3. Nội dung nghiên cứu
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phƣơng pháp thu mẫu
- Dụng cụ thu mẫu: Túi polyetylen cỡ trung bình có khóa kéo kín, kéo cắt cây, giấy báo, nhãn, cồn khử trùng, sổ ghi chép, máy ảnh...
- Phƣơng pháp thu mẫu:
+ Điều tra các vùng trồng đậu tƣơng tại Thái Nguyên và Sơn La.
+ Xác định các cây đậu tƣơng có triệu chứng bệnh khảm lá (theo Vũ Triệu Mẫn (1998)) nghi do nhiễm SMV.
+ Ngắt mẫu lá nghi bị bệnh bỏ vào nitơ lỏng để cố định mẫu bệnh. Nếu điều kiện không có nitơ lỏng thì thu cả cây bị bệnh và không đƣợc để cây có hiện tƣợng héo mất nƣớc. Thời gian thu mẫu và giữ mẫu ở điều kiện nhiệt độ môi trƣờng không quá 12 giờ. Nếu thu mẫu lá phát hiện có rệp cần phải thu ngay rệp vì đó là một vector truyền bệnh quan trọng.
+ Ghi rõ tên ngƣời, thời gian, địa điểm thu mẫu, số lƣợng mẫu thu/cây thu mẫu nơi nghi nhiễm.
- Bảo quản mẫu trong tủ âm ở nhiệt độ -300C hoặc -850C.
2.2.2. Các phƣơng pháp
2.2.2.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
Sử dụng bộ kit GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific) để tách chiết RNA tổng số từ các mẫu lá đậu tƣơng theo chỉ dẫn của nhà sản xuất gồm các bƣớc:
- Nghiền nhanh 100mg mẫu trong nitơ lỏng.
- Hút 500 µl Plant RNA Lysis Solution, thêm 10 µl DTT 2M cho vào ống 1,5 ml.
- Ủ trong 3 phút, 560C sau đó li tâm 5 phút 14.000 vòng/phút. - Thu dịch nổi (khoảng 450 – 550 µl) chuyển vào ống sạch. - Thêm 250 µl cồn 96%, trộn đều.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Li tâm 1 phút 11.000 vòng/phút. - Sau đó loại bỏ dịch trong ống.
- Thêm 700 µl Wash Buffer WB1 vào cột lọc (đảm bảo rằng WB1 đã đƣợc bổ sung cồn).
- Li tâm 1 phút 11.000 vòng/phút.
- Loại bỏ dịch trong ống sau đó chuyển cột sang ống 2 ml.
- Thêm 500 µl Wash Buffer WB2 vào cột lọc (đảm bảo rằng WB2 đã đƣợc bổ sung cồn).
- Li tâm 1 phút 11.000 vòng/phút. - Sau đó loại bỏ dịch trong ống.
- Cho tiếp 500 µl Wash Buffer WB2 vào cột lọc. - Sau đó li tâm nhanh 1 phút 20.000 vòng/phút. - Loại bỏ dịch và chuyển cột sang ống 1,5ml.
- Tách RNA ra khỏi màng bằng cách thêm 50 µl H2O vào đúng giữa màng, để 1 phút tại nhiệt độ phòng.
- Sau đó li tâm 1 phút 11.000 vòng/phút.
- Bảo quản RNA ở -200C. Giữ RNA trên đá trƣớc và trong khi làm việc. Kiểm tra sản phẩm RNA tổng số bằng phƣơng pháp điện di: Điện di RNA tổng số tách chiết đƣợc trên gel agarose 1%. Sản phẩm điện di đƣợc nhuộm ethidium bromide, soi và chụp ảnh dƣới ánh sáng cựu tím. Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của RNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.
2.2.2.2. Phương pháp RT-PCR
RNA tổng số đƣợc sử dụng để nhân gen CP bằng kỹ thuật RT-PCR gồm 2 bƣớc:
Bước 1: Tổng hợp cDNA: Sử dụng Kit tổng hợp cDNA (RevertAid First
Strand cDNA Synthesis Kit) (Thermo Scientific) theo chỉ dẫn của nhà sản xuất gồm các bƣớc:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
(i) Bổ sung lần lƣợt các thành phần vào ống Eppendorf 0,5ml đã đƣợc xử lý DEPC 0,01% 2.1).
(ii) Li tâm nhanh.
(iii) Cho vào máy PCR ủ theo chu trình nhiệt : 420
C/60 phút; 700C/5 phút. Sản phẩm cDNA có thể sử dụng trực tiếp, giữ ở -200C trong 1 tuần hoặc giữ lâu hơn ở -700
C. 2.1. ợ Thành phần Thể tích RNA tổng số 5 µl Oligo (dT) primers 1 µl Nƣớc 6 µl Tổng thể tích 12 µl
- Ủ ở 650C/5 phút sau đó đặt ngay vào đá lạnh.
- Tiếp tục bổ sung các thành phần sau vào ống phản ứng:
Thành phần Thể tích
5X Reaction Buffer 4 µl
RiboLock RNase Inhibitor (20u/ µl) 1 µl
10 mM dNTP Mix 2 µl
RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase (200u/ µl)
1 µl
Tổng thể tích 20 µl
Bước 2: Phản ứng PCR: cDNA của gen CP đƣợc khuếch đại bằng kỹ
thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu SMVCP-F/SMVCP-R. Trình tự cặp mồi đƣợc trình bày trong bảng 2.2.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 2.2. Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
Mồi Trình tự
SMVCP-F 5’-TTACCATCAGGCAAGGAGCAGGAAG -3’ SMVCP-R 5’-TGGACTTGATGGGAACATCTCAACT -3’
Thành phần, chu trình nhiệt cho phản ứng PCR đƣợc thể hiện trong bảng 2.3 và bảng 2.4.
Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng PCR
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Nƣớc khử ion 8,6
2 Master Mix 12,5
3 Mồi xuôi (10 pmol/µl) 0,7
4 Mồi ngƣợc (10 pmol/µl) 0,7
5 cDNA khuôn ( 10 – 20 ng/µl) 2,5
Tổng thể tích 25
Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0
C) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 3 phút 1
2 Biến tính 94 1 phút
35
3 Gắn mồi 57 45 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 45giây
5 Hoàn tất kéo dài 72 5 phút 1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% trong TAE 1X, với sự có mặt của maker chuẩn và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím. Sau đó, sản phẩm đƣợc tinh sạch (thôi gel).
2.2.2.3. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Quá trình tinh sạch đƣợc thực hiện theo quy trình và bộ hóa chất sử dụng cho tinh sạch của hãng QIAGEN (QIAquick DNA Gel Extraction Kit), gồm các bƣớc sau:
- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1 % và cắt lấy băng quan tâm. - Bổ sung dung dịch QG theo tỷ lệ : Vmẫu : VQG = 1: 3 (1 µl tƣơng đƣơng với 1 mg mẫu).
- Ủ ở 500C trong 15 phút, 3 phút trộn nhẹ một lần, sau khi gel tan hết ủ thêm 5 phút cho gel tan hoàn toàn.
- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel QIAquick spin column, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Bổ sung 500 µl dung dịch QG, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút. Loiạ bỏ dịch chảy qua cột.
- Thêm 750 µl dung dịch PE vào cột, để ở nhiệt độ phòng.
- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phút để loại hết PE.
- Hòa tan DNA trong 30 – 50 µl H2O deion khử trùng, đã đƣợc làm ấm đến 500C để ở nhiệt độ phòng 1 phút sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
2.2.2.4. Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng
Sản phẩm PCR sau khi đƣợc tinh sạch sẽ đƣợc gắn trực tiếp vào vetor tách dòng pBT nhờ enzyme nối T4 ligase. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT đƣợc thể hiện ở bảng 2.5.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 2.5. Thành phần gắn gen CP vào vector tách dòng pBT
STT Thành phần Thể tích 1 CP ( 10 – 20 ng/µl) 7 µl 2 Ligation buffer 10X 1 µl 3 Vector pBT 1 µl 4 T4 ligase 1 µl Tổng thể tích 10 µl
Bổ sung lần lƣợt các thành phần của phản ứng vào ống eppendorf 0,5ml. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 220C trong 3 giờ, sau đó đƣợc biến nạp vào khả biến E.coli DH5α.
Hình 2.1. Sơ đồ vector pBT
2.2.2.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
Tế bào khả biến đƣợc lấy từ trong tủ -850C chuyển sang môi trƣờng -40C khoảng 20 phút (bình đá). Biến nạp sản phẩm ghép nối vào E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Biến nạp
Bổ sung 5µl vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ. Hỗn hợp đƣợc đặt trong bình đá 15 phút, rồi ủ ở 420
C chính xác 1 phút 30 giây. Sau đó, chuyển nhanh hỗn hợp vào đá lạnh trong 5 phút. Bổ sung 500 µl LB lỏng (pepton, cao nấm men, NaCl) cho vào hỗn hợp. Hỗn hợp đƣợc nuôi lắc 200 vòng/phút ở 370C trong 1 giờ.
Cấy trải tế bào biến nạp trên LB đặc
Đổ thạch môi trƣờng cấy trải (100mg/l ampicillin, 40mg/l X-gal, 0,1mM IPTG, 400µl LB đặc) vào đĩa thủy tinh hoặc nhựa.
Mẫu sau khi nuôi phục hồi li tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, bỏ dịch nổi giữ lại 150µl trộn nhẹ. Sử dụng que cấy trải đã khử trùng, trải 150 µl dịch khuẩn lên đĩa môi trƣờng môi trƣờng cấy trải có kháng sinh ampicillin. Ủ đĩa petri ở 370C trong 16 giờ.
Chuyển khuẩn lạc sang pha nuôi lỏng
Chọn các khuẩn lạc trắng đem nuôi trong môi trƣờng LB lỏng có bổ sung ampicillin (100mg/l). Nuôi ở 370C, lắc 200 vòng/phút, trong 16 giờ.
2.2.2.6. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR)
Lấy dịch nuôi lỏng chứa vi khuẩn đã biến nạp, đem kiểm tra sản phẩm các mẫu đã chọn dòng bằng phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi pUC18-F1/pUC18-R1. Đây là cặp mồi đƣợc thiết kế chung cho các vector tách dòng, có vị trí bắt cặp nằm trên vector và nhân đoạn gen vừa biến nạp.
Thành phần phản ứng colony - PCR thể hiện ở bảng 2.6 2.7.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Bảng 2.6. Thành phần phản ứng colony – PCR STT Thành phần Thể tích 1 Nƣớc khử ion 13µl 2 Đệm PCR 10X 2,5µl 3 MgCl2 ( 25mM) 2µl 4 dNTPs ( 10mM) 2,5µl
5 Mồi pUC18R (10pmol/µl) 1µl
6 Mồi pUC (pmol/µl) 1µl
7 cDNA khuôn (10 – 20 ng/µl) 2µl
8 Taq DNA polimerase (5 đơn vị/µl) 1µl
Tổng thể tích 25µl
Bảng 2.7. Chu trình nhiệt của phản ứng colony - PCR
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0
C) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 5 phút 1
2 Biến tính 94 1 phút
30
3 Gắn mồi 57 1 phút
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
2.2.2.7. Phương pháp tách chiết plasmid
Phƣơng pháp tách chiết plasmid đƣợc thực hiện theo Sambrook và cs (2001), bằng Plasmid Miniprep Kit của hãng Qiagen.
Với sự tham gia của 3 loại hóa chất:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Sol II (0,2M NaOH, SDS 1%)
Sol III (60 ml CH3COOK 5M; 11,5ml CH3COOH; 28,5ml H2O)
Quy trình tách plasmid
Lấy 10 ml dung dịch vi khuẩn nuôi trong LB lỏng 12 - 16 giờ. Ly tâm 8000 vòng/phút thu tế bào, có thể lặp lại 5 lần để thu hết cặn khuẩn của 10 ml dịch khuẩn.
Bổ sung 200 µl Sol I hòa tan tế bào hoàn toàn. Bổ sung 400 µl Sol II trộn nhẹ trong 30 giây. Bổ sung tiếp 300 µl Sol III trộn nhẹ trong 30 giây.
Bổ sung 900 µl chloroform : isoamin (24 : 1) trộn đều trong 3 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút, hút nhẹ nhàng không cặn 900µl pha trên sang ống Effendorf mới.
Cho 900 µl isopropanol 100% để ở nhiệt độ -4o
C trong 30 – 180 phút, ly tâm 13000 vòng/phút, loại bỏ phần dịch lỏng, thu cặn.
Cho 500 µl cồn 70% vào, ly tâm 7000 vòng/phút trong 5 phút, sau đó loại bỏ cồn và làm đông khô trong 30 phút.
Hòa tan sản phẩm trong 50 µl nƣớc khử ion. Bổ sung RNase
Ủ ở 370C trong 30 phút.
Kiểm tra sản phẩm tách plasmid bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
2.2.2.8. Phương pháp xác định và phân tích trình tự nucleotide của gen
Trình tự của gen CP đƣợc xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ THU THẬP MẪU
Tiến hành và thu mẫu lá đậu tƣơng nghi nhiễm SMV tại các vùng trồng đậu tƣơng của hai tỉnh Thái Nguyên và Sơn La. Mẫu lá đậu tƣơng nghi nhiễm SMV đƣợc chụp ảnh khi còn ở trên cây sau khi thu đƣợc lƣu giữ tại phòng thí nghiệm.
Hình 3.1. Hình ảnh lá đậu tƣơng nghi nhiễm SMV thu tại
Thái Nguyên -
g)
Kết quả phân tích mẫu lá nghi nhiễm bệnh do SMV có thể nhận thấy: lá bị nhiễm SMV thƣờng bị xoăn, nhăn mặt lá, có hiện tƣợng khảm, trên mặt lá phần diệp lục không đều, có xen lẫn màu vàng, lá cong queo và mép dọc
A B
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
của lá bị uốn cong xuống phía dƣới. Những lá này có kích thƣớc nhỏ hơn những lá không bị bệnh. Một số lá có hiện tƣợng biến vàng nhƣng bề mặt của lá vẫn tƣơi, không có biểu hiện của héo úa. Ngoài ra, trên một số lá có rệp. Đa số những cây bị nhiễm SMV đều phát triển kém hơn những cây không bị nhiễm bệnh.
Khi so sánh với lá không bị nhiễm bệnh, chúng tôi thấy lá không nhiễm bệnh có màu xanh tƣơi, không có bất cứ biểu hiện triệu chứng nào của bệnh virus nhƣ xoăn, nhăn lá. Trên bề mặt của lá mịn, không có hiện tƣợng khảm vàng.
Kết quả quan sát cho thấy, ở thời kỳ tuổi cây còn non và phần non của cây là nơi virus sinh sản mạnh nhất, cho đến khi các cây già cỗi thì quá trình này sẽ chậm lại và hầu nhƣ ngừng hẳn. Vì vậy, các lá biểu hiện triệu chứng bệnh rõ là những lá non ở phần ngọn. Ở mặt dƣới lá cây đậu tƣơng nhiễm bệnh còn quan sát thấy rất nhiều rệp (Hình 3.1 D). Rệp là côn trùng truyền bệnh, là tác nhân chính làm lây lan bệnh trên đồng ruộng.
Tuy nhiên, các triệu chứng đặc trƣng nhƣ lá bị khảm và xoăn có thể do nhiều loại virus gây bệnh trên đậu tƣơng. Việc dựa vào triệu chứng để xác định bệnh chỉ mang tính chất tƣơng đối. , để xác định chính xác tác nhân gây bệnh phải sử dụng kỹ thuật gen.
Những mẫu lá đậu tƣơng nghi nhiễm SMV đƣợc thu thập, tiến hành xử lý và bảo quản để làm vật liệu nghiên cứu lâu dài.
3.2. CP
3.2.1. CP
Chúng tôi sử dụng bộ kit GeneJET Plant RNA Purification Mini (của hãng Thermo Scientific) để tách chiết RNA tổng số từ các mẫu lá đậu tƣơng nghi nhiễm SMV. SMV tập trung nhiều ở mạch dẫn của lá nên các mẫu lá
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
đƣợc loại bỏ bớt phần thịt lá, giữ lại phần gân lá rồi đƣợc nghiền thành bột mịn trong cối chày sứ có nitơ lỏng. Đối với những mẫu có rệp thì giữ nguyên lá và rệp trên lá đem nghiền. RNA là loại phân tử không bền vững, dễ bị phân hủy bởi các ribonuclease (RNase). Hơn nữa, các RNase có mặt khắp nơi, hoạt tính mạnh và bền. Vì thế, việc tách chiết RNA đòi hỏi thao tác thật cẩn thận để tránh mọi tạp nhiễm chứa RNase từ môi trƣờng, tất cả các dụng cụ phải đƣợc trƣớc khi tiến hành thí nghiệm. RNA tổng số sau khi tách đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel argarose 1% và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím.
, Kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis
tổng hợp cDNA .
Trình tự đoạn gen CP SMV đậu tƣơng
kích thƣớc ƣớc tính khoảng 0,7kb. Đoạn gen CP đƣợc nhân lên từ
cDNA bằng phƣơng pháp PCR SMVCP-F/ SMVCP-R.
Kết quả nhân gen CP đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%
trong TAE 1X, với sự có mặt của thang DNA chuẩn và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím.
Hình 3.2. điện di sản phẩm PCR trên gel agarose
M: n 1 kb ;1- 2: SL3
M 1 2
1,0 kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Kết quả điện di sản phẩm PCR ở hình 3.2 cho thấy đã nhân đƣợc đoạn DNA với kích thƣớc khoảng 0,7kb đối với mẫu SL3. Kết quả này phù hợp theo tính toán lý thuyết khi chúng tôi thiết kế mồi và tƣơng ứng với kích thƣớc của đoạn gen CP của SMV. Nhƣ vậy, có thể sơ bộ kết luận rằng
bằng kĩ thuật PCR đã nhân bản thành công đoạn gen có kích thƣớc tƣơng ứng với gen CP của SMV từ mẫu lá nghi nhiễm bệnh thu đƣợc tại tỉnh Sơn La.
Chúng tôi sử dụng bộ kit QIAquick DNA Gel Extraction (của hãng