Nghiên cứu đặc tính kháng kháng sinh và mối liên hệ kiểu gen của các chủng Pseudomonas aeruginosa phân lập tại Bệnh viện Việt Đức

Nghiên cứu đặc tính kháng kháng sinh và mối liên hệ kiểu gen của các chủng Pseudomonas aeruginosa phân lập tại Bệnh viện Việt Đức Nghiên cứu đặc tính kháng kháng sinh và mối liên hệ kiểu gen của các chủng Pseudomonas aeruginosa phân lập tại Bệnh viện Việt Đức luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Vũ Thị Thu Hiền NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH VÀ MỐI LIÊN HỆ KIỂU GEN CỦA CÁC CHỦNG Pseudomonas aeruginosa PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN VIỆT ĐỨC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Vũ Thị Thu Hiền NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH VÀ MỐI LIÊN HỆ KIỂU GEN CỦA CÁC CHỦNG Pseudomonas aeruginosa PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN VIỆT ĐỨC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.BS TRẦN HUY HOÀNG PGS.TS BÙI THỊ VIỆT HÀ HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ biết ơn chân thành sâu sắc tới TS.BS Trần Huy Hoàng, Trưởng Phịng Thí nghiệm Kháng sinh, Khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, người trực tiếp hướng dẫn tơi cơng việc thí nghiệm Thầy tận tình hướng dẫn, dạy bảo cho tơi hiểu biết lĩnh vực nghiên cứu chuyên sâu vi khuẩn tạo điều kiện thuận lợi để tiến hành cơng việc thí nghiệm cách tốt hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn tới PGS.TS Bùi Thị Việt Hà, Bộ môn Vi sinh vật học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, giáo viên đồng hướng dẫn Cô dạy dỗ, giúp đỡ, đưa lời khuyên góp ý quan trọng cho tơi suốt q trình học tập để tơi hồn thành luận văn cách tốt Tôi xin chân thành cảm ơn đến thầy cô giáo Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên dạy cho kiến thức sinh học để tơi hồn thành cơng việc nghiên cứu tốt Để hồn thành luận văn này, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới anh chị, bạn bè đồng nghiệp Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương giúp đỡ, dẫn, khuyên bảo suốt q trình học tập thực thí nghiệm để tơi hồn thành cơng việc cách thuận lợi Cuối muốn gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, anh chị, bạn bè sát cánh bên tôi, động viên tôi, tiếp thêm cho sức mạnh lúc tơi gặp khó khăn sống học tập để vững vàng bước đường chọn Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2018 Tác giả Vũ Thị Thu Hiền MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan kháng sinh 1.1.1 Khái niệm kháng sinh 1.1.2 Sự kháng kháng sinh (đề kháng) vi khuẩn 1.1.2.1 Sự phát triển đặc tính kháng kháng sinh vi khuẩn 1.1.2.2 Phân loại đề kháng 1.1.3 Cơ chế kháng kháng sinh vi khuẩn 1.1.3.1 Thay đổi đích tác ̣ng 1.1.3.2 Tạo enzym 1.1.3.3 Giảm tính thấm màng nguyên sinh chất 1.1.4 Thực trạng kháng kháng sinh vi khuẩn Gram âm 1.2 Một số nét Pseudomonas aeruginosa 1.2.1 Đặc điểm vi sinh vật 1.2.2 Nhiễm trùng lâm sàng P aeruginosa gây 11 1.2.3 Khả gây bệnh 12 1.2.4 Độc lực 13 1.2.4.1 Các yếu tố hỗ trợ cho gắn kết P aeruginosa vào tế bào vật chủ 13 1.2.4.2 Các yếu tố hỗ trợ xâm nhập P aeruginosa vào mô ức chế đáp ứng miễn dịch vật chủ 13 1.2.5 Cơ chế kháng kháng sinh 16 1.2.5.1 Kháng trung gian qua porin màng 16 1.2.5.2 Kháng kháng sinh thông qua hệ thống bơm đẩy 17 1.2.5.3 Thay đổi đích tác động 21 1.2.5.4 Sản sinh enzym phân hủy kháng sinh 21 1.2.5.5 Cơ chế kháng việc hình thành màng sinh học-biofilm 24 1.2.6 Tình hình kháng kháng sinh P aeruginosa 24 1.2.6.1 Tình hình kháng kháng sinh P aeruginosa giới 24 1.2.6.2 Tình hình kháng kháng sinh P aeruginosa Việt Nam 26 1.2.7 Các kĩ thuật thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh P aeruginosa 27 1.2.7.1 Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán thạch 27 1.2.7.2 Kỹ thuật xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 28 1.2.7.3 Kỹ thuật E-test 28 1.2.8 Các kĩ thuật sinh học phân tử xác định kiểu gen P aeruginosa 28 1.2.8.1 Kĩ thuật RAPD-PCR (Random amplified polymorphic ADN fingerprinting) 28 1.2.8.2 Kĩ thuật điện di xung trường (PFGE) 29 1.2.8.3 Kĩ thuật phân loại trình tự đa vị trí (Multi Locus Sequence Typing-MLST) 29 1.2.8.4 Kĩ thuật giải trình tự gen 30 1.3 Tính mới, tính thời ý nghĩa khoa học nghiên cứu 30 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 33 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 33 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 33 2.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN 33 2.2.1 Thời gian thực 33 2.2.2 Địa điểm thực thí nghiệm 33 2.2.3 Thiết kế nghiên cứu 33 2.2.4 Vật liệu nghiên cứu – trang thiết bị sinh phẩm vật tư tiêu hao 33 2.3 Các phương pháp nghiên cứu 34 2.3.1 Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC) 34 2.3.1.1 Các bước tiến hành 35 2.3.1.2 Đọc phân tích kết 38 2.3.2 Kỹ thuật điện di xung trường (PFGE) 39 2.3.2.1 Quy trình tiến hành 39 2.3.2.2 Phân tích kết 41 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 43 3.1 Mức độ nhạy cảm kháng sinh P aeruginosa 43 3.1.1 Sự phân bố của P aeruginosa theo mẫu bệnh phẩm theo Khoa 43 3.1.2 Mức độ nhạy cảm kháng sinh P aeruginosa 44 KẾT LUẬN 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Sự phát triển đề kháng kháng sinh vi khuẩn Bảng 1.2: Cơ chất gen điều hòa hệ thống bơm đẩy P aeruginosa 20 Bảng 2.1: Các kháng sinh thử nghiệm diễn giải MIC với 35 P aeruginosa 35 Bảng 2.2: Các hóa chất sử dụng kỹ thuật PFGE 40 Bảng 3.1: Mức độ nhạy cảm kháng sinh P aeruginosa loại kháng sinh 46 Bảng 3.2 Sự phân bố kiểu gen chủng P aeruginosa với nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế phát triển vi khuẩn 53 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cơ chế đề kháng kháng sinh vi khuẩn .6 Hình 1.2: Đặc điểm hình thái P aeruginosa mơi trường ni cấy 10 Hình 2.1: Cách pha loãng bậc cho 16 nồng độ kháng sinh từ dung dịch mẹ 36 Hình 2.2: Sơ đồ chấm chủng cấy 32 giếng 38 Hình 3.1: Tỉ lệ P aeruginosa phân lập mẫu bệnh phẩm 43 Hình 3.2: Tỉ lệ phân bố chủng P aeruginosa theo Khoa 44 Hình 3.3: Chủng mọc đĩa thạch khơng có kháng sinh có kháng sinh 45 Hình 3.4: Tỉ lệ P aeruginosa kháng hoàn toàn kháng trung gian với loại kháng sinh 47 Hình 3.5: Hình ảnh đại diện cho kiểu gen các s ố chủng P aeruginosa phân lập bệnh viện Việt Đức 49 Hình 3.6: Cây phân nhóm kiểu gen chủng P aeruginosa phân lập bệnh viện Việt Đức 50 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Viết đầy đủ tiếng anh Viết giải nghĩa tiếng việt AND Acid Deoxyribonucleic Phân tử axit nucleic Bp Base pair CDC Trung tâm kiểm soát Control and Prevention phòng ngừa bệnh dịch Dynamics, Economics & Policy ESBL Ấn Độ phổ rộng beta lactam Multidrug- resistant WGS Kinh tế Chính sách lactamases MDR PFGE Biến động Bệnh dịch, Enzym kháng kháng sinh Metallo-beta-lactamase MLST Trung tâm Nghiên cứu Extended-spectrum beta- MBLs MIC phân tử DNA Centers for Disease Center for Disease CDDEF Đơn vị đo trọng lượng Minimal Inhibitory Concentration Enzym kháng kháng sinh nhóm beta lactam Đa kháng Nồng độ ức chế tối thiểu Multilocus Sequence Phân loại dựa đa Typing điểm trình tự gen Pulsed-field gel electrophoresis Whole Genome Sequence Điện di xung trường Giải trình tự tồn hệ gen vi khuẩn MỞ ĐẦU Việc phát minh kháng sinh kỷ 20 đóng vai trị quan trọng việc khống chế bệnh nhiễm trùng Cùng với việc cải thiện điều kiện vệ sinh, nhà ở, dinh dưỡng chương trình tiêm chủng mở rộng góp phần quan trọng làm giảm tỷ lệ tử vong bệnh nhiễm trùng tuổi thọ người nâng cao Tuy nhiên, thực trạng vi khuẩn kháng kháng sinh vấn đề nghiêm trọng mà nhân loại phải đối mặt kỷ 21 xác định đóng vai trị trọng tâm cơng tác chăm sóc sức khoẻ toàn cầu với chiến lược đánh giá tác động vi khuẩn kháng kháng sinh lên cộng đồng giai đoạn 2020-2025 Trên giới, vi khuẩn kháng lại kháng sinh mức độ nguy hiểm Các kháng sinh hệ không lựa chọn để điều trị nhiều trường hợp, kháng sinh hệ đắt tiền cephalosporin hệ 3, 4, đặc biệt kháng sinh nhóm carbapenem dần hiệu lực lây lan nhanh chóng chủng vi khuẩn kháng thuốc [35, 81] Trong khơng có kháng sinh phát để điều trị bệnh nhiễm trùng vi khuẩn gây ra, đặc biệt vi khuẩn Gram âm Theo dự báo GS Jim O’Neill đến năm 2050, năm vi khuẩn kháng kháng sinh gây tử vong khoảng 10 triệu người, cao tỷ lệ người tử vong nguyên nhân nào, kể ung thư (8,2 triệu) gây thiệt hại cho kinh tế bao gồm chi phí điều trị tạo sản phẩm lao động khoảng 100 nghìn tỷ USD toàn giới [89] Pseudomonas aeruginosa hay gọi trực khuẩn mủ xanh biết đến tác nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện, là viêm phổi, nhiễm trùng tiế t niê ̣u , viêm da viêm mô mềm [79] Các lựa chọn kháng sinh điề u tri ̣ P aeruginosa bị hạn chế vi khuẩn có xu hướng phát triển kháng lại với nhiều dòng kháng sinh nhờ chế kháng đa dạng biểu mức hệ thống bơm đẩy, giảm tính thẩm thấu màng ngồi (OM), sản sinh β-lactamase phân hủy kháng sinh nhóm β-lactama [54] Tính đa kháng P aeruginosa gây nhiều khó khăn trình điều trị, làm tăng tỉ lệ bệnh tật, ... thể tính kháng kháng sinh để đánh giá mối liên hệ kiểu gen, lưu hành chủng P aeruginosa gây bệnh bệnh viện, tiến hành thực đề tài: ? ?Nghiên cứu đặc tính kháng kháng sinh mối liên hệ kiểu gen chủng. .. NHIÊN Vũ Thị Thu Hiền NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH VÀ MỐI LIÊN HỆ KIỂU GEN CỦA CÁC CHỦNG Pseudomonas aeruginosa PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN VIỆT ĐỨC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07... chủng Pseudomonas aeruginosa phân lập Bệnh viện Việt Đức? ?? với mục tiêu sau: Xác định tính nhạy cảm kháng sinh chủng Pseudomonas aeruginosa phân lập Bệnh viện Việt Đức Xác định mối liên hệ kiểu gen