Đánh giá hoạt tính sinh học của một số nhóm chất tách chiết từ cây tô mộc caesanpinia sapan l

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Đỗ Thị Huế ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ NHĨM CHẤT TÁCH CHIẾT TỪ CÂY TƠ MỘC (CAESALPINIA SAPPAN L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Đỗ Thị Huế ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ NHĨM CHẤT TÁCH CHIẾT TỪ CÂY TƠ MỘC (CAESALPINIA SAPPAN L.) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Hồng Điệp Hà Nội - 2018 Luận văn Thạc sỹ khoa học Đỗ Thị Huế LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn thạc sĩ, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Lê Hồng Điệp - Bộ mơn Hóa sinh Sinh học phân tử, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, người tận tình bảo, hướng dẫn tạo điều kiện tốt cho em suốt trình học tập nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS TS Nguyễn Quang Huy Trưởng khoa Sinh học, TS Trần Văn Tuấn - Bộ môn Vi sinh vật học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên giúp đỡ cho em nhiều lời khuyên quý báu trình thực luận văn Em xin cảm ơn thầy cô giáo, cán anh chị mơn Hóa sinh Sinh học phân tử, thầy cô khoa Sinh học trường ĐH Khoa học Tự nhiên tạo điều kiện giúp đỡ, truyền dạy cho em kiến thức, kỹ kinh nghiệm nghiên cứu khoa học để em hồn thành luận văn Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè, em sinh viên phịng thí nghiệm Hóa sinh Sinh học phân tử Lab 132T1 ln bên giúp đỡ, khích lệ động viên em lúc khó khăn đưa góp ý, chia sẻ kinh nghiệm học tập nghiên cứu Em xin trân trọng cảm ơn dự án Hợp tác Việt Bỉ (Exploring the Medical, (ECO)-Toxicological and Socio-Economic Potential of Natural Extracts in North Vietnam) hỗ trợ kinh phí nguồn mẫu để tiến hành thí nghiệm q trình thực đề tài luận văn Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 21 tháng 11 năm 2018 Học viên Đỗ Thị Huế Luận văn Thạc sỹ khoa học Đỗ Thị Huế DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ADN Axit Deoxyribonucleic AG Axit gallic American Type Culture Collection ATCC (Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ) CAMHB Cation-adjusted Mueller-Hinton broth Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI (Viện Tiêu chuẩn lâm sàng xét nghiệm Hoa Kỳ) Dichloromethane fraction DMF (Phân đoạn dichloromethane ) DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl EAF Ethyl acetate fraction (Phân đoạn ethyl acetate ) EF Ethanol fraction (Phân đoạn ethanol) GAE Đương lượng axit gallic LB Luria- Bertani MAE Microwave assisted extraction Minimal bactericidal concentration MBC (Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu) MHA Mueller Hinton Agar Luận văn Thạc sỹ khoa học MHB Mueller Hinton Broth Minimal inhibitory concentration MIC (Nồng độ ức chế tối thiểu) nHF n-hexan fraction (Phân đoạn n-hexan) OD Optical Density (Mật độ quang học) PDA Potato dextrose agar SFE Supercritical fluid extraction SPME Solid Phase Microextraction TM Tô mộc UAE Ultrasound assisted extraction VH Vibrio harveyi VP Vibrio parahaemolyticus VSV Vi sinh vật Đỗ Thị Huế Luận văn Thạc sỹ khoa học Đỗ Thị Huế DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Độ hấp thụ quang phổ axit gallic bước sóng 765 nm .29 Bảng 3.1 Hiệu suất tách chiết gỗ Tô mộc 40 Bảng 3.2 Kết chiết phân đoạn gỗ Tô mộc 42 Bảng 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn gỗ Tô mộc chủng E coli 44 Bảng 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn gỗ Tô mộc chủng B subtilis 44 Bảng 3.5 Hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn EAF chủng S aureus B cereus 46 Bảng 3.6 Hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn EAF chủng S typhimurium P aeruginos 47 Bảng 3.7 Kết xác định MIC/MBC cao EAF chủng VSV .49 Bảng 3.8 Hoạt tính kháng khuẩn cao EAF chủng Vibrio 51 Bảng 3.9 Kết thử hoạt tính kháng nấm cao EAF 55 Bảng 3.10 Hoạt tính chống oxi hóa axit ascorbic cao EAF 57 Luận văn Thạc sỹ khoa học Đỗ Thị Huế DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây Tơ mộc (Đỗ Xn Cẩm) Hình 1.2 Một số hợp chất từ Tơ mộc Hình 1.3 Một số phương pháp tách chiết thông thường [7] .19 Hình 1.4 Sơ đồ phương pháp tách chiết có hỗ trợ vi sóng [71] .20 Hình 1.5 Sơ đồ phương pháp chiết siêu tới hạn [37] .23 Hình 2.1 Mẫu gỗ Tơ mộc 27 Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn gỗ Tô mộc .28 Hình 2.3 Đường chuẩn axit gallic 30 Hình 2.4 Cách xác định vịng kháng khuẩn .33 Hình 2.5 Sơ đồ phản ứng trung hòa gốc DPPH chất chống oxi hóa [40] 37 Hình 2.6 Phương trình đường chuẩn axit ascorbic 38 Hình 3.1 Sơ đồ hiệu suất tách chiết phân đoạn gỗ Tơ mộc 43 Hình 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn gỗ Tơ mộc chủng E coli B subtilis 45 Hình 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn EAF chủng S aureus B cereus 47 Hình 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn EAF chủng S typhimurium P aeruginosa 48 Hình 3.5 Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết EAF chủng Vibrio 52 Hình 3.6 Kết khảo sát khả ức chế vi khuẩn Vibrio cao EAF .53 Hình 3.7 Kết thử hoạt tính kháng nấm cao EAF 56 Luận văn Thạc sỹ khoa học Đỗ Thị Huế MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Giới thiệu chung Tô mộc 1.1.1 Sơ lược phân họ Vang 1.1.2 Giới thiệu chung Tô mộc 1.2 Tình hình nghiên cứu Tơ mộc 1.2.1 Các nghiên cứu Tô mộc giới 1.2.2 Tình hình nghiên cứu Tơ mộc Việt Nam .15 1.3 Khái quát phương pháp chiết cao dược liệu .16 1.3.1 Tổng quan chiết xuất dược liệu 16 1.3.2 Các phương pháp chiết xuất dược liệu 17 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24 2.1 Vật liệu .24 2.1.1 Mẫu thực vật 24 2.1.2 Chủng vi sinh vật .24 2.1.3 Dụng cụ thí nghiệm 26 2.1.4 Thiết bị hóa chất 26 2.1.5 Môi trường 26 2.2 Phương pháp 27 2.2.1 Phương pháp thu xử lý mẫu 27 2.2.2 Phương pháp chiết phân đoạn 27 2.2.3 Phương pháp định lượng Phenolic tổng số .28 2.2.4 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn 31 2.2.5 Phương pháp xác định hoạt tính kháng nấm .35 2.2.6 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa 36 Luận văn Thạc sỹ khoa học Đỗ Thị Huế 2.2.7 Phương pháp thống kê .38 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Đánh giá hiệu suất lựa chọn phương pháp tách chiết 39 3.2 Kết tách chiết thu phân đoạn 41 3.3 Khảo sát sơ hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn cao chiết Tô mộc 43 3.4 Đánh giá hoạt kháng khuẩn phân đoạn ethyl acetate (EAF) 46 3.4.1 Kết thử hoạt tính kháng khuẩn phương pháp khuếch tán giếng thạch 46 3.4.2 Kết xác định MIC/MBC phương pháp pha loãng 48 3.4.3 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn ethyl acetate chủng Vibrio .50 3.5 Đánh giá hoạt tính kháng nấm phân đoạn ethyl acetate 55 3.6 Đánh giá hoạt tính oxi hóa phân đoạn ethyl acetate 56 KẾT LUẬN 58 KIẾN NGHỊ .59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 Luận văn Thạc sỹ khoa học Đỗ Thị Huế MỞ ĐẦU Dược liệu đóng vai trò quan trọng đời sống người thuộc tính đặc biệt chúng nguồn cung cấp vô giá hoạt chất tự nhiên từ thực vật cho y học Năm 1985 Farnsworth cộng xác định 119 chất chuyển hóa thực vật sử dụng làm thuốc Trong số 255 loại thuốc coi cần thiết Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), 11% số dược chất thu từ thực vật tổng hợp từ tiền chất tự nhiên Các hợp chất tự nhiên từ thực vật biết đến với nhiều hoạt tính sinh học quan trọng chống oxi hóa, kháng khuẩn, kháng nấm, chống ung thư,…[16] Hiện không Việt Nam mà giới, nguyên liệu sản xuất dược phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên chiết xuất từ thực vật xu hướng nhằm tạo loại thuốc thân thiện với sức khỏe người tác dụng phụ Theo báo cáo tổ chức y tế giới (WHO), khoảng 80% dân số dựa vào loại thuốc có nguồn gốc tự nhiên chăm sóc sức khỏe cộng đồng, đặc biệt sử dụng chế phẩm, sản phẩm từ dược liệu, kể nước phát triển phát triển Các loại thuốc sử dụng phòng chữa bệnh hầu hết điều chế từ hai nguồn: dược liệu hóa dược Theo số liệu thống kê WHO (1985) có tới 20000 lồi thảo dược Khơng nước Á Đông mà nước phương Tây tiêu thụ lượng lớn dược liệu Người ta thống kê thấy nước có cơng nghiệp phát triển mạnh 1/4 số thuốc kê đơn có chứa hoạt chất từ thảo dược Tại Việt Nam, theo báo cáo Cục quản lý dược - Bộ Y tế, năm nước ta tiêu thụ khoảng 50 - 60 nghìn loại dược liệu khác nhau, sử dụng vào việc chế biến vị thuốc Y học cổ truyền, cung cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược xuất Ngày nay, việc tìm kiếm hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao để làm thuốc xu nhà khoa học quan tâm Nhiều dược liệu sử dụng để tách chiết hoạt chất làm thuốc như: chiết berberin từ vàng đắng (Coscinium fenestratum), rutin từ hoa hòe (Shophora japonica), morphin từ ...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Đỗ Thị Huế ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ NHĨM CHẤT TÁCH CHIẾT TỪ CÂY TƠ MỘC (CAESALPINIA SAPPAN L. ) Chuyên... pháp pha l? ??ng 48 3.4.3 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn ethyl acetate chủng Vibrio .50 3.5 Đánh giá hoạt tính kháng nấm phân đoạn ethyl acetate 55 3.6 Đánh giá hoạt tính. ..ơi tiếp tục đánh giá hoạt tính chống oxi hóa phân đoạn ethyl acetate (EAF) chiết xuất từ gỗ Tô mộc theo phương pháp loại bỏ gốc tự DPPH Patel cộng (2011) Hoạt tính chống oxi hóa cao EAF tính tươ