Tổng hợp 2-methylisothiazol-3(2H)-on (MIT) và 5-cloro-2- methylisothiazol-3(2H)-on

Chất bảo quản dùng trong mỹ phẩm 2-methylisothiazol-3(2H)-on (MIT) và 5-cloro-2- methylisothiazol-3(2H)-on (MCT) có thể gây phản ứng có hại trên da nếu vượt quá nồng độ cho phép nhưng hiện nay trong nước chưa tự sản xuất được các chất đối chiếu này để phục vụ công tác kiểm tra chất lượng mỹ phẩm. Mục tiêu: Tổng hợp MIT và MCT ở quy mô phòng thí nghiệm đạt độ tinh khiết phù hợp để thiết lập chất đối chiếu dùng trong kiểm nghiệm mỹ phẩm.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 Nghiên cứu TỔNG HỢP 2-METHYLISOTHIAZOL-3(2H)-ON VÀ 5-CLORO-2-METHYLISOTHIAZOL-3(2H)-ON Trương Ngọc Tuyền*, Nguyễn Ngọc Vinh**, Lê Nguyễn Bảo Khánh*, Phạm Ngọc Tuấn Anh*, Nguyễn Thị Hương Giang*, Nguyễn Ngọc Anh Đào*** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Chất bảo quản dùng mỹ phẩm 2-methylisothiazol-3(2H)-on (MIT) 5-cloro-2methylisothiazol-3(2H)-on (MCT) gây phản ứng có hại da vượt nồng độ cho phép nước chưa tự sản xuất chất đối chiếu để phục vụ công tác kiểm tra chất lượng mỹ phẩm Mục tiêu: Tổng hợp MIT MCT quy mơ phịng thí nghiệm đạt độ tinh khiết phù hợp để thiết lập chất đối chiếu dùng kiểm nghiệm mỹ phẩm Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Hợp chất dị vòng MIT MCT tổng hợp từ nguyên liệu đầu acid 3-mercaptopropionic thông qua phản ứng oxy hóa, amid hóa, đóng vịng clor hóa Sản phẩm tổng hợp tinh chế sắc ký cột, xác định cấu trúc phổ IR, MS, 1H-NMR 13C-NMR, xác định độ tinh khiết HPLC-PDA Kết quả: Sản phẩm tổng hợp chứng minh cấu trúc, độ tinh khiết đạt 100% Kết luận: Đã tổng hợp thành cơng MIT, MCT có độ tinh khiết cao, đạt tiêu chuẩn thiết lập chất đối chiếu Từ khóa: 2-methylisothiazol-3(2H)-on, 5-cloro-2-methylisothiazol-3(2H)-on, methylisothiazolon, cloro methylisothiazolon, chất bảo quản, mỹ phẩm ABSTRACT SYNTHESIS OF 2-METHYLISOTHIAZOL-3(2H)-ONE AND 5-CHLORO-2-METHYLISOTHIAZOL-3(2H)-ONE Truong Ngoc Tuyen, Nguyen Ngoc Vinh, Le Nguyen Bao Khanh, Pham Ngoc Tuan Anh, Nguyen Thi Huong Giang, Nguyen Ngoc Anh Dao * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 24 - No - 2020: 41 - 45 Background: Cosmetic preservatives 2-methylisothiazol-3(2H)-one (MIT) and 5-chloro-2-methylisothiazol3(2H)-one (MCT) can cause harmful skin reactions if their concentrations are beyond the permissible limit However, at present, reference standards that used for cosmetic quality control have not been domestically produced yet Objectives: Synthesis of MIT and MCT at a laboratory scale to obtain substances with suitable purity to establish references used in cosmetic testing Method: Heterocyclic MIT, MCT compounds are synthesized from 3-mercaptopropionic acid through oxidation, amidation, ring closure and chlorination reactions The synthesized products are purified by column chromatography, identified structure by IR, MS, 1H-NMR and 13C-NMR spectra, determined purity by HPLC-PDA Results: The products are proved that they have desired structure and purity of 100% Conclusion: Successfully synthesized MIT, MCT with high purity that meet requirements for establishment Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh ***Khoa Y Dược, Trường Đại học Trà Vinh Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS.TS Trương Ngọc Tuyền ĐT: 0903330604 Email: truongtuyen@ump.edu.vn * ** B - Khoa học Dược 41 Nghiên cứu Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 of reference standards Keywords: 2-methylisothiazol-3(2H)-one, 5-chloro-2-methylisothiazol-3(2H)-one, methylisothiazolone, chloro methylisothiazolone, preservatives, cosmetics Máy đo nhiệt độ nóng chảy GallenkampĐẶT VẤNĐỀ Sanyo, máy cộng hưởng từ hạt nhân NMR Hợp chất 2-Methylisothiazol-3(2H)-on (MIT) Bruker Avance III 500 MHz, máy đo khối phổ 5-cloro-2-methylisothiazol-3(2H)-on (MCT) LC-MS Shimadzu, máy đo phổ IR Affinity-1S chất bảo quản thường dùng nhiều Shimadzu, máy sắc ký lỏng hiệu cao LC loại mỹ phẩm dầu gội, sữa tắm, kem chống solution Shimadzu nắng… phổ kháng khuẩn, kháng nấm rộng, Phương pháp nghiên cứu tương kỵ Tuy nhiên hai chất gây nhiều phản ứng có hại viêm da, dị ứng(1) Hội Phương pháp tổng hợp đồng mỹ phẩm ASEAN Cục Quản lý Dược MIT MCT tổng hợp qua giai đoạn Việt Nam quy định hỗn hợp MIT, MCT tỉ lệ : theo sơ đồ 1(3, 4) Các sản phẩm đo nhiệt độ sử dụng sản phẩm rửa nóng chảy chứng minh cấu trúc phổ: IR, với nồng độ tối đa 15 ppm, MIT riêng lẻ tối đa 100 MS, 1H-NMR 13C-NMR (Hình 1) ppm, hỗn hợp MIT, MCT tỉ lệ : phối hợp thêm Giai đoạn với MIT khơng phép sử dụng(2) Để thực Oxy hóa acid 3-mercaptopropionic tạo acid công tác kiểm tra chất lượng mỹ phẩm, việc 3,3’-dithiodipropionic sử dụng chất đối chiếu cần thiết Tuy nhiên, hai chất chưa có mặt Giai đoạn danh mục chất đối chiếu cung cấp Amid hóa tạo dẫn chất N,N’-dimethyl-3,3’các Viện Kiểm nghiệm thuốc Việt Nam Do đó, dithiodipropionamid nghiên cứu tiến hành với mục tiêu tổng hợp Giai đoạn MIT, MCT quy mơ phịng thí nghiệm đạt độ tinh Đóng vịng clor hóa tạo sản phẩm MIT khiết phù hợp để thiết lập chất đối chiếu dùng MCT kiểm nghiệm mỹ phẩm Phương pháp xác định độ tinh khiết hàm lượng ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU Nguyên liệu thiết bị Acid 3-mercaptopropionic, thionyl clorid, sulfuryl clorid từ Mỹ; methylamin từ Ấn Độ; methanol dùng cho HPLC từ Đức; hóa chất khác bao gồm iod, kali iodid, natri hydroxyd, natri bicarbonat, dicloromethan, ethyl acetat, methanol, ethanol có nguồn gốc từ Trung Quốc dùng trực tiếp không qua tinh chế Độ tinh khiết hàm lượng MIT MCT sơ xác định phương pháp HPLC Điều kiện tiến hành: cột pha đảo Phenomenex C8 4,6 ì 250 mm, pha tnh àm, th tích tiêm mẫu 10 µL, tốc độ dịng mL/ phút, chạy đẳng dịng 30 phút, hệ dung mơi pha động cho MIT methanol-nước (5:95), cho MCT methanol-nước (30:70), detector PDA, bước sóng phát 210 nm 274 nm(5) Hình Quy trình tổng hợp MIT MCT 42 B - Khoa học Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 KẾT QUẢ Tổng hợp acid 3,3’-dithiodipropionic (1) Cho từ từ iod (2,55 g; 10 mmol) vào erlen chứa sẵn hỗn hợp gồm acid 3-mercaptopropionic (2,12 g; 20 mmol), natri hydroxyd (0,8 g; 20 mmol) kali iodid (0,1 g; 0,6 mmol) 50 mL methanol, khuấy nhiệt độ phòng Sau 15 phút, natri thiosulfat thêm vào để làm màu dung dịch Cô cạn áp suất thấp, lọc, rửa với nước cất lạnh kết tinh lại ethanol 50% thu 1,83 g sản phẩm Hiệu suất 87% Acid 3,3’-dithiodipropionic (1) tinh thể trắng dạng vẩy; tan nước; dễ tan methanol, ethanol; khó tan cloroform, ethyl acetat Nhiệt độ nóng chảy: 155 oC Rf = 0,47 (nhexan-ethyl acetat, 1:1); 0,75 (ethyl acetat-ethanol, 4:1); 0,83 (cloroform-ethanol, 9:1) Phổ IR (cm-1): 2928 (νO-H), 1689 (νC=O), 1236 (νC-O) Phổ MS (m/z) C6H10O4S2 [M–H]– dự kiến: 208,9942; [M–H]– tìm thấy: 208,9899 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ (ppm): 2,95 (2H, t, J = Hz, S-CH2); 2,73 (2H, t, J = Hz, CH2) Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ (ppm): 175,3 (C=O); 49,0 (CO-CH2); 34,7 (S-CH2) Tổng hợp N,N’-dimethyl-3,3’dithiodipropionamid (2) Cho sản phẩm (1) (2,1 g; 10 mmol) vào bình cầu hai cổ có chứa SOCl2 (7 mL, 96 mmol), khuấy 60 oC đến (1) tan hết tạo thành chất lỏng màu vàng cam Để nguội hòa tan 10 mL dicloromethan Nhỏ từ từ dung dịch vào bình cầu chứa methylamin 40% (8 mL, 93 mmol) làm lạnh nước đá đồng thời khuấy mạnh Sau khuấy nhiệt độ phòng, lớp dicloromethan tách ra, làm khan với natri sulfat cô cạn áp suất giảm thu sản phẩm rắn, kết tinh lại ethyl acetat 1,38 g Hiệu suất: 58,62% N,N’-Dimethyl-3,3’-dithiodipropionamid tinh thể hình kim màu trắng; dễ tan methanol, ethanol; khó tan ethyl acetat, n-hexan Nhiệt độ nóng chảy: 105 oC Rf = 0,23 (ethyl acetat-ethanol, 14:1); 0,50 (cloroform-ethanol, B - Khoa học Dược Nghiên cứu 9:1) Phổ IR (cm-1): 3314 (νNH), 1637 (νC=O), 1541 (δNH) Khối phổ MS C8H16N2O2S2; [M+Na]+ dự kiến: 259,0551; [M+Na]+ tìm thấy: 259,0504 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 6,43 (1H, s, NH); 2,99 (2H, t, J = Hz, S-CH2); 2,83 (3H, d, J = Hz, CH3); 2,59 (2H, t, J = Hz, CH2) Phổ 13CNMR (125 MHz, CDCl3) δ (ppm): 171,8 (C=O); 35,8 (CO-CH2); 34,4 (S-CH2); 26,4 (CH3) Tổng hợp 2-methylisothiazol-3(2H)-on 5cloro-2-methylisothiazol-3(2H)-on (3a, 3b) Phân tán sản phẩm (2) (2,36 g; 10 mmol) 10 mL dicloromethan, sau nhỏ từ từ vào bình cầu cổ chứa sẵn dung dịch gồm sulfuryl clorid (2,43 mL; 30 mmol) 10 mL dicloromethan làm lạnh oC Sau nhỏ xong, khuấy tiếp nhiệt độ phòng Theo dõi sắc ký lớp mỏng với pha động ethyl acetat đến vết nguyên liệu biến dừng phản ứng Tách lớp dầu bên hòa tan nước cho từ từ dung dịch natri bicarbonat bão hòa vào đến pH khoảng để chuyển sản phẩm từ dạng muối HCl thành dạng base Chiết với ethyl acetat lần, lần 10 mL sau làm khan với natri sulfat Cô quay áp suất giảm thu hỗn hợp (3a) (3b) dạng dầu màu vàng nhạt Tiến hành sắc ký cột với silica gel 0,2-0,5 µm, pha động ethyl acetatethanol (15:1) để tách (3a) (3b) Sau cô dung môi, (3b) xuất dạng dầu nhầy nên tiến hành kết tinh lại n-hexan tinh thể hình kim màu trắng Tổng khối lượng sản phẩm thu 0,64 g Hiệu suất chung đạt 45,12% Sản phẩm (3a) chất lỏng vàng nhạt; dễ tan nước, methanol, ethanol; khó tan cloroform, ethyl acetat, n-hexan Rf = 0,28 (ethyl acetat); 0,42 (ethyl acetat-ethanol, 14 : 1); 0,60 (cloroform-ethanol, : 1) (3b) tinh thể trắng hình kim; dễ tan nước, methanol, ethanol; tan cloroform, ethyl acetat, khó tan n-hexan, nóng chảy 57 oC Rf = 0,68 (ethyl acetat); 0,75 (ethyl acetat-ethanol, 14 : 1); 0,72 (cloroform-ethanol, : 1) Dữ liệu phổ hai chất thể bảng 1, đối chiếu với liệu tham khảo cho phép khẳng định cấu trúc sản phẩm tổng hợp 43 Nghiên cứu Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 Bảng Thông tin cấu trúc sản phẩm MIT MCT (cm-1) Phổ IR MIT Khối phổ MS (C4H5NOS) Phổ 1H-NMR δ (ppm) Phổ 13C-NMR δ (ppm) Phổ IR (cm-1) MCT Khối phổ MS (C4H4ClNOS) Phổ 1H-NMR δ (ppm) Phổ 13C-NMR δ (ppm) Sản phẩm tổng hợp 3110 (ν=C-H), 2984 (νC-H), 1646 (νC=O), 1590 (νC=C), 1328 (νC-N) [M+H]+ dự kiến: 116,0170; [M+H]+ tìm thấy: 116,0180 Tài liệu tham khảo(6) 1648 (νC=O) [M]: 115,1 8,49 (1H, d, J = 6,5 Hz, S-CH=); 6,32 (1H, d, J = 6,5 Hz, 8,42 (1H, d, J = 6,1 Hz, S-CH=); 6,22 (1H, d, CH=); 3,41 (3H, s, CH3) (a) J = 6,1 Hz, CH=); 3,35 (3H, s, CH3) (a’) (b) 168,5 (C=O); 141,9 (S-CH=); 113,5 (CH=); 29,6 (CH3) 172,0 (C=O); 143,8 (S-CH=); 114,9 (CH=); 31,2 (CH3) (b’) 3075 (ν=C-H), 1641 (νC=O), 1528 (νC=C), 1296 (νC-N) 1659 (νC=O) [M+H]+ dự kiến: 149,9780; [M+H]+ tìm thấy: 149,9744 [M]: 151,0 (37Cl); 149,0 (35Cl) 6,44 (1 H, s, CH=); 3,35 (3H, s, CH3) (c) 168,8 (C=O); 147,6 (CCl); 113,9 (CH=); 30,5 (CH3) (d) 6,20 (1H, s, CH=); 3,29 (3H, s, CH3) (c’) 166,9 (C=O); 145,3 (CCl); 114,3 (CH=); 29,9 (CH3) (d’) 500 MHz, D2O; (a’) 200 MHz, CD3OD; (b) 125 MHz, DMSO-d6; (b’) 50 MHz, CD3OD; (c) 500 MHz, D2O; (c’) 200 MHz, CDCl3; (d) 125 MHz, D2O ; (d’) 50 MHz, CDCl3 (a) Xác định độ tinh khiết hàm lượng 2-methylisothiazol-3(2H)-on, 5-cloro-2methylisothiazol-3(2H)-on phương pháp sắc ký lỏng Xác định độ tinh khiết hàm lượng mẫu thử Sắc ký đồ cho thấy hai sản phẩm có độ tinh khiết cao Với MIT, kể quan sát bước Chuẩn bị mẫu thử Cân xác khoảng 10 mg MIT thêm vừa đủ 20 mL methanol, thực tương tự với MCT sóng thấp 210 nm thấy đỉnh tạp nhỏ, chiếm tỉ lệ khơng đáng kể (Hình 2) Điều kiện tiến hành Như phần phương pháp nghiên cứu Còn sản phẩm MCT có pic sắc ký đồ quan sát hai bước sóng Khảo sát tính phù hợp hệ thống (Hình 3) Dựa theo phần trăm diện tích pic, có Tiêm lần mẫu thử MIT MCT Hệ thống thể kết luận độ tinh khiết sắc ký hai sản sắc ký đạt yêu cầu độ thích hợp hệ thống để phẩm đạt 100% phân tích mẫu MIT MCT (Bảng 2) Bảng Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình phân tích HPLC Tên chất MIT MCT Thời gian lưu (phút) 10,7 (RSD = 0,2%) 9,6 (RSD = 0,07%) Hệ số bất đối 0,8 ≤ AS 1,5 1,4 1,5 Din tớch (àV ì giõy) RSD ≤ 2% 6798502 (RSD = 0,1%) 10741092 (RSD = 0,2%) Số đĩa lý thuyết N ≥ 2000 5264 11627 Hình Sắc ký đồ MIT (I) bước sóng 210 nm; (II) bước sóng 274 nm 44 B - Khoa học Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 Nghiên cứu Hình Sắc ký đồ MCT (III) bước sóng 210 nm; (IV) bước sóng 274 nm KẾT LUẬN Từ nguyên liệu đầu acid 3mercaptopropionic tác nhân phản ứng đơn giản, tổng hợp thành công 2methylisothiazol-3(2H)-on 5-cloro-2methylisothiazol-3(2H)-on quy mơ phịng thí nghiệm qua giai đoạn oxy hóa, amid hóa, đóng vịng clor hóa Hai sản phẩm đạt độ tinh khiết sắc ký 100% kiểm tra phương pháp HPLC, cột pha đảo Phenomenex C8, đầu dị PDA, bước sóng phát 210 274 nm Độ tinh khiết sản phẩm thu phù hợp với tiêu chuẩn thiết lập chất đối chiếu dùng kiểm nghiệm mỹ phẩm Với kết nghiên cứu bước đầu, tiếp tục khảo sát để tối ưu hóa điều kiện phản ứng nhằm nâng cao hiệu suất quy trình tổng hợp tiến hành thiết lập chất đối chiếu TÀI LIỆU THAM KHẢO Taubert K, Kraus S, Schulze B (2002) Isothiazol-3(2H)-ones, part I: synthesis, reaction and biological activity Journal of Sulfur Reports, 23(1):79-121 B - Khoa học Dược Cục Quản lý Dược (2018) Biên họp ACSB 27, ACC 27 phụ lục Hiệp định mỹ phẩm ASEAN thống sau họp ACC 27 URL: https://dav.gov.vn/bien-ban-cuochop-acsb-27-acc-27-va-phu-luc-hiep-dinh-my-pham-aseanthong-nhat-sau-cuoc-hop-acc-27 n779.html (access on 24/05/2020) Easton J (1985) Syntheses of β-Lactams by ring contraction ofisothiazolidinones Journal of the Chemical Society, I: 153 – 157 Kim JM, Kim JS (2002) Process for preparation of 3isothiazolone mixture and composition comprising the mixture US Patents 6376680B1 Viện Le Hoa, Vo Hung, Do Trang, Thai Thu, Dinh Le (2019) Development and validation of an HPLC method for simultaneous assay of MCI and MI in shampoos containing plant extracts International Journal of Analytical Chemistry, 2019(6):1-10 Sanchez R (2003) Studies of chemical selectivity of hapten, reactivity, and skin sensitization potency Synthesis and studies on the reactivity toward model nucleophiles of the 13C-labeled skin sensitizers, 5-chloro-2-methylisothiazol3-one and 2-methylisothiazol-3-one Chem Res Toxicol, 16(5):627-636 Ngày nhận báo: 04/02/2020 Ngày phản biện nhận xét báo: Ngày báo đăng: 24/04/2020 20/07/2020 45 ... GallenkampĐẶT VẤNĐỀ Sanyo, máy cộng hưởng từ hạt nhân NMR Hợp chất 2 -Methylisothiazol-3(2H)-on (MIT) Bruker Avance III 500 MHz, máy đo khối phổ 5-cloro -2 -methylisothiazol-3(2H)-on (MCT) LC-MS Shimadzu,... (S-CH2); 26,4 (CH3) Tổng hợp 2 -methylisothiazol-3(2H)-on 5cloro -2 -methylisothiazol-3(2H)-on (3a, 3b) Phân tán sản phẩm (2) (2,36 g; 10 mmol) 10 mL dicloromethan, sau nhỏ từ từ vào bình cầu cổ chứa... trình tổng hợp MIT MCT 42 B - Khoa học Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 KẾT QUẢ Tổng hợp acid 3,3’-dithiodipropionic (1) Cho từ từ iod (2,55 g; 10 mmol) vào erlen chứa sẵn hỗn hợp