Đặc điểm của đoạn gen mã hóa Protein vỏ phân lập từ Soybean Mosaic Virus

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HOÀNG THỊ HẢI YẾN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HOÀNG THỊ HẢI YẾN Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các trong nhóm nghiên cứu. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Hoàng Thị Hải Yến XÁC NHẬN CỦA KHOA CHUYÊN MÔN XÁC NHẬN CỦA CÁN BỘ HƢỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS. Chu Hoàng Mậu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành NCS. Lò Thị Mai Thu, giảng viên Trƣờng Đại học Tây Bắc. Xin cảm ơn t cán bộ Phòng Công nghệ , Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia về Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện thí nghiệm của đề tài. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Di truyền&Sinh học hiện đại, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh - KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi, tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Cuối cùng, tôi bày tỏ lời cảm ơn đến các đồng nghiệp, bạn bè cùng toàn thể gia đình đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập. Thái Nguyên, ngày 03 tháng 06 năm 2014 Tác giả Hoàng Thị Hải Yến Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt iv Danh mục các bảng v Danh mục các hình vi MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 TƢƠNG 3 1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây đậu tƣơng 3 1.1.2. Giá trị kinh tế của cây đậu tƣơng 4 1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và ở Việt Nam 5 BEAN MOSAIC VIRUS (SMV) 8 1.2.1. Bệnh virus hạ 8 , kí chủ ế truyền bệnh 11 1.2.3. Triệu chứng của bệ 13 1.2.4. Biện pháp phòng trừ 14 15 15 1.3.2. Protein vỏ (CP) và gen mã hóa protein vỏ của SMV 17 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ 19 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu 19 2.1.2. Hoá chất và thiết bị 19 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu 19 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.2.1. Phƣơng pháp thu mẫu 20 20 Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1. KẾT QUẢ THU THẬP MẪU 29 CP 30 CP 30 CP 32 3.3. Ự ĐA DẠNG CỦA CÁC DÒNG SMV 40 CP 40 ễn từ CP 42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45 1. Kết luận 45 2. Đề nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT DNA : Deoxyribonucleic Acid RNA : Ribonucleic Acid bp : Cặp bazơ cDNA : Sợi bổ sung DNA (Complementary DNA) tổng hợp từ mARN nhờ Enzym phiên mã ngƣợc CP : Coat protein cs : cộng sự DEPC : Diethy pyrocarbonate dNTP : Deoxynucleotide Kb : Kilo bazơ LB : Luria Bertani PCR : Polymerase chain reaction - Phản ứng chuỗi polymerase RT- PCR : Reverse trancriptase - Polymerase chain reaction (PCR ngƣợc) Rase : Ribonuclease SMV : Soybean mosaic virus X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside IPTG : isopropylthio-β-galactoside RNAi : RNA interference TN : Thái Nguyên SL3 : Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Tình hình sản xuất đậu tƣơng ở Việt Nam giai đoạn 2008 - 2012 7 Bảng 1.2. Một số virus gây bệnh trên đậu tƣơng 11 2.1. 22 Bảng 2.2. Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 23 Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng PCR 23 Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 23 Bảng 2.5. Thành phần gắn gen CP vào vector tách dòng pBT 25 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng colony – PCR 27 Bảng 2.7. Chu trình nhiệt của phản ứng colony - PCR 27 Bảng 3.1. Các vị trí sai khác giữa trình tự đoạn gen CP của SMV dòng SL3 so với trình tự có mã số X63771 36 Bảng 3.2. Các vị trí sai khác giữa trình tự amino acid suy diễn từ gen CP phân lập từ SMV dòng SL3 và trình tự amino acid của protein có mã số CAA45307 38 CP 41 gen CP 41 Bảng 3.5. Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác về trình tự amino CP 43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Sơ đồ các gen trong hệ gen của SMV 16 Hình 1.2. Hình ảnh 3D protein vỏ của SMV 17 Hình 2.1. Sơ đồ vector pBT 25 Hình 3.1. Hình ản 29 sản phẩm PCR trên gel agarose 31 Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc 33 Hình 3.4. So sánh trình tự đoạn gen CP 3 thu tại tỉnh Sơn La và trình tự gen CP của dòng virus SMV đƣợc đăng ký GenBank có mã số X63771 35 Hình 3.5. So sánh trình tự amino acid suy diễn từ gen CP phân lập từ SMV dòng SL3 và trình tự amino acid của protein có mã số CAA45307 trên GenBank 36 - - protein có mã số CAA45307 trên GenBank 37 Hình 3.7. Kết quả so sánh bằng Nucleotide blast của đoạn gen CP của SMV dòng SL3 trên NCBI 39 Hình 3.8. Kết quả so sánh bằng Protein blast của trình tự amino acid suy diễn từ gen CP của SMV dòng SL3 trên NCBI 40 CP 42 Hình 3.10. Sơ đồ hình cây thiết lập dựa trên trình tự amino acid suy diễn từ gen CP của 10 dòng SMV 43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế và hàm lƣợng dinh dƣỡng cao. Tỉ lệ khối lƣợng các chất khô trong hạt đậu tƣơng có đến 30 - 45% protein với đầy đủ và cân đối các loại axit amin cần thiết, 19 - 25% lipit, 20% gluxit, 4 - 5% chất khoáng và các vitamin (B1, B2, C, D, E, K ). Hạt đậu tƣơng cung cấp nguồn dinh dƣỡng phong phú cho con ngƣời và động vật. Rễ đậu tƣơng có nốt sần chứa vi khuẩn có khả năng cố định nitơ không khí, vì vậy trồng đậu tƣơng góp phần cải tạo đất và bảo vệ môi trƣờng. Với những giá trị to lớn đó, cây đậu tƣơng đƣợc đánh giá là cây trồng quan trọng trong sản xuất nông nghiệp và đời sống xã hội nhiều nƣớc trên thế giới. Hiện nay ở Việt Nam, cây đậu tƣơng chiếm một vị trí rất quan trọng trong cơ cấu cây trồng nông nghiệp, đƣợc gieo trồng ở cả 7 vùng nông nghiệp trên cả nƣớc với mục đích giải quyết vấn đề thiếu protein cho ngƣời và gia súc, xuất khẩu và cải tạo đất. Những năm gần đây, năng suất đậu tƣơng bình quân của thế giới và của nƣớc ta bị giảm sút đáng kể do nhiều nguyên nhân nhƣ tác động xấu của môi trƣờng, sâu bệnh, chất lƣợng hạt giống, kỹ thuật canh tác… Trong những nguyên nhân trên, các bệnh do nhiễm virus đã gây tổn thất lớn về năng suất, chất lƣợng đậu tƣơng và hiện nay vẫn chƣa có biện pháp hiệu quả để phòng trừ. Đậu tƣơng là cây trồng dễ bị nhiễm nhiều loại virus, nhƣ bệnh khảm (Soybean mosaic virus - SMV), bệnh khảm vàng (Bean yellow mosaic virus - BYMV), bệnh xoăn lá và một số bệnh virus khác. Soybean mosaic virus (SMV) là một trong những loại virus gây bệnh nghiêm trọng nhất ở cây đậu tƣơng. Sau khi nhiễm SMV, đậu tƣơng sẽ suy giảm khả năng sinh trƣởng, phát triển, giảm năng suất và chất lƣợng hạt. Nghiên cứu hệ gen của SMV sẽ cung cấp những gợi ý để xác định các yếu tố quyết định đến [...]... tự nucleotide của Tobacco etch virus, Tobacco vein mottling virus, Potato virus Y, Plum pox virus, SMV - G2 và SMV - G7, Jayaram và cs nhận thấy các khu vực đƣợc bảo tồn nhất trong genome của potyvirrus là các gen mã hóa protein nhƣ gen CI, gen NIb, gen CP Gen CP của SMV giống nhất với gen CP của Potato virus Y và Tobacco etch virus, nhƣng về tổng thể hệ gen của SMV tƣơng tự nhƣ Plum pox virus [25] Won-Seok... (PStV) Potyvirus 9 Peanut stunt virus (PSV) Cucumovirus 10 Soybean chlorotic mottle (SbCMV) Caulimovirus 11 Soybean crinkle leaf viruss (SCLV) Begomovirus 12 Soybean dwarf virus (SbDV) Luteovirus 13 Soybean mosaic virus (SMV) Potyvirus 14 Soybean severe stunt virus (SSSV) Nepovirus 15 Tobacco ringspot virus (TRSV) Nepovirus 1.2.2 , cơ chế truyền bệnh SMV (Soybean mosaic virus) là tác nhân gây bệnh khảm... tƣơng nhiễm SMV từ vùng trồng đậu hai tỉnh Sơn La và Thái Nguyên 3.2 Tách chiết RNA tổng số, tạo cDNA và nhân bản gen CP từ hệ gen của SMV 3.3 Tách dòng và xác định trình tự gen CP mã hóa protein vỏ của SMV 3.4 So sánh trình tự nucleotide của gen CP; trình tự amino acid poty-coat trong protein do đoạn gen CP mã hóa đƣợc với trên GenBank 3.5 trình tự nucleotide của -coat trong protein do Số hóa bởi Trung... Một số virus gây bệnh trên đậu tƣơng [26] STT Tên virus Chi 1 Alfalfa mosaic virus (AMV) Alfamovirus 2 Bean pod mottle virus (BPMV) Comovirus 3 Bean yellow mosaic virus (BYMV) Potyvirus 4 Tobacco streak virus (TSV) Ilarvirus 5 Cowpea chlorotic mottle virus (CCMV) Bromovirus 6 Mung bean yellow mosaic virus (MYMV) Begomovirus 7 Peanut mottle virus (PeMoV) Potyvirus 8 Peanut stripe virus (PStV) Potyvirus...triệu chứng bệnh khảm lá ở cây đậu tƣơng, từ đó nghiên cứu tạo cây đậu tƣơng kháng virus phục vụ công tác chọn tạo giống đậu tƣơng sạch bệnh Xuất phát từ lí do trên, chúng tôi lựa chọn và tiến hành đề tài: Đặc điểm của gen mã hóa protein vỏ Soybean mosaic virus 2 Mục tiêu nghiên cứu Xác định đƣợc đặc điểm trình tự -coat CP phân lập từ SMV gây bệnh khảm lá ở cây đậu tƣơng 3 Nội dung nghiên... 99% [33] Trình tự nucleotide hoàn chỉnh của các chủng này có thể cung cấp những gợi ý để xác định các yếu tố quyết định đến triệu chứng bệnh khảm lá ở cây đậu tƣơng, từ đó có các biện pháp hiệu quả để phòng trừ SMV cho đậu tƣơng 1.3.2 Protein vỏ (CP) và gen mã hóa protein vỏ của SMV Trong bộ gen của Potyvirus, gen CP đƣợc nghiên cứu phổ biến nhất Gen CP của 30 potyviruses đã đƣợc xác định [29] Ngƣời ta... 36 KD Hệ gen của SMV là 1 sợi RNA đơn dƣơng, đƣợc liên kết với protein viron (VPg) ở đầu 5’ và có đuôi poly(A) ở đầu 3’ Viêc hoàn thành giải trình tự 45 chủng SMV phân lập đƣợc cho thấy hệ gen của SMV có khoảng 9600 nucleotide mã hóa cho một polyprotein với 3066 amino acid Polyprotein này gồm 10 chuỗi polypeptid: P1 proteinase (P1), Helper component proteinase (HC-pro), Protein P3 (P3), 6 kDa protein. .. thực vật, (4) gen CP là gen dễ tiếp cận nhất để nhân bản vì nó là gen cuối cùng nằm ở đầu 3’ của bộ gen potyvirus Hình 1.2 Hình ảnh 3D cấu trúc protein vỏ của SMV (Gerald Stubbs và cs, 2008) [10] CP của potyvirus có chức năng sinh học chính là giữ hình dạng virus, bảo vệ RNA virus, tham gia tƣơng tác với tế bào thực vật và lây truyền virus từ tế bào này sang tế bào khác Số hóa bởi Trung tâm Học liệu... Cytoplasmic inclusion protein (CI), 6 kDa protein 2 (6K2), Viral genomeSố hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ linked protein (VPg), Nuclear inclusion protein A (NIa), Nuclear inclusion protein B (NIb), Coat protein (CP) (Hình 1.1) Hình 1.1 Sơ đồ các gen trong hệ gen của SMV (Jayaram và cs (1992)) [25] Hệ gen của SMV có vùng bảo thủ (NTRs) ở đầu 5’ và đầu 3’ Chiều dài của 5’NTR trong khoảng... đã phân tích trình tự nucleotide hoàn chỉnh của RNA genome của SMV chủng G5 (SMV-G5) và G7H (SMV-G7H) và so sánh với trình tự của các chủng SMV khác Mỗi RNA của SMV dài 9588 nucleotides (chƣa kể đuôi poly A), chứa một khung đọc mở (ORF) mã hóa cho một polyprotein mà sau đó đƣợc phân cắt thành 10 protein chức năng So sánh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ trình tự amino acid của . phát từ lí do trên, chúng tôi lựa chọn và tiến hành đề tài: Đặc điểm của gen mã hóa protein vỏ Soybean mosaic virus . 2. Mục tiêu nghiên cứu Xác định đƣợc đặc điểm trình tự -coat CP phân lập. nhân bản gen CP từ hệ gen của SMV. 3.3. Tách dòng và xác định trình tự gen CP mã hóa protein vỏ của SMV. 3.4. So sánh trình tự nucleotide của gen CP; trình tự amino acid poty-coat trong protein. trình tự amino acid suy diễn từ gen CP phân lập từ SMV dòng SL3 và trình tự amino acid của protein có mã số CAA45307 trên GenBank 36 - - protein có mã số CAA45307 trên GenBank 37 Hình 3.7. Kết