Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase liên quan đến sự tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (catharanthus roseus (l ) g don )

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG NGỌC ANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA ENZYME PEROXIDASE LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don.) LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên - 2017 i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HỒNG NGỌC ANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HĨA ENZYME PEROXIDASE LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Nguyễn Thị Tâm THÁI NGUYÊN – 2017 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Thị Tâm Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Thái Ngun, tháng 09 năm 2016 TÁC GIẢ Hoàng Ngọc Anh iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Tâm tận tình hướng dẫn bảo suốt q trình tơi nghiên cứu thực đề tài Tôi xin cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn, phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học cơng nghệ Việt Nam tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi trình thực thí nghiệm nghiên cứu đề tài luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ thầy cô giáo cán Khoa Khoa học sống trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn; cảm ơn đóng góp ý kiến quý báu buổi seminar khoa học báo cáo đề cương luận văn Trong trình nghiên cứu, nhận giúp đỡ kĩ thuật viên Trần Thị Hồng, phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên Tôi xin chân thành cảm ơn môn Sinh học đại GD sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi để thực q trình nghiên cứu Tơi xin cảm ơn thầy cô giáo cán Khoa Khoa học sống, thầy cô cán Bộ phận đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khóa học Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè động viên, quan tâm, tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Thái Nguyên, tháng năm 2016 TÁC GIẢ Hoàng Ngọc Anh iv MỤC LỤC DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN viii MỞ ĐẦU .1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu .2 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu dừa cạn .3 1.1.1 Đặc điểm phân loại phân bố dừa cạn 1.1.2 Đặc điểm sinh học dừa cạn 1.1.3 Tác dụng dừa cạn .5 1.2 Hợp chất alkaloid tác dụng 1.2.1 Alkaloid 1.2.2 Alkaloid dừa cạn 1.3 Quá trình sinh tổng hợp vinblastine vincristine dừa cạn 10 1.4 Enzyme peroxidase (Prx) gen mã hóa Prx 12 1.4.1 Enzyme peroxidase Prx 12 1.4.2 Gen mã hóa peroxidase (Prx) 13 1.5 Phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens .14 1.6 Các nghiên cứu nâng cao khả tổng hợp vinblastine vincristine dừa cạn 16 1.6.1 Nghiên cứu nâng cao khả tổng hợp vinblastine vincristine dừa cạn phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật 16 1.6.2 Nghiên cứu nâng cao khả tổng hợp vinblastine vincristine dừa cạn phương pháp chuyển gen 17 1.7 Phân tích chuyển gen kỹ thuật PCR 18 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Vật liệu nghiên cứu 20 2.1.1 Vật liệu thực vật 20 v 2.1.2 Vật liệu di truyền 20 2.2 Hóa chất, thiết bị địa điểm nghiên cứu 20 2.2.1 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 20 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro 21 2.3.2 Phương pháp chuyển gen vào dừa cạn 22 2.3.3 Phân tích chuyển gen 26 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .30 3.1 Kết tạo dừa cạn mang gen chuyển crPrx 30 3.1.1 Chuyển cấu trúc mang gen crPrx vào dừa cạn nhờ A tumefaciens 30 3.1.2 Xác định có mặt gen chuyển crPrx hệ gen dừa cạn 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hoa ba giống Catharanthus roseus (L.) G Don [24] Hình 1.2 Cơng thức hóa học Vinblastine (A) Vincristine (B) Hình 1.3 Sơ đồ chuyển hóa tạo vinblastine vincristine .11 Hình 1.4 Cấu trúc Cấu trúc intron exon CrPrx [15] .13 Hình 2.1 Sơ đồ chuyển gen vào dừa cạn thông qua vi khuẩn A Tumefaciens .23 Hình 3.1 Gieo hạt tạo in vitro 30 Hình 3.2 Ngâm mảnh mầm dịch huyền phù vi khuẩn 31 Hình 3.3 Mảnh mầm mơi trường đồng ni cấy CCM 31 Hình 3.4 Mẫu thấm khô đặt lên môi trường SIM .32 Hình 3.5 Mẫu phát triển đa chồi mơi trường SIM 32 Hình 3.6 Chọn lọc kéo dài chồi SEM 33 Hình 3.7 Cây giá thể .33 Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm PCR xác định có mặt gen chuyển crPrx dừa cạn chuyển gen 36 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số loại môi trường tái sinh Dừa cạn .24 Bảng 2.2 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn .24 Bảng 2.3 : Hóa chất pha đêṃ rửa 28 Bảng 2.4: Hóa chất pha đêṃ chiết .28 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi 35S 28 Bảng 2.6 Chu kỳ phản ứng PCR 29 Bảng 3.1 Thống kê số lượng mẫu chuyển gen vào dừa cạn 34 viii DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN AS bp CrPrx cs CCM DNA ELISA EDTA GM GMO kb LB MS OD PCR Prx Prx RM SEM Shoot Elongation Medium ix Môi trường kéo dài chồi SIM T-DNA Ti-plasmid Vir WHO x mg/ ml) ủ 37oC - Bảo quản DNA tổng số -20oC 27 Bang 2.3 : Ho STT ́́ Thêm nươc đến th ́́ Bang 2.4: Hoa STT ́́ Thêm nươc đến th ́́ Bảng 2.5 Thành ph STT H2O Master mix Mồi xuôi Mồi ngược AND/ cDNA Tổ 28 Bảng 2.6 Chu kỳ phản ứng PCR Bước Phản ứn Biến tính Biến tính Gắn mồi Kéo dài chuỗi Hoàn tất kéo dà Kết thúc phản ứ Chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR - Cân 0,4g agarose cho vào 40 ml TAE 1X, đun đến sôi để agarose tan hồn tồn Để nguội 45 – 50oC đổ vào khn gel chuẩn bị sẵn Sau 30 phút gel nguội đơng cứng chuyển khay chứa gel vào máy điện di cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di cho đệm ngập gel khoảng 0,5 – cm - Tra mẫu: Sản phẩm PCR tra vào giếng gel Chạy điện di: Sau tra mẫu điện di xong, máy điện di kết nối với nguồn Đặt 120V, 90mA, 30 phút - Nhuộm gel dung dịch ethibium 15 phút Quan sát: gel soi đèn tử ngoại, ADN phát sáng nhờ liên kết với EtBr - Chụp ảnh gel 2.3.2.3 Các phương pháp phân tích xử lý số liệu Hiệu suất chuyển gen xác định công thức: Sốcây mang gen chuyển Hiêụ suất chuyển gen (%) = 29 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tạo dừa cạn mang gen chuyển crPrx 3.1.1 Chuyển cấu trúc mang gen crPrx vào dừa cạn nhờ A tumefaciens Hạt dừa cạn khử trùng cồn 70% lắc phút javen 60% lắc 15 phút, sau cho nảy mầm mơi trường MS đến phát triển (hình 3.1 A-B), mầm tách đôi, loại bỏ đỉnh sinh trưởng để làm vật liệu nhận gen B A C Hình 3.1 Gieo hạt tạo in vitro A: Gieo hạt dừa cạn môi trường MS; B: Hạt phát triển thành con; C: Hai mảnh mầm 30 Lá mầm ngâm dịch huyền phù vi khuẩn có bổ sung acetosyringone 100 M 30 phút (hình 3.2) Hình 3.2 Ngâm mảnh mầm dịch huyền phù vi khuẩn Sau thấm khơ, cấy mơi trường mơi trường CCM Ni tối ngày (hình 3.3) Hình 3.3 Mảnh mầm mơi trường đồng ni cấy CCM 31 Hình 3.4 Mẫu thấm khơ đặt lên mơi trường SIM Hình 3.5 Mẫu phát triển đa chồi mơi trường SIM 32 Hình 3.6 Chọn lọc kéo dài chồi SEM Các chồi nhỏ sống sót kéo dài mơi trường SEM có kháng sinh chọn lọc kanamycin chuyển sang môi trường rễ RM sau đem trồng lên giá thể (hình 3.7), tái sinh đưa mơi trường tự nhiên Hình 3.7 Cây giá thể 33 Chúng tiến hành biến nạp cấu trúc gen crPrx nhờ vi khuẩn A tumefaciens qua nách mầm hạt chín dừa cạn, giai đoạn nuôi cấy chọn lọc, kết sau: Lá mầm ngâm dịch huyền phù vi khuẩn có OD600nm = 0,8 bổ sung acetosyringone 100 M 30 phút Sau đồng nuôi cấy ngày, chuyển mẫu lên môi trường nuôi cấy để chọn lọc tái sinh chồi chuyển gen: MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + MES 0,59g/ l + muối B5 3g/ l + BAP 0,5mg/ l + cefotaxim 500 mg/ l + kanamycin 50 mg/ l Các mẫu tạo chồi đưa sang môi trường chọn lọc để tránh mẫu chết sản sinh chất làm ức chế tái sinh mẫu tạo chồi Chồi đạt chiều cao – cm chuyển sang môi trường rễ: MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + BAP 0,5mg/ l + IBA 0,4mg/ l + kanamycin 50 mg/ l Cây có chiều cao – 10 cm rễ đạt từ – cm đưa giá thể Kết thu trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Thống kê số lượng mẫu chuyển gen vào dừa cạn Lơ thí nghiệm Lần Lần ĐC 0* ĐC*1 Ghi chú: * ĐC0 mầm dừa cạn không chuyển gen cấy mơi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh *ĐC1 mầm dừa cạn không chuyển gen cấy môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh Thí nghiệm chuyển cấu trúc mang gen crPrx vào giống dừa cạn hoa hồng nhụy tím qua hai lần biến nạp với 666 mảnh mầm (Bảng 3.1) thu 197 mẫu tạo chồi, 65 mẫu có chồi kéo dài môi trường kháng sinh chọn lọc SEM, 40 chồi rễ khỏe mạnh thu 15 T phát triển giá thể 34 Song song với thí nghiệm lây nhiễm vi khuẩn chuyển gen crPrx, chúng tơi có bố trí hai lơ đối chứng ĐC ĐC1 (mỗi lô 50 mẫu) Kết lô ĐC0 (lá mầm dừa cạn không chuyển gen cấy môi trường tái sinh bổ sung kháng sinh chọn lọc), mầm bị đào thải kháng sinh; lô ĐC1 (lá mầm dừa cạn không chuyển gen cấy tái sinh không bổ sung kháng sinh chọn lọc) thu tái sinh không chuyển gen sử dụng làm đối chứng Các dừa cạn T0 tái sinh sau lây nhiễm trồng, chăm sóc ngồi mơi trường tự nhiên khoảng tuần tiến hành thu mẫu để kiểm tra có mặt hoạt động gen chuyển crPrx 3.1.2 Xác định có mặt gen chuyển crPrx hệ gen dừa cạn Trong lĩnh vực công nghệ gen thực vật, nói, thành cơng sớm có giá trị lĩnh vực biểu protein thực vật việc sử dụng promoter định có nguồn gốc từ virus vi khuẩn Agrobacterium làm công cụ biểu gen ngoại lai hiệu trồng biến đổi gen Rất nhiều promoter sử dụng rộng rãi công nghệ gen thực vật tiếp tục promoter chọn lựa nghiên cứu biểu nhanh, đơn giản với rủi ro thấp Một promoter sử dụng rộng rãi để điều khiển biểu gen ngoại lai trồng biến đổi gen 35S Promoter 35S promoter dạng định có khả điểu khiển biểu gen mức độ cao, khả hoạt động mạnh nhiều loại mơ nhiều lồi cây, hoạt động mạnh hệ thống biểu tạm thời tế bào chuyển gen thực vật ổn định [5] Để kiểm tra có mặt gen chuyển crPrx dừa cạn chuyển gen, sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi 35S để khuếch đại gen cần xác định Tiến hành tách chiết, tinh DNA tổng số từ 15 dừa 35 cạn chuyển gen thực phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu Kết kiểm tra sản phẩm PCR gel agarose 0,8% thể hình 3.8 Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm PCR xác định có mặt gen chuyển crPrx dừa cạn chuyển gen M: thang chuẩn DNA 1kb; 1-15: sản phẩm PCR chuyển gen; (+): sản phẩm PCR 35S promoter; (-) sản phẩm PCR dừa cạn không chuyển gen Trên gel điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen crPrx (Hình 3.8), chạy điện di số 1-2-4-8-9-10-13 xuất băng DNA với kích thước khoảng 0,3 kb tương ứng kích thước ước tính cho 35S promoter xuất ngang với vị trí băng DNA điện di đối chứng dương (sản phẩm PCR 35S promoter) điều rằng, hệ gen dừa cạn chuyển gen số 1-2-4-8-9-10-13 (ký hiệu DT01- DT02- DT04- DT08- DT09DT010- DT013) có mặt gen crPrx Hiệu suất chuyển gen giai đoạn đánh giá đạt 7/ 666 = 1,05% Các dừa cạn chuyển gen dương tính với phản ứng PCR kết ban đầu đưa đến thành cơng quy trình chuyển gen crPrx vào dừa cạn Các dương tính với phản ứng PCR chăm sóc ưu tiên phát triển nhằm có phân tích khả hoạt động biểu gen chuyển crPrx 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Chuyển thành công gen crPrx vào dừa cạn nhờ Agrobacterium tumefaciens tạo 15 dừa cạn chuyển gen T0 trồng bầu đất ngồi mơi trường tự nhiên 1.2 Gen chuyển crPrx xác định tồn hệ gen dừa cạn hệ T0 hiệu suất chuyển gen đạt 1,05 % Đề nghị Tiếp tục phân tích dịng dừa cạn chuyển gen qua hệ T 1, T2, T3… nhằm chọn tạo dòng ổn định có khả tổng hợp vinblastine vincristine cao 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Thị Hà, Lương Thanh Huyền, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2014), "Tách dịng phân tử gen mã hóa peroxidase từ hai giống dừa cạn Catharanthus roseus", Tạp chí khoa học công nghệ, Đại học Thái Nguyên, 119(15) Bùi Thị Hà, Trần Thị Anh, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2015), "Nghiên cứu hệ thống tái sinh đa chồi in vitro dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G.Don)", Tạp chí Khoa học, 4, pp 56 - 62 Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng (2006), "Ảnh hưởng chất điều hòa tăng trưởng thực vật đường saccharose lên dịch nuôi cấy huyền phù tế bào dừa cạn Catharanthus roseus.", Tạp chí Phát triển Khoa học & Cơng nghệ - ĐHQG TPHCM, 9(6), pp 59 - 66 Đào Hùng Cường, Lê Xuân Văn (2011), "Nghiên cứu chiết tách alkaloid rễ dừa cạn hoa hồng Bình Định", Tạp chí Khoa học Cơng nghệ - Đại học Đà Nẵng, 43, pp 85 Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (2007), "Promoter ứng dụng công nghệ gen thực vật", Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 5(1), pp - 18 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005), "Giáo trình cơng nghệ sinh học nơng nghiệp", NXB Nông nghiệp, Hà Nội Viện dược liệu (2001), "Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam", Nxb Khoa học Kỹ thuật, 1, pp 57 - 89 Aerts R.J., Stoker A., Beishuizen M., van de Heuvel M., van der Meijden E., Verpoorte R (1992), "Detrimental effects of Cinchona leaf alkaloids on larvae of the polyphagous insect Spodoptera exigua", J Chem Ecol, 18(11), pp 1955–1964 Bùi Thị Hà, Chu Hoàng Mậu, Nguyên Thị Tâm, Đỗ Huy Hồng (2016), "Nghiên cứu quy trình chuyển gen gus dừa cạn", Tạp chí Khoa học Công nghệ Thái Nguyên, 157, pp 71-75 10 Costa M.M., Hilliou F., Duarte P., Pereira L.G., Almeida I., Leech M., et al (2008), "Molecular cloning and characterization of a vacuolar class III peroxidase involved in the metabolism of anticancer alkaloids in Catharanthus roseus", Plant Physiol, 146(2), pp 403 - 417 11 Fattorusso E., Taglialatela O (2008), "Modern alkaloids: structure, isolation, synthesis and biology", Wiley-VCH, Weinheim, Germany 12 Ferreres F., Figueiredo R., Bettencourt S., Carqueijeiro I., Oliveira J., Gil-Izquierdo A., et al (2011), "Identification of phenolic compounds in isolated vacuoles of the medicinal plant Catharanthus roseus and their interraction with vacuator class III peroxidase: an H2O2 affair", J Exp Bot, 62(8), pp 2841-2854 38 13 Guggisberg A., Hesse M (1996), "The Alkaloids", The University of Zurich 14 Javier P., Elisabeth M., Silvia F (1998), "Effect of Agrobacterium rhizogenes T-DNA on alkaloid production in Solanaceae plants", Phytochemistry, 52(7), pp 1287 - 1292 15 Jinwei Liu, Jianhua Zhu, Le Tang, Wei Wen, Shuangshuang Lv, Rongmin Yu (2013), "Enhancement of vindoline and vinblastine production in suspension-cultured cells of Catharanthus roseus by artemisinic acid elicitation", MIRCEN Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, DOI:10.1007/s11274-013-1432 16 Kumar S1., Dutta A., Sinha A.K., Sen J (2007), "Cloning, characterization and localization of a novel basic peroxidase gene from Catharanthus roseus", FEBS J, 274(5), pp 1290-1303 17 Kumar S1., Jaggi M., Taneja J., Sinha A.K (2011), "Cloning and characterization of two new Class III peroxidase genes from Catharanthus roseus", Plant Physiol Biochem, 49(4), pp 404-412 18 Marfori E C., Alejar A A (1993), "Alkaloid yield variation in callus cultures derived from different plant parts of white and rosypurple periwinkle Catharanthus roseus (L.) Don", Philippine Journal of Biotechnology, 19 Pahwa D (2008), "Catharanthus alkaloids", B Pharm Punjab University Chandigarh, 19(1), pp 52 - 63 20 Van der Heijden R., Jabos D., Snoeijer W., Hallard D., Verpoorte R (2004), "The Catharanthus alkaloids: pharmacognosy and biotechnology", Curr Med Chem, 11, pp 607 – 628 21 Wang Q., Xing S., Pan Q., Yuan F (2012), "Development of efficient catharanthus roseus regeneration and transformation system using agrobacterium tumefaciens and hypocotyls as explants", BMC Biotechnology, 29, pp 12 - 34 22 Wang Q., Yuan F., Pan Q., Li M., Wang G., Zhao J., et al (2010), "Isolation and functional analysis of the Catharanthus roseus deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase gene promoter", Plant Cell Rep, 29(2), pp 185 - 192 23 Zhao J1., Zhu W., Hu Q (2001), "Selection of fungal elicitors to increase indole alkaloid accumulation in Catharanthus roseus suspension cell culture", Enzyme Microb Technol, 28(8), pp 666 - 672 24 zz "http://en.wikipedia.org/wiki/Catharanthus_roseus" 25 zz "https://en.wikipedia.org/wiki/Agrobacterium" 39 ... THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG NGỌC ANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA ENZYME PEROXIDASE LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L. ) G Don .) Chuyên ngành:... chúng tơi tiến hành thực đề tài ? ?Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase liên quan đến tổng hợp alkaloid dừa cạn (Catharanthus roseus (L. ) G Don .)? ?? Mục tiêu nghiên cứu Tạo dòng dừa cạn chuyển. .. gen chứa gen mã hóa enzyme peroxidase Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase dừa cạn Phân tích biểu gen chuyển crPrx dòng chuyển gen hệ T0 kỹ thuật PCR Chương TỔNG