Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu quy trình công nghệ tách chiết và tinh chế Mangostin trong vỏ quả măng cụt Garcinia Mangostnan L làm thuốc hỗ trợ điều trị ung thư Nghiên cứu quy trình công nghệ tách chiết và tinh chế Mangostin trong vỏ quả măng cụt Garcinia Mangostnan L làm thuốc hỗ trợ điều trị ung thư luận văn tốt nghiệp thạc sĩ
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - MAI THỊ HIÊN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ MANGOSTIN TRONG VỎ QUẢ MĂNG CỤT GARCINIA MANGOSTANA L LÀM THUỐC HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - MAI THỊ HIÊN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ MANGOSTIN TRONG VỎ QUẢ MĂNG CỤT GARCINIA MANGOSTANA L LÀM THUỐC HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐỖ THỊ TUYÊN Đề tài thực phòng CNSH Enzyme, Viện CNSH Hà Nội - 2011 Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC HÌNH v DANH MỤC CÁC BẢNG vi CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .2 1.1 Giới thiệu măng cụt 1.1.1 Sự phân bố măng cụt 1.1.2 Đặc điểm sinh học măng cụt 1.2 Các hợp chất xanthone có vỏ măng cụt 1.2.1 Cấu trúc hợp chất xanthone .3 1.2.2 Một số dẫn xuất xanthone quan trọng vỏ măng cụt 1.3 Hoạt tính sinh học mangostin dẫn xuất xanthone khác .6 1.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn 1.3.2 Hoạt tính kháng nấm 1.3.3 Hoạt tính kháng viêm 1.3.4 Hoạt tính chống oxi hóa 1.3.5 Hoạt tính chống ung thƣ 1.4 Peroxidase 10 1.5 Peroxy hóa lipid 12 1.6 Giới thiệu số vi sinh vật gây bệnh ngƣời 13 1.6.1 Staphylococcus aureus 13 1.6.2 Pseudomonas aeruginosa 13 1.6.3 Candida albicans 14 1.7 Tình hình nghiên cứu mangostin 15 1.7.1 Trên giới 15 1.7.2 Ở Việt Nam .17 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 18 Mai Thị Hiên ii Luận văn thạc sĩ 2.1 Sinh học thực nghiệm Nguyên liệu hóa chất 18 2.1.1 Nguyên liệu .18 2.1.1.1 Chủng vi sinh vật 18 2.1.1.2 Động vật thí nghiệm 18 2.1.1.3 Nguyên liệu thực vật .18 2.1.2 Hóa chất 18 2.2 Các thiết bị thí nghiệm 20 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Tách chiết -mangostin xác định cấu trúc 20 2.3.2 Tối ƣu điều kiện tách chiết 21 2.3.2.1 Tối ƣu dung môi 21 2.3.2.2 Tối ƣu tỷ lệ dung môi chiết .21 2.3.2.3 Tối ƣu thời gian tách chiết 22 2.3.2.4 Tối ƣu nhiệt độ tách chiết 22 2.3.3 Các phƣơng pháp tinh .22 2.3.3.1 Tinh tách phân đoạn .22 2.3.3.2 Tinh sắc kí cột 22 2.3.4 Sắc kí mỏng 23 2.3.5 Xác định làm lƣợng malondialdehyde 23 2.3.6 Xác định hoạt độ peroxidase 24 2.3.7 Định lƣợng protein 24 2.3.8 Xác định khả ức chế vi sinh vật 25 2.3.9 Phƣơng pháp thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa mangostin…………… 26 2.3.9.1 Phƣơng pháp thử nghiệm chuột .26 2.3.9.2 Phƣơng pháp lấy mẫu gan .27 2.3.10 Xử lý số liệu 27 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Tách chiết tinh -mangostin từ vỏ măng cụt 28 3.1.1 Tối ƣu điều kiện tách chiết 28 3.1.1.1 Tối ƣu dung môi chiết .28 Mai Thị Hiên iii Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm 3.1.1.2 Tối ƣu tỷ lệ dung môi 29 3.1.1.3 Tối ƣu thời gian chiết 29 3.1.1.4 Tối ƣu nhiệt độ tách chiết 30 3.1.2 Tinh -mangostin 31 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn -mangostin 33 3.2.1 Hoạt tính kháng S aureus .33 3.2.2 Hoạt tính ức chế sinh trƣởng P aeruginosa 34 3.2.3 Hoạt tính ức chế Candida albicans 34 3.3 Hoạt tính chống oxi hóa -mangostin 35 3.3.1 Trọng lƣợng thể chuột nhóm nghiên cứu 35 3.3.2 Khả bảo vệ gan α-mangostin dƣới tác dụng CCl4 .37 3.3.3 Ảnh hƣởng -mangostin lên hoạt độ peroxidase gan chuột……………… 39 3.3.4 Ảnh hƣởng -mangostin lên hàm lƣợng MDA gan chuột………… 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC 48 Mai Thị Hiên iv Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Quả măng cụt Hình 1.2 Cấu trúc khung xương phân tử xanthone Hình 1.3 Cấu tạo hóa học số xanthone từ vỏ măng cụt Hình 1.4 Cơ chế xúc tác phản ứng peroxidase .10 Hình 1.5 Cấu trúc nhân hem peroxidase 11 Hình 1.6 Hình dạng vi khuẩn Staphylococcus aureus 13 Hình 1.7 Hình dạng vi khuẩn P aeruginosa 14 Hình 1.8 Hình dạng nấm C albicans 14 Hình 2.1 Qui trình tách chiết tinh chế -mangostin 21 Hình 2.2 Đường chuẩn peroxidase 24 Hình 2.3 Đường chuẩn Bradford với BSA làm chuẩn 25 Hình 3.1 Tối ưu dung mơi chiết 28 Hình 3.2 Tối ưu tỷ lệ dung mơi chiết 29 Hình 3.3 Tối ưu thời gian chiết 30 Hình 3.4 Tối ưu nhiệt độ tách chiết 30 Hình 3.5 Kiểm tra độ sản phẩm -mangostin tinh .31 Hình 3.6 Hoạt tính kháng S aureus -mangostin 33 Hình 3.7 Hoạt tính ức chế sinh trưởng P aeruginosa 34 Hình 3.8 Hoạt tính ức chế nấm C albicans -mangostin 35 Hình 3.9 Sự thay đổi trọng lượng thể chuột q trình thí nghiệm 36 Hình 3.10 Hình ảnh thể gan nhóm chuột nghiên cứu 37 Hình 3.11 Sự thay đổi trọng lượng gan chuột nhóm nghiên cứu 38 Hình 3.12 Hoạt độ peroxidase gan chuột tác dụng -mangostin .39 Hình 3.13 Sự thay đổi hàm lượng MDA gan tác động -mangostin .41 Mai Thị Hiên v Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Danh sách hóa chất sử dụng thí nghiệm .19 Bảng 2.2 Thành phần loại đệm dung dịch .19 Bảng 2.3 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật .19 Bảng 2.4 Các thiết bị thí nghiệm 20 Bảng 2.5 Các nhóm chuột xử lí hóa chất 26 Bảng 3.1 Tỷ lệ sản phẩm tách chiết so với nguyên liệu thô .32 Bảng 3.2 Trọng lượng chuột trước sau thí nghiệm 36 Bảng 3.3 Ảnh hưởng -mangostin lên tỷ lệ trọng lượng gan/trọng lượng thể .38 Bảng 3.4 Hoạt độ peroxidase gan chuột 39 Bảng 3.5 Hàm lượng MDA gan chuột tác dụng -mangostin 41 Mai Thị Hiên vi Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm CÁC CHỮ VIẾT TẮT DMSO Dimethyl sulfoxide ĐC Đối chứng EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid EP Ether petroleum EtOAC Ethyl acetate EtOH Ethanol HPLC High-performance liquid chromatography LB Luria broth LDL Low density lipoprotein MDA Malondialdehyde MeOH Methanol MIC Minimum inhibitory concentration OD Optical density Rf Retention factor SD Standard deviation SDS Sodium dodecyl sulfate SOD Superoxide dismutase TB Trung bình TBA Thiobarbituric acid TL Trọng lượng TLC Thin layer chromatography TMB 3,3´-5,5´-tetramethyl benzidine TN Thí nghiệm TT Thể trọng v/v Volume/volume v/w Volume/weight w/v Weight/volume Mai Thị Hiên vii Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm MỞ ĐẦU Ung thư mối nguy hiểm kiểm sốt xã hội lồi người Cuộc chiến chống ung thư thức bắt đầu cách 40 năm Cho đến nay, Viện ung thư quốc gia Mỹ dùng đến 90 tỉ USD cho chiến phịng chống ung thư [11] Theo dự đốn Tổ chức Y tế Thế giới, từ năm 2007 đến 2030 số ca tử vong tăng từ 7,5 triệu người lên đến 11,5 triệu người, số người mắc ung thư giai đoạn tăng từ 11,3 triệu người lên đến 15,5 triệu người Ở Việt Nam, tỷ lệ người mắc ung thư cao Theo Nguyễn Bá Đức cộng sự, giai đoạn từ 1/1/2001 đến 31/12/2004 có 32,944 ca ung thư mắc ghi nhận tỉnh: Hải Phòng, Hà Nội, Thái Nguyên, Thừa Thiên Huế, Cần Thơ (http://benhvienk.com) Hiện nay, nhà khoa học tập trung nghiên cứu, tìm hợp chất có khả ngăn chặn tác dụng tác nhân gây ung thư, giúp loại bỏ nguy ung thư Trong đó, hợp chất từ tự nhiên, chủ yếu từ thực vật quan tâm đặc biệt nhờ ưu điểm gây tác dụng phụ hợp chất hóa học tổng hợp Các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên vinblastine từ dừa cạn (Catharanthus roseus), taxol thông đỏ (Taxus brevifolia), colchicine từ tỏi độc (Colchicum autunale), scutebalcaletone từ bán chi liên (Scutellaria barbata), số hoạt chất từ chè xanh (Camellia sinensis), sử dụng để điều trị cho bệnh nhân ung thư Trong đó, măng cụt Garcinia mangostana L ăn trồng nhiều miền Nam, Việt Nam Theo kinh nghiệm dân gian, vỏ măng cụt cịn dùng để điều trị nhiều loại bệnh nhiễm trùng Tuy nhiên việc khai thác ứng dụng hoạt chất sinh học từ vỏ măng cụt nước ta chưa quan tâm nhiều Xuất phát từ thực tế đề tài “Nghiên cứu quy trình cơng nghệ tách chiết tinh chế mangostin vỏ măng cụt Garcinia mangostana L làm thuốc hỗ trợ điều trị ung thư” thực với mục tiêu: tách chiết tinh chế -mangostin từ vỏ măng cụt nghiên cứu số hoạt tính sinh học -mangostin Mai Thị Hiên Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu măng cụt 1.1.1 Sự phân bố măng cụt Măng cụt có tên khoa học Garcinia mangostana L thuộc họ Bứa (Clusiaceae), loại ăn trồng vùng khí hậu nhiệt đới, đặc biệt phổ biến vùng Đông Nam Á, Ấn Độ, Sri Lanka Ở Việt Nam măng cụt chủ yếu trồng vùng đồng sông Cửu Long với tổng diện tích lên tới 4900 ha, cho sản lượng khoảng 4500 Theo dự án phát triển sản xuất xuất rau, hoa tươi Việt Nam, dự kiến phát triển diện tích trồng măng cụt vùng đồng sông Cửu Long lên khoảng 11300 ha, cho sản lượng 24000 Trong tập trung trồng chủ yếu tỉnh Bến Tre, Vĩnh Long, Trà Vinh Bình Dương Măng cụt địi hỏi điều kiện thổ nhưỡng khắt khe, khí hậu nóng ẩm Do đó, măng cụt phân bố vùng có khí hậu ấm áp, khơng tiến xa vùng khí hậu lạnh phía bắc mà dừng lại Huế Hình 1.1 Quả măng cụt 1.1.2 Đặc điểm sinh học măng cụt Măng cụt thuộc loại thân gỗ vừa có chiều cao 12-25 m, thân có nhiều nhánh đối chéo nằm ngang, nhựa màu vàng Thân non màu xanh lục, thân già màu nâu đen sẫm, sần sùi có nhiều rãnh nứt dọc, tiết diện trịn Lá đơn, mọc đối, khơng có kèm Phiến bóng, dày dai, hình elip thn dài, gốc gần tròn, mũi Mai Thị Hiên Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm tế bào chất màng ty thể hầu hết tế bào, đặc biệt hoạt động mạnh gan hồng cầu, quan có vai trị quan trọng q trình giải độc vận chuyển điện tử thể Peroxidase giúp thể thu dọn peroxide nội sinh H2O2 chuyển hóa thành H2O, giúp giảm thiểu xâm hại gốc tự lên tổ chức mô thể, ngăn ngừa ung thư Sự thay đổi hàm lượng hoạt độ enzyme chống oxy hóa có peroxidase biểu khơng bình thường trạng thái sinh lý, cân nội bào thể đáp ứng với chất độc ngoại sinh Hoạt độ peroxidase gan nhóm chuột uống CCl4 bị giảm đáng kể, giảm 12% so với nhóm đối chứng (Bảng 3.4), nguyên nhân CCl4 gây hoại tử tế bào gan, làm cho peroxidase sản sinh tế bào gan bị phá hủy, thấy gan có màu trắng bạc, úng nước phù nề (Hình 3.11) Trong nhóm chuột điều trị -mangostin có xu hướng tăng hoạt độ peroxidase gan, đặc biệt nhóm chuột uống -mangostin liều 0,1 mg/10 g thể trọng, tăng 45% so với nhóm đối chứng (Bảng 3.4) Tuy nhiên, nồng độ -mangostin tăng lên 0,2 mg/10 g thể trọng hoạt độ peroxidase giảm xuống (Hình 3.12), nồng độ -mangostin cao gây độc cho thể, ức chế q trình sinh lý, sinh hóa tế bào gan, làm cho hoạt độ peroxidase giảm xuống Như vậy, -mangostin có ảnh hưởng quan trọng lên thay đổi hoạt độ peroxidase gan chuột Tương tự, nghiên cứu Devi Sampath cộng (2007) khẳng định -mangostin có khả ngăn chặn suy giảm enzyme chống oxi hóa glutathione-S-transferase (GST), glutathione peroxidase (GPx), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) isoproterenol (một loại hợp chất sử dụng điều trị tim mạch) gây [15] 3.3.4 Ảnh hưởng -mangostin lên hàm lượng MDA gan chuột MDA sản phẩm q trình peroxy hóa lipid, xảy tác động chất oxi hóa, gốc tự tác động lên phân tử có chất lipid tế bào Hàm lượng MDA thị quan trọng biểu mức độ hoạt động chất có Mai Thị Hiên 40 Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm tính oxi hóa tế bào Bảng 3.5 Hàm lượng MDA gan chuột tác dụng -mangostin Nhóm nghiên cứu ± SD Tỷ lệ % so với đối chứng Hàm lượng MDA (mol/g protein) n ĐC 11 44,6 ± 11,5 100 TN1 68,7 ± 16,8 154 TN2 12 46,7 ± 5,4 105 TN3 43,1 ± 11,6 97 TN4 43,7 ± 15,4 98 TN5 41,9 ± 10,5 94 Hàm lượng MDA tương đối (%) n: Số cá thể thí nghiệm; : giá trị trung bình, SD: sai số 200 160 120 80 40 ĐC TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 Nhóm nghiên cứu Hình 3.13 Sự thay đổi hàm lượng MDA gan tác động -mangostin Hàm lượng MDA gan nhóm uống CCl4 tăng rõ rệt, tăng 54% so với nhóm đối chứng Điều cho thấy phản ứng peroxy hóa lipid tế bào gan tác động CCl4 nhóm chuột bị nhiễm độc diễn mạnh mẽ Ở nhóm TN2, nhóm chuột nhiễm độc CCl4 điều trị -mangostin liều 0,1 mg/10 g thể trọng, hàm lượng MDA giảm xuống gần nhóm đối chứng (Hình 3.13, Bảng 3.5) Nguyên nhân tác dụng ngăn cản q trình peroxy hóa lipid CCl4 hoạt chất -mangostin Thêm vào đó, nhóm TN5 uống -mangostin liều 0,2 mg/10 g thể trọng, hàm lượng MDA gan giảm 6% so với Mai Thị Hiên 41 Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm nhóm đối chứng, giảm 60% so với nhóm nhiễm độc CCl4 Kết nghiên cứu cho thấy cho thấy -mangostin tác dụng bảo vệ gan khỏi bị nhiễm độc ngoại sinh mà bảo vệ gan khỏi gốc oxi hóa nội sinh Khả bảo vệ phân tử có chất lipid khỏi cơng gốc tự do, tác nhân oxi hóa -mangostin không xảy điều kiện in vivo mà xảy điều kiện in vitro Trong nghiên cứu Williams cộng (1995) chứng minh mangostin có khả bảo vệ phân tử hàm lượng thấp có chất lipoprotein (LDL) tránh khỏi oxi hóa ion kim loại (Cu2+) nồng độ 100 mM thời điểm giờ, điều kiện in vitro [44] Tương tự, Mahabusarakam cộng (2000) chứng minh -mangostin dẫn xuất tổng hợp ngăn chặn oxi hóa phân tử LDL Sự thay đổi cấu trúc -mangostin, thay C3 C4 dẫn xuất aminoethyl làm tăng cường hoạt hoạt động chống oxi hóa, thay gốc methyl acetate làm giảm hoạt động chống oxi hóa [24] Mai Thị Hiên 42 Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Hoạt chất -mangostin tinh tách chiết từ bột vỏ măng cụt chiếm 0,13% khối lượng nguyên liệu thô ban đầu có độ 98,5%, với thơng số kĩ thuật sau: dung môi chiết ethanol, tỷ lệ dung môi : nguyên liệu 3:1, 60C, Hoạt chất -mangostin có khả kháng lại số vi khuẩn nấm gây bệnh người S aureus, P aeruginosa, C albicans Diệt 100% vi khuẩn S aureus nồng độ 15 g/ml; ức chế 70% phát triển P aeruginosa nồng độ 1000 g/ml, 50% phát triển nấm C albicans nồng độ 1500 g/ml Hoạt chất -mangostin có khả chống oxi hóa, bảo vệ gan khỏi công chất độc có tính oxi hóa mạnh CCl4 Thể tác dụng làm tăng hoạt độ peroxidase làm giảm hàm lượng MDA gan chuột nhóm nghiên cứu, đặc biệt hai nhóm nghiên cứu: nhóm chuột uống -mangostin liều 0,1 mg/10 g thể trọng, hoạt độ peroxidase gan tăng 45% so với nhóm đối chứng, 57% so với nhóm nhiễm độc CCl4; nhóm chuột uống -mangostin liều 0,2 mg/10 g thể trọng, hàm lượng MDA gan chuột giảm 6% so với nhóm đối chứng, giảm 60% so với nhóm nhiễm độc CCl4 KIẾN NGHỊ Thử nghiệm hoạt tính chống ung thư -mangostin số dòng tế bào ung thư từ chuột Sản xuất -mangostin qui mô pilot để làm thuốc hỗ trợ phòng chống điều trị ung thư chống oxi hóa Mai Thị Hiên 43 Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trương Văn Châu, Trần Hồng Quang, Đỗ Ngọc Liên (2004), "Đặc tính kháng khuẩn hợp chất phenolic số loài thuộc chi Garcinia L " Tạp chí Sinh học 26(4): pp 59-62 Đào Hùng Cường, Đỗ Thị Thuý Vân (2010), "Nghiên cứu chiết tách xác định xanthone từ vỏ Măng cụt (Garcinia mangostin L)", Tạp chí Khoa học cơng nghệ, Đại học Đà nẵng, 5(40): pp 167-173 Nguyễn Thị Ngọc Dao, Đỗ Thị Hồng Cẩm (1997), "Hoạt độ peroxidase số tổ chức thực vật", Tạp chí Y học Việt Nam, 6: pp 39-43 Hoàng Văn Huấn (1998), "Nghiên cứu biến đổi hệ thống enzyme cytochrome P450 vài thơng số hóa sinh có liên quan nhiễm độc thực nghiệm nhiên liệu lỏng tên lửa", Luận văn thạc sỹ y học, Học viện Quân Y, Bộ Giáo dục Đào tạo - Bộ Quốc Phòng Đỗ Tất Lợi (2000), Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB Y học Hà Nội 567-568 Hồng Cơng Minh (2001), "Nghiên cứu ảnh hưởng hỗn hợp dichlorodiethyl sulfide với chlorovinyl dichlorarsine lên số tiêu độc học, hóa sinh, huyết học động vật thực nghiệm tác dụng thuốc điều trị", Luận án tiến sỹ y học, Học viện Quân y, Bộ Giáo dục Đào tạo Bộ Quốc phòng Nguyễn Mai Phương, Nguyễn Thị Thịnh, Nguyễn Diệu Linh, Phan Tuấn Nghĩa (2010), "Thu nhận tìm hiểu tác dụng sinh học chế phẩm chứa xanthone từ vỏ măng cụt (Garcinia Mangostin L.)", Tạp chí cơng nghệ sinh học, 8: pp 717-735 Nguyễn Thị Mai Phương, Phan Tuấn Nghĩa, Nguyễn Thị Ngọc Dao, Đỗ Ngọc Liên (2004), "Thành phần polyphenol vỏ măng cụt (Garcinia mangostana L) tác dụng ức chế sinh axit vi khuẩn sâu Streptococcus mutans", Tạp chí Dược học, 44: pp 18-21 Đỗ Thị Tuyên , Nguyễn Thu Thùy , Nguyễn Ngo ̣c Ha ̣nh , Nguyễn Thi ̣Ánh Tuyế t , Phùng Văn Trung , Quyề n Đình Thi , Nguyễn Thi ̣Mai Phương , Nguyễn Thi ̣Ngo ̣c Dao (2010), "Nghiên cứu quy trình tách chiết hoạt tính kháng khuẩn alpha-mangostin từ vỏ Măng cụt Garcinia mangostana L", Hội nghị Khoa học kỉ niệm 35 năm viện Công nghệ Khoa học Việt Nam, pp 136-143 Tiếng Anh 10 Anderson, J B (2005), "Evolution of antifungal-drug resistance: mechanisms and pathogen fitness", Nat Rev Microbiol, 3(7): pp 547-556 11 Balaram, P (2011), "Cancer: human mortality and cellular immortality", Curr Sci, 100(12): pp 1761-1762 Mai Thị Hiên 44 Luận văn thạc sĩ 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Sinh học thực nghiệm Bumrungpert, K., Kalpravidh, R W., Chia-Chi Chuang, C C., Overman, A., Martinez, K., Kennedy, A., McIntosh, M (2010), "Xanthones from Mangosteen inhibit inflammation in human macrophages and in human adipocytes exposed to macrophage-conditioned media", J Nutr, 140: pp 842–847 Cohen, R J., Shannon, B A., McNeal, J E., Shannon, T., Garrett, K L (2005), "Propionibacterium acnes associated with inflammation in radical prostatectomy specimens: a possible link to cancer evolution", J Urol, 173(6): pp 1969-1974 Daniel, M B., Michael, D R., Stuart, J E (1996), Protein methods, ed Wiley-Liss, New York Devi Sampath, P., Vijayaraghavan, K (2007), "Cardioprotective effect of alpha-mangostin, a xanthone derivative from mangosteen on tissue defense system against isoproterenol-induced myocardial infarction in rats", J Biochem Mol Toxicol, 21(6): pp 336-339 Ee, G C., Daud, S., Taufiq-Yap, Y H., Ismail, N H., Rahmani, M (2006), "Xanthones from Garcinia mangostana (Guttiferae)", Nat Prod Res, 20(12): pp 1067-1073 Favari, L., Perez-Alvarez, V (1997), "Comparative effects of colchicine and silymarin on CCl4-chronic liver damage in rats", Arch Med Res, 28(1): pp 11-17 Gopalakrishnan, G., Banumathi, B., Suresh, G (1997), "Evaluation of the antifungal activity of natural xanthones from Garcinia mangostana and their synthetic derivatives", J Nat Prod, 60(5): pp 519-524 Iinuma, M., Tosa, H., Tanaka, T., Asai, F., Kobayashi, Y., Shimano, R., Miyauchi, K (1996), "Antibacterial activity of xanthones from guttiferaeous plants against methicillin-resistant Staphylococcus aureus", J Pharm Pharmacol, 48(8): pp 861-865 Jakab, E., Zbinden, R., Gubler, J., Ruef, C., von Graevenitz, A., Krause, M (1996), "Severe infections caused by Propionibacterium acnes: an underestimated pathogen in late postoperative infections", Yale J Biol Med, 69(6): pp 477-482 Josephy, P D., Eling, T., Mason, R P (1982), "The horseradish-peroxidase catalyzed oxidation of 3,5,3'5'-tetramethylbenzidine Free radical and chargetransfer complex intermediates", J Biol Chem, 257: pp 3669-3675 Jung, H A., Su, B N., Keller, W J., Mehta, R G., Kinghorn, A D (2006), "Antioxidant xanthones from the pericarp of Garcinia mangostana (Mangosteen)", J Agric Food Chem, 54(6): pp 2077-2082 Kaomongkolgit, R., Jamdee, K., Chaisomboon, N (2009), "Antifungal activity of alpha-mangostin against Candida albicans", J Oral Sci, 51(3): pp 401-406 Mai Thị Hiên 45 Luận văn thạc sĩ 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Sinh học thực nghiệm Mahabusarakam, W., Proudfoot, J., Taylor, W., Croft, K (2000), "Inhibition of lipoprotein oxidation by prenylated xanthones derived from mangostin", Free Radic Res, 33(5): pp 643-659 Matsumoto, K., Akao, Y., Yi, H., Ohguchi, K., Ito, T., Tanaka, T., Kobayashi, E., Iinuma, M., Nozawa, Y (2004), "Preferential target is mitochondria in alpha-mangostin-induced apoptosis in human leukemia HL60 cells", Bioorg Med Chem, 12(22): pp 5799-5806 McAlester, G., O'Gara, F., Morrissey, J P (2008), "Signal-mediated interactions between Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans", J Med Microbiol, 57(5): pp 563-569 Misra, H., Dwivedi, B K., Mehta, D., Mehta, B K., Jain, D C (2009 ), "Development and validation of high performance thin-layer chromatographic method for fetermination of α-mangostin in fruit pericarp of mangosteen plant (Garcinia mangostana L.) using ultraviolet visible detection ", Rec Nat Prod, 3(4): pp 178-186 Molero, G., Diez-Orejas, R., Navarro-Garcia, F., Monteoliva, L., Pla, J., Gil, C., Sanchez-Perez, M., Nombela, C (1998), "Candida albicans: genetics, dimorphism and pathogenicity", Int Microbiol, 1(2): pp 95-106 Nakagawa, Y., Iinuma, M., Naoe, T., Nozawa, Y., Akao, Y (2007), "Characterized mechanism of alpha-mangostin-induced cell death: caspaseindependent apoptosis with release of endonuclease-G from mitochondria and increased miR-143 expression in human colorectal cancer DLD-1 cells", Bioorg Med Chem, 15(16): pp 5620-5628 Nakatani, K., Atsumi, M., Arakawa, T., Oosawa, K., Shimura, S., Nakahata, N., Ohizumi, Y (2002), "Inhibitions of histamine release and prostaglandin E2 synthesis by mangosteen, a Thai medicinal plant", Biol Pharm Bull, 25(9): pp 1137-1141 Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K (1979), "Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction", Anal Biochem, 95(2): pp 351-358 Pedraza-Chaverri, J., Cardenas-Rodriguez, N., Orozco-Ibarra, M., PerezRojas, J M (2008), "Medicinal properties of Mangosteen (Garcinia mangostana)", Food Chem Toxicol, 46(10): pp 3227-3239 Peres, V., Nagem, T J., de Oliveira, F F (2000), "Tetraoxygenated naturally occurring xanthones", Phytochemistry, 55(7): pp 683-710 Pothitirat, W., Chomnawang, T M., Gritsanapan, W (2009), "Anti-acne inducing bacteria activity and alpha-mangostin content of Garcinia mangostana fruit rind extracts from different provenience", Songklanakarin J Sci Technol, 31(1): pp 41-47 Mai Thị Hiên 46 Luận văn thạc sĩ 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 Sinh học thực nghiệm Pothitirat, W., Gritsanapan, W (2008), "Quantitative analysis of total mangostins in Garcinia mangostana fruit rind", J Health Res, 22(4): pp 161166 Rachel, J G., Franklin, D L (2008), "Pathogenesis of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection", Clin Infect Dis, 46(5): pp 350-359 Sakagami, Y., Iinuma, M., Piyasena, K G., Dharmaratne, H R (2005), "Antibacterial activity of alpha-mangostin against vancomycin resistant Enterococci (VRE) and synergism with antibiotics", Phytomedicine, 12(3): pp 203-208 Sen, K A., Sarkar, K K., Mazumder, C P., Banerji, N., Uusvuori, R., Hase, T A (1980), "A xanthone from Garcinia mangostana", Phytochemistry, 14(10): pp 2223-2225 Shankaranarayan, D., Gopalakrishnan, C., Kameswaran, L (1979), "Pharmacological profile of mangostin and its derivatives", Arch Int Pharmacodyn Ther, 239(2): pp 257-269 Shibata, M A., Iinuma, M., Morimoto, J., Kurose, H., Akamatsu, K., Okuno, Y., Akao, Y., Otsuki, Y (2011), "alpha-Mangostin extracted from the pericarp of the mangosteen (Garcinia mangostana Linn) reduces tumor growth and lymph node metastasis in an immunocompetent xenograft model of metastatic mammary cancer carrying a p53 mutation", BMC Med, 9: pp 69 Steinberg, D (1997), "Low density lipoprotein oxidation and its pathobiological significance", J Biol Chem, 272(34): pp 20963-20966 Sun, D., Zhang, S., Wei, Y., Yin, L (2009), "Antioxidant activity of mangostin in cell-free system and its effect on K562 leukemia cell line in photodynamic therapy", Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 41(12): pp 1033-1043 Szymonik-Lesiuk, S., Czechowska, G., Stryjecka-Zimmer, M., Slomka, M., Madro, A., Celinski, K., Wielosz, M (2003), "Catalase, superoxide dismutase, and glutathione peroxidase activities in various rat tissues after carbon tetrachloride intoxication", J Hepatobiliary Pancreat Surg, 10(4): pp 309-315 Williams, P., Ongsakul, M., Proudfoot, J., Croft, K., Beilin, L (1995), "Mangostin inhibits the oxidative modification of human low density lipoprotein", Free Radic Res, 23(2): pp 175-184 Yates, P., Stout, G H (1958), "The structure of mangostin", J Am Chem Soc, 80: pp 1691-1700 Yu, L., Zhao, M., Yang, B., Qiangzhong, Z., Jiang, Y (2007), "Phenolics from hull of Garcinia mangostana fruit and their antioxidant activities", Food Chemistry, 104: pp 176-181 Mai Thị Hiên 47 Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm PHỤ LỤC Bảng P.1 Ảnh hưởng dung môi chiết lên khối lượng cao chiết Dung môi chiết Khối lượng cao chiết (g) Lần Lần TB EP 0,105 0,065 0,085 0,028 EtOAC 0,46 0,425 0,4425 0,025 EtOH 0,81 0,78 0,795 0,021 MeOH 1,11 1,09 1,1 0,014 Bảng P.2 Ảnh hưởng thời gian chiết lên khối lượng cao chiết Khối lượng cao chiết (g) Thời gian chiết (giờ) Lần Lần TB 0,084 0,082 0,083 0,001 0,096 0,084 0,09 0,008 0,094 0,092 0,093 0,001 0,092 0,086 0,089 0,004 Bảng P.3 Ảnh hưởng nhiệt độ chiết lên khối lượng cao chiết Khối lượng cao chiết (g) Nhiệt độ chiết (C) Lần Lần TB 30 0,054 0,056 0,055 0,001 40 0,054 0,052 0,053 0,001 50 0,068 0,07 0,069 0,001 60 0,07 0,072 0,071 0,001 Bảng P.4 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi : nguyên liệu lên khối lượng cao chiết Tỷ lệ dung môi : nguyên liệu Khối lượng cao chiết (g) Lần Lần TB 0,186 0,166 0,176 0,014 0,264 0,234 0,249 0,021 0,248 0,242 0,245 0,042 Mai Thị Hiên 48 Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm Bảng P.5 Khả ức chế nấm S aureus -mangostin Nồng độ -mangostin (g/ml) Số khuẩn lạc mọc ( x 106 khuẩn lạc) % ức chế Lần Lần TB 592 604 598 332 400 366 48 39 79 53 66 18 89 7,5 19 10 13 98 10 45 99 15 11 100 20 0 00 100 Bảng P.6 Khả ức chế P aeruginosa -mangostin Nồng độ -mangostin (g/ml) Số khuẩn lạc mọc ( x 106 khuẩn lạc) % ức chế Lần Lần TB 345 301 323 31 100 317 287 302 21 6,5 200 205 279 242 52 25,1 300 182 170 176 45,5 400 160 180 170 14 47,4 500 164 158 161 50,2 600 150 146 148 54,2 700 116 132 124 11 61,6 800 125 135 130 59,8 900 107 115 111 65,6 1000 100 94 97 70,0 Mai Thị Hiên 49 Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm Bảng P.7 Khả ức chế nấm C albicans -mangostin Nồng độ -mangostin (g/ml) Số khuẩn lạc mọc ( x 106 khuẩn lạc) % ức chế Lần Lần TB 48 49 49 0,71 1000 31 29 30 1,41 38,1 1500 23 24 24 0,71 51,5 2000 23 38 31 10,61 37,1 2500 20 40 30 14,14 38,1 3000 23 40 32 12,02 35,1 Bảng P.8 Ảnh hưởng -mangostin lên hoạt độ peroxidase gan chuột Hoạt độ peroxidase gan (IU/mg protein) TT Lô ĐC Lô TN1 Lô TN2 Lô TN3 Lô TN4 Lô TN5 0,00674 0,00370 0,00745 0,00968 0,00710 0,00549 0,00299 0,00570 0,01016 0,00886 0,00697 0,00674 0,00263 0,00809 0,00939 0,01053 0,00808 0,00625 0,00307 0,00788 0,00503 0,00584 0,00760 0,00610 0,00678 0,00267 0,00338 0,00590 0,00484 0,00526 0,00699 0,00717 0,00124 0,00764 0,00388 0,00540 0,00849 0,00618 0,00426 0,00880 0,00459 0,00492 0,00760 0,00501 0,01145 0,00813 0,00533 0,00574 0,00847 0,00463 0,01333 10 0,00363 0,01130 11 0,00192 0,00763 12 0,00621 0,00607 TB +SD 0,00443 0,00597 0,00523 0,00672 0,00888 0,00605 0,00559 0,0024 0,0022 0,0036 0,0025 0,0017 0,0006 100 88 124 145 101 94 % so với đối chứng Mai Thị Hiên 50 Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm Bảng P.9 Ảnh hưởng -mangostin lên hàm lượng MDA gan chuột Hàm lượng MDA gan (mol/g protein) TT Nhóm Đc Nhóm TN1 Nhóm TN2 Nhóm TN3 Nhóm TN4 Nhóm TN5 48,6 70,7 48,7 64,98 49,28 28,85 21,0 86,7 51,4 36,94 53,21 51,76 49,2 64,9 41,0 43,03 32,93 31,33 35,2 81,7 32,7 55,77 72,28 33,33 42,7 35,3 38,1 35,02 32,37 41,59 51,1 56,3 87,7 32,53 31,25 39,58 53,3 86,1 53,8 42,71 34,46 56,25 50,1 77,6 55,4 33,81 53,3 58,8 52,7 10 62,0 27,1 11 24,2 27,1 12 52,40 86,2 TBSD 44,611,5 68,716,8 46,75,4 43,111,6 43,715,4 41,910,5 % so với đối chứng 100 154 105 97 98 94 Mai Thị Hiên 51 Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm Hình P.1 Hình ảnh chuột trước nghiên cứu Hình P.2 Hình ảnh chuột sau nghiên cứu Mai Thị Hiên 52 Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm Hình P3 Phổ carbon C13 Mai Thị Hiên 53 Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm Hình P3 Phổ Hidro Mai Thị Hiên 54 ... NHIÊN - MAI THỊ HIÊN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ MANGOSTIN TRONG VỎ QUẢ MĂNG CỤT GARCINIA MANGOSTANA L LÀM THUỐC HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ Chuyên ngành: Sinh học... tinh chế mangostin vỏ măng cụt Garcinia mangostana L làm thuốc hỗ trợ điều trị ung thư? ?? thực với mục tiêu: tách chiết tinh chế -mangostin từ vỏ măng cụt nghiên cứu số hoạt tính sinh học -mangostin. .. Ở Việt Nam Trong thuốc dân gian, măng cụt sử dụng l? ?m thuốc trị bệnh nhiễm trùng [5] Vỏ măng cụt sử dụng l? ?m nguồn nguyên liệu trình sản xuất thuốc trị bệnh Tuy nhiên, việc nghiên cứu, khai thác