TIỂU LUẬN MÔN CÁC HỢP CHẤT TỰ NHIÊN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ THỰC VẬT Nhóm chất alcaloid

nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khicó trong động vật, thường có dược lực tính mạnh và cho những phản ứng hóa họcvới một số thuốc thử

Bộ Giáo Dục Và Đào Tạo Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội Viện Công Nghệ Sinh Học Và Thực Phẩm

TIỂU LUẬN MÔN CÁC HỢP CHẤT TỰ NHIÊN

Tháng 4 năm 2014

MỤC LỤC

Trang

1.1 Tổng quan về alcaloid……… 1

1.1.1 Khái niệm……… 1

1.1.2 Danh pháp……… 3

1.1.3 Phân loại……… 4

1.1.4 Phân bố trong thiên nhiên……… 7

1.1.5 Sự tạo thành alcaloid trong cây……… 9

1.1.6 Tính chất của alcaloid 9

1.2 Chiết xuất, tinh chế và phân lập alcaloid……… 11

1.2.1 Chiết xuất 11

1.2.2 Tinh chế và phân lập 13

1.2.3 Định tính alcaloid 15

1.2.4 Định lượng alcaloid……… 16

1.2.5 Thuốc thử alcaloid 18

1.2.6 Quy trình chiết xuất quinin từ vỏ canhkina……… 19

1.3 Hoạt tính sinh học của các alcaloid và ứng dụng trong y dược và thực phẩm chức năng……… 22

1.3.1 Đối với sinh vật 22

1.3.2 Đối với con người 22

1.3.3 Đối với y dược 22

1.3.4 Thuốc diệt côn trùng……… 31

1.3.5 Thực phẩm chức năng……… 32

ALCALOID 1.1 Tổng quan về alcaloid

1.1.1 Khái niệm

Đã từ lâu các nhà khoa học tìm thấy trong cây các hợp chất tự nhiên, nhữnghợp chất này thường là những acid hoặc những chất trung tính Đến năm 1806 mộtdược sĩ là Friedrich Wilhelm Sertüner phân lập được một chất từ nhựa thuốc phiệncó tính kiềm và gây ngủ mạnh đã đặt tên là “Cinchonino”, sau đó chiết được chấtkết tinh từ vỏ cây Canhkina và đặt tên là “Cinchonino”, sau đó P.J Pelletier vàJ.B.Caventou lại chiết được hai chất có tính kềm từ một loài Strychnos đặt tên làstrychnin và brucin Đến năm 1819 một dược sĩ là Wilhelm Meissner đề nghị xếpcác chất có tính kiềm lấy từ thực vật ra thành một nhóm riêng và ông đề nghị gọitên là alcaloid do đó người ta ghi nhận Meissener là người đầu tiên đưa ra khái niệm

về alcaloid và có định nghĩa: Alcaloid là những hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, cóphản ứng kiềm và lấy từ thực vật ra

Sau này người ta đã tìm thấy alcaloid không những có trong thực vật mà còncó trong động vật như: Samandarin, samanin lấy từ tuyến da con Salamandramaculosa và S altra

Bufotenin, serotonin, bufotenidin, dehydrobufotenin là những chất độc lấy từcác loài cóc Bufo, batrachotoxin trong tuyến da loài ếch độc Phyllobates aurotaenia

Ngoài tính kiềm, alcaloid còn có những đặc tính khác như có hoạt tính sinhhọc mạnh, có tác dụng với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alcaloid…Sau này Pôlônôpski đã định nghĩa: “Alcaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa

nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khicó trong động vật, thường có dược lực tính mạnh và cho những phản ứng hóa họcvới một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alcaloid”.

Tuy nhiên cũng có một số chất được xếp vào nhóm alcaloid nhưng nitơkhông có dị vòng mà ở mạch nhánh như: Ephedrin trong ma hoàng (Ephedra sinicaStaf.), capsaisin trong ớt (Capsicum annuum L.), hordenin trong mầm mạch nha(Hordenum sativum Jess.), colchicin trong hạt cây tỏi độc (Colchicum autumnaleL.); một số alcaloid không có phản ứng với kiềm như colchicin lấy từ hạt tỏi độc,ricinin lấy từ hạt thầu dầu (Ricinus communis L.), theobromin trong hạt cây cacao(Theobroma cacao L.) và có alcaloid có phản ứng acid yếu như arecaidin vàguvacin trong hạt cau (Areca catechu L.)

- Alcaloid là những hợp chất có chứa dị vòng nitơ, có tính bazơ, thường gặptrong nhiều loại thực vật, đôi khi còn tìm thấy trong một vài động vật Ngoài hợpchất dị vòng, người ta còn thấy một số ít alcaloid có nguyên tử nitơ nằm ở ngoàivòng (như colchixin, hordenin…)

- Alcaloid có tính chất hoạt động sinh lý cao đối với cơ thể người và độngvật, nhất là đối với hệ thần kinh.Với một lượng nhỏ có thể là loại thuốc đặc hiệu,nhưng lượng tương đối lớn nó là chất độc gây chết người

1.1.2 Danh pháp

Các alcaloid thường có cấu tạo phức tạp nên người ta không gọi tên theodanh pháp khoa học mà thường gọi chúng theo một tên riêng Tên của alcaloid luônluôn có đuôi in và xuất phát từ:

- Tên chi hoặc tên loài của cây + in Ví dụ: Papaverin từ Papaversomniferum; palmatin từ Jatrorrhiza palmata; cocain từ Erythroxylum coca

- Đôi khi dựa vào tác dụng của alcaloid đó Ví dụ như Emetin do từ εμεtos cónghĩa là gây nôn, morphine do từ morpheus

- Có thể từ tên người + in Ví dụ như: Pelletierin do tên Pelletier Nicotin dotên J Nicot Những alcaloid phụ tìm ra sau thường được gọi tên bằng cách thêmtiếp đầu ngữ hoặc biến đổi vĩ ngữ của alcaloid chính (biến đổi in thành – indin, -anin, - alin…)

- Tiếp đầu ngữ nor diễn tả một chất mất một nhóm methyl Ví dụ: Ephedrin(C10H15ON), norephedrin (C19H13ON)

Các đồng phân thường có tiếp đầu ngữ: Pseodo, iso, epi, allo, neo…

1.1.3 Phân loại

Về cấu tạo, alcaloid có đến 250 dạng cấu trúc khác nhau với gần 6000 chất tựnhiên (> 5500).Vì vậy, người ta phân loại dựa vào cấu trúc của alcaloid thành gần

20 nhóm, nhưng ngày nay, người ta còn đề nghị chia thành các nhóm nhỏ hơn

Các alcaloid có trong cùng một cây hoặc cùng một họ thực vật thường có cấutrúc gần giống nhau

Các alcaloid trong cây thường kết hợp với axit (như axit oxalic, tactric,lactic…) để tạo muối

Thành phần các alcaloid trong cây phụ thuộc nhiều vào khí hậu, mùa trongnăm

Để phân loại các alcaloid người ta dựa vào vị trí của N hay dựa vào số hóa trịcủa N trong phân tử của alcaloid Ví dụ:

- Các alcaloid có N ở mạch nhánh, không có N ở trong nhân như capsaicintrong quả ớt, ephedrin trong ma hoàng

- Các alcaloid có N trong nhân dị vòng như nicotin trong thuốc lá, morphintrong thuốc phiện

Tùy theo bản chất của các vòng chứa nitơ mà người ta chia ra các nhómalcaloid dị vòng khác nhau như:

1.1.3.1 Các alcaloid là dẫn xuất của vòng pyridin hay piperidin (nicotin trong

thuốc lá, arecolin trong hạt cau, hồ tiêu)

Cây cau Arecolin

1.1.3.2 Các alcaloid là dẫn xuất của tropan

- Atropin và scopolamin trong cà độc dược

- Cocain trong lá coca

Cây canhkina

1.1.3.4 Các alcaloid là dẫn xuất của isoquinolin như tetrahydropalmatin trong củ

bình vôi; berberin trong hoàng liên gai; morphin trong nhựa thuốc phiện; nuciferintrong lá sen

Cây thuốc phiện

1.1.3.5 Các alcaloid là dẫn xuất của indol: strychnin trong hạt mã tiền; reserpin

trong rễ ba gạc; vinblastin; vincristin trong lá dừa cạn

Cây và hạt mã tiền Strychnin

1.1.3.6 Các alcaloid là dẫn xuất của purin: caphein, theobromin trong chè.

1.1.3.7 Các alcaloid có các dị vòng khác

- - dichoroin (lá thuồng sơn)

- Có nhân quinazolin solanidin (trong mầm khoai tây)

- Có nhân steroid, aconitin (trong ô đầu)

- Có nhân cấu trúc terpenoid

1.1.4 Phân bố trong thiên nhiên

1.1.4.1 Alcaloid có phổ biến trong thực vật

Ngày nay đã biết khoảng trên 6000 alcaloid từ hơn 5000 loài, hầu hết ở thựcvật bậc cao chiếm khoảng 15-20% tổng số các loài cây, tập trung ở một số họ:Apocynaceae (họ Trúc đào) có gần 800 alcaloid, Papaveraceae (họ Thuốc phiện)gần 400 alcaloid, Fabaceae (họ Đậu) 350 alcaloid, Rutaceae (họ Cam) gần 300alcaloid, Liliaceae (họ Hành) gần 250 alcaloid, Solanaceae (họ Cà) gần 200alcaloid, Amaryllidaceae (họ Thủy tiên) 178 alcaloid, Menispermaceae (họ Tiết dê)

172 alcaloid, Rubiacea (họ Cà phê) 156 alcaloid, Loganiaceae (họ Mã tiền) 150alcaloid, Buxaceae (họ Hoàng dương) 131 alcaloid, Asteraceae (họ Cúc) 130alcaloid, Euphorbiaceae (họ Thầu dầu) 120 alcaloid…

Có những họ có tới trên 50% loài cây chứa alcaloid như Ranuculaceae,Berberidaceae, Papaveraeae, Buxaceae, Cactaceae

Ở nấm có alcaloid trong nấm cựa khỏa mạch (Claviceps purpurea), nấmAmanita phalloides

Ở động vật, cũng đã tìm thấy alcaloid ngày càng tăng, alcaloid samandarin,samandaridin, samanin có trong tuyến da của loài kỳ nhông Salamandra maculosa

và Salamandra altra Bufotenin, bufotenidin, dehydrobufotenin lấy từ nhựa cóc(Bufo bufo gargorizans, B bufo asiaticus, B melansiticus… - Bufobudae).Batrachotoxin có trong tuyến da của loài ếch độc (Phyllobates aurotaenia)

1.1.4.2 Trong cây, alcaloid thường tập trung ở một số bộ phận nhất định Ví dụ:

Alcaloid tập trung ở hạt như Mã tiền, Cà phê, Tỏi độc… ở quả như Ớt, Hồ tiêu,Thuốc phiện; ở lá như benladin, Coca, Thuốc lá, Chè…; ở hoa như Cà độc dược…;

ở thân như Ma hoàng; ở vỏ như Canhkina, Mức hoa trắng, Hoàng bá; ở rễ như Bagạc, Lựu, ở củ như Ô đầu, Bình vôi; Bách bộ…

1.1.4.3 Rất ít trường hợp trong cây chỉ có một alcaloid duy nhất mà thường có hỗn hợp nhiều alcaloid, trong đó alcaloid có hàm lượng cao được gọi là alcaloid chính,

còn những alcaloid khác hàm lượng thấp hơn thường gọi là alcaloid phụ Nhữngalcaloid trong cùng một cây thường có cấu tạo tương tự nhau nghĩa là chúng có mộtnhân cơ bản chung Ví dụ: Isopelletierin và metyisopelletierin trong vỏ rễ Lựu đềucó nhân piperidin; các chất tropin, hyoscyamin, atropin trong lá Benladon đều cónhân tropan

Các alcaloid ở trong những cây cùng một họ thực vật cũng thường có cấu tạorất gần nhau Ví dụ: Alcaloid trong một số cây họ Cà như Atropa belladonna L.,Hyoscyamus niger L.; Datura metel L., Datura stramonium L., Datura tatula L đềucó chung nhân tropan Nhưng cũng có những cây trong cùng một họ thực vật màchứa những alcaloid hoàn toàn khác nhau về cấu trúc hóa học Ví dụ: Một số câytrong họ Cà phê (Rubiaceae) như cây Cà phê có cafein (nhân purin), cây Ipeca cóemetin (nhân isoquinolin), cây Canhkina có quinin (nhân quinolin)

Cũng có alcaloid có thể gặp ở nhiều cây thuộc những họ khác nhau như ephedrin cótrong Ma hoàng (họ Ma hoàng – Ephedraceae), trong cây Thanh tùng (họ Kim giao– Taxaceae), trong cây Ké đồng tiền (họ Bông – Malvaceae) Becberin có trong câyHoàng liên (họ Hoàng liên – Ranunculaceae), cũng có trong cây Hoàng bá (họ Cam– Rutaceae), có trong cây Vàng đắng (họ Tiết dê – Menispermaceae)…

1.1.4.4 Hàm lượng alcaloid trong cây thường rất thấp, trừ một số trường hợp như

cây Canhkina hàm lượng alcaloid đạt 6-10 %, trong nhựa thuốc phiện (20-30%).Một số dược liệu chưa 1-3% alcaloid đã được coi là hàm lượng khá cao

Hàm lượng alcaloid trong cây phụ thuộc vào nhiều yếu tố như khí hậu, ánhsáng, chất đất, phân bón, giống cây, bộ phận thu hái và thời kỳ thu hái Vì vậy đốivới mỗi dược liệu cần nghiên cứu cách trồng trọt, thu hái và bảo quản để có hàmlượng hoạt chất cao

1.1.4.5 Trong cây, alcaloid ít khi ở trạng thái tự do (alcaloid base), mà thường ở

dạng muối của các acid hữu cơ như citrat, tactrat, oxalat, acetat… (đôi khi có ởdạng muối của acid vô cơ) tan trong dịch tế bào, ở một số cây alcaloid kết hợp vớitanin hoặc kết hợp với acid đặc biệt của chính cây đó như acid meconic trong Thuốcphiện, acid tropic trong một số cây họ Cà, acid aconitic có trong cây Ô đầu… Cómột số ít trường hợp alcaloid kết hợp với đường tạo ra dạng glycoalcaloid nhưsolasonin và solamacgin trong cây Cà lá xẻ (Solanum laciniatum)

1.1.5 Sự tạo thành alcaloid trong cây

Trước đây người ta cho rằng nhân cơ bản của các alcaloid là do các chấtđường hay thuộc chất của đường kết hợp với amoniac để có nitơ mà sinh ra Ngàynay bằng phương pháp dùng các nguyên tử đánh dấu (đồng vị phóng xạ) người ta đãchứng minh được alcaloid tạo ra từ các acid amin

Vì C14 và N15 có tính phóng xạ, tia β phát ra có thể trực tiếp tác dụng lênnhũ dịch thuốc ảnh nên có thể chụp X quang hoặc đo bằng máy đo phóng xạ Người

ta đã dùng acid amin có C14 và N15, những acid amin này được giả thiết là tiềnchất của alcaloid đưa vào môi trường nuôi cấy hoặc có thể tiêm vào thân cây hayrắc lên bề mặt của lá Alcaloid tạo ra trong cây được chiết xuất và phân lập, người tathấy alcaloid này có tính phóng xạ Làm phản ứng phân hủy để tìm xem phần nàocủa alcaloid có nguyên tử phóng xạ Qua làm thực nghiệm đã chứng minh đượcnguyên tử nitơ và hầu như mọi trường hợp các nguyên tử carbon của acid amin đềunằm trong cấu trúc nhân cơ bản của alcaloid Ngoài ra, trong cấu trúc alcaloid còncó những hợp chất khác như gốc acetat, hemi hoặc monotecpen tham gia vào.Những công trình nghiên cứu về sinh tổng hợp các alcaloid đi từ tiền chất là cácamin rất phong phú

Qua định tính và định lượng trong các bộ phận khác nhau của cây và theo dõi

sự thay đổi của chúng trong quá trình phát triển của cây người ta thấy nơi tạo raalcaloid không phải luôn luôn là nơi tích tụ alcaloid Nhiều alcaloid được tạo ra ở rễlại vận chuyển lên phần trên mặt đất của cây, sau khi thực hiện những biến đổi thứcấp chúng được tích lũy ở lá, quả hoặc hạt Người ta đã chứng minh alcaloid chínhtrong cây Beladon là L – hyoscyamin được tạo ra ở rễ, sau đó chuyển lên phần trênmặt đất Khi cây một tuổi, thân cây chứa nhiều alcaloid hơn lá, khi cây 2 tuổi thâncây hóa gỗ nhiều hơn, hàm lượng alcaloid giảm xuống, hàm lượng alcaloid ở phầnngọn đạt được mức tối đa vào lúc cây ra hoa và giảm đi khi quả chín

1.1.6 Tính chất của alcaloid

1.1.6.1 Trạng thái

- Các alcaloid có chứa oxi thường ở trạng thái rắn

- Các alcaloid không chứa oxi thường tồn tạo ở trạng thái lỏng.

1.1.6.2 Tính tan

- Hầu hết alcaloid không tan trong nước (trừ một số ít như nicotin, conintan được trong nước), nhưng tan trong dung môi hữu cơ như ete, CHCl3, các ancol

thấp (metanol, etanol, propanol, butanol).

- Một số alcaloid có nhóm phân cực nên tan một phần trong nước hay kiềmloãng (như morphin, cephalin có OH phenol) Ngược lại với các bazơ (alcaloid), cácmuối của alcaloid nói chung tan được trong nước và hầu như không tan trong dungmôi hữu cơ (CHCl3, ete…)

- Một số hợp chất alcaloid (có hợp chất ngoại lệ) như Ephindrin, colchixincác bazơ của chúng tan được trong nước đồng thời cũng khá tan trong dung môihữu cơ và các muối của chúng thì ngược lại

1.1.6.3 Tính bazơ

Alcaloid do có mặt nitơ nên có tính bazơ, nhưng lực bazơ của chúng khônggiống nhau, tuỳ thuộc bản chất của các nhóm thế và các nhóm chức trong phân tử

- Hầu hết có tính bazơ mạnh do đó làm xanh quỳ tím

- Tạo muối với axit

- Một số tạo tủa Al(OH)3, Fe(OH)3 trong dung dịch của muối kim loại này

Do tính bazơ khác nhau, nên ở môi trường axit yếu, một số bazơ mạnh có thểchuyển thành muối, nhưng bazơ yếu thì một số alcaloid tồn tại trong dung dịch dướidạng bazơ (không tác dụng với axit yếu)

Dựa vào đặc tính này, người ta áp dụng để tách các nhóm alcaloid có pKakhác nhau ra khỏi hỗn hợp của chúng

Việc chiết xuất alcaloid dựa vào tính chất chung sau:

- Alcaloid nói chung là những base yếu, thường tồn tại trong cây dưới dạngmuối của acid hữu cơ hoặc vô cơ, đôi khi ở dạng kết hợp với tanin; nên phải tán nhỏdược liệu để dễ thấm với dịch chiết và giải phóng alcaloid khỏi muối của nó bằngnhững kiềm trung bình hoặc kiềm mạnh

- Hầu hết các alcaloid base không tan trong nước nhưng lại dễ tan trong dungmôi hữu cơ ít phân cực (hydrocacbon thơm, chloroform, ether) Trái lại, các muốialcaloid thường tan trong nước, cồn và không tan trong các dung môi ít phân cực.Mặt khác còn tùy theo tính chất của alcaloid như loại bay hơi hoặc không bay hơi

mà dùng phương pháp chiết xuất cho thích hợp

* Đối với những alcaloid bay hơi được như coniin (trong cây Coniummaculatum), nicotin (trong cây thuốc lá), spactein (trong cây Cytisus scoparius)…có thể cất kéo được bằng hơi nước thì sau khi sấy khô dược liệu, tán nhỏ, cho kiềmvào để đẩy alcaloid dạng muối ra dạng base rồi lấy alcaloid ra khỏi dược liệu theophương pháp cất kéo bằng hơi nước, người ta thường hứng dịch cất được vào trongdung dịch acid và từ đó thu được muối alcaloid

* Đối với những alcaloid không bay hơi người ta sử dụng những phươngpháp sau:

1.2.1.1 Chiết xuất bằng dung môi hữu cơ ở môi trường kiềm

- Tán nhỏ dược liệu rồi tẩm bột dược liệu với dung dịch kiềm trong nước.Thường dùng amoni hydroxyt, cũng có thể dùng cacbonat kiềm nhưng chỉ thích hợpvới alcaloid có tính base mạnh Vôi, NaOH chỉ dùng khi cần thiết để đấy các basemạnh, đặc biệt đối với những alcaloid tồn tại trong cây ở dạng kết hợp với tanin;hoặc dùng để biến các alcaloid có nhóm chức phenol thành phenat tran trong nước,không tan trong các dung môi hữu cơ Người ta sử dụng tính chất này để lấy riêngmorphin trong phương pháp định lượng morphin ở nhựa thuốc phiện

- Chiết bột dược liệu sau khi đã kiềm hóa như trên bằng dung môi hữu cơkhông phân cực thích hợp, dung môi này hòa tan các alcaloid base vừa được giảiphóng Ở phòng thí nghiệm thường dùng benzen, choloroform, ether + chloroform.Trong sản xuất công nghiệp người ta phải chú ý dùng dung môi rẻ tiền, ít độc, khócháy Có thể chiết nguội trong bình ngấm kiệt hoặc chiết nóng trong các dụng cụSoxhlet hoặc Kumagava

- Cất thu hồi dung môi hữu cơ dưới áp lực giảm rồi lắc dịch chiết cô đặc vớidung dịch acid loãng (2-5%), (thường dùng acid hydrocloric, acid sulfuric, đôi khidùng acid acetic hoặc acid focmic) Các alcaloid được chuyển sang dạng muối tantrong nước; còn mỡ, sắc tố, sterol… ở lại dung môi hữu cơ Trong phòng thí nghiệmngười ta lắc trong bình gạn, trong công nghiệp phải có thiết bị thích hợp

- Gộp các dịch chiết muối alcaloid lại rồi kiềm hóa để chuyển alcaloid sangdạng base, lắc với dung môi hữu cơ thích hợp nhiều lần để lấy kiệt alcaloid base.Việc chiết bằng dung môi hữu cơ có thể dùng bình gạn hoặc các dụng cụ chiết chấtlỏng theo kiểu bình ngấm kiệt

- Sau khi lấy riêng lớp dung môi hữu cơ chứa alcalod base người ta thườngloại nước bằng muối trung tính khan nước (Na2SO4 khan) rồi cất thu hồi dung môihoặc bốc hơi dung môi sẽ thu được cắn alcaloid thô.

1.2.1.2 Chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nước

- Thẩm ẩm bột dược liệu bằng dung môi chiết xuất Các alcaloid trong dượcliệu sẽ chuyển sang dạng muối và tan trong dung môi trên

- Cất thu hồi dung môi hoặc bốc hơi dung môi dưới áp lực giảm, dùng etherrửa dịch chiết đậm đặc còn lại Ở môi trường acid, ether thường hòa tan một số tạpchất chứ không hòa tan các alcaloid

- Sau khi tách lớp ether, kiềm hóa dung dịch nước rồi lấy alcaloid base đượcgiải phóng ra bằng một dung môi hữu cơ thích hợp, (dung môi này phải không trộnlẫn với dung dịch nước) thường dùng chloroform, ether, benzen… Cất thu hồi dungmôi hữu cơ rồi bốc hơi tới khô sẽ thu được cặn alcaloid thô

Phương pháp này còn gọi là phương pháp STAS – OTTO

1.2.1.3 Chiết bằng cồn

Có một số alcaloid trong dược liệu tồn tại dưới dạng muối tan tốt trong cồn ởmôi trường trung tính do đó sau khi tán nhỏ dược liệu ở kích thước thích hợp đemthấm ẩm và chiết bằng cồn etylic cho tới kiệt alcaloid Quá trình tiếp theo được thựchiện tương tự như ở trên

Trong quá trình chiết xuất người ta dùng thuốc thử tạo tủa để kiểm tra xemcác alcaloid đã lấy kiệt chưa

Các phương pháp chung đã nêu ở trên có kết quả tốt đối với phần lớn cácalcaloid trong dược liệu, nhưng có một số alcaloid ở dạng base lại tan nhiều trongnước (ephedrin, colchicin…) hoặc ở dạng muối ít tan trong nước (becberin nitrat…)tan trong dung môi hữu cơ (reserpin hydroclorid tan trong chloroform) thì người taphải có cách riêng cho thích hợp

Nếu là hỗn hợp nhiều alcaloid, để tinh chế và phân lập riêng từng alcaloidtrước đây thường dùng phương pháp kết tinh phân đoạn bằng các dung môi, ngàynay người ta sử dụng thêm một số phương pháp khác: Phương pháp trao đổi ion,phương pháp sắc ký cột, sắc ký lớp điều chế…

1.2.2.1 Phương pháp trao đổi ion

Phương pháp trao đổi ion dựa vào sự trao đổi thuận nghịch giữa các iontrong dung dịch muối alcaloid và các ion đã bị hấp phụ trên chất mang (nhựa traođổi ion)

Các nhựa trao đổi ion (ionit) được dùng là các cationit (= những cao phân tửrắn mang nhóm acid có khả năng hấp phụ các cation) và các anionit (= những caophân tử rắn mang nhóm base có khả năng hấp phụ các anion) Các nhựa trao đổi ionnày không tan trong nước và các dung môi hữu cơ

Muối alcaloid hòa tan trong nước tạo ra các cation lớn:

b Nếu sử dụng anionit

Ani+OH- + [BH]+Cl- ↔ Ani+Cl- + B + H2OKhi cho dung dịch muối alcaloid qua cột anionit ở dạng OH- các gốc acidđược trao đổi với OH-, alcaloid được giải phóng dạng base và sau đó được chiết rabằng dung môi hữu cơ hoặc hỗn hợp dung môi thích hợp

Các alcaloid trong hỗn hợp thường có độ kiềm khác nhau, do đó khi cho quacột trao đổi ion có sự hấp phụ khác nhau và trong lớp ionit xảy ra sự trao đổi képnối tiếp nhau, chất có độ kiềm lớn bị giữ lại ở trên, còn những chất có độ kiềm nhỏchuyển sâu vào cột ionit do đó người ta có thể lấy tách riêng các alcaloid ra

1.2.2.2 Phương pháp sắc ký cột

Dựa trên nguyên tắc các thành phần trong hỗn hợp alcaloid có độ hấp phụkhác nhau trên chất hấp phụ đã nạp trong cột, bột cellulose… khi cho dịch chiếtalcaloid qua cột, các alcaloid sẽ phân bố lần lượt trong cột, ở phần trên của cột sẽtập trung chất bị hấp phụ mạnh nhất, còn ở phần dưới của cột tập trung chất hấp phụkém nhất Tuy nhiên các miền chưa được phân chia thành ranh giới rõ rệt, nghĩa làchưa phân chia rõ rệt các chất trong cột Do đó để tách hoàn toàn các alcaloid có

trong cột người ta phải dùng một dung môi hay một hệ dung môi chạy qua cột đểrửa dải các alcaloid đã hấp phụ trong cột.

1.2.2.3 Sắc ký lớp điều chế

Dựa theo nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng, dịch chiết đậm đặc alcaloid đượcchấm lên những tấm kính đã tráng chất hấp hấp phụ tương đối dày thành một đườngthẳng Sau khi khai triển bằng một hệ dung môi thích hợp, các chất khác nhau cótốc độ di chuyển khác nhau nên được tách ra một cách dễ dàng dưới ánh sáng tửngoại người ta thường dùng chất hấp phụ có trộn thêm chất phát quang Ví dụ nhưsilicagen GF254, silicagen GF254+366, oxid nhôm GF254+366 của hãng MERCK (CHLBĐức) Nếu chất hấp phụ không có chất phát quang thì người ta dùng tấm kính khácphủ lên tấm sắc ký, trên cơ sở ấy đánh dấu từng dải đã chứa alcaloid Sau đó cạo lấyriêng từng phần chất hấp phụ có chứa các alcaloid riêng biệt, rồi chiết riêng lấy từngchất bằng dung môi thích hợp Sau khi bốc hơi dung môi sẽ thu được từng alacloidriêng biệt

1.2.3 Định tính alcaloid

1.2.3.1 Định tính trên tiêu bản thực vật

Muốn xác định xem trên tiêu bản thực vật có alcaloid hay không và có ở vịtrí nào người ta thường dùng thuốc thử Bouchardat Vì protit cũng có thể cho kếttủa với thuốc thử này do đó để kết luận chắc chắn người ta thường làm hai tiêu bản,một tiêu bản ngay sau khi mới cắt, nhỏ một giọt thuốc thử Bouchardat, đợi một lúcrồi quan sát dưới kính hiển vi sẽ thấy kết tủa màu nâu Tiêu bản thứ hai đem ngâmvào rượu tactric, sau đó rửa sạch rượu tactric, đặt lên phiến kính rồi nhỏ một giọtthuốc thử Bouchardat, để một lúc đem quan sát dưới kính hiên vi Nếu tế bào chứaalcaloid thì alcaloid đã hòa tan trong rượu và trên vi phẫu không quan sát thấy tủanâu Trái lại, nếu vẫn thấy tủa thì phải nghĩ tới tủa protit

Có thể dùng những phản ứng đặc hiệu để xác định alcaloid nhưng thườngcác thuốc thử có độ acid cao dễ phá hủy tế bào làm cho việc xác định vị trí alcaloidkhó khăn

1.2.3.2 Định tính trong dược liệu và trong các chế phẩm

Muốn định tính ta phải chiết alcaloid và loại những chất kèm theo gây trởngại cho các phản ứng Sau đó làm phản ứng tạo tủa để xác định xem có alcaloidhay không Muốn xác định xem đó là alcaloid gì thì phải làm phản ứng tạo màu đặchiệu, ngày nay thường kết hợp với phương pháp sắc ký nhất là sắc ký lớp mỏng cóalcaloid tinh khiết làm chất chuẩn so sánh

Trong sắc ký lớp mỏng có thể dùng chất hấp phụ là silicagen nhôm oxid, bôtcellucose… Tùy theo cấu tạo alcaloid mà người ta chọn hệ dung môi khai triển cho

thích hợp Một vài hệ dung môi hay dùng như CHCl3:MeOH:NH4OH [50:9:1], Butanol : acid acetic : nước [4:1:5], cyclohexan:chloroform:diethylamin [5:4:1],chloroform:methanol [4:1]… Thuốc thử phun hiện màu hay dùng nhất là thuốc thửDragendorff (cho vết da cam, hoặc đỏ nâu Ngoài ra, có thể dùng các thuốc thử đểphun hiện màu khác như iodo – iodid, iodoplatinat, antimon (III) clorid Tùy theocấu tạo alcaloid có thể dùng những thuốc thử phun hiện màu riêng Đối với cácalcaloid của ba gạc có thể phát hiện bằng hỗn hợp acid percloric và FeCl3; alcaloid

n-vỏ canhkina có thể phát hiện bằng acid focmic (vết có huỳnh quang xanh đậm dướiánh sáng tử ngoại), các alcaloid là dẫn chất phenylalkylamin được hiện màu bằngthuốc thử ninhydrin, alcaloid có nhân indol có thể phun hiện màu bằng hỗn hợpthuốc thử andehyd cinnamic và HCl Thuốc thử Van – Urk dùng phun hiện màualcaloid cuả cựa khỏa mạch Các alcaloid có nhân purin có thể phun hiện màu bằngdung dịch iod và acid H2SO4

1.2.4 Định lượng alcaloid

Người ta có thể định lượng toàn bộ alcaloid hay chỉ một vài alcaloid là hoạtchất trong một dược liệu Có nhiều phương pháp định lượng như phương pháp cân,phương pháp đo acid, phương pháp so màu, phương pháp đo bằng quang phổ tửngoại, phương pháp cực phổ, phương pháp sinh vật…

Nói chung các phương pháp đều gồm hai giai đoạn chính:

+ Lấy riêng alcaloid ra khỏi dược liệu: Có thể tiến hành theo nhiều cách khácnhau nhưng việc chiết xuất phải có tính chất định lượng và phải bảo đảm ở từng giaiđoạn là hoàn toàn xong

+ Định lượng: Tùy theo tính chất của alcaloid mà lựa chọn phương pháp chothích hợp

Sau đây giới thiệu một vài phương pháp hay dùng:

1.2.4.1 Phương pháp cân

Để định lượng alcaloid bằng phương pháp cân, cần phải chiết được alcaloidtinh khiết nghĩa là loại được hoàn toàn những tạp chất kèm theo Do đó phươngpháp này tương đối lâu và người ta chỉ sử dụng khi không sử dụng được nhưngphương pháp định lượng khác

Phạm vi sử dụng của nó là những alcaloid có tính base rất yếu, vì nhữngalcaloid này không chuẩn độ được bằng phương pháp acid – base, do hằng số điện

ly quá bé sẽ không có bước nhảy trên đường cong chuẩn độ nên không quan sátđược sự chuyển màu rõ rệt của chỉ thị Ví dụ như colchicin trong hạt tỏi độc,alcaloid có nhân purin như cafein trong lá chè, hạt cà phê… Ngoài ra, phương pháp

cân còn được dùng trong trường hợp định lượng những alcalodi chưa xác định rõcấu trúc hóa học hoặc hỗn hợp nhiều alcaloid có phân tử lượng rất khác nhau.

Khi định lượng, người ta phải chiết được alcaloid tinh khiết bằng một dungmôi thích hợp, đem bốc hơi dung môi, sấy cặn tới khối lượng không đổi rồi đemcân

Nếu hàm lượng alcaloid trong dược liệu rất thấp thì định lượng bằng phương phápcân trực tiếp khó chính xác, do đó có thể tạo ra các dẫn chất có khối lượng phân tửlớn bằng cách cho acid photphovonfranic, acid picrolonic… Một hệ số được xácđịnh bằng phương pháp thực nghiệm đối với mỗi alcaloid nguyên chất cho phéptính ra hàm lượng alcloid base trong dược liệu Ví dụ: Bertrand đã định lượngcafein, nicotin… bằng cách tạo tủa với acid silicovonfranic Tủa đã tạo ra tương ứngvới công thức 12WO3.SiO2.2H2O.X.M.alc; rửa sạch tủa, sấy khô rồi cân; sau đemnung tủa thành tro chỉ còn lại hỗn hợp WO3.SiO2 rồi đem cân Căn cứ vào đó tínhđược hệ số x=4 Bertrand đã lập thành công thức của tủa để tính là12WO3.SiO2.2H2O.4.M.alc

1.2.4.2 Phương pháp trung hòa

Mặc dù alcaloid chiết xuất ra đã được tinh chế nhưng định lượng bằngphương pháp cân thường có sai số thừa vì các tạp chất còn bị lôi cuốn theo lẫn vớicặn alcaloid

Do đó định lượng alcaloid bằng phương pháp trung hòa được dùng nhiềuhơn, nhất là những alcaloid họ Cà

Muốn định lượng bằng phương pháp này thì alcaloid phải chiết ra ở dạngbazơ Dung dịch alcaloid base phải trong, vì có vẫn đục hay lẫn phần nhỏ nhũ dịch

sẽ gây ra hiện tượng hấp phụ các chất kiềm làm cho kết quả định lượng sai số thừa.Ngoài ra, nếu có lẫn các chất kiềm như amoniac, các amin cũng như chất béo vàchất màu sẽ ảnh hưởng tới kết quả khi định lượng bằng phương pháp trung hòa códùng chỉ thị màu Nếu có amoniac và các amin sẽ gây sai số thừa, còn nếu lẫn chấtmàu và chất béo sẽ làm cho khi chuẩn độ khó quan sát vùng chuyển màu của chỉ thị

Để loại amoniac và amin người ta lợi dụng tính dễ bay hơi của nó Sau khi bốc hơidung môi, cặn còn lại cho thêm vài ml ether hoặc ethanol, rồi cho bốc hơi hết (nếucần thu hồi dung môi thì mỗi lẫn cất cần chú ý khi lấy bình ra không để hơi dungmôi đọng ở trên rơi xuống)

Chất béo nói chung được loại trong quá trình chuyển alcaloid từ dung môinày sang dung môi khác hoặc có thể dùng các chất hấp phụ màu

Sau khi đã có dịch chiết alcaloid base có thể tiến hành định lượng bằng cáchhoặc lắc alcaloid trong dung môi hữu cơ với lượng acid chuẩn độ dư, sau đó định

lượng acid thừa bằng kiềm tương ứng, hoặc làm bốc hơi dung môi hữu cơ, cặnalcaloid còn lại được định lượng trực tiếp hay gián tiếp bằng acid chuẩn độ.

Người ta thường dùng HCl hoặc H2SO4 có nồng độ 0,01 - 0,1N để chuẩn độ,chỉ thị màu dùng trong định lượng alcaloid phần lớn là methyl đỏ Vì theo lý thuyếtcũng như thực tế pH của hầu hết các muối alcaloid đều có vùng chuyển màu của chỉthị này (pH 4,2 – 6,3)

Vài alcaloid (ví dụ như hydrastin, narcotin, alcaloid của vỏ lựu…) có điểmtương đương trên đường cong chuẩn độ ở khoảng pH 4, trong trường hợp này người

ta dùng methyl vàng cam làm chỉ thị màu

Một số trường hợp dùng hỗn hợp chỉ thị để quan sát rõ vùng chuyển màuhơn là dùng một chỉ thị màu (ví dụ định lượng alcaloid trong vỏ canhkina người tadùng hỗn hợp methyl đỏ và xanh methylen làm chỉ thị)

Khi tính kết quả, nếu trong dược liệu có nhiều alcaloid mà chúng đều địnhlượng được bằng phép chuẩn độ sẽ tính theo một hệ số là khối lượng phân tử trungbình của các alcaloid có trong dược liệu, nhưng kết quả này không được chính xác

vì tỷ lệ alcaloid thường khác nhau Do đó người ta thường tính theo một alcaloidchính của dược liệu; ví dụ định lượng alcaloid toàn phần trong là Beladon thì tínhtheo hyosxyamin, trong ma hoàng tính theo ephedrin

Định lượng alcaloid trong môi trường khan:

Những alcaloid có tính base yếu thì chuẩn độ trong môi trường dung dịchnước không chính xác Tuy vậy, nếu hòa tan alcaloid vào trong dung môi khôngphải là nước, thường dùng acid acetic khan (gọi là môi trường khan) thì người ta cóthể định lượng được những alcaloid có tính base rất yếu này Thường dùng acidpercloric 0,1N để định lượng và chỉ thị màu là tím tinh thể

Alcaloid + CH3COOH ↔ Alcaloid.H+ + (CH3COO)

-HClO4 + CH3COOH ↔ (CH3COOH2)+ + ClO4

-Alcaloid.H+ + (CH3COO)- +(CH3COOH2)+ + ClO4- ↔ Alcaloid.H+ + ClO4- +

2CH3COOH

1.2.4.3 Phương pháp so màu

Phương pháp so màu chỉ cần một lượng nhỏ alcaloid, lại có độ nhạy và cókết quả nhanh, do đó cũng là phương pháp hay dùng để định lượng alcaloid Hầuhết các alcaloid không có màu nhưng có thể tiến hành định lượng bằng phươngpháp so màu theo nguyên tắc:

- Dựa vào phản ứng tạo màu của alcaloid, dùng dung dịch có màu đó để địnhlượng