(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của xạ khuẩn streptomyces orientalis 4912

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Chu Thanh Bình NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VANCOMYXIN CỦA XẠ KHUẨN STREPTOMYCES orientalis 4912 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội – Năm 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Chu Thanh Bình NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VANCOMYXIN CỦA XẠ KHUẨN STREPTOMYCES orientalis 4912 Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN PHƢƠNG NHUỆ Hà Nội – Năm 2012 Lời cảm ơn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Lê Gia Hy, TS Nguyễn Phương Nhuệ, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, hướng cho ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn TS Phí Quyết Tiến – trưởng phịng cán Phịng Cơng nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình nghiên cứu Tơi xin trân trọng cảm ơn thày cô giáo Khoa Sinh học, Bộ môn Vi sinh vật học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học Tơi xin trân trọng cảm ơn Phân viện Công nghệ sinh học – Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học luận văn Tôi xin cảm ơn hỗ trợ kinh phí đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vancomyxin hydrochlorid công suất kg/mẻ” mã số 032/2012/HĐĐTCNHD, thuộc “Chương trình nghiên cứu khoa học cơng nghệ trọng điểm quốc gia phát triển cơng nghiệp Hóa dược đến năm 2020” Cuối cùng, tơi xin tỏ lịng biết ơn đến gia đình bè bạn, người ln bên tơi, động viên, góp ý tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Chu Thanh Bình MỤC LỤC Lời cảm ơn ………………………………………………………… Mục lục ……………………………………………………………….…… Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt…………………………………… Danh mục bảng ………………………………………………………… Danh mục hình vẽ, đồ thị……………………………………………… MỞ ĐẦU …………………………………………………………… …… CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………… … 1.1 Chất kháng sinh vancomyxin ………………………………………… 1.1.1 Lịch sử phát triển kháng sinh vancomyxin………………………… 1.1.2 Đặc tính vancomyxin 1.1.3 Cơ chế kháng khuẩn vancomyxin………………………………… 1.1.4 Ứng dụng điều trị bệnh vancomyxin……………………… 1.2 Streptomyces orientalis yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp vancomyxin … 1.2.1 Streptomyces orientalis 1.2.2 Sinh tổng hợp vancomyxin xạ khuẩn……………………………… 1.2.3 Nghiên cứu qui trình cơng nghệ sản xuất vancomyxin ……………… 11 1.3 Nghiên cứu trì nâng cao hiệu suất chủng giống sản xuất vancomyxin……………………… ……………………………… 14 1.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất vancomyxin…… ……… 18 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……… 21 2.1 Vật liệu .……………… …………………………………………… 21 2.1.1 Chủng giống vi sinh vật ………………………………………… 21 2.1.2 Hoá chất …………………………………………………………… 21 2.1.3 Thiết bị ……………………………………………………………… 21 2.1.4 Môi trƣờng …………………………………………………………… 22 2.1.5 Các dung dịch đệm 24 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu …… …………………………………… 24 2.2.1 Bảo quản giống ……………………………………………………… 24 2.2.2 Xác định đặc điểm sinh học ………………………………… 25 2.2.3 Xác định sinh khối ………………………………………………… 25 2.2.4 Xác định hoạt tính kháng sinh……………………………………… 25 2.2.5 Phƣơng pháp lên men 26 2.2.6 Phƣơng pháp phá vỡ tế bào sóng siêu âm 28 2.2.7 Thu nhận tế bào trần xạ khuẩn………………………………………… 28 2.2.8 Nghiên cứu nâng cao hiệu suất sinh kháng sinh xử lý UV Nmetyl-N‟-nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG)………………………… 29 2.2.9 Xây dựng đƣờng cong sống sót……………………………………… 30 2.2.10 Xác định biến đổi hình thái khuẩn lạc hoạt tính kháng sinh… 30 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………… 32 3.1 Đặc điểm sinh học chủng Streptomyces orientalis 4912 32 3.1.1 Đặc điểm nuôi cấy…………………………………………………… 32 3.1.2 Đặc điểm hình thái…………………………………………………… 33 3.2 Khả sinh tổng hợp kháng sinh chủng S orientalis 4912 34 3.3 Nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng S orientalis 4912……… 36 3.3.1 Thu nhận bào tử tế bào trần từ chủng S.orientalis 4912……………… 36 3.3.2 Nâng cao HTKS chủng S orientalis 4912 phƣơng pháp gây đột biến dùng tia UV N-metyl-N‟-nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG)…………………………………………………………………… 40 3.4 Một số đặc điểm sinh học biến chủng Streptomyces orientalis 491281- 61……………………………………………… 46 3.5 Tối ƣu hóa quy trình lên men biến chủng S orientalis 4912-81-61… 48 3.5.1 Lựa chọn môi trƣờng nhân giống…………………………………… 48 3.5.2 Lựa chọn môi trƣờng lên men……………………………………… 48 3.5.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp vancomyxin biến chủng S orientalis 4912-81-61…………………………………… 48 3.5.4 Biến động trình lên men sinh tổng hợp vancomyxin biến chủng S orientalis 4912-81-61 thiết bị lên men Bioflo………… 57 KẾT LUẬN 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………… 59 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Phổ kháng khuẩn vancomyxin 3.1 Đặc điểm nuôi cấy chủng S orientalis 4912 32 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn chủng S orientalis 4912 35 3.3 Ảnh hƣởng nồng độ lysozym tới khả tạo TBT chủng S orientalis 4912 38 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ glyxin tới khả tạo TBT chủng S orientalis 4912 39 3.5 Ảnh hƣởng nồng độ MNNG tới khả sống sót chủng S orientalis 4912 41 3.6 Ảnh hƣởng pH xử lý MNNG tới khả sống sót chủng S orientalis 4912 41 3.7 Ảnh hƣởng thời gian xử lý MNNG tới khả sống sót chủng S orientalis 4912 42 3.8 Sự biến đổi hình thái khuẩn lạc chủng S orientalis 4912 sau xử lý UV MNNG 44 3.9 Kết lên men biến chủng sau đột biến 45 3.10 Một số đặc điểm sinh học biến chủng S orientalis 4912-81-61 47 3.11 Khả sinh trƣởng biến chủng S orientalis 4912-81-61 số môi trƣờng 48 3.12 Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến khả sinh tổng hợp vancomyxin biến chủng S orientalis 4912-81-61 49 3.13 Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến khả sinh tổng hợp vancomyxin biến chủng S orientalis 4912-81-61 50 3.14 Ảnh hƣởng bột đậu tƣơng, glucoza đƣờng saccaroza tới khả sinh tổng hợp vancomyxxin biến chủng S orientalis 491281-61 51 3.15 Ảnh hƣởng CaCl2 đến khả sinh tổng hợp vancomyxin biến chủng S orientalis 4912-81-61 52 3.16 Ảnh hƣởng CuSO4 đến khả sinh tổng hợp vancomyxin biến chủng S orientalis 4912-81-61 52 3.17 Ảnh hƣởng pH, nhiệt độ, tỷ lệ giống đến khả sinh tổng hợp vancomyxin biến chủng S orientalis 4912-81-61 54 3.18 Ảnh hƣởng oxy hòa tan tới sinh trƣởng sinh tổng hợp vancomyxin biến chủng S.orientalis 4912-81-61 56 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Tên hình Trang 1.1 Cấu trúc hóa học vancomyxin 1.2 Các bƣớc công thành tế bào vi khuẩn vancomyxin 1.3 Quá trình tổng hợp vancomyxin tế bào xạ khuẩn 10 3.1 Khuẩn lạc chủng S orientalis 4912 MT 48 33 3.2 Hình dạng bào tử chủng S orientalis 4912 33 3.3 Hình dạng khuẩn ty chuỗi bào tử chủng S orientalis 4912 34 3.4 Hoạt tính kháng sinh kháng B subtilis ATCC 6633 chủng S orientalis 4912 35 3.5 Tế bào trần chủng S orientalis kính hiển vi 36 3.6 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy tới khả tạo thành TBT chủng S orientalis 4912 37 3.7 Ảnh hƣởng thời gian xử lý lysozym tới khả tạo thành TBT chủng S orientalis 4912 37 3.8 Khả sống sót tế bào trần bào tử chủng 4912 sau xử lý UV MNNG 40 3.9 Hình dạng khuẩn lạc chủng S orientalis 4912 sau chiếu tia UV tế bào trần 43 3.10 HTKS biến chủng nhận đƣợc sau gây đột biến tế bào trần 45 3.11 Khuẩn lạc biến chủng S orientalis 4912-81-61 (A) chủng S orientalis 4912 (B) 46 3.12 Ảnh hƣởng độ thơng khí tới khả sinh tổng hợp vancomyxin biến chủng S orientalis 4912-81-61 55 3.13 Biến động trình lên men sinh tổng hợp vancomyxin biến chủng S orientalis 4912-81-61 thiết bị Bioflo 110 57 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT BT Bào tử CKS Chất kháng sinh CMC Cacboxyl metyl xenluloza ĐKVVK Đƣờng kính vịng vơ khuẩn HTKS Hoạt tính kháng sinh KS Kháng sinh KTCC Khuẩn ty chất KTKS Khuẩn ty khí sinh MNNG N-metyl-N‟-nitro-N-nitrosoguanidin MT Môi trƣờng SK Sinh khối SKK Sinh khối khô SS Tế bào sống sót TBT Tế bào trần VSV Vi sinh vật MỞ ĐẦU Theo thống kê, Việt Nam thuộc vào nƣớc nhập thuốc nhiều giới, hàng năm khoảng 350-400 triệu USD, kháng sinh chiếm thị phần tiêu thụ cao Dự kiến đến năm 2020, nƣớc cần năm 1,5 tỷ USD tiền thuốc, kháng sinh chiếm 30% Theo Quyết định số 61/2007/QĐ- TTg ngày 07/5/2007 Thủ tƣớng Chính phủ phê duyệt “Chương trình Nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển cơng nghệ hóa dược đến năm 2020” mục tiêu chƣơng trình là: “Nghiên cứu tạo cơng nghệ có chất lƣợng cao phù hợp với điều kiện sản xuất nƣớc, làm chủ ứng dụng cơng nghệ đại nƣớc ngồi, tiến tới chủ động việc sản xuất thuốc chữa bệnh nƣớc” Do vậy, việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học tiên tiến, phù hợp với điều kiện kinh tế, nhằm phát triển sản xuất kháng sinh Việt Nam cần thiết Vancomyxin nguyên liệu để nghiên cứu tạo loại kháng sinh bán tổng hợp với đặc tính chữa bệnh cao chọn lọc Chất kháng sinh đƣợc sản xuất nhờ xạ khuẩn Streptomyces orientalis Việc nâng cao khả sinh kháng sinh vancomyxin chủng hạ giá thành sản phẩm cần thiết Do vậy, tiến hành nghiên cứu đề tài:“Nghiên cứu nâng cao khả sinh tổng hợp vancomyxin xạ khuẩn Streptomyces orientalis” với nội dung nhƣ sau: Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng S orientalis Nghiên cứu nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng S orientalis Nghiên cứu tối ƣu môi trƣờng điều kiện lên men chủng S orientalis 10 Trong thí nghiệm, chủng 61 đƣợc ni lắc bình tam giác 500 ml với 75 ml MT Hàm lƣợng đƣờng sacaroza thay đổi từ 15-75 g/l; bột đậu tƣơng thay đổi từ 5-45 g/l; glucoza từ 5-25 g/l Từ bảng 3.14, tìm đƣợc khoảng có ý nghĩa công nghệ thành phần MT lên men là: đƣờng kính 30-60 g/l; glucoza 10-20 g/l; bột đậu tƣơng 15-35 g/l Tối ƣu thành phần MT lên men theo phƣơng pháp BoxWilson, lập đƣợc phƣơng trình hồi qui nhƣ sau: Y  b0  b1 ~ x1  b2 ~ x2  b3 ~ x3  23,24  0,35~ x1  0,4~ x2  0,61~ x3 Từ thực hiên tối ƣu hoá chọn đƣợc bƣớc nhảy x1 (glucoza) 0,5 g/l; x2 (đƣờng saccaroza) 1,7 g/l; bƣớc nhảy x3 (bột đậu tƣơng)là 1,4 g/l Thực nghiệm theo ma trận tiến lên tìm đƣợc thành phần MT cho sinh tổng hợp vancomyxin cao biến chủng 61 (g/l): đƣờng kính 51,8; glucoza 17; bột đậu tƣơng 30,6; NaCl 2,5; CaCO3 2; pH 6,5-7,0 Trên MT tối ƣu, sau 120 lên men, CKS tích lũy đạt 2603 mcg/ml Bảng 3.15 Ảnh hƣởng CaCl2 Bảng 3.16 Ảnh hƣởng CuSO4 đến khả sinh tổng hợp đến khả sinh tổng hợp vancomyxin biến chủng S vancomyxin biến chủng S orientalis 4912-81-61 orientalis 4912-81-61 Hàm lƣợng HTKS Hàm lƣợng HTKS CaCl2.2H2O (mcg/ml) CuSO4.5H2O (mcg/ml) (mg/l) (mg/l) 2603 2603 2608 2603 2613 2611 10 2620 10 2621 20 2623 20 2595 40 2629 40 2458 100 2490 63 Theo số tài liệu, trình lên men vancomyxin, chất khống có ảnh hƣởng tích cực lên hoạt động enzym Tiến hành thí nghiệm với số muối khống đƣợc cho có tác động tốt lên khả sinh vancomyxin nhƣ CaCl2 CuSO4 [29], [33] Kết nghiên cứu bảng 3.15 3.16 cho thấy, nghiên cứu riêng rẽ loại muối khống, hàm lƣợng CaCl2.2H2O thích hợp 40 mg/l, hàm lƣợng CuSO4 đƣợc lựa chọn 10 mg/l Khi MT có hàm lƣợng muối khống lớn HTKS chủng giảm Đặc biệt kết hợp loại muối khoáng MT tối ƣu hàm lƣợng lựa chọn trên, sau thời gian lên men 120 giờ, hoạt tính kháng sinh tăng lên, đạt 2648 mcg/ml Theo số tài liệu [30], [33], [48], [54], tối ƣu điều kiện nuôi cấy nhƣ pH, nhiệt độ, độ oxy hòa tan, thành phần MT lên men tăng khả sinh kháng sinh chủng sản lên gần lần Trên sở MT tối ƣu có thành phần (g/l): đƣờng kính 51,8; glucoza 17; bột đậu tƣơng 30,6; NaCl 2,5; CaCO3 2; CaCl2.2H2O 0,04; CuSO4.5H2O 0,01; pH 6,5-7,0; tiếp tục nghiên cứu tối ƣu điều kiện lên men cho sinh tổng hợp vancomyxin biến chủng S orientalis 491281-61 3.5.3.2 Ảnh hưởng số điều kiện lên men Ảnh hƣởng yếu tố điều kiện lên men nhƣ pH ban đầu MT, nhiệt độ, tỷ lệ giống tiếp vào MT chủng 61 đƣợc nghiên cứu riêng rẽ bình tam giác Dải pH khảo sát 6-7,5; nhiệt độ 25-32oC; tỷ lệ tiếp giống 4-10% Kêt bảng 3.17 cho thấy, tỷ lệ tiếp giống khơng có ảnh hƣởng rõ rệt đến trình lên men Nhƣ vậy, lựa chọn tỷ lệ tiếp giống 4% cho thí nghiệm Khi lên men nhiệt độ 25, 28, 30 32oC HTKS chủng 61 đạt cao 2657 mcg/ml 30oC So với chủng gốc 4912, nhiệt độ tối thích cho lên men sinh vancomyxin chủng 61 cao 2oC Độ pH tối ƣu cho sinh vancomyxin chủng 4912-81-61 6,5 - 7, điều phù hợp với số tài liệu công 64 bố S orientalis pH thích hợp cho sinh trƣởng đồng thời pH thích hợp cho tạo thành CKS [29], [30], [33] Bảng 3.17 Ảnh hƣởng pH, nhiệt độ, tỷ lệ giống đến khả sinh tổng hợp vancomyxin biến chủng S orientalis 4912-81-61 pH ban HTKS Nhiệt độ HTKS Tỷ lệ giống HTKS đầu (mcg/ml) (oC) (mcg/ml) (%) (mcg/ml) 2013 25 1506 2645 6,5 2648 28 2648 2648 2665 30 2657 2642 7,5 2110 32 1618 10 2439 Nhƣ vậy, biến chủng 61 khác biệt so với chủng gốc khả sinh vancomyxin cao cịn giữ đặc tính sinh lý ƣa ấm ƣa pH trung tính Trong thí nghiệm với biến chủng áp dụng điều kiện: pH ban đầu 7,0; tỷ lệ tiếp giống 4% nhiệt độ nuôi 30oC Chủng S orientalis vi sinh vật hiếu khí, hàm lƣợng oxy hịa tan MT nhân giống lên men đóng vai trò quan trọng sinh trƣởng sinh tổng hợp vancomyxin Nhu cầu oxy biến chủng 61 đƣợc đánh giá cách gián tiếp thơng qua ni lắc bình tam giác 500 ml với thể tích MT thay đổi từ 50, 75, 100, 125 150 ml Tỷ lệ MT thể tích bình tƣơng ứng là: 10, 15, 20, 25 30% Kết đo HTKS cho thấy lƣợng kháng sinh đạt cao 2665 mcg/ml thể tích MT 50 ml, tƣơng ứng với 10% thể tích bình Kiểm tra song song phƣơng pháp đục lỗ thạch cho kết tƣơng tự (Hình 3.12), 50, 75, 100, 125 150 mẫu tƣơng ứng với thể tích MT lên men Trên hình thấy rõ hoạt tính kháng sinh giảm mạnh thể tích MT khác Điều phù hợp với cơng bố tác giả khác nghiên cứu sinh 65 tổng hợp vancomyxin từ xạ khuẩn S orientalis thể tích MT lên men chiếm khoảng 10 % so với thể tích bình phù hợp [30], [47] Theo số tài liệu [30], [33] lên men xạ khuẩn S orientalis sinh vancomyxin quy mô pilot, điều chỉnh hàm lƣợng oxy hòa tan MT mức 20-30% cách thay đổi tốc độ khuấy tăng HTKS chủng sản lên đáng kể Hình 3.12 Ảnh hƣởng độ thơng khí tới khả sinh tổng hợp vancomyxin biến chủng S orientalis 4912-81-61 Trong 50, 75, 100, 125 150 thể tích mơi trƣờng lên men (ml) bình tam giác dung tích 500 ml Để nghiên cứu ảnh hƣởng hàm lƣợng oxy hòa tan MT tới sinh trƣởng sinh tổng hợp vancomyxin thiết bị Bioflo, thí nghiệm lên men biến chủng 4912-81-61 đƣợc thực hệ thống Bioflo 110 dung tích 7,5 lit Khí nén đƣợc cấp với tốc độ khơng đổi lít khơng khí/ lít MT/ phút Tốc độ khuấy bình đối chứng đƣợc trì 500 vịng/phút suốt q trình lên men, cịn bình thí nghiệm đƣợc điều chỉnh nhằm trì dO2 mức: dƣới 10%, khoảng 10-20, 20-30 30-40% Quan sát thí nghiệm cho thấy dO2 giảm nhanh, sau 24 xuống tới 60% từ 36 đến 48 lên men phải điều chỉnh tốc độ khuấy để trì dO2 mức mong muốn Ở bình đối chứng, sau 48 dO2 xuống tới 20% giữ mức 66 thấp Kết xác định sinh khối khô HTKS sau 120 lên men đƣợc trình bày bảng 3.18 Theo đó, dO2 đƣợc trì mức 20-30% lƣợng vancomyxin sinh khối đạt cao nhất, tƣơng ứng 2983 mcg/ml 9,8 mg/ml Mẫu đối chứng cho kết thấp hơn, sinh khối đạt 8,5 mg/ml HTKS 2509 mcg/ml Nhƣ vậy, kết thí nghiệm cho thấy việc cung cấp đủ oxy hòa tan bảo đảm đảo trộn tốt bình lên men điều kiện thiết yếu sản xuất vancomyxin Điều phù hợp với nhiều tài liệu cơng bố ảnh hƣởng oxy hịa tan tới trình trao đổi chất hình thành sản phẩm Một số chủng có phản ứng dễ nhận biết nồng độ oxy hịa tan thấp, ví dụ dO2 dƣới mức 20% MT nuôi cấy xạ khuẩn S orientalis xuất sắc tố màu đỏ [42] Tƣơng tự, lên men sản xuất erythromyxin từ Saccharopolyspora eythraea điều kiện oxy thấp tạo nên sắc tố đỏ Tăng sản lƣợng erythromyxin xephalosporin C cách điều chỉnh lƣợng oxy hòa tan MT lên men đƣợc công bố Brunker DeModena Dunstan công bố lên men chủng S orientalis ATCC 19795 điều kiện oxy thấp khơng có tổng hợp vancomyxin [17] Bảng 3.18 Ảnh hƣởng oxy hòa tan tới sinh trƣởng sinh tổng hợp vancomyxin biến chủng S orientalis 4912-81-61 Oxy hòa tan (%) Sinh khối khô (mg/ml) HTKS (mcg/ml) Đối chứng 8,5 2509 0†10 8,9 2680 10 † 20 9,5 2705 20 ÷ 30 9,8 2983 30 † 40 9,5 2552 Có thể tóm tắt kết nghiên cứu tối ƣu điều kiện thành phần MT lên men cho biến chủng S orientalis 4912-81-61 nhƣ sau: MT tối ƣu bao gồm (g/l): đƣờng kính 51,8; glucoza 17; bột đậu tƣơng 30,6; NaCl 2,5; CaCO3 2; CaCl2.2H2O 0,04; 67 CuSO4.5H2O 0,01 Điều kiện lên men thích hợp nhất: pH 7, nhiệt độ 30oC, tỷ lệ tiếp giống 4%, thể tích MT lên men chiếm 10% so với thể tích bình (quy mơ bình tam giác) dO2 mức 20-30% tốc độ khuấy tới 800 vịng/phút (quy mơ bình lên men Bioflo 110) 3.5.3 Biến động trình lên men sinh tổng hợp vancomyxin biến chủng S orientalis 4912-81-61 thiết bị lên men Bioflo Để xác định đƣợc thời điểm thu hồi CKS thích hợp cần nghiên cứu động thái trình lên men sinh tổng hợp vancomyxin biến chủng 61 Thí nghiệm đƣợc thực thiết bị lên men Bioflo 110 dung tích 14 lít với điều kiện lên men xác định đƣợc mục Kết trình bày hình 3.13 cho thấy, biến chủng 61 phát triển tốt bình lên men, đặc biệt từ 48 sinh khối chủng tăng nhanh đạt 5,8 mg/ml Cũng thời điểm chủng bắt đầu sinh CKS, tới 120 nồng độ đạt cực đại 2983 mcg/ml sinh khối đạt 9,8 mg/ml Trong 24 đầu lƣợng đƣờng giảm ít, nhƣng sau thời điểm chủng phát triển mạnh tiêu thụ đƣờng với tốc độ nhanh chóng Nhƣ 120 thời điểm thích hợp để thu hồi CKS, kéo dài thêm HTKS chủng bị giảm xuống pH, Sinh khối (mg/ml) Đường khử (mg/ml), HTKS (x100 mcg/ml) 12 70 10 60 50 40 30 20 10 0 24 48 72 96 120 144 Thời gian (giờ) pH Sinh khối Đường khử HTKS Hình 3.13 Biến động trình lên men sinh tổng hợp vancomyxin biến chủng S orientalis 4912-81-61 thiết bị Bioflo 110 68 KẾT LUẬN Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn S orientalis 4912 cho thấy, chủng có khả sử dụng nhiều nguồn đƣờng; sinh trƣởng tốt khoảng nhiệt độ 28-30oC pH 6-9; có khả chịu NaCl đến 6% không sinh xenlulaza Chủng 4912 có hoạt phổ kháng khuẩn rộng mạnh, ức chế đƣợc vi khuẩn Gram dƣơng Gram âm Bằng phƣơng pháp gây đột biến tế bào trần từ chủng S orientalis 4912 dùng N-metyl-N‟-nitro-N-nitrosoguanidin, chọn lọc đƣợc biến chủng ký hiệu S orientalis 4912-81-61 có hoạt tính kháng sinh cao nhất, cao chủng gốc 94,3 % Môi trƣờng lên men biến chủng S orientalis 4912-81-61 sản xuất vancomyxin đƣợc tối ƣu hóa với thành phần nhƣ sau (g/l): đƣờng kính 51,8; glucoza 17; bột đậu tƣơng 30,6; NaCl 2,5; CaCO3 2; CaCl2.2H2O 0,04; CuSO4.5H2O 0,01; pH ban đầu 7,0 Với môi trƣờng này, lên men biến chủng 491281-61 thiết bị Bioflo 110 dung tích 14 lít cho lƣợng kháng sinh cực đại đạt 2983 mcg/ml 120 giờ, tăng 3,44 lần so với chủng gốc 4912 ban đầu 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Khoa học Công nghệ (2003), Báo cáo tổng kết đề tài KC 04 -09: “Nghiên cứu áp dụng công nghệ sản xuất kháng sinh hiệu cao nguyên liệu nước”, Hà Nội Egorov N X (1976), Thực tập vi sinh vật học (Nguyễn Lân Dũng dịch), Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Vi Thị Đoan Chính (2000), Nghiên cứu nâng cao họat tính kháng sinh chủng Streptomyces rimosus R77 Streptomyces hygroscopicus 5820 kỹ thuật dung hợp tế bào trần, Luận án tiến sỹ sinh học, Hà Nội Tiếng Anh Alfonso R G (2000), The Science and Practice of Pharmacy, Lippicatt Willium & Wilkins Allen N E., Nicas T I (2003), “Mechanism of action of oritavancin and related glycopeptide antibiotics”, FEMS Microbiology Reviews 26, pp 511- 532 Anne J., Mellaert L V., Eyssen H (1990), “Optimum conditions for efficient transformation of Streptomyces venezuelae protoplasts”, Applied Microbiology and Biotechnology 32 (4), pp 431-435 Anupama M., Narayana K J P., Vijayalakshmi M (2007), “Screening of Streptomyces purpeofuscus for antimicrobial metabolites”, Research Journal of Microbiology 2(12), pp 992-994 Atta H M., Dabour S M., Desoukey S G (2009), “Sparsomycin antibiotic production by Streptomyces Sp AZ-NIOFD1: Taxonomy, fermentation, purification and biological activities”, American-Eurasian Journal Agricultural and Environment Science 5(3), pp 368-377 Ayar-Kayali H., Tarhan L (2006), “Vancomycin antibiotic production and TCA-glyoxalate pathways depending on the glucose concentration in 70 Amycolatopsis orientalis”, Enzyme and Microbial Technology 38, pp 727– 734 10 Bates J (1997), “Epidemiology of vancomycin – resistant enterococci in the community and the relevance of farm animals to human infection”, Journal of Hospital Infection 37, pp 89-101 11 Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (1989), Williams & Wilkins, Baltimore, USA, Vol 12 Carneiro-da-Cunha M G., de Filho J L L., de Campos-Takaki G M (2002), “Protoplast formation and regeneration from Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 and clavulanic acid production”, Brazilian Journal of Microbiology 33, pp 347-351 13 Chilukuri S P S., Tutika S R., Pulipaka S N H R R., Uppuleti V P (2002), “Assay of vancomycin and dotabumin using sodium metaperiodate”, Microchimica Acta 140, pp 109-118 14 Demain A L (1981), “Industrial Microbiology”, Science 214, pp 987-995 15 Derek J H (2006), “Production of antibiotics fermentation”, In: Ratledge C., B Kristiansen eds., Basic Biotechnology, Cambridge University Press, Cambridge, 3th, pp 518-534 16 Diana J., Visky D., Roets E., Hoogmartens J (2003), “Development and validation of an improved method for the analysis of vancomycin by liquid chromatography, Selective of reversed-phase column towards vancomycin components”, Journal of Chromatography I 996, pp 115-131 17 Dunstan G H., Avignone-Rosa C., Langley D., Bushell M E (2000), “The vancomycin biosynthetic pathway is induced in oxygen-limited Amycolatopsis orientalis (ATCC 19795) cultures that not produce antibiotic”, Enzyme and Microbial Technology 27, pp 502-510 18 Farber B B (1984), “Vancomycin: Renewed interest in an old drug”, Europe Journal Clinical Microbiology 3, pp 1-3 71 19 Garrity G M., Bell J A and Lilburn T G (2004), “Taxonomic outline of the prokaryotes”, In: Bergey’s manual of the systematic bacteriology, Williams & Wilkins, Baltimore, USA, 2nd edition 20 Heck A J R., Bonnici P J., Breukink E., Morris D., Wills M (2001), “Modification and inhibition of vancomycin group antibiotics by formaldehyde and acetaldethyde”, European Journal of Organic Chemistry 7(4), pp.910-916 21 Hilgendor P., Heiser V., Diekmann H., Thoma M (1987), “Constant dissoved oxygen concentrations in cephlosporin C fermentation: Applicability of different controllers and effect on fermentation parameters”, Applied Microbiology and Biotechnology 27, pp 247-251 22 Holder I A., Neely A N (1998), “Vancomycin resistant enterococci”, Bunrs 24, pp 389-391 23 Hopwood D A (2007), Streptomyces in nature and medicine, Oxford University Press, New York, pp 8-28 24 Hopwood D A., Bibb M J., Chater K F, Kieser T., Bruton C J., Kieser H M., Lydiate D J., Smith C P., Ward J M (1985), Genetic manipulation of Streptomyces, A laboratory manual, F Crowe & Sons, Norwich, England, pp 35 – 41 25 Hyun H H, Jung H M., Kim S Y., Lee J K., Yoo S R (2001), “Amycolatopsis orientalis mutant strain producing vancomycin and fermentation method of vancomycin using the same”, Korean Patent 0421712 26 Ismail A (2006), “Numerical assessment of mycelium color in classification of some Streptomyces isolates”, International Journal of Agriculture  Biology 8(6), pp 872-875 27 Jensen S E and Demain A L (1995), “Beta-lactams”, Genetics and biochemistry of antibiotics production, Butterworth-Heinemann, Newton, Mass, pp 239-268 72 28 Johnson J L H., Yalkowsky S H (2006), “Refomulation of a new vancomycin analog: An example of the importance of buffer species and strength”, American Association of Pharmaceutical Science Technology 7(1), Article 5, pp 1-5 29 Jung H M., Kim S Y., Hyun H H., Lee J K (2002), “Ca2+ and Cu2+ supplementation augments vancomycin production by Amycolatoppsis orientalis”, Biotechnology Letters 24, pp 293 – 296 30 Jung H M., Kim S Y., Moon H J., Oh D K., Lee J K (2007), “Optimization of culture conditions and scale-up to pilot and plant scale for vancomycin production by orientalis”, Amycolatopsis Applied Microbiology Biotechnology 77, pp 789-795 31 Kampfer P., Kroppenstedt R M., Dott W (1991), “A numerical classification of the genera Streptomyces and Streptoverticillium using miniaturized physiological test”, Journal of Genetic Microbiology 137, pp.1831-1891 32 Kim K S., Cho N Y., Pai H S., Ryu D D Y (1983), “Mutagenesis of Micromonospora rosaria by using protoplasts and mycelia fragments”, Applied and Environmental Microbiology 46(3), pp 689-693 33 Kim S Y., Kim D S., Jung H M., Lee J K (2008), “Mutant strain of Amycolaptosis orientalis and process for preparing vancomycin hydrochloride”, European patent application EP 1959006A1 34 Koch A L (2003), “Bacterial wall as target for attack: Past, Present, and Future research”, Clinical Microbiology Reviews 16, pp 673-687 35 Kothe H.W., Vohis G., Kroppenstedt R M and Henssen A (1989), “A taxonomic study of Mycolateless, wall chemotype IV Actinomyces”, Systematic Applied Microbiology 12, pp 61-69 36 Lawrence M T (2001), Current Medical Diagnosis and Treatment, Mc Graw Hill, USA 37 Lessard I A D., Pratt S D., Mccafferty D G., Bussiere D E., Hutchins C., Wanner B L., Waslch L K (1998), “Homologs of the vancomycin 73 resistance D-Ala- D-Ala dipeptidase Van X in Sreptomyces toyocaensis, Escherichia coli and Synechicystis: attributes of catalytic efficiency, stereoselectivity and regulation with implication for function”, Chemistry & Biology 5(9), pp 489-504 38 Martins R A., Giumarães L M, Pambukian C R., Tonso A., Facciotti M C R., Schmidell W (2004), „„The effect of dissolved oxygen concentration control on cell growth and antibiotic retamycin production in Streptomyces olindensis S20 fermentations”, Brazilian Journal of Chemical engineering 21(2), pp 185-192 39 Matsushima P., McHenney M A., Baltz R H (1987), "Efficient transformation of Amycolatopsis orientalis (Nocardia orientalis) protoplasts by Streptomyces plasmids”, Journal of Bacteriology 169, pp 2298-2300 40 McCornick M H., McGuire J M and L (1962), “Vancomycin and method for its preparation”, US Patent 622264 41 Mclntyre J J., Bull A T., and Bunch A W (1996), “Vancomycin production in batch and continuous culture”, Biotechnology and Bioengineering 49, pp 412-420 42 Mclntyre J J., Bunch A W., and Bull A T (1999), “Vancomycin production is enhanced in chemostat culture with biomass-recycle”, Biotechnology and Bioengineering 62, pp 576-582 43 Mulichak A M., Losey H C., Walsh C T., Garavito R M (2001), “Structure of the UDP-Glucosyltransferase GtfB that modifies the heptapeptide aglycone in the biosythesis of vancomycin group antibiotics”, Structure 9, pp 547-557 44 Nagarajan R (1991), “Antibacterial activities and modes of action of vancomycin and related glycopeptides”, Chemotherapy 35, pp 605-609 74 Antimicrobiology Agents 45 Nagy M., Miklos J., Istvan F., Ilona V., Geza K., Viola M., Andrasi A., Laszlo K., Gabriella Z., Marta S nee Z., Endre K., Agnes U., Mihaly G (1993), “Process for the preparation of vancomycin”, US patent 5223413 46 Narayana K J P., Prabhakar P., Vijayalakshmi M., Venkateswarlu Y., Krishna P S J (2008), “Study on bioactive compounds from Streptomyces sp ANU 6277”, Polish Journal of Microbiology 57(1), pp 35-39 47 Padma P N., Rao A B., Yadav J S., Reddy G (2002), “Optimization of fermentation conditions for production of glycopeptide vancomycin by Amycolatopsis orientalis”, Applied antibiotic Biochemistry and Biotechnology 103, pp 395-406 48 Peter F S (2000), “Fermentation technology”, In: Walker J M., Rapley R., Molecular Biology and Biotechnology, Royal Society of Chemistry Publishing, Cambridge, 4th, pp 1-24 49 Punita M., Pradeep S., Subir K (2005), “A comparative evalution of oxygen mass transfer and broth viscosity using Cephalosporin C production as a case strategy”, World Journal of Microbiology and Biotechnology 21, pp 525-530 50 Radhakrishnan M., Balaji S., Balagurunathan R (2007), “Thermotolerant actinomycetes from the Himalayan mountain-antagonistic potential, characterization and identification of selected strains”, Malaysian Applied Biology 36 (1), pp 59-65 51 Robert E.W H., Daniel S C (1999), “Peptide antibiotics”, Antimicrobial agents and chemotherapy 43, pp 1317 – 1323 52 Sahin N., Ugur A (2003), “Investigation of the Antimicrobial Activity of Some Streptomyces Isolates”, Turkey Journal Biology 27, pp 79-84 53 Sattur A P., Lee J H., Song K B., Panda T., Kim C H., Rhee S K., Gokul B (2000), “Analytical techniques for vancomycin”, Biotechnology Bioprocess Engineering 5, pp 153-158 75 54 Schmidt F R (2005), “Optimization and scale up of industrial fermentation processes”, Applied Microbiology Biotechnology (●), pp 1-11 55 Sherling, E.B and D.Gottlieb (1966), “Methods for characterization of Streptomyces species”, International Journal of Systematic Bacteriology 16(3), pp 313-340 56 Srinivasan A., Dick J.D., and Perl T.M (2002), “Vancomycin resistance in staphylococci”, Clinical Microbiology Reviews 15 (3), pp 430-438 57 Staroske T and William D H (1998), “Synthesis of covalent head to tail dimers of vancomycin”, Tetrahedron Letters 39, pp 4917 – 4920 58 Sussmuth R D (2006), “The chemistry and biology of vancomycin and other glycopeptide antibiotic derivatives” In: Liang X T., Fang W S., eds, Medicinal chemistry of bioactive natural products, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, pp 35-52 59 Tarhan L and Ayarkayali H (2005), “Variations of vancomycin production by Amycolatopsis orientalis depending on the glucose and glycerol concentrations as carbon sources”, Trakya University Journal Science, Turkey (2), pp 108-115 60 The Columbia Electronic Encyclopedia (2007), Production of Antibiotics, Columbia University Press, 6th 61 Tresner H D., Backus E J (1963), “System of color wheels for Streptomycete taxonomy”, Applied Microbiology 11, pp 335-338 62 Vila M M D C., Salomao A A., Tubino M (2008), “Flow injection analysis of vancomycin”, Ecletica Quimica 33(2), pp 62-72 63 Vladimir B (1975), Methods in Enzymology, The University of Leningrad, Leningrad, VXLIII, pp 100-123 64 Yan H., Cheng X and He B (1998), “Calculation of concentrations of equilibrum components in an vitro activity test of vancomycin antibiotics and the possible mode of action”, Biophysical Chemistry 74, pp 107 -115 76 65 Yong G E., Yongping L., Xue-ying P., Jin, Jian Z C., Jun R L (2003), “Vancomycin producing strain and optimization of the fermentation medium”, Chinese Journal of Antibiotics 28(3), pp 134-143 66 Waksman S A (1961), “Classification, idetification and description of the genera and species”, In: The Actinomycetes, Vol.2, The Williams and Wilkins Co., Baltimore 67 Williams S T., Goodfellow M., Alderson G., Wellington E.M., Sneath P.H.A and Sackin M.J (1983), “Numerical classification of Streptomyces and related genera”, Journal of Genetic Microbiology 129, pp.1743-1813 68 Witt D and Stackebbandt E (1990), “Unification of the genera Streptomyces and Streptoverticillium and amendation of Streptomyces Waksman and Henrici 1443”, Systematic Applied Microbiology 13, pp 361- 371 69 Wright G.(2005), “Glycopeptide biosynthesis”, MAC Biochemistry 30, pp.1-3 70 KCTC Strain Database http://kctc.kribb.re.kr/intranet Online Catalogue 71 http://www.cai.mcgill.ca/meded/drugdb/vancomycin/vancomycin_db.htm 72 http://www.cheap-vancomycin-vancocin.netfirms.com/ 77 ... hành nghiên cứu đề tài:? ?Nghiên cứu nâng cao khả sinh tổng hợp vancomyxin xạ khuẩn Streptomyces orientalis? ?? với nội dung nhƣ sau: Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng S orientalis Nghiên cứu nâng cao. .. - Chu Thanh Bình NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VANCOMYXIN CỦA XẠ KHUẨN STREPTOMYCES orientalis 4912 Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG... tổng hợp vancomyxxin biến chủng S orientalis 49128 1-61 51 3.15 Ảnh hƣởng CaCl2 đến khả sinh tổng hợp vancomyxin biến chủng S orientalis 4912- 81-61 52 3.16 Ảnh hƣởng CuSO4 đến khả sinh tổng hợp vancomyxin