Ứng dụng phương pháp realtime PCR trong điều tra đánh giá tỉ lệ bệnh sốt mò tại bệnh viện bạch mai năm 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TÔ ĐỨC LINH ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP REALTIME PCR TRONG ĐIỀU TRA ĐÁNH GIÁ TỈ LỆ BỆNH SỐT MÒ TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI NĂM 2016 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TÔ ĐỨC LINH ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP REALTIME PCR TRONG ĐIỀU TRA ĐÁNH GIÁ TỈ LỆ BỆNH SỐT MÒ TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI NĂM 2016 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành:Di truyền học Mã số : 60420121 Cán hƣớng dẫn : TS Lê Thị Hội PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân Hà Nội – 2018 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, muốn đƣợc bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới Lê Thị Hội, Tiến Sĩ – Trƣởng Phòng Hợp tác quốc tế - Khoa Xét nghiệm – Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ƣơng ngƣời hƣớng dẫn khoa học, ln giúp đỡ tơi, tận tình bảo, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm để tơi hoàn thành luận văn Sự động viên, giúp đỡ dìu dắt Cơ giúp tơi có thêm nhiều động lực để vƣợt qua khó khăn học tập sống Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân, trƣởng môn Di truyền – Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội, ngƣời thầy đồng hƣớng dẫn Ngƣời ln nhiệt tình giúp đỡ, bảo, động viên tơi suốt q trình học tập để tơi hồn thành luận văn Bằng tình cảm u mến lịng biết ơn chân thành nhất, tơi xin gửi tới thầy, cô, anh, chị bạn đồng nghiệp quan tâm, giúp đỡ, hỗ trợ tơi q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn trân trọng tới: - Ban giám hiệu trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội - Phòng Sau Đại học - Ban giám đốc bệnh viện Bạch Mai - Ban giám đốc bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung Ƣơng - Tập thể khoa Xét nghiệm, bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung Ƣơng Xin cảm ơn ngƣời bệnh cho phép lấy bệnh phẩm xét nghiệm để thực đề tài Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình thân yêu tôi, ngƣời sinh thành, nuôi dƣỡng trƣởng thành Những ngƣời bên tôi, chỗ dựa vững để yên tâm học tập hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 12 tháng 10 năm 2018 Tô Đức Linh DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DNA Deoxy ribonucleotide Acid dNTPs Deoxynucleoside triphosphates E coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid L.akamushi Leptotrombidium akamushi L.arenicula Leptotrombidiumarenicula L.deliensei Leptotrombidiumdeliensei L.fletcheri Leptotrombidiumfletcheri L.pallidum Leptotrombidiumpallidum L.scutellare Leptotrombidiumscutellare O tsutsugamushi Orientia tsutsugamushi PBMC Peripheral blood mononuclear cell PCR Polymerase Chain Reaction RFLP Restricted Fragment Length Polymorphism Analysis Tm Melting temperature DANH MỤC HÌNH Hình Mị Leptotrobidium Hình Chu trình nhân lên vi khuẩn O.tsutsugamushi tế bào vật chủ 15 Hình Vết đốt đặc trƣng biểu phát ban bệnh sốt mị 19 Hình Kết so sánh cho mồi xi với trình tự đích 32 Hình Kết so sánh mồi ngƣợc với trình tự đích 32 Hình Kết so sánh probe với trình tự đích 32 Hình Tín hiệu khuếch đại Realtime PCR 52oC 33 Hình Tín hiệu khuếch đại Realtime PCR 55oC 34 Hình Tín hiệu khuếch đại Realtime PCR 58oC 34 Hình 10 Tín hiệu khuếch đại Realtime PCR 60oC 34 Hình 11 Đƣờng khuếch đại Realtime-PCR nồng độ magie khác 35 Hình 12 Kết xác định tỷ lệ nhiễm O.tsutsugamushi Real time - PCR 38 Hình 13 Kết Realtime PCR số mẫu bệnh nhân đƣợc xét nghiệm 37 Hình 14 Tín hiệu huỳnh quang phản ứng Realtime PCR thử độ đặc hiệu 40 Hình 15 Tín hiệu huỳnh quang phản ứngRealtime PCR đối chứng dƣơng 41 Hình 16 Đƣờng chuẩn 42 Hình 17 Tín hiệu huỳnh quang phản ứng Realtime PCR cho độ nhạy 44 Hình 18 Sự phân bố nhiễm bệnh sốt mị theo nhóm tuổi 46 Hình 19 Tỉ lệ nhiễm bệnh sốt mò nam nữ 47 Hình 20 Sự phân bố nhiễm bệnh sốt mị theo nhóm ngành nghề 48 Hình 21 Sự phân bố bệnh sốt mị theo vùng 50 Hình 22 Sự phân bố bệnh sốt mị theo miền 51 Hình 23 Phân bố tỉ lệ nhiễm O.tsutsugamushi năm 2016 52 DANH MỤC BẢNG Bảng Trình tự mồi probe sử dụng cho kỹ thuật Realtime PCR (gen mã hố protein vỏ có khối lƣợng phân tử 47 kDa - HtrA) 25 Bảng Thành phần phản ứng Real time – PCR 26 Bảng Chƣơng trình chạy Realtime PCR 27 Bảng Các thơng số đặc tính mồi mẫu dị 30 Bảng 5.Năng lƣợng tự ΔG cấu trúc thứ cấp mồi (kcal/mol) 30 Bảng Chu kỳ ngƣỡng Realtime-PCR nồng độ magie khác 36 Bảng Kết độ đặc hiệu phản ứng Realtime – PCR 39 Bảng Kết thử độ nhạy phản ứng Realtime PCR 43 Bảng Biểu triệu chứng khởi phát bệnh nhân nghiên cứu 44 Bảng 10 Phân bố nhiễm bệnh sốt mò theo nghề nghiệp 46 Bảng 11 Phân bố nhiễm bệnh sốt mò theo vùng miền, địa phƣơng 48 Bảng 12 Tỉ lệ nhiễm bệnh sốt mò theo miền 50 Bảng 13 Bảng thống kê tỉ lệ nhiễm bệnh sốt mò theo tháng năm 2016 51 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Dịch tễ học bệnh sốt mò 1.1.1 Vi khuẩn O tsutsugamushi – tác nhân gây bệnh sốt mò 1.1.2 Mò Leptotrobidium - ổ bệnh trung gian truyền bệnh 1.1.3 Nhiễm O tsutsugamushi động vật 1.1.4 Tình hình sốt mò giới 10 1.1.5 Tình hình sốt mị Việt Nam 11 1.2 Sinh bệnh học sốt mò 14 1.2.1 Sự xâm nhập nhân lên O tsutsugamushi tế bào vật chủ 14 1.2.2 Tính nhạy cảm thể vật chủ với nhiễm O tsutsugamushi 16 1.2.3 Đáp ứng miễn dịch sốt mò 16 1.3 Triệu chứng lâm sàng chẩn đốn bệnh sốt mị 19 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 22 2.2 Vật liệu nghiên cứu 22 2.2.1 Chủng vi khuẩn nghiên cứu 22 2.2.2 Mẫu bệnh phẩm 22 2.2.3 Tiêu chuẩn chọn mẫu 22 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Tách chiết lớp tế bào máu đơn nhân ngoại vi (PBMC) 23 2.3.2 Tách chiết DNA tổng số 23 2.3.3 Thiết kế cặp mồi probe 24 2.3.4 Thành phần phản ứng (Master mix) 26 2.3.5 Tối ƣu chu kỳ nhiệt phản ứng Realtime – PCR 26 2.3.6 Nhận định phân tích kết 27 2.3.7 Phƣơng pháp xác đinh ̣ độ đặc hiệu phản ứng 28 2.3.8 Phƣơng pháp xác đinh ̣ độ nhạy phản ứng 28 2.3.9 Đạo đức nghiên cứu………………………………………………… 29 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30 3.1 Quy trình tối ƣu phản ứng Realtime – PCR 30 3.1.1 Thiết kế mồi 30 3.1.2 Tối ƣu nhiệt độ gắn Taqman probe 33 3.1.3 Kết tối ƣu nồng độ magie phản ứng Realtime-PCR 35 3.2 Xây dựng quy trình chẩn đoán O tsutsugamushi Realtime – PCR37 3.2.1 Tách chiết DNA 37 3.2.2 Ứng dụng phản ứng Realtime PCR chẩn đoán O tsutsugamushi 37 3.2.3 Đánh giá độ đặc hiệu phản ứng Realtime PCR 39 3.2.4 Đánh giá độ nhạy phản ứng Realtime PCR 41 3.3 Một số đặc điểm lâm sàng bệnh nhân nghi mắc bệnh sốt mò 45 3.4 Kết khảo sát yếu tố liên quan đến nhiễm O tsutsugamushi bệnh nhân điều trị bệnh viện Bạch Mai năm 2016 45 3.4.1 Tỉ lệ nhiễm O tsutsugamushi tuổi 45 3.4.2 Tỉ lệ nhiễm O tsutsugamushi theo giới tính 47 3.4.3 Phân bố nhiễm bệnh theo nhóm nghề nghiệp 47 3.4.4 Phân bố nhiễm bệnh theo vùng miền, địa phƣơng 49 3.4.5 Phân bố nhiễm bệnh theo khoảng thời gian năm 2016 51 CHƢƠNG KẾT LUẬN 53 CHƢƠNG KIẾN NGHỊ………………………………………………… 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 ĐẶT VẤN ĐỀ Sốt mị (Scrub typhus) bệnh truyền nhiễm cấp tính,bệnh truyền qua côn trùng, tiết túc vi khuẩn ký sinh nội bào Orientia tsutsugamushi (trƣớc gọi Ricketsia orientalis Ricketsia tsutsugamushi) gây nên Đây bệnh sốt cấp tính lƣu hành gây dịch nhiều nơi giới, có Việt Nam Ƣớc tính có khoảng tỷ ngƣời có nguy bị mắc bệnh khoảng triệu ca bệnh năm [32,44] Trong năm gần đây, sốt mò đƣợc phát tái phát nhiều nƣớc vùng dịch tễ nhƣ: Lào, Ấn Độ, Sri Lanka, Maldives Sốt mò bệnh động vật, chủ yếu động vật gặm nhấm động vật có xƣơng sống nhỏ khác thuộc lớp thú Ổ bệnh trung gian truyền bệnh mị Leptotrumbidium, lồi chân đốt thuộc họ ve bét Mò nhiễm O tsutsugamushi truyền vi khuẩn cho đời sau qua trứng qua giai đoạn phát triển Ấu trùng mò nhiễm O tsutsugamushitruyền mầm bệnh cho động vật ngƣời đốt[36,37,49] Sốt mò ngƣời có biểu lâm sàng đa dạng, giống với nhiều bệnh truyền nhiễm cấp tính khác Các ca bệnh điển hình có vết đớ t đặc hiệu ngồi da có giá trị chẩn đốn nhƣng có số bệnh nhân, không đại diện đầy đủ cho phổ bệnh thực sốt mị đơi khơng đƣợc phát Bệnh tiến triển nặng gây tử vong khơng đƣợc chẩn đốn sớm, điều trị đặc hiệu [52] Các xét nghiệm chẩn đốn xác định bệnh sốt mị có ý nghĩa quan trọng việc xác định ca bệnh lâm sàng, định hƣớng điều trị sớm điều trị đặc hiệu nhằm giảm thiểu biến chứng nguy tử vong cho ngƣời bệnh.Tuy nhiên, viê ̣c phát hiê ̣n bệnh sốt mị khó khơng có phƣơng pháp chẩn đốn phù hợp Trƣớc có phƣơng pháp chẩn đoán đại, việc chẩn đoán phụ thuộc nhiều vào trình độ bác sĩ nhƣ xuất vectơ truyền bệnh hay vết đốt Nhiều ngƣời bệnh có triệu chứng khơng điển hình, sốt kéo dài làm cho chẩn đoán bị nhầm lẫn Nếu đƣợc chẩn đốn việc điều trị đơn giản Do đó, chẩn đốn bệnh xét nghiệm xác kịp thời hỗ trợ nhiều cho bác sĩ việc điều trị bệnh ricketssia Ngày giới, có ba phƣơng TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 3.4.3 Phân bố nhiễm bệnh theo nhóm nghề nghiệp Bệnh nhân có kết dƣơng tính với O tsutsugamushicó phân bố rộng nhiều nhóm ngành nghề khác Số bệnh nhân cơng nhân tuổi học sinh, sinh viên chiếm tỉ lệ nhỏ (< 10%) Nhóm bệnh nhân nơng dân có tỉ lệ nhiễm cao nhất, vƣợt trội hẳn so với nhóm ngành nghề cịn lại, chiếm đến 42.3% tổng số ngƣời bị nhiễm Các nhóm ngành nghề khác chiếm tỉ lệ nhiễm tƣơng đối khoảng từ 10% - 20% Nghiên cứu tƣơng tự với nghiên cứu Phạm Thanh Thủy [18] với 56,2% làm ruộng, Nguyễn Trọng Chính [8] Đỗ Văn Thành [17] cho kết tƣơng tự Nhƣ vậy, khẳng định lần rằng, ngƣời nơng dân có nguy phơi nhiễm với ấu trùng mị cao đối tƣợng bị bệnh Bảng 10 Phân bố nhiễm bệnh sốt mò theo nghề nghiệp Nghề nghiệp Số ngƣời xét nghiệm Số bệnh nhân Tỉ lệ nhiễm ( %) Học sinh, sinh viên 08 05 6.4 Nông dân 68 33 42.3 Công nhân 03 01 1.3 Nhân viên 38 16 20.5 24 14 18.0 15 09 11.5 156 78 100 Ở nhà (nghỉ hƣu, nội trợ) Ngành nghề khác Tổng số 48 TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 80 45 70 40 60 35 Số ngƣời 25 40 20 30 15 20 10 10 0 Tỉ lệ % 30 50 Học Nông dân Công nhân Nhân viên Nghỉ Ngành sinh, sinh hƣu, nội nghề khác viên trợ Số ngƣời xét nghiệm Số bệnh nhân Tỉ lệ nhiễm bệnh ( %) Hình 20 Sự phân bố nhiễm bệnh sốt mị theo nhóm ngành nghề 3.4.4 Phân bố nhiễm bệnh theo vùng miền, địa phƣơng Bệnh nhân sốt mò cƣ trú nhiều vùng khác nhau, nơng thơn nơi có nhiều bệnh nhân dƣơng tính với O tsutsugamushi nhất, sau vùng thị xã/thị trấn, thành phố Tuy nhiên khả mắc bệnh bệnh nhân cƣ trú thành phố thị trấn lại cao so với nông thôn (khả mắc bệnh cao 50%, nông thôn có 44%) Các bệnh nhân sống thành phố phơi nhiễm với sốt mị tới vùng dịch tễ nơi cƣ trú Bảng 11 Phân bố nhiễm bệnh sốt mò theo vùng miền, địa phƣơng Vùng Số ngƣời xét nghiệm Số ngƣời nhiễm bệnh Tỉ lệ nhiễm (%) Thành phố 43 25 32.1 Thị trấn 38 20 25.6 Nông thôn 75 33 42.3 Tổng số 156 78 100 49 80 45 70 40 60 35 30 50 25 40 75 20 30 20 10 Tỉ lệ % Số ngƣời TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 15 43 38 25 33 20 10 0 Thành phố Tổng số Thị trấn Số ngƣời nhiễm Nơng thơn Tỉ lệ nhiễm Hình 21 Sự phân bố bệnh sốt mò theo vùng Sự phân bố bệnh sốt mị đƣợc chúng tơi thống kê theo miền địa hình: miền núi, trung du, đồng miền biển Kết phân bố phản ánh bệnh chủ yếu xuất miền đồng bằng, số trung du giảm hẳn miền núi Riêng miền biển có số bệnh nhân xét nghiệm nhỏ nên chƣa phản ánh đƣợc ảnh hƣởng Tuy nhiên phân bố hợp lý với đặc tính sinh trƣởng O tsutsugamushi Bởi đồng nơi có đơng dân cƣ, động vật có khả cao tiếp xúc với ngƣời ngày nhƣ chó mèo, chuột… làm tăng hội nhiễm bệnh cho ngƣời, tăng lây lan ngƣời sang ngƣời Ở miền khác tỉ lệ nhiễm giảm xuống hạn chế tiếp xúc nguồn bệnh nơi thích hợp cho sinh trƣởng phát triển O tsutsugamushi Nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu Vũ Hồng Chiến Nguyễn Thị Kim Chính tổng số 73 bệnh nhân nghiên cứu bệnh nhân nhiễm sốt mò chủ yếu vùng đồng bằng, thành thị ( bao gồm chủ yếu Hà Nội: 16,3% tỉnh lân cận: Hƣng Yên 9,6% Bắc Ninh 9,6%) [4] 50 TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 Bảng 12 Tỉ lệ nhiễm bệnh sốt mò theo miền Miền Số ngƣời xét nghiệm Số ngƣời nhiễm bệnh Tỉ lệ nhiễm (%) Miền núi 30 11 14.1 Trung du 12 10.3 Đồng 112 59 75.6 Miền biển 0 Tổng số 156 78 100 120 80 70 100 Số ngƣời 50 60 40 112 30 40 20 59 20 Tỉ lệ % 60 80 30 11 Miền núi Tổng số 12 Trung du Đồng Số ngƣời nhiễm 10 Miền biển Tỉ lệ nhiễm (%) Hình 22 Sự phân bố bệnh sốt mò theo miền 3.4.5 Phân bố nhiễm bệnh theo thời gian Khảo sát thời gian bùng phát bệnh sốt mị theo tháng, chúng tơi nhận thấy bệnh xuất vào tất thời điểm năm 2016 Thời gian bùng phát bệnh cao điểm khoảng từ tháng – (chiếm tới 60% tổng số ca sốt mò), đặc biệt tháng tháng có tới 40 ngƣời mắc bệnh sốt mò, chiếm 50 % số ca mắc bệnh năm 2016 bệnh viện Bạch Mai Hai khoảng thời 51 TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 điểm lân cận với khoảng thời gian có số ca mắc bệnh giảm hẳn, chiếm tỉ lệ thấp, thấp năm khoảng từ tháng 10 đến tháng 12 Kết nghiên cứu tƣơng tự với nghiên cứu Phạm Thanh Thủy [18], Bùi Đại Berman [8] Theo Phạm Thanh Thủy, bệnh nhân nhiễm sốt mò rải rác tất tháng năm nhƣng gặp nhiều tháng mùa nóng từ tháng 05 đến tháng 11 Tƣơng tự, theo Nguyễn Văn Sơn, bệnh nhi mắc sốt mò tất tháng năm, nhiều vào tháng mùa nóng từ tháng đến tháng 11 [16] Theo Lê Đăng Hà, Cao Văn Viên CS, bệnh nhân mắc sốt mò chủ yếu vào mùa hè [11] Theo Vũ Hồng Chiến Nguyễn Thị Kim Chính bệnh nhân nhiễm sốt mò rải rác tât tháng năm, nhiều từ tháng 05 đến tháng 11 [4] Theo nghiên cứu Nguyễn Văn Sơn có 85,9% bệnh nhân mắc sốt mò xảy vào tháng 05 đến tháng 11, gặp tháng 12 đến tháng 04 năm sau Sự phân bố bệnh nhân sốt mị theo tháng năm có liên quan chặt chẽ đến mùa phát triển mò Sự thay đổi số lƣợng mật độ quần thể mò yếu tố ảnh hƣởng đến tần suất mắc sốt mò vùng bệnh lƣu hành Bảng 13 Bảng thống kê tỉ lệ nhiễm bệnh sốt mò theo tháng năm 2016 Tháng 1–3 4–6 7–9 10 – 12 Tổng số Số ngƣời xét nghiệm 24 90 28 14 156 Số ngƣời nhiễm 14 47 10 78 Tỉ lệ nhiễm (%) 17,9 60.3 12.8 9.0 100 % 52 TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 70 60 40 90 30 20 47 24 14 Tỉ lệ % 50 Số ngƣời 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 28 10 Tháng 1-3 Tháng 4-6 Tháng 7-9 Số ngƣời xét nghiệm Số ngƣời mắc bệnh 14 10 Tháng 10-12 Tỉ lệ nhiễm bệnh Hình 23 Phân bố tỉ lệ nhiễm O tsutsugamushi năm 2016 53 TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN Đã xây dựng thành cơng quy trình xác định tình trạng nhiễm O tsutsugamushi gây bệnh sốt mị kĩ thuật Realtime PCR sử dụng gen Htr A mã hóa cho protein ngoại bào vi khuẩn có trọng lƣợng 47 kDa Nhiệt độ tối ƣu cho giai đoạn bắt cặp chu trình Realtime PCR 60oC Nồng độ MgSO4 sử dụng phản ứng Realtime PCR 5mM.Quy trình Realtime PCR có độ đặc hiệu 100% độ nhạy 100 sao/ ml Xác định đƣợc tỉ lệ bệnh nhân nhiễm O tsutsugamushi bệnh viện Bạch Mai năm 2016 Nghiên cứu thu tuyển đƣợc 156 bệnh nhân nghi ngờ nhiễm sốt mị bệnh viện Bạch Mai năm 2016, 78 bệnh nhân dƣơng tính với vi khuẩn O tsutsugamushi ( bao gồm 41 nam 37 nữ) chiếm 50% tổng số bệnh nhân đƣợc thu tuyển Nông dân đối tƣợng mắc sốt mò chiếm tỉ lệ cao 42,3% Bệnh nhiều từ tháng 04 đến tháng 06 năm 54 TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 CHƢƠNG V KIẾN NGHỊ Kiến nghị Bác sỹ lâm sàng, có bệnh nhân nghi ngờ nhiễm O.tsutsugamushi nên cho làm xét nghiệm sớm để rút ngắn thời gian chẩn đoán điều trị giảm thiểu nguy tử vong Đối với ngƣời làm xét nghiệm q trình thao tác cần xác, đặc biệt hút lớp PBMC để có kết xét nghiệm tốt 55 TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 TÀI LIỆU THAM KHẢO • TIẾNG VIỆT Lê Văn An, Nguyễn Đình Khoa, Lê Văn Trịnh, Phan Trung Tiên, 2005: “Chuẩn đốn bệnh sốt mị (SCRUBS TYPHUS) O TSUTSUGAMUSHI Thừa Thiên Huế”.Y học thực hành; 521: 68 – 73 Chu Chƣơng Cảnh, 1963: “Một trƣờng hợp sốt phát ban Rickettsia” Y học thực hành; 96( tháng 6): 22 – 24 Nguyễn Văn Châu, 1997: “Tài liệu phân loại Mò( Acariformes Trombicilidae) Việt Nam” Nhà xuất Y học Hà Nội 1997 “Nhận xét đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm điều trị bệnh sốt mò khoa Truyền Nhiễm bệnh viện Bach Mai”: BSYK/ Vũ Hồng Chiến; Nguyễn Thị Kim Chính – H; Trƣờng đại học Y Hà Nội, 2014 – 72 tr Nguyễn Trọng Chính, 2004 “ Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng điều trị bệnh nhân sốt mò bệnh viện 108” Y học thực hành, số ( 474): 61 – 64 Phạm Xuân Đà, 2005: “Nghiên cứu dịch tễ học hồi cứu tổng quan chế lây truyền Orientia tsutsugamushi véc tơ truyền bệnh” Y học thực hành; Số 1( 501): 31 – 34 Bùi Đại, 1994: “ Bệnh sốt mò, bách khoa thƣ bệnh học” Trung tâm biên soạn từ điển bách khoa toàn thư Việt Nam, Hà Nội: tập II, trang 88 – 93 Bùi Đại, 2005: “Bệnh Rickettsia ( Ricketsiosis), bệnh học Truyền nhiễm” Nhà xuất Y học : Hà Nội p 312 – 317 Bùi Đại, Nguyễn Hòe, 1965: “Bệnh sốt triền sông Nhật Bản” Y học thực hành; 115: 15 – 17 10 Lê Đăng Hà, Cao Văn Viên, Đỗ Văn Thành, Nguyễn Thị Hạnh, 2000: “Nghiên cứu bệnh cảnh lâm sàng, xét nghiệm điều trị bệnh sốt mò Rickettsia 56 TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 tsutsugamushi” Cơng trình nghiên cứu khoa học bệnh viện Bạch Mai 1999 – 2000( tập 1) Nhà xuất y học, Hà Nội: 234 – 242 11 Lê Đăng Hà, Cao Văn Viên CS, 2001: “Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm, chẩn đoán điều trị bệnh sốt mò Rickettsia tsutsugamushi Viện Y học Lâm sàng Bệnh nhiệt đới” Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 12 Nguyễn Hoàn, Vũ Thị Vy, Đinh Kiều Diễm, Đỗ Thung, Hồng Tuyết Minh, Đỗ Ngọc Bích, 1974: “Điều tra tình hình lƣu hành Rickettsia Tsutsugamushi đảo N( Quảng Ninh)” Vệ sinh phòng dịch; 1: 16 13 Lê Thị Hội CS: “Ứng dụng kĩ thuật Realtime PCR để xác định ba nhóm vi khuẩn Rickettsia gây bệnh sốt cấp tính ngƣời, 2015” 14 Nguyễn Phƣơng, Chu Lạc Đạo, Đào Xn Dƣơng, Nơng Vĩnh Lai, 1974: “Kết bƣớc đầu dùng Tetracyclin uống DMP xoa để phòng bệnh sốt mò đơn vị” Vệ sinh phòng dịch; 1: 16 15 Nguyễn Văn Sản, Nơng Vĩnh Lai CS, 1973: “Thực nghiệm phịng bệnh sốt mò Tetracyclin chuột nhắt trắng” Nội san đại học Quân Y; 9: 44 – 47 16 Nguyễn Văn Sơn, 2004: “Nghiên cứu số đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm điều trị bệnh sốt mò Rickettsia tsustugamushi trẻ em” Luận văn tốt nghiệp bác sỹ chuyên khoa cấp II chuyên ngành Nhi – Lây 17 Đỗ Văn Thành, 1998: “Nghiên cứu bệnh cảnh lâm sàng, xét nghiệm điều trị bệnh sốt mò Rickettsia tsutsugamushi” Luận văn tốt nghiệp bác sỹ nội trú, chuyên ngành truyền nhiễm 18 Phạm Thanh Thủy, 2007: “Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, phƣơng pháp chẩn đoán điều trị bệnh sốt mò” Luận án tiến sĩ y học Đại học y Hà Nội 19 Phạm Thanh Thúy, Lê Đăng Hà, Cao Văn Tiến, Shuzo Kanagawa, Tadatoshi Kuratsuji, 2006 “ Đặc điểm dịch tế sốt mò trƣờng hợp trƣờng hợp điều trị viện YHLSCBND, 2001 – 2003” Y học dự phòng, tập XVI số 1( 79); trang 59 – 64 57 TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 20 Phạm Hùng Vân ( 2009): “PCR Realtime PCR vấn đề áp dụng thƣờng gặp” Nhà xuất Y học • TIẾNG ANH: 21 Cracco C., Delafosse C., Baril L., Lefort Y., Morelot C., Derenne J.P., et al., 2000: “Multiple organ failure complicating probable scrub typhus” Clin Infect Dis Jul;31(1):191-2 22 Ewing E.P Jr., Takeuchi A., Shirai A , Osterman J.V., 1978: “Experimental infection of mouse peritoneal mesothelium with scrub typhus rickettsiae: an ultrastructural study” Infect Immun Mar;19(3):1068-75 23 Frances S.P., Watcharapichat P., Phulsuksombati D., 2001: “Vertical transmission of Orientia tsutsugamushi in two lines of naturally infected Leptotrombidium deliense (Acari: Trombiculidae)” J Med Entomol Jan;38(1):1721 24 Groves M.G., Kelly D.J., 1989: “Characterization of factors determining Rickettsia tsutsugamushi pathogenicity for mice” Infect Immun May;57(5):147682 25 Groves M.G., Osterman J.V., 1978: “Host defenses in experimental scrub typhus: genetics of natural resistance to infection” Infect Immun Feb;19(2):583-8 26 Groves M.G., Rosenstreich D.L., Taylor B.A., Osterman J.V., 1980: “Host defenses in experimental scrub typhus: mapping the gene that controls natural resistance in mice” J Immunol Sep;125(3):1395-9 27 Hanson B., 1985: “Identification and partial characterization of Rickettsia tsutsugamushi major protein immunogens” Infect Immun.; 50(3): 603-609 28 Jensenius M., Fournier P.E., Raoult D., 2004: “Rickettsioses and the international traveler” Clin Infect Dis Nov 15;39(10):1493-9 58 TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 29 Kadosaka T., Kimura E., 2003: “Electron microscopic observations of Orientia tsutsugamushi in salivary gland cells of naturally Infected Leptotrombidium pallidum larvae during feeding” Microbiol.Immunol.;47(10):72733 30 Kawamura A.Jr., Tanaka H., 1988: “Rickettsiosis in Japan” Jpn J Exp Med Aug;58(4):169-84 31 Kawamori F., Akiyama M., Sugieda M., Kanda T., Akahane S., Uchikawa K., et al., 1992: “Epidemiology of Tsutsugamushi disease in relation to the serotypes of Rickettsia tsutsugamushi isolated from patients, field mice, and unfed chiggers on the eastern slope of Mount Fuji, Shizuoka Prefecture, Japan” J Clin Microbiol Nov;30(11):2842-6 32 Kelly D.J., Richards A.L., Temenak J., Strickman D., Dasch G.A., 2002: “The past DNA present threat to military medicine DNA international public health” Clin Infect Dis.;34 (suppl 4):s145-69 33 Kobayashi Y., Kawamura S., Oyama T., 1985: “Immunological studies of experimental tsutsugamushi disease in congenitally athymic (nude) mice” Am J Trop Med Hyg May;34(3):568-77 34 Kollars T.M Jr., Kengluecha A., Khlaimanee N., Tanskul P., 2001: “Temporal changes in prevalence of scrub typhus rickettsia (Orientia tsutsugamushi) infecting the eggs of Leptotrombidium imphalum (Acari: Trombiculidae)” J Med Entomol Jan;38(1):108-10 35 Lerdthusnee K., Khlaimanee N., Monkanna T., Sangjun N., Mungviriya S., Linthicum KJ, et al., 2002: “Efficiency of Leptotrombidium chiggers (Acari: Trombiculidae) at transmitting Orientia tsutsugamushi to laboratory mice” J Med Entomol May;39(3):521-5 36 Lerdthusnee K., Khuntirat B., Leepitakrat W., Tanskul P., Monkanna T., Khlaimanee N., et al., 2003: “Scrub typhus: vector competence of Leptotrombidium 59 TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 chiangraiensis chiggers and transmission efficacy and isolation of Orientia tsutsugamushi” Ann N Y Acad Sci Jun;990:25-35 37.Oaks S.C., Ridgway R.L., Shirai A , Twartz J.C., 1983: “Scrub typhus” Bulletin No 21 from the Inst Med Res., Malaysia 38 Pham X.D., Otsuka Y., Suzuki H., Takaoka H., 2001: “Detection of Orientia tsutsugamushi (Rickettsiales: Rickettsiaceae) in unengorged chiggers (Acari: Trombiculidae) from Oita Prefecture, Japan, by nested polymerase chain reaction” J Med Entomol March;38(2):308-311 39 Rapmund G., 1984: “Rickettsial diseases of the Far East: new perspectives” J Infect Dis Mar;149(3):330-8 40 Ree H.I., Cho M.K., Lee I.Y., Jeon S.H., 1995: “Comparative epidemiological studies on vector/reservoir animals of tsutsugamushi disease between high and low endemic areas in Korea” Korean J Parasitol Mar;33(1):2736 41 Rikihisa Y., Ito S., 1983: “Effect of antibody on entry of Rickettsia tsutsugamushi into polymorphonuclear leukocytes cytoplasm” Infect Immun; 39(2): 928-938 42 Saunders J.P., Brown G.W., Shirai A., Huxsoll D.L., 1980: “The longevity of antibody to Rickettsia tsutsugamushi in patients with confirmed scrub typhus” Trans R Soc Trop Med Hyg.;74(2):253-7 43 Shirai A., Catanzaro P.J., Phillips S.M., Osterman J.V., 1976:“Host defenses in experimental scrub typhus: role of cellular immunity in heterologous protection” Infect Immun Jul;14(1):39-46 44 Shirai A., Catanzaro P.J., Eisenberg G.H Jr., Osterman J.V., 1977: “Host defenses in experimental scrub typhus: effect of chloramphenicol” Infect Immun Nov;18(2):324-9 60 TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 45 Takahashi M., Urakami H., Yoshida Y., Furuya Y., Misumi H., Hori E., et al., 1997: “Occurrence of high ratio of males after introduction of minocycline in a colony of Leptotrombidium fletcheri infected with Orientia tsutsugamushi” Eur J Epidemiol Jan;13(1):79-86 46 Takahashi M., Misumi H., Urakami H., Nakajima S., Furui S., Yamamoto S., et al., 2004: “Seasonal occurrence of Leptotrombidium deliense (Acari: Trombiculidae) attached to sentinel rodents in an orchard near Bangkok, Thailand” J Med Entomol Nov;36(6):869-74 47.Tamura A., Ohashi N., Urakami H., Miyamura S., 1995: “Classification of Rickettsia tsutsugamushi in a new genus, O tsutsugamushi gen nov., as O tsutsugamushicomb” nov Int J Syst Bacteriol Jul;45(3):589-91 Review 48 Thiebaut M.M., Bricaire F., Raoult D., 1997: “Scrub typhus after a trip to Vietnam” N Engl J Med May 29;336(22):1613-4 49 Traub R., Wisseman C.L Jr., Jones M.R., O'Keefe J.J., 1975: “The acquisition of Rickettsia tsutsugamushi by chiggers (trombiculid mites) during the feeding process” Ann N Y Acad Sci.;266:91-114 50 Van Peenen P.F.D., Ho C.M., Bourgeois A.L., 1977: “Indirect immunofluorescent antibodies in natural and acquired Rickettsia tsutsugamushi infections of Philippin rodents” Infect Immun.; 15(3): 813-816 51 Watt G., Parola P., 2003:“Scrub typhus DNA tropical rickettsioses” Curr Opin Infect Dis Oct;16(5):429-36 Review 52.Wisseman C.L., 1991 Rickettsial infections In StricklDNA GJ (ed.): “Hunters Tropical Medicine, 7th edition” Saunders Company, Philadelphia,: 256-282 53 Walker, D.H and L.S Blanton (2015), 188 – Ricketsia riketsii and Other Spotted Fever Group Rickettsiae ( Rocky Moutain Spotted Fever and Other Spotted Fever), in Mandell, Douglas, and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases ( Eighth Edition), J.E.B.D.J Content Repository: Philadelphia p 2198–2205.e4 61 TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 54 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 55 https://sg.idtdna.com 56 https://microbiologyinfo.com 62 ... công tác chẩn đốn chữa bệnh Vì vậy, chúng tơi tiến hành thực đề tài ? ?ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP REALTIME PCR TRONG ĐIỀU TRA ĐÁNH GIÁ TỈ LỆ BỆNH SỐT MÒ TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI NĂM 2016? ?? với mục tiêu nghiên... TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TÔ ĐỨC LINH ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP REALTIME PCR TRONG ĐIỀU TRA ĐÁNH GIÁ TỈ LỆ BỆNH SỐT MÒ TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI NĂM 2016 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành:Di... Realtime PCR, đánh giá độ đặc hiệu độ nhạy phản ứng TÔ ĐỨC LINH – HVCH K24 Ứng dụng phƣơng pháp Realtime PCR để xác định tỉ lệ nhiễm O tsutsugamushi bệnh viện Bạch Mai năm 2016 điều tra số yếu tố