(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu đặc điểm kháng khuẩn của vi khuẩn lactic phân lập từ một số thực vật ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Mỹ Lệ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN LACTIC PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ THỰC VẬT Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Mỹ Lệ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN LACTIC PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ THỰC VẬT Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÁN BỘ HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Quỳnh Uyển TS Lê Hồng Điệp Hà Nội - 2019 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Quỳnh Uyển, cán Viện Vi sinh học Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm, giúp tơi hồn thành luận văn theo định hƣớng ban đầu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: TS Lê Hồng Điệp, cán Bộ mơn Hóa sinh Sinh học phân tử, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn CN Hồng Thu Hà, CN Lê Hồng Anh toàn thể cán bộ, sinh viên Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ động viên tơi q trình làm thực nghiệm Đề tài “Đánh giá nguồn gen vi khuẩn lactic địa định hƣớng ứng dụng thực phẩm, dƣợc phẩm thức ăn chăn nuôi” - Bộ khoa học Cơng nghệ hỗ trợ hóa chất, dụng cụ thí nghiệm suốt q trình thực luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, ngƣời thân, bạn bè anh chị đồng học bên giúp đỡ, động viên, khích lệ tơi vƣợt qua khó khăn thời gian học tập suốt năm vừa qua Hà Nội, ngày tháng Học viên Nguyễn Thị Mỹ Lệ i năm 2019 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Sơ lƣợc loài thực vật dùng nghiên cứu 1.2 Vi khuẩn lactic (Acid lactic Bacteria - LAB) .4 1.2.1 Đặc điểm chung vi khuẩn lactic 1.2.2 Trao đổi chất vi khuẩn lactic 1.2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng, phát triển vi khuẩn lactic 1.2.4 Ứng dụng vi khuẩn lactic 1.3 Bacteriocin 10 1.3.1 Định nghĩa 11 1.3.2 Phân loại 11 1.3.3 Cơ chế hoạt động bacteriocin 13 1.3.4 Phƣơng pháp tinh bacteriocin 14 1.3.5 Lợi ích hạn chế bacteriocin 16 1.3.6 Ứng dụng bacteriocin 17 1.3.7 Tình hình nghiên cứu bacteriocin từ LAB 19 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Nguyên liệu 23 2.1.1 Nguồn phân lập 23 2.1.2 Nguồn vi sinh vật 23 2.1.3 Mơi trƣờng, hóa chất thiết bị 24 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 26 ii 2.2.2 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn lactic 27 2.2.3 Xác định hoạt tính hoạt độ bacteriocin 27 2.2.4 Phƣơng pháp định danh vi sinh vật sinh học phân tử 28 2.2.5 Nghiên cứu điều kiện phù hợp cho khả sinh tổng hợp bacteriocin 30 2.2.6 Một số tính chất bacteriocin 30 2.2.7 Tinh bacteriocin 31 2.2.8 Phƣơng pháp thống kê sinh học 33 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic sinh bacteriocin định danh 34 3.1.1 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 34 3.1.2 Hoạt độ bacteriocin chủng UL830 36 3.1.3 Định danh chủng UL830 37 3.2 Nghiên cứu điều kiện phù hợp cho khả sinh tổng hợp bacteriocin chủng vi khuẩn L plantarum UL830 37 3.2.1 Thời gian nuôi cấy 37 3.2.2 Nhiệt độ nuôi cấy 38 3.3 Một số tính chất bacteriocin từ chủng vi khuẩn L plantarum UL830 39 3.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn 39 3.3.2 Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính bacteriocin từ chủng UL830 42 3.3.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin từ chủng UL830 43 3.3.4 Ảnh hƣởng enzyme tiêu hóa đến hoạt tính bacteriocin từ chủng UL830 44 3.4 Tinh bacteriocin 45 3.4.1 Kết tinh bacteriocin sắc ký trao đổi cation 45 3.4.2 Kết tinh bacteriocin sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 47 KẾT LUẬN 49 KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AU HPLC Activity Unit Sắc ký lỏng hiệu cao (High-Performance Liquid Chromatography) kDa Kilo Dalton LAB Vi khuẩn lactic (Acid lactic Bacteria) LB Luria Bertani MRS Man, Rogosa, Sharpe PCR Polymerase chain reaction TSBYE Tryptic Soy Broth Yeast Extract iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tác dụng y học 10 loài thực vật Bảng 1.2 Một số bacteriocin quan trọng sinh tổng hợp Lactobacilli [83] 12 Bảng 1.3 Tinh số bacteriocin đƣợc sinh tổng hợp LAB [60] .15 Bảng 2.1 Các chủng vi khuẩn kiểm định 23 Bảng 2.2 Các chủng vi sinh vật gây bệnh 24 Bảng 3.1 Các chủng vi khuẩn lactic đƣợc phân lập 34 Bảng 3.2 Khả kháng vi khuẩn kiểm định chủng lựa chọn 35 Bảng 3.3 Hoạt độ bacteriocin sinh tổng hợp chủng UL830 36 Bảng 3.4 Kết đƣờng kính vịng kháng khuẩn 41 Bảng 3.5 Tinh bacteriocin chủng L plantarum UL830 sắc ký trao đổi cation 46 v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cơ chế hoạt động bacteriocin [82] .14 Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm .26 Hình 2.2 Cách pha loãng mẫu theo hệ số 27 Hình 3.1 Kết điện di DNA genome chủng UL830 (A) điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA (B) 37 Hình 3.3 Hoạt tính bacteriocin chủng L plantarum UL830 nhiệt độ nuôi cấy khác .39 Hình 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn chủng UL830 40 Hình 3.5 Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính bacteriocin từ chủng L plantarum UL830 42 Hình 3.6 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin từ chủng L plantarum UL830 43 Hình 3.7 Ảnh hƣởng trypsin (A) chymotrypsin (B) đến hoạt tính bacteriocin từ chủng L plantarum UL830 44 Hình 3.8 Sắc ký đồ dịch ni cấy chủng UL830 qua cột Hitrap SP FF mL 45 Hình 3.9 Kết kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn rửa giải 46 Hình 3.10 Sắc ký phân tích HPLC bactericoin sinh tổng hợp chủng UL830 47 Hình 3.11 Kết kiểm tra hoạt tính bacteriocin đỉnh HPLC 48 vi MỞ ĐẦU Thực phẩm chứa mầm bệnh ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sức khỏe ngƣời nguyên nhân gây dịch bệnh Mặc dù tiến kỹ thuật công nghệ nguyên tắc vệ sinh an toàn thực phẩm (GMP, HACCP,…) đƣợc áp dụng, nhƣng nguy nhiễm vi sinh vật gây bệnh trình chế biến thực phẩm ngày tăng Chính thế, chất bảo quản hóa học đƣợc sử dụng tràn lan Nhiều nghiên cứu chứng minh chất phụ gia thực phẩm gây tác dụng không mong muốn cho ngƣời tiêu dùng Do đó, việc tìm hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn từ nguồn gốc tự nhiên, an tồn đặc hiệu đƣợc quan tâm Trƣớc yêu cầu trên, vi khuẩn lactic (LAB) nhóm vi khuẩn đƣợc tập trung nghiên cứu nhiều chúng có khả sinh hợp chất kháng khuẩn nhƣ acid lactic, hydrogen peroxide, carbon dioxide, diacetyl, bacteriocin, reuterin reutericyclin Trong đó, bacteriocin hợp chất kháng khuẩn thu hút đƣợc nhiều quan tâm Chúng có khả kháng vi sinh vật gây hỏng thực phẩm nhƣ Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella… Do tính chất an toàn ngƣời động vật, LAB đƣợc ứng dụng rộng rãi chế biến thực phẩm đối tƣợng nghiên cứu nhiều nhà khoa học năm qua Việt Nam nƣớc nhiệt đới gió mùa với nguồn động thực vật phong phú Nguồn thực vật dồi dào, gần gũi với đời sống ngƣời nhƣ lô hội, ngải cứu, rau muống, sung… không thực phẩm hàng ngày mà cịn có tác dụng y học Trên sở đó, chúng tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đặc điểm kháng khuẩn vi khuẩn lactic phân lập từ số thực vật Việt Nam” Mục tiêu ban đầu phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả sinh tổng hợp bacteriocin định danh Qua đó, xác định ảnh hƣởng pH, nhiệt độ, enzyme tiêu hóa đến hoạt tính bacteriocin sơ tinh bacteriocin nhằm góp phần làm phong phú thêm thông tin nhƣ tiềm ứng dụng từ bacteriocin đƣợc sinh tổng hợp từ vi khuẩn LAB CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Sơ lƣợc loài thực vật dùng nghiên cứu Việt Nam có nguồn tài nguyên thực vật phong phú đa dạng Thống kê cho thấy Việt Nam có đến 12000 lồi thực vật có mạch bậc cao, sinh trƣởng điều kiện sinh thái hình thành kiểu thảm thực vật khác [2] Từ trƣớc đến có nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu thuốc vị thuốc để chữa trị bệnh nhƣ: GS Đỗ Tất Lợi (1999) “Những thuốc vị thuốc Việt Nam” giới thiệu 800 để làm thuốc; sách “Cây thuốc Việt Nam” lƣơng y Lê Trần Đức (1997) có ghi 830 thuốc; TS Võ Văn Chi (1997) với “Từ điển thuốc Việt Nam” có ghi 3200 thuốc có loài thuốc nhập ngoại… Theo tài liệu Viện dƣợc liệu (2000) Việt Nam có đến 3820 lồi làm thuốc Nhƣng qua điều tra tìm hiểu số đƣợc nâng lên kiến thức sử dụng thuốc ngƣời dân chƣa đầy đủ Ngồi cơng dụng làm thực phẩm sống hàng ngày số tác dụng y học mƣời loài thực vật đƣợc chọn làm đối tƣợng nghiên cứu đƣợc trình bày Bảng 1.1 dƣới đây: Bảng 1.1 Tác dụng y học 10 loài thực vật STT Tên thực vật Tác dụng y học Cải xan Độ bacteriocin thu đƣợc sau sắc ký trao đổi cation tăng 827,01 lần hiệu suất thu hồi bacteriocin đạt 11,36% [86] Còn nghiên cứu tăng 4,537 lần so với bacteriocin thô ban đầu hiệu suất thu hồi bacteriocin từ vi khuẩn L plantarum UL830 (2,363%) Nhƣ vậy, chƣơng trình tinh cần đƣợc cải thiện nhằm tăng hiệu suất thu hồi bacteriocin nhƣ độ 3.4.2 Kết tinh bacteriocin sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Để tinh thêm, phân đoạn rửa giải có hoạt tính sau cột Hitrap SP FF mL đƣợc dùng hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Sắc ký đồ kết kiểm tra hoạt tính bacteriocin với chủng vi khuẩn Lactobacillus sakei subsp.sakei JCM 1157 đỉnh sau sắc ký HPLC đƣợc trình bày Hình 3.10 Hình 3.11 tƣơng ứng 37.185 DAD1 E, Sig=280,16 Ref=360,100 (UYEN\PL1S0817.D) mAU Đỉnh 200 150 100 52.847 39.020 36.233 27.225 23.346 22.321 19.189 7.612 8.359 6.878 Đỉnh 20.382 21.008 Đỉnh 50 0 10 20 30 40 50 Hình 3.10 Sắc ký phân tích HPLC bactericoin sinh tổng hợp chủng UL830 47 ... NHIÊN Nguyễn Thị Mỹ Lệ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN LACTIC PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ THỰC VẬT Ở VI? ??T NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÁN... y học Trên sở đó, chúng tơi tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu đặc điểm kháng khuẩn vi khuẩn lactic phân lập từ số thực vật Vi? ??t Nam? ?? Mục tiêu ban đầu phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả... ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Sơ lƣợc loài thực vật dùng nghiên cứu Vi? ??t Nam có nguồn tài nguyên thực vật phong phú đa dạng Thống kê cho thấy Vi? ??t Nam có đến 12000 lồi thực vật có mạch bậc cao, sinh trƣởng