam ĐT 51 DT84, mô ̣t trin ̀ h tự Hoa Kỳ, mô ̣t trin ̀ h tự ở Korea và trình tự Taiwan Kế t quả phân tić h ̣ số tương đồ ng và ̣ số phân ly dựa triǹ h tự nucleotide của gen GmCHI bảng 3.5 cho thấ y ̣ số tương đồ ng dao đô ̣ng từ 71,3% đến 100%, hệ số phân ly từ 0,0% đến 37,5% Bảng 3.4 Các trình tự genGmCHI phân lâ ̣p từ các giố ng đâ ̣u tương Viê ̣t Nam và trình tự gen mang mã số Ngân hàng Gen sử dụng phân tích TT Giớ ng / Mã số Năm công GenBank bố Quố c gia Tác giả CHI –ĐT51 2015 Viê ̣t Nam Chu MH et al CHI-DT84 2015 Viê ̣t Nam Chu MH et al NM_001248290 2015 Hoa Kỳ Ralston et al AF276302 2001 Taiwan Chiu,M.-h.J et al DQ191401 2007 Taiwan Liao,R.-M Et al DQ835284 2007 Korea Chung,E and Nam,M.-H Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 53 Bảng 3.5 Hê ̣ số tương đồ ng và ̣ số phân ly của các giố ng đâ ̣u tương dựa trình tự nucleotide gen GmCHI Mố i quan ̣ di truyề n giữa các giố ng đâ ̣u tương dựa trình tự nucleotide của gen GmCHI đươ ̣c thể hiê ̣n ở sơ đồ hiǹ h 3.10 Sơ đồ hiǹ h 3.10 cho thấ y giố ng đâ ̣u tương phân bớ ở hai nhánh chiń h Nhánh thứ có giớ ng có trình tự gen CHI mang mã sớ DQ191401, trình tự cịn lại phân bố nhánh thứ hai Khoảng cách di truyền giữa hai nhánh là 18,5% % Hình 3.10 Sơ đồ hình mơ tả mối quan hệ của mơ ̣t sớ giống đậu tương dựa trình tự nucleotide của gen GmCHI 3.3.2 Sƣ̣ đa da ̣ng về trin ̀ h tƣ̣ amino acid suy diễn của gen GmCHI Tiế p tu ̣c phân tích tính đa dạng di truyền dựa trình tự amino acid suy diễn của gen GmCHI kế t quả đươ ̣c thể hiê ̣n ở bảng 3.6 hình 3.11 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 54 Bảng 3.6 Hê ̣ số tương đồ ng và ̣ số phân ly của các giố ng đâ ̣u tương dựa trình tự amino acid suy diễn gen GmCHI Bảng 3.6 cho thấ y ̣ số tương đồ ng giữa các giố ng đâ ̣u tương từ 94,5% đến 100%; ̣ số phân ly từ 0% đến 5,7% Mố i quan ̣ di truyề n giữa các giố ng đâ ̣u tương dựa trình tự amino acid suy diễn của gen GmCHI đươ ̣c thể hiê ̣n ở sơ đờ hình 3.11 % Hình 3.11 Sơ đồ hình mơ tả mối quan hệ của mơ ̣t sớ giống đậu tương dựa trình tự amino acid suy diễn của gen GmCHI Trên hin ̀ h 3.11, sáu giống đậu tương phân bố hai nhánh Nhánh thứ nhấ t chỉ có giớ ng DT 84 giố ng còn la ̣i thuô ̣c nhánh chính thứ hai với khoảng cách di truyề n là 2,4% Kế t quả phân tić h dựa triǹ h tự amino acid suy diễn của gen GmCHI sơ đồ hình 3.11 thấ y giớ ng ĐT 51 DT84 phân bố ở hai nhánh khác Điề u này có liên quan gì đế n sự khác biê ̣t về hàm lươ ̣ng isoflavone giữa hai giố ng ĐT 51 DT84 vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 55 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHI ̣ Kế t luâ ̣n 1.1 Hàm lượng daidzein, genistein ̣t nảy mầ m ngày tuổi ba giống ĐT51, DT90 DT84 dao đô ̣ng từ 29,43 mg/100g đến 41,28 mg/100g Giố ng đâ ̣u tương ĐT51 có hàm lượng daidzein genistein ̣t nảy mầ m ngày tuổ i cao nhấ t và thấ p nhấ t là ở giố ng DT84 1.2 Gen mã hóa chalcone isomerase (GmCHI) đươ ̣c phân lâ ̣p từ mRNA giố ng đâ ̣u tương ĐT 51 DT 84 có kích thước 657 nucleotide, mã hóa cho 218 amino acid Hê ̣ số tương đồ ng về trình tự nucleotide của gen GmCHI hai giố ng đâ ̣u tươ ng ĐT 51, DT84 97,9% tương đồng với giống đậu tương mang mã số NM_001249093 GenBank là 98,9% Hai giớ ng ĐT51 DT84 có sai khác 14 vị trí nucleotide trình tự gen GmCHI 12 vị trí trình tự amino acid suy diễn 1.3 Khoảng cách di truyền giống ĐT 51 DT84 dựa triǹ h tự amino acid suy diễn của gen GmCHI 2,4% Đề nghi ̣ Tiế p tu ̣c phân tích làm sáng tỏ mối liên quan khác biệt trình tự nucleotide và trin ̀ h t ự amino acid gen GmCHI với hàm lươ ̣ng isoflavone của hai giố ng ĐT51 DT84 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 56 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Lê Thị Hồng Trang, Trần Thị Thanh Vân, Hồ Mạnh Tường, Phạm Thanh Tùng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Mậu (2016), “Đă ̣c điể m của gen GmCHI phân lâ ̣p từ mô ̣t số giố ng đâ ̣u tương khác n hau về hàm lươ ̣ng isoflavone” , Tạp chí sinh học 38(2), pp 236-242 DOI: 10.15625/0866-7160/v38n2.7959 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Ngô Thế Dân (1999), Cây đậu tương, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Đường Hồng Dật (2008), Cây đậu tương – Thâm canh tăng suất đẩy mạnh phát triển, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Trần Văn Điền (2007), Giáo trình đậu tương, Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội Phạm Văn Thiều (2008), Cây đậu tương – Kỹ thuật trồng chế biến sản phẩm, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội Chu Hoàng Mâ ̣u (2008), Phương pháp phân tích di truyền đại chọn giớ ng trồ ng, Nxb Đa ̣i ho ̣c Thái Nguyên Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thúy Hường, Chu Hoàng Hà, Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2011), Gen đặc tính chịu hạn đậu tương, Nxb Đại học Quốc Gia, Hà Nội Tiếng Anh Dastmalchi M., Dhaubhadel S 2015), “Soybean chalcone isomerase: evolution of the fold, and the differential expression and localization of the gene family”, Planta 241(2), pp 507-23 Dong X., Braun E L., and Grotewold E (2001), “Functional conservation of plant secondary metabolic enzymes revealed by complementation of Arabidopsis flavonoid mutants with maize genes”, Plant Physiol 127, pp 46-57 10 Druka A., Kudrna D., Rostoks N., Brueggeman R., Von Wettstein D and Kleinhofs A (2003), “Chalcone isomerase gene from rice (Oryza sativa) and barley (Hordeum vulgare), Physical, genetic and mutation mapping”, Gene 302 (1-2), pp 171-178 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 58 11 Grotewold E., Peterson T (1994), “Isolation and characterization of a maize gene encoding chalcone flavanone isomerase”, Mol Gen Genet 24(2), pp 1-8 12 Gutha L R., Casassa L F., Harbertson J F., Naidu R A (2010), “Modulation of flavonoid biosynthetic pathway genes and anthocyanins due to virus infection in grapevine (Vitis vinifera L.) leaves”, BMC Plant Biol, 23(10), pp 187-196 13 Heather I McKhann and Ann M Hirsch (1994), “Isolation of chalcone synthase and chalcone isomerase cDNAs from alfalfa (Medicago sativa L.): highest transcript levels occur in young roots and root tips”, Plant Molecular Biology 24(1), pp 767-777 14 HK Kim, Jang YH , Baek IS , Lee JH , Park MJ, Kim JK (2005), “Polymorphism and Expression of Isoflavone Synthase Genes from Soybean Cultivars”, Mol Cells 19(1), pp 67-73 15 JA Kim, Hong SB, Jung WS , Yu CY, Ma KH, Gwag JG, Chung IM (2007) “Comparison of isoflavones composition in seed, embryo, cotyledon and seed coat of cooked-with-rice and vegetable soybean (Glycine max (L.)) varieties”, Food Chemistry 102 (3), pp 738–744 16 Kimura Y., Aoki T., Ayabe S (2001), “Chalcone isomerase isozymes with different substrate specificities towards 6'-hydroxy- and 6'-deoxychalcones in cultured cells of Glycyrrhiza echinata, a leguminous plant producing 5deoxyflavonoids”, Plant Cell Physiol 42(10), pp 1169-1173 17 Lyle Ralston, Senthil Subramanian, Michiyo Matsuno, and Oliver Yu (2005) Partial Reconstruction of Flavonoid and Isoflavonoid Biosynthesis in Yeast U sing Soybean Type I and Type II Chalcone Isomerases Plant Physiol 137, pp 1375 –1388 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 59 18 M Picmanov, Honys D, Koblovsk R , Lapcík O (2012), “Isoflavone synthase genes in legumes and nonleguminous plants”, International Conference on Biomedical Engineering and Biotechnology, IEEE pp 344 – 347 DOI 10.1109/iCBEB.2012.257 19 Maria G Campos, Miguel P Matos, Maria T Câmara, Margarida M Cunha (2007), “The variability of isoflavones in soy seeds and the possibility of obtaining extracts for over the counter tablet preparations that can be standardized”, Industrial Crops and Products 26(1), pp 85–92 20 N Shimada, T Aoki, S Sato, Y Nakamura, S Tabata, and S Ayabe (2003), “A Cluster of Genes Encodes the Two Types of Chalcone Isomerase Involved in the Biosynthesis of General Flavonoids and Legume-Specific 5- Deoxy(iso)flavonoids in Lotus japonicus”, Plant Physiol 131(3), pp 941-951 21 O Yu, J Shi, AO Hession, CA Maxwell, B McGonigle, JT Odell (2005) Metabolic engineering to increase isoflavone biosynthesis in soybean seed, Phytochemistry 63, pp 753–763 22 Ralston L., Subramanian S., Matsuno M., Yu O (2005), “Partial reconstruction of flavonoid and isoflavonoid biosynthesis in yeast using soybean type I and type II chalcone isomerases”, Plant Physiol 137(4), pp 1375-1388 23 Ralston L, Subramanian S, Matsuno M and Yu O (2015), “Glycine max chalcone isomerase (CHI), mRNA” GenBank ACCESSION NM_001248290 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001248290 24 Ribeiro MLL, Mandarino JMG, Carrão-Panizzi MC, Oliveira MCN, Campo CBH, Nepomuceno AL, Ida EI (2006),“Beta-Glucosidase activity and isoflavone content in germinated soybean radicles and cotyledon” Journal of Food Biochemistry 30, pp 453–465 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 60 25 Sambrook J and Russell DW (2001), Molecular Cloning: A laboratory Manual, 1st ed Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 26 Shirley, B W., Kubasek, W L., Storz, G., Bruggemann, E., Koornneef, M., Ausubel, F M., and Goodman, H M (1995) Analysis of Arabidopsis mutants deficient in flavonoid biosynthesis, Plant J 8, pp 659-671 27 Soderlund C., Descour A., Kudrna D., Bomhoff M., Boyd L., Currie J., Angelova A., Collura K., Wissotski M., Ashley E., Morrow D., Fernandes J., Walbot V., Yu Y (2009), “Sequencing, mapping, and analysis of 27,455 maize full-length cDNAs”, PLoS Gene 5(11), pp 740-747 28 Terai Y, Fujii I, Byun S H., Nakajima O., Hakamatsuka T., Ebizuka Y., Sankawa U (1996), “Cloning of chalcone-flavanone isomerase cDNA from Pueraria lobata and its overexpression in Escherichia coli”, Prot Expr Purif 8(1), pp 183–190 29 Verhoeyen, M E., Bovy, A., Collins, G., Muir, S., Robinson, S., deVos, C H R., and Colliver, S (2002), “Increasing antioxidant levels in tomatoes through modification of the flavonoid biosynthetic pathway” J Exp Bot 53, pp 20992106 30 Y Hasanah, TC Nisa, H Armidin, H Hanum (2015), Isoflavone content of soybean [Glycine max (L) Merr.] cultivars with different nitrogen sources and growing season under dry land conditions Journal of Agriculture and Environment for International Development - JAEID 109 (1), pp – 17 31 Zhu D, Hettiarachchy NS, Horax R, Chen P (2005), “Isoflavone contents in germinated soybean seeds” Plant Foods Hum Nutr 60(3), pp 147-51 32 http://www.gos.gov.vn 33 http://faostat.fao.org Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ... Xuất phát từ lý , đề tài luận văn thạc sĩ lựa chọn thực là: ? ?Nghiên cứu đặc điểm gen mã hóa chalcone isomerase phân lập từ đậu tương? ?? Mục tiêu nghiên cứu Phân tích đặc điểm gen mã hóa chalcone. .. TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN THỊ THANH VÂN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN MÃ HÓA CHALCONE ISOMERASE PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƢƠNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG... kDa) CHI3 với mã số AB073787, chiều dài 678 bp, mã hóa cho 225 amino acid (24,2 kDa) [20] Năm 2005, Ralston phân lập gen CHI1A từ mRNA đậu tương thấy gen có chiều dài 1157 bp, mã hóa cho 128 amino