OUBAIN (G – STROPHANTHIN) HỢP CHẤT GLYCOSID TỰ NHIÊN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC CHO VIỆC ĐIỀU TRỊ BỆNH TIM MẠCH

BÁO CÁO BÀI TẬP NHÓM OUBAIN (G – STROPHANTHIN) HỢP CHẤT GLYCOSID TỰ NHIÊN CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC CHO VIỆC ĐIỀU TRỊ BỆNH TIM MẠCH Đà Nẵng, Ngày 18 tháng 09 năm 2016 Mục lục I Đặt vấn đề Hợp chất thiên nhiên (hay hợp chất tự nhiên) chất hóa học có nguồn gốc từ thiên nhiên người tách từ loại động vật, thực vật tự nhiên có hoạt tính sinh học có tác dụng dược học dùng để làm thuốc Ngành hóa học chuyên nghiên cứu để chiết tách chuyển hóa hợp chất tự nhiên gọi ngành hóa học hợp chất thiên nhiên (hay hóa học hợp chất tự nhiên) Đây mơn khoa học có ý nghĩa quan trọng khơng ngành hóa học mà cịn y học.Một số hợp chất thiên nhiên biết đến rộng rãi y học nhóm Glycosid tim chất có tác dụng đặc hiệu bệnh tim Ngày với trình độ khoa học kỹ thuật tiên tiến ,việc xuất thành phần Glycosid tim số phận (ví dụ trúc đào ,hành biển…) thực đại trà phịng thí nghiệm ,hay trung tâm nghiên cứu dược liệu nhằm đáp ứng nhu cầu sản xuất thuốc chữa bệnh tim cho người Có nhiều chất thuộc nhóm Glycosid có hoạt tính sinh học cao ứng dụng cho việc chữa bệnh tim mạch hợp chất đến G – STROPHANTHIN (OUBAIN) tách chiết từ chi Strophanthus II Tổng quan Giới thiệu chung Glycosid 1.1 Định nghĩa Glycosid trợ tim glycosid steroid có tác dụng đặc biệt lên tim Tùy loại glycosid trợ tim mà chúng có tác dụng cường tim, làm chậm điều hoà nhịp tim 1.2 Đặc điểm chung glycosid  Tất có nguồn gốc từ thực vật, có hoạt chất glycosid, tác dụng chủ yếu lên tim, thuốc chữa suy tim  Cấu trúc hóa học gần giống  Có chung chế tác dụng 1.3 Phân loại glycosid  Phân loại theo cầu nối: Phần đường phần không đường glycosid thường nối với cầu nối oxy cầu nối khác S, N Một số trường hợp phần đường không đường liên kết với dây nối ester, loại gọi pseudoglycosid (Asiaticoside)  Phân loại theo cấu trúc phần không đường: Dựa vào cấu trúc phần không đường người ta chia thành nhóm chất: Glycosid tim, iridoid, saponin, anthranoid,flavonoid, coumarin, tanin…  Phân loại theo thời gian tác dụng thuốc: có loại - Các Glycosid tác dụng dài: Digitoxin Digitoxin dễ tan lipid, khơng ion hóa, nên hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, có tác dụng sau uống thuốc, tác dụng tối đa từ – 12 giờ, kéo dài – ngày sau liều điều trị - Các Glycosid tác dụng trung bình Digoxin Digoxin dễ tan lipid, khơng ion hóa, nên hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, tác dụng điều trị sau giờ, tối đa giờ, kéo dài 24 - Các Glycosid tim tác dụng nhanh: Strophantin, Ouabain Ouabain khơng hấp thụ qua đường tiêu hóa nên phải tiêm, tác dụng nhanh sau tiêm tĩnh mạch – 20 phút, kéo dài vài Giới thiệu (Oubain) G – Strophanthin 2.1 Định nghĩa Ouabain gọi g-strophanthin, glycosid steroid có nhân steroid nối với vịng lacton cạnh khơng bão hịa vị trí C17 nối với phân tử đường L-ramnose C3 2.2 Phân bố thực vật Ouabain có nhiều chi Strophanthus thuộc họ trúc đào, cẩm anh Acokanthera schimperi, sừng Dê, đặc biệt Cây Sừng dê hoa vàng (Strophanthus divaricatus (Lour.) Hook Et Arn Phân bố chủ yếu châu Phi, nam Ấn Độ Trung Quốc, Việt Nam tập trung tỉnh miền trung: Hà Tĩnh, Nghệ An,… Thành phần hóa glicozit tim g-strophanthin (đồng nghĩa: ouabain), k -strophanthin e-strophanthin hàm lượng ouabain từ 3-7%, thu chủ yếu từ hạt Hạt thu hái vào mùa đơng chín già, lấy hạt bỏ chùm lông, phơi hay sấy khô Cành, lá, dịch sử dụng hiệu suất thấp 2.2 Cấu trúc Ouabain Cấu trúc không gian hai chiều: gồm phần đường L-glucose liên kết với phần không đường aglycon cholesterol biến đổi gồm có nhóm OH nhóm este hai đầu, chúng liên kết liên kết glycosid Phần đường ouabain làm tăng cường hoạt động aglycon, thúc đẩy hoạt tính thấm qua màng tim, trì tác dụng aglycon tim Có nhiều nhóm OH phân tử oubain với este hai đầu nên giúp cho ouabain liên kết với bơm Na-K màng tế bào Cấu trúc khơng gian ba chiều: có cấu trúc hình học phân tử hóa học lập thể hình bên Trong cấu trúc khơng gian ba chiều thấy rõ phân bố liên kết có cực C-O liên kết khơng phân cực C-C không gian phân tử ouabain Điều giúp cho việc hình dung gắn kết chất ức chế với ouabain dễ dàng Ouabain liên kết dọc theo protein bên bó alpha xoắn Thành phần khơng phân cực cịn lại ouabain giúp phần việc phối hợp oubain thông qua lực Van der Waals, phần lại phân cực, glutamid, aspartic threonine song song với liên kết amid alanine, bao quanh nhóm OH carbonyl phối tử, tạo thành liên kết H với chiều dài đến Ăngstron Điều không giữ thuốc chỗ mà cho phép thay đổi cấu hình khơng cần thiết cho chức protein Hình 1.1 Cấu trúc khơng gian hai chiều Oubain Hình 1.2 Cấu trúc khơng gian chiều Oubain 2.3 Tính chất 2.3.1.Tính chất vật lí - Khơng mùi, tinh thể màu trắng Vị đắng Tính tan: tan nước lạnh, tan nhiều nước nóng cồn, không tan ether - cloroform Khối lượng phân tử: 584.65246g/mol Nhiệt độ nóng chảy: 2000C 2.3.2.Tính chất hóa học - Liên kết phân tử: liên kết cộng hóa trị Phản ứng thủy phân Cơ chế tác động: Ouabain glycosid tim có tác dụng cách ức chế / K + -ATPase bơm ion natri-kali Na + Khi ouabain liên kết với enzyme này, enzyme khơng cịn chức năng, dẫn đến gia tăng natri tế bào tăng natri tế bào làm giảm hoạt động trao đổi natri-canxi (NCX),do ion canxi khỏi tế bào ba sodium ion vào tế bào làm giảm gradient nồng độ Do đó, việc giảm gradient nồng độ natri vào tế bào xảy Na / K-ATPase bị ức chế làm giảm khả NCX hoạt động Điều nâng cao canxi tế bào Điều dẫn đến co bóp tim cao Sự thay đổi gradient ion ouabain ảnh hưởng đến điện áp màng tế bào dẫn đến rối loạn nhịp tim 2.3.3.Hoạt tính sinh học - Điều trị hạ huyết áp rối loạn nhịp tim liều lượng thấp Tăng lực co tim Có tác dụng nhanh, giải trừ nhanh, khơng tích lũy(hấp thu qua đường ống) Điều trị hạ huyết áp rối loạn nhịp tim liều lượng thấp (với liều lượng thấp: với liều tiêm tĩnh mạch 0,25 - 0,50mg, ngày lần; với liều uống 0,50mg ngày1 - lần)  mục đích y học : Ouabain có số mục đích y học liều nhỏ ouabain sử dụng để điều trị hạ huyết áp rối loạn nhịp tim Tại Pháp Đức, ouabain tĩnh mạch có thời gian lâu dài sử dụng điều trị suy tim, đau thắt ngực nhồi máu tim Gần đây, việc sử dụng ouabain biện pháp tránh thai nghiên cứu, cho thấy làm giảm nghiêm trọng khả vận động tinh trùng  ý: Các triệu chứng sử dụng liều xảy triệu chứng sau: co giật nhanh chóng cổ ngực bắp, suy hô hấp, tăng nhịp tim không đều, tăng huyết áp, co giật, thở khò khè, nhấp vào, thở hổn hển Cái chết tim ngừng đập 2.4 Phương pháp tách chiết GLYCOSID TIM – G-STROPHANTHIN (OUBAIN) từ Cây Sừng dê hoa vàng (Strophanthus divaricatus (Lour.) Hook 2.4.1.Giới thiệu chung Cây Sừng dê hoa vàng (Strophanthus divaricatus (Lour.) Hook thuộc chi Strophanthus, họ Trúc đào (Apocynaceae) Hiện Việt Nam có 4-5 lồi thuộc Chi Strophanthus DC Và lồi điều có tính dược liệu cao dùng làm thuốc, đáng lưu ý loài Sừng dê Cây phân bố rải Hinh 1.3 Cây sừng dê vàng rác tỉnh dọc theo bờ biển từ Quảng Ninh đến Kiên Giang Cây Sừng dê có thấy đảo lớn Cát Bà, Phú Quốc Cơn Ðảo Ngồi ra, số tỉnh nằm sâu đất liền Hải Dương (vùng Chí Linh), Hồ Bình thấy có Sừng dê Các tỉnh Nghệ An, Hà Tĩnh Quảng Bình có nhiều mọc tương đối tập trung Trên giới, Cây Sừng dê mọc tỉnh phía Nam Trung Quốc, Campuchia, Thái Lan, Malaysia Ấn Ðộ Hạt thu hái già, bỏ chịm lơng, phơi hay sấy khô Cây Sừng dê trồng chủ yếu hạt Hạt chín thu vào tháng - 10, gieo vào tháng -3, đến tháng - tháng - năm sau, đánh đem trồng Cây Sừng dê hoa vàng (Strophanthus divaricatus (Lour.) Hook Et Arn (có nhiều địa phương nước ta) bụi nhỏ, cao 2-3m hay Thân, cành mảnh, vươn dài vỏ màu nâu lục nhạt non, sau nâu đen có nhiều nốt sần nhỏ Lá mọc đối, hình mác thn, dài - 9cm, rộng 2,5-5cm, gốc thuôn, đầu nhọn, hai mặt nhẵn, mặt sẫm bóng, mặt nhạt Cuống dài 3-8mm Cụm hoa mọc đầu cành thành xim, 1-3 hoa màu vàng pha nâu đỏ Ðài hình chng, hẹp Tràng cánh, hình phễu, đầu cánh kéo dài thành hình sợi đặc sắc Nhị Bầu Quả gồm đại, chỗi ngang, nhẵn Hạt nhiều dẹt, màu nâu, có túm lơng dài đầu Toàn chứa nhựa mủ trắng Mùa hoa: tháng 5-7; mùa quả: tháng 10-11 Bộ phận dùng: Hạt nhựa - Semen et Latex Strophanthi Caudati 2.4.2 Phương pháp chiết xuất Cấu trúc hóa học Glycosid đa dạng nên tính chất phân cực phụ thuộc vào cấu trúc phần không đường (aglycon) nên phương pháp tách chiết chất thuộc nhóm Glycosid khơng có phương pháp chung Nhưng Glyosid có tính phân cực mạnh, nên không tan nước dung môi phân cực (eter dầu hỏa, hexan, benzene ) tan tốt dung mơi ancol, nước nóng, dietyl eter… Dựa vào tính chất Glycosid nói chung tách chiết - Loại bỏ tạp chất dung môi phân cực thu glycosid dung môi phân cực mạnh etannol, metannol, nước nóng, ancol… 2.4.3 Sơ đồ quy trình chiết tách II.4.4 Thuyết minh quy trình Ngun liệu tách chiết hạt hạt xay mịn Khử chất béo có nguyên liệu khí eter Sau khử chất béo xong ta tiến hành ngâm chiết với 10 ethanol 70% với tỷ lệ 10gram mẫu cần 10ml dung môi ethanol ngâm giờ, đồng thời ta tiến hành lắc hổm hợp 100 vòng phút (100v/p) Gạn lọc dịch chiết qua giấy lọc rửa nước dung dịch 2% axit 3,4-dinitrobenzoic 95% ethanol, ta thu dịch chiết tiến hành chiết lỏng rượu n-butyl ta thu dịch chiết tách dung môi phương pháp bay làm khan nước, kết ta thu glycosid Sau tách chiết xong tiến hành làm phản ứng định tính sắc ký lớp mỏng 2.4.5 Tiến hành phản ứng định tính a Phản ứng Liberman Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim 1ml anhydrid acetic, lắc cho tan hết cắn Nghiêng ống 450 Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng ống Ở mặt tiếp xúc hai lớp chất lỏng xuất vịng màu tím đỏ Lớp chất lỏng phía có màu hồng, lớp có màu xanh b Phản ứng Legal Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim 0,5ml ethanol 90% Lắc cho tan hết cắn Nhỏ giọt thuốc thử Natri nitroprussiat 0,5% giọt dung dịch NaOH 10% Lắc xuất màu đỏ cam c Phản ứng Keller-Kiliani Cho vào ống nghiệm chứa cắn glycosid tim 0,5ml ethanol 90% Lắc cho tan hết cắn Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha acid acetic Lắc Nghiêng ống 450 Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulphuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng ống Ở mặt tiếp xúc lớp chất lỏng xuất vịng màu tím đỏ Lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía có màu xanh 11 II.4.5 Mô tả Sắc ký lớp mỏng Dịch chấm sắc ký: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim giọt CHCl3 - EtOH (1 : 1), lắc nhẹ để hòa tan cắn dịch chấm sắc ký Lấy 1mg tinh thể Neriolin chuẩn hòa tan 0,5ml CHCl - EtOH (1 : 1), lắc nhẹ dung dịch Neriolin chuẩn để chấm sắc ký Bản mỏng sắc ký: Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 (Merck), hoạt hóa 1100C giờ, bảo quản bình hút ẩm để chấm sắc ký Dùng mao quản chấm riêng biệt dịch chấm sắc ký dung dịch Neriolin chuẩn lên mỏng silicagel kích thước x 10cm Hệ dung môi khai triển: CHCl3 - n-BuOH (9 : 0,5) Bình sắc ký bão hịa dung mơi khai triển Sau khai triển sắc ký, quan sát vết đèn tử ngoại bước sóng 254nm 366nm, sau phun thuốc thử vanilin 1%/ H2SO4 Kết quả: Sắc ký đồ dịch chiết cắn glycosid tim từ Trúc đào phải có vết tương ứng với vết Neriolin chuẩn với Rf = 0,75, có màu xanh đen bước sóng 254nm TÀI LIỆU THAM KHẢO Giáo trình Hợp chất thiên nhiên-TS.Nguyễn Văn Bời-ĐHCN.TPHCM 12 Giáo trình chuyên đề Hợp chất thiên nhiên – thầy Lê Văn Đăng –ĐHSP.TPHCM http://www.hopchatthiennhien.wordpress.com/ http://proteopedia.org/wiki/index.php/Ouabain http://www.strophantus.de/ Separate determination of the main groups of glycosids in preparations of strophanthus kombe G L Genkina and N K Abubakirov 13 ... tháng - 10, gieo vào tháng -3 , đến tháng - tháng - năm sau, đánh đem trồng Cây Sừng dê hoa vàng (Strophanthus divaricatus (Lour.) Hook Et Arn (có nhiều địa phương nước ta) bụi nhỏ, cao 2-3 m hay... Lá mọc đối, hình mác thuôn, dài - 9cm, rộng 2, 5-5 cm, gốc thuôn, đầu nhọn, hai mặt nhẵn, mặt sẫm bóng, mặt nhạt Cuống dài 3- 8mm Cụm hoa mọc đầu cành thành xim, 1 -3 hoa màu vàng pha nâu đỏ Ðài hình... trung: Hà Tĩnh, Nghệ An,… Thành phần hóa glicozit tim g-strophanthin (đồng nghĩa: ouabain), k -strophanthin e-strophanthin hàm lượng ouabain từ 3- 7%, thu chủ yếu từ hạt Hạt thu hái vào mùa đơng chín