Sàng lọc đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thư ruột kết không polyp di truyền ở người việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Lê Thị Lan Anh SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN SỬA CHỮA BẮT CẶP SAI MLH1 LIÊN QUAN ĐẾN UNG THƢ RUỘT KẾT KHÔNG POLYP DI TRUYỀN Ở NGƢỜI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Lê Thị Lan Anh SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN SỬA CHỮA BẮT CẶP SAI MLH1 LIÊN QUAN ĐẾN UNG THƢ RUỘT KẾT KHÔNG POLYP DI TRUYỀN Ở NGƢỜI VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Hồng Vân Hà Nội – Năm 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Di truyền ung thƣ 1.1.1 Khái niệm ung thƣ 1.1.2 Gen ung thƣ gen ức chế khối u 1.2 Hội chứng ung thƣ ruột kết 1.3 Hội chứng ung thƣ ruột kết không polyp 1.3.1 Đặc điểm di truyền HNPCC 1.3.2 Đặc điểm lâm sàng phổ khối u 1.3.3 Chẩn đoán lâm sàng 1.4 Cơ sở phân tử HNPCC 1.4.1 Tính bất ổn định vi vệ tinh 1.4.2 Cơ chế sửa chữa ADN bắt cặp sai (MMR - Mismatch Repair) 1.4.3 Đột biến gen MMR nguy ung thƣ 1.4.4 Gen MLH1 1.5 Một số kỹ thuật di truyền sử dụng tron 1.5.1 Kỹ thuật PCR 1.5.2 Kỹ thuật PCR phiên mã ngƣợc (RT-PCR: Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) 1.5.3 Kỹ thuật phân tích trình tự lăp lại đơn giản (SSR - Simple Sequence Repeat) 1.5.4 Kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism) 1.5.5 Kỹ thuật phân tích đa hình sợi đơn (SSCP: Single Strand Conformation Polymorphism) 1.5.6 Phƣơng pháp giải trình tự ADN 1.6 Mục tiêu nội dung nghiên cứu đ 1.6.1 Mục tiêu nghiên cứu 1.6.2 Nội dung nghiên cứu đề tài Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Đối tƣợng địa điểm nghiên cứu 2.1.2 Hóa chất 2.1.3 Thiết bị 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Thu thập bảo quản mẫu 2.2.2 Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 2.2.3 Xác định độ tinh hàm lƣợng ADN tổng số 2.2.4 Kỹ thuật PCR 2.2.5 Phân tích đa hình sợi đơn (SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism) 2.2.6 Phản ứng cắt enzym giới hạn 2.2.7 Giải trình tự gen Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tách chiết ADN tổng số 3.2 Phản ứng PCR 3.2.1 Kết tối ƣu phản ứng PCR 3.2.2 Nhân exon quan tâm kỹ thuật PCR 3.3 Kết phân tích SSCP 3.4 Kết phân tích đột biến PCR – RFLP 3.4.1 Kết xử lý exon 16 enzym MspI 3.4.2 Kết xử lý exon 19 enzym CviQI 3.4.3 Kết xử lý exon 18 enzym CviQI 3.5 Kết giải trình tự ADN so sánh trình tự 3.5.1 Phân tích trình tự exon 13 mẫu mơ từ bệnh nhân số 3.5.2 Kết phân tích trình tự exon 14 từ mẫu T19 3.5.3 Phân tích trình tự exon 18 từ mẫu T20 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I KẾT LUẬN II KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Thị Lan Anh DANH MỤC BẢNG Bảng Độ thâm nhập đột biến MLH1 MSH2 bệnh nhân ung thƣ Bảng Thống kê bệnh ung thƣ liên quan đến HNPCC Bảng Các gen MMR liên quan tới HNPCC Bảng Cấu trúc gen MMR Bảng Tỉ lệ đột biến thƣờng gặp hai gen MLH1 MSH2 bệnh nhân HNPCC Bảng Các thành phần phản ứng PCR Bảng Trình tự mồi tƣơng ứng exon 8, 13, 14, 16, 17, 18, 19 gen MLH1 Bảng Thành phần PAGE 12% cho 10 ml dung dịch Bảng Thành phần tham gia phản ứng cắt exon 16, 18 19 gen MLH1 Bảng 10 Chu trình nhiệt PCR tối ƣu exon 8, 13, 14, 16, 17, 18 19 gen MLH1 DANH MỤC HÌNH Hình Các đƣờng hình thành ung thƣ đại trực tràng Hình Các phân nhóm ung thƣ ruột kết Hình Sửa chữa bắt cặp sai trình tự vi vệ tinh Hình Cơ chế sửa chữa bắt cặp sai E.coli Hình Sửa chữa ADN bắt cặp sai ngƣời Hình Con đƣờng dẫn đến ung thƣ di truyền ngƣời thông qua đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR) Hình Tỷ lệ loại đột biến phát gen MLH1, MSH2 MSH6 Hình Vị trí MLH1 NST số Hình Sơ đồ gen MLH1 Hình 10 Sơ đồ protein đƣợc mã hóa MLH1 Hình 11 Kết phân tích SSCP exon gen AR Hình 12 (A) Kết tách ADN tổng số từ mẫu mô (B) Kết tách ADN tổng số từ mẫu máu 0 Hình 13 Sản phẩm PCR exon gen MLH1 với nhiệt độ gắn mồi: 60 C, 60,5 C, 0 61 C, 61,5 C Hình 14 (A), (B) Sản phẩm PCR exon gen MLH1 Hình 15 (A), (B) Sản phẩm PCR exon 13 gen MLH1 Hình 16 (A), (B) Sản phẩm PCR exon 14 gen MLH1 Hình 17 (A), (B) Sản phẩm PCR exon 16 gen MLH1 Hình 18 (A), (B) Sản phẩm PCR exon 17 gen MLH1 Hình 19 (A), (B) Sản phẩm PCR exon 18 gen MLH1 Hình 20 (A), (B) Sản phẩm PCR exon 19 gen MLH1 Hình 21 (A), (B) Kết phân tích SSCP exon gen MLH1 Hình 22 (A), (B) Kết phân tích SSCP exon 13 gen MLH1 Hình 23 (A), (B) Kết phân tích SSCP exon 14 gen MLH1 Hình 24 Kết phân tích SSCP exon 16 gen MLH1 Hình 25 Kết phân tích SSCP exon 17 gen MLH1 Hình 26 Kết phân tích SSCP exon 18 gen MLH1 Hình 27 Kết phân tích SSCP exon 19 gen MLH1 Hình 28 Kết PCR-RFLP mẫu máu từ 20 thành viên gia đình mắc hội chứng ung thƣ ruột kết không polyp di truyền Nhật Bản Hình 29 Dự đốn kết phản ứng cắt exon 16 gen MLH1 enzym MspI Hình 30 Sản phẩm cắt exon 16 sản phẩm PCR exon 16 điện di gel agarose 2% Hình 31 Dự đoán sản phẩm cắt exon 19 enzym CviQI Hình 32 Sản phẩm cắt exon 19 enzym CviQI điện di gel polyacrylamide 12% Hình 33 Dự đoán sản phẩm cắt exon 18 gen MLH1 enzym CviQI Hình 34 (A), (B), (C), (D) Sản phẩm cắt exon 18 enzym CviQI điện di gel polyacrylamide 12% Hình 35 (A) Kết so sánh trình tự exon 13 đối chứng bệnh nhân số (B) Trình tự ngƣợc exon 13 gen MLH1 cho thấy có đột biến thay vị trí 203 G>A Hình 36 (A) Kết so sánh trình tự exon 14 đối chứng bệnh nhân số 19 (B) Trình tự xi exon 14 gen MLH1 cho thấy có đột biến thay vị trí 176C>G đột biến thay vị trí 185T>A Hình 37 So sánh trình tự exon 18 từ mẫu mô ung thƣ bệnh nhân 20 mô ngƣời bình thƣờng Hình 38 Kết so sánh trình tự exon 18 từ mẫu máu mẫu mô bệnh nhân số 19 Chữ viết tắt ADN ARN RNase APS BLB bp dNTP EDTA FAP HNPCC Kb LOH MMR MSI NST PCR RFLP RT-PCR SNP SSCP SSR TLB TAE TE TEMED Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 MỞ ĐẦU Trong 20 năm qua, phát minh to lớn di truyền học phân tử góp phần thúc đẩy phát triển mạnh mẽ công nghệ sinh học Các kỹ thuật nhƣ tách dòng gen, tạo ADN tái tổ hợp, giải trình tự gen nhiều kỹ thuật sinh học phân tử khác ngày đƣợc ứng dụng rộng rãi có hiệu việc phát hiện, chẩn đoán điều trị bệnh, có bệnh ung thƣ Sự phát ung thƣ bệnh di truyền đƣợc coi thắng lợi sinh y học đại Nhiều nỗ lực nghiên cứu không ngừng nghỉ hiệu giúp xác định chi tiết biến đổi di truyền nhân tố trực tiếp gây ung thƣ, hình thành khối u, sau tăng sinh lan rộng chúng Tỷ lệ mắc bệnh ung thƣ có xu hƣớng gia tăng phần lớn nƣớc giới Hiện tại, qua thống kê cho thấy tồn cầu có khoảng 22,4 triệu ngƣời sống chung với bệnh ung thƣ Theo Tổ chức Y tế Thế giới, ƣớc tính hàng năm giới có khoảng 10,1 triệu trƣờng hợp mắc ung thƣ Các ung thƣ hàng đầu giới nam giới ung thƣ phổi, dày, đại trực tràng, tiền liệt tuyến, gan; Ở nữ giới ung thƣ vú, đại trực tràng, cổ tử cung, dày phổi Cũng theo Tổ chức Y tế Thế giới, ƣớc tính năm có khoảng 6,7 triệu ngƣời chết ung thƣ Tỷ lệ chết ung thƣ chiếm 12% số nguyên nhân gây tử vong ngƣời [28] Riêng Việt Nam, năm phát khoảng 200.000 ngƣời khoảng 75.000 ngƣời chết bệnh ung thƣ [47] Trong số bệnh ung thƣ thƣờng gặp ngƣời, ung thƣ đại trực tràng loại ung thƣ tƣơng đối phổ biến, chiếm khoảng 11,5% tổng số trƣờng hợp ung thƣ chiếm tới 15,2% tổng số trƣờng hợp tử vong ung thƣ Loại ung thƣ thƣờng gặp nhiều nƣớc phát triển có xu hƣớng tăng nhanh nƣớc phát triển Nguy ung thƣ đại trực tràng tăng cao Lê Thị Lan Anh Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 ngƣời có tiền sử viêm đại tràng gia đình, dịng họ có ngƣời bị ung thƣ đại trực tràng [3] Ung thƣ ruột kết không polyp di truyền (HNPCC - Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer), đƣợc gọi hội chứng Lynch chiếm 15% trƣờng hợp ung thƣ đại trực tràng Đây hội chứng di truyền trội gen nhiễm sắc thể thƣờng gây Những đột biến gây bất hoạt tế bào mầm gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR) bao gồm gen MLH1, MSH2, MSH6 PMS2, dẫn đến thay đổi hoạt tính protein, làm bất hoạt hệ thống sửa chữa bắt cặp sai nguyên nhân gây HNPCC Nhiều nghiên cứu cho thấy, đột biến gen MLH1 chiếm khoảng 50% số đột biến xác định đƣợc gen MMR [2, 5] Trên giới có nhiều nghiên cứu gen MLH1 đƣợc thực nhiều quần thể ngƣời khác Tại Việt Nam, xét nghiệm di truyền chẩn đốn ung thƣ nói chung ung thu đại trực tràng nói riêng hầu nhƣ chƣa đƣợc thực Việc phát biến đổi di truyền gen MMR liên quan đến ung thƣ đại trực tràng có khuynh hƣớng di truyền, nhằm đƣa kết nghiên cứu bƣớc đầu gen MLH1 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng Việt Nam góp phần cung cấp liệu đột biến gen mở hƣớng nghiên cứu gen MMR khác, ứng dụng chẩn đoán sớm ung thƣ ruột kết không polyp di truyền Việt Nam cần thiết Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, chúng tơi tiến hành thực đề tài “Sàng lọc đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thƣ ruột kết không polyp di truyền ngƣời Việt Nam” Đề tài đƣợc thực phịng thí nghiệm Phân tích di truyền thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sống, Khoa Sinh học Phòng Sinh học thụ thể phát triển thuốc thuộc phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ Enzym Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Lê Thị Lan Anh Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 vị trí 2104 2001 số bệnh nhân ngƣời Hàn Quốc [60] Năm 2008, H Zang cộng phát đƣợc đột biến exon 18 gen MLH1 vị trí 2101 2038 bệnh nhân ngƣời Trung Quốc Hầu hết đột biến exon 18 đột biến thay nucleotit làm thay đổi điện tích làm thay đổi cấu hình khơng gian protein MLH1 vị trí nhận biết với protein PMS2 [61] Trong điều kiện hạn chế thời gian, chúng tơi chƣa phân tích đuợc tồn trình tự exon gen MLH1 (19 exon) exon nhân Một số phát thay đổi trình tự nucleotit phân đoạn phân tích kết ban đầu Tuy nhiên, khẳng định kỹ thuật PCR-SSCP giải trình tự ADN hồn tồn áp dụng việc sàng lọc đột biến gen MLH1 nhóm gen sửa chữa bắt cặp sai liên kết chặt với hội chứng HNPCC nhƣ dạng ung thƣ khác Việt Nam Lê Thị Lan Anh Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I KẾT LUẬN Từ kết thu đƣợc với việc ứng dụng kỹ thuật PCR-SSCP PCRRFLP phân tích đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thƣ đại trực tràng không polyp di truyền, đƣa kết luận nhƣ sau: Đã tách chiết thành công ADN tổng số từ 50 mẫu mô 20 mẫu máu bệnh phẩm Đã nhân thành công exon quan tâm gen MLH1, bao gồm việc thiết kế cặp mồi đặc hiệu tối ƣu hóa phản ứng PCR Đã phát đƣợc mẫu phân đoạn gen MLH1 từ bệnh nhân có mơ hình phân tích băng điện di khác biệt exon 13 (mẫu 13T6) exon 14 (mẫu 14T18 14T19) gen MLH1 so sánh với đối chứng, sử dụng kỹ thuật PCR-SSCP Đã phát đƣợc mẫu phân đoạn gen MLH1 từ bệnh nhân có mơ hình phân tích băng điện di khác biệt exon 18 gen MLH1 từ bệnh nhân số 19 bệnh nhân số 20 so sánh với đối chứng, sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP Đã phát đƣợc đột biến thể dị hợp tử thay nucleotit G>A vị trí 203 exon 13 từ mẫu mô bệnh phẩm bệnh nhân số (mẫu 13T6), đột biến thay nucleotit C>G vị trí 176 đột biến thay T>A vị trí 185 thuộc exon 14 gen MLH1 từ mẫu mô bệnh phẩm ngƣời số 19 (mẫu 14T19) giải trình tự gen Những sai khác mơ hình điện di SSCP RLFP nhƣ thay đổi trình tự nucleotit đƣợc phát mẫu mô, không phát đƣợc mẫu máu tƣơng ứng Điều chứng tỏ đột biến mà xác định đƣợc đột biến soma Lê Thị Lan Anh Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 II KIẾN NGHỊ Trên sở kết nghiên cứu này, chúng tơi có số kiến nghị nhƣ sau: Tiếp tục tiến hành phân tích đột biến exon lại gen MLH1 kỹ thuật PCR-SSCP kỹ thuật di truyền khác (SSR, HET, DGGE ) để xác định dạng đột biến thuộc gen MLH1 có bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng Việt Nam Mở rộng nghiên cứu gen MMR khác (MSH2, MSH6…) nhằm xây dựng sở liệu đột biến gen MMR ngƣời Việt Nam Lê Thị Lan Anh Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trịnh Đình Đạt (2009), Công nghệ sinh học, Tập 4, NXB Giáo Dục, Hà Nội Võ Thị Thƣơng Lan (2007), Một số vấn đề sinh học phân tử, NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2009), Cơ sở Di truyền học Phân tử Tế bào, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý ứng dụng, NXB Khoa Học Kỹ Thuật Tiếng Anh Aaltonen L, Peltomaki P, Leach FS, Sistonen P, Pylkkanen L, Mecklin J-P, Jarvinen H, et al (1993), “Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer”, Science, 260: 812-816 Aarnio M, Mecklin JP, Aaltonen LA, Nystrom-Lahti M, Jarvinen HJ (1995), “Life-time risk of different cancers in hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC) syndrome”, Int J Cancer, 20: 430-43 Aarnio M, Sankila R, Pukkala E, Salovaara R, Aaltonen L, de la Chapelle A, Peltomaki P, Mecklin J-P, Jarvinen H (1999), “Cancer risk in mutation carriers of DNA mismatch repair genes”, Int J Cance, 81: 214–218 Annie Yu H-J, Lin K.M, Lynch H.T (2003), “Hereditary non-polyposis colorectal cancer: preventive management”, Cancer Treat Rev, 29: 461-470 An ZW, Xie LL, Cheng H, Zhou Y, Zhang Q, He XG, Huang HS (2009), “A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment”, Anal Biochem, 391(1): 77-9, Epub 2009 May 12, PubMed PMID: 19442642 Lê Thị Lan Anh Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 10 Boland CR, Thibodeau SN, Hamilton SR, et al (1998), “National Cancer Institute workshop on microsatellite instability for cancer detection ang familial predisposition: Development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer”, Cancer Res, 58: 5248-5257 11 Burt RW et al (1996), Prevention and early detection of CRC, London: Saunders, 171–194 12 Cecily P Vaughn, Elaine Lyon, Wade S Samowitz (2008), “Confirmation of Single Exon Deletions in MLH1 and MSH2 Using Quantitative Polymerase Chain Reaction”, Journal of Molecular Diagnostics, Vol.10, No.4 13 Cunningham JM, Kim CY, Christensen ER, Tester DJ, Parc Y, Burgart LJ, Halling KC, McDonnell SK, Schaid DJ, Walsh Vockley C, Kubly V, Nelson H, Michels VV, Thibodeau SN (2001), “The frequency of hereditary defective mismatch repair in a prospective series of unselected colorectal carcinoma”, Am J Hum Genet, 69: 780-790 14 De la Chapelle A (2004), “Genetic predisposition to colorectal cancer”, Nat Rev Cancer, 769-780 15 De la Chapelle A (2005), “The incidence of Lynch syndrome”, Fam Cancer, 4(3), 233-237 16 Dietmaier W, Wallinger, Bocker T, Kullmann F, Fishel R, Ruschoff J (1997), “Diagnostic microsatellite instabillity: definition and corelation with mismatch repair protein expression”, Cancer Res, 57: 4749-4756 st 17 Fred Burz (2008), Principles of cancer genetics, Springer, ed 18 Griffiths AJF, Miller JH, Suzuki DT, et al (2000), An Introduction to Genetic Analysis, 7th edition, W H Freeman, New York 19 Girado A, Gomez A, Salguero G, Garcia H, Aristizabal F, Gutierrez O, Angel L.A, Padron J, Martinez H, Malaver O, Florez L, Barvo R (2005), “MLH1 and MSH2 mutations in Colombian families with hereditary non-polyposis colorectal Lê Thị Lan Anh Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 cancer (Lynch syndrome) description of four novel mutations”, Fam Cancer, 4: 285-290 20 Han HJ, Maruyama M, Baba S, Park JG, Nakamura Y (1995), “Genomic structure of human mismatch repair gene hMLH1, and its mutation analysis patients with hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC)”, Hum Mol Genet, 4: 237-242 21 Hendriks YM, de Jong AE, Morreau H, et al (2006), “Diagnostic approach and management of Lynch syndrome (hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma): a guide for clinicians”, CA Cancer J Clin, 56(4): 213-238 22 Herman JG, Umar A, Polyak K, et al (1998), “Incidence and functional consequence of hMLH1 promotor hypermethylation in colorectal carcinoma”, Proc Nalt Acad Sci USA, 95: 6870-6875 23 Huang J, Kuismanen SA, Liu T, et al (2001), “MSH6 and MSH3 are rarely involved in genetic predisposition to nonpolypotic colon cancer”, Cancer Res, 61(4): 1619-1623 24 Iaccarino I, Marra G, Palombo F, Jiricny J (1998), “hMSH2 and hMSH6 play distinct roles in mismatch binding and contribute differently to the ATPase activity of hMutSalpha”, EMBO J, 17(9): 2677-2686 25 Ionov Y, Peinado MA, Malkhosyan S, Shibata D, and Perucho M (1993), “Ubiquitous somatic mutations in simple repeated sequence reveal a new mechanism for colonic carcinogenesis”, Nature (Lond), 363: 558-561 26 Jiricny J (2000), “Mediating mismatch repair”, Nat Genet, 24(1): 6-8 27 Kane MF, Massimo L, Giada GM, Lipman J, Mishra R, Goldman H, Jessup J M, and Kolodner R (1997), “Methylation of the hMLH1 promoter correlates with lack of expression of hMLH1 in sporadic colon tumors and mismatch repair-defective human tumor cell lines”, Cancer Res, 57: 808-811 Lê Thị Lan Anh Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 28 Knudson AG (1996), “Hereditary cancer: two hits revisited”, J Cancer Res Clin Oncol, 122: 135-140 29 Kolodner RD, Marsischky GT (1999), “Eukaryotic DNA mismatch repair”, Curr Opin Genet Dev, 9(1): 89-96 30 Liu B, Parsons R, Papadopoulos N, Nicolaides NC, Lynch HT, Watson P, Jass LR, Dunlop M, Wyllie A, Peltomaki P, de la Chapelle A, Hamilton SR, Vogelstein B, and Kinzler KW (1996), “Analysis of mismatch repair genes in hereditary non-polyposis colorectal cancer patients” Nat Med, 2:169-174 1996 31 Loukola A, Vilkki S, Singh J, Launonen V, Aaltonen LA (2000), “Germline and somatic mutation analysis of MLH3 in MSI-positive colorectal cancer”, Am J Pathol, 157(2): 347-352 32 Lynch HT, de la Chapelle A (2003) “Hereditary colorectal cancer”, N Engl Med, 348: 919-932 33 Lynch HT, Smyrk T, Watson P, Lanspa SJ, Boman BM, Lynch PM, Lynch JF, Cavalieri (1991), “Hereditary colorectal cancer” Semin Oncol, 18: 337 – 366 34 Lynch HT, de la Chapelle A (1999), “Genetic susceptibility to nonpolyposis colorectal cancer”, J Med Genet; 36: 801-818 35 Manuel Perucho, (2000), “Genetic and Epigenetic Modification of MLH1”, American Journal of Pathology, 157: 1052-1053 36 Marra G, Boland CR (1995), “Hereditary nonpolyposis colorectal cancer: the syndrome, the genes and historical perspectives”, J Natl Cancer Inst 87: 1114-112 37 Minna Nystrom-Lahti, Ramon Parsons, Pertti Sistonen, Lea Pylkkanen, Lauri A Aaltonen, Fredrick S Leach, Stanley R Hamilton, Patrice Watson, Earlene Bronson, Ramon Fusaro, Jennifer Cavalieri, Jane Lynch, Stephen Lanspa, Tom Smyrk, Patrick Lynch, Thomas Drouhard, Kenneth W Kinzler, Bert Vogelstein, Henry T Lynch, Albert de la Chapelle, and Paivi Peltomaki (1994), “Mismatch Lê Thị Lan Anh Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 Repair Genes on Chromosomes 2p and 3p Account for a Major Share of Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer Families Evaluable by Linkage”, Am J Hum Genet, 55(4): 659–665 38 Modrich P (2006), “Mechanisms in eukaryotic mismatch repair”, J Biol Chem, 281(41): 30305-30309 39 Ohmiya N, Matsumoto S, Yamamoto H, Baranovskaya S, Malkhosyan SR, Perucho M (2001), “Germline and somatic mutations in hMSH6 and hMSH3 in gastrointestinal cancers of the microsatellite mutator phonotype”, Gene, 272(12): 301-313 40 Orita M, Iwahana H, Kanazawa H, Hayashi K, Sekiya T, (1989), “Detection of polymorphism of human DNA by gel electrophoresis as single strand conformation polymorphism”, Proc Natl Acad Sci USA, 86: 2766-2770 41 Papp J, Kovacs ME, Olah E (2007), “Germline MLH1 and MSH2 mutational spectrum including frequent large genomic aberrations in Hungarian hereditary non-polyposis colorectal cancer families: implications for genetic testing”, World J Gastroenterol,13(19): 2727-2732 42 Peltomaki P (2001), “Deficient DNA mismatch repair: a common etiologic factor for colon cancer”, Hum Mol Genet, 10: 735-740 43 Peltomaki P (2005), “Lynch syndrome genes”, Fam Cancer, 4(3): 227-232 44 Peltomaki P, Vasen H (2004), “Mutations associated with HNPCC predisposition-update of ICG-HNPCC/INSIGHT mutation databases”, Dis Markers, 20: 269-276 45 Sambrook J, Russell DW (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, rd Ed, Cold Spring Harbor Laboratoty Press, Cold Spring Harbor, New York 46 Shin KH, Ku JL, Park JG (2002), “Mutational analysis of promoters of mismatch repair genes hMSH2 and hMLH1 in hereditary nonpolyposis colorectal cancer and early onset colorectal cancer patients: identification of Lê Thị Lan Anh Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 three novel germ-line mutations in promoter of the hMSH2 gene”, Cancer Res, 62: 38-42 47 Stewart B W ADN Kleihues P (2003), “World Cancer Report”, IARC Press, Lyon 48 Sunnucks P, et al (2000), “SSCP Is Not So Difficult: The Application and Utility of Single-Stranded Conformation Polymorphism in Evolutionary Biology and Molecular Ecology”, Molecular Ecology, 9: 1699-710 49 Thibodeau Sn, Bren G, Schaid D (1993), “Microsattellite instability in cancer of the proximal colon”, Science, 260: 816-819 50 Umar A, Boland CR, Terdiman JP, Syngal S, de la Chapelle A, Ruschoff J, et al (2004), “Revised Bethesda Guideline for heteitary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch Syndrome) and microsatellite instability”, J Natl Cancer Inst, 96: 261-268 51 Umar A, Rinsinger JI, Hawk ET, Barrett JC (2004), “Testing guidelines for hereditary non-polyposis colorectal cancer”, Nat Rev Cancer, 153-158 52 Vasen HF, Mecklin JP, Khan PM, Lynch HT (1991), “The International Collaborative Group on Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer (ICGHNPCC)”, Dis Colon Rectum, 34(5): 424-425 53 Vasen HF, Watson P, Mecklin JP, Lynch HT (1999), “New clinical criteria for hereditary colorectal cancer (HNPCC, Lynch syndrome) proposed by the International collaborative group on HNPCC”, Gastroenterology, 116: 14531456 54 Warthin AS (1925), “The further of study of a cancer family”, J Cancer Res, 279 – 286 55 Watson P, Lynch HT (1993), “Extracolonic cancer in hereditary nonpolyposis colorectal Cancer”, Cancer, 71: 677-685 Lê Thị Lan Anh Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 56 Weber T (1996), “Clinical surveillance recommendations for HNPCC”, Cancer, 348-465 57 Weijnen J, Khan PM, Vasen H, van der Klift H, et al (1997), “Hereditary nonpolyposis colorectal cancer families not complying with the Amsterdam criteria show extremely low frequency of mismatch –repair –gene mutations”, Am J Hum Genet, 61: 329-335 58 Wijnen J, Khan PM, Vasen H, Menko F, vander Klift H, van den Broek M, van Leuuwen-Cornelisse I, Nagengast F, Meijers-Heijboer EJ, Linhout D, Griffioen G, Cats A, Kleibeuker J, Varesco L, Bertario L, Bisgaard ML, Morh J, Kolodner R, Fodde (1996), “Majority of hMLH1 mutations responsible for hereditary nonpolyposis colorectal cancer cluster at the exonic region 15-16”, Am J Ham genet, 58: 300-307 59 Yamashita K, Dai TY, Yamamoto F, Perucho (2003), “Genetics supersedes epigenetics in colon cancer phenotype”, Cancer cell, 4: 121-131 60 Young KS, Seung CH, Joo HS, Sung HH, Ja LK, Byong CY, Il JK, Jae GP, (2004), “Germline mutations in MLH1, MSH2 and MSH6 in Korean HNPCC families”, Human mutation, Mutation in brief, 748 61 Zhang J, Lindroos A, Ollila S, et al (2006), “Gene conversion is a frequent mechanism of inactivation of the wild-type allele in cancers from MLH1/MSH2 deletion carriers”, Cancer Res, 66(2): 659-664 Trang web 62 http://atlasgeneticsoncology.org/Genes/MLH1ID149ch3p21.html 63 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ 64 http://www.protocol-online.org/prot/Protocols/Single-Strand- Conformation Polymorphism SSCP Analysis-by-Nondenaturing-PAGE3468.html Lê Thị Lan Anh Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 65 http://www.springerimages.com/Images/Biomedicine/1-10.1007_s10689- 008-9200-1-3 66 http://www.springerimages.com/Images/LifeSciences/1-10.1007_s11010- 008-9761-1-1 Lê Thị Lan Anh ... NHIÊN - Lê Thị Lan Anh SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN SỬA CHỮA BẮT CẶP SAI MLH1 LIÊN QUAN ĐẾN UNG THƢ RUỘT KẾT KHÔNG POLYP DI TRUYỀN Ở NGƢỜI VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 70 LUẬN... đề tài ? ?Sàng lọc đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thƣ ruột kết không polyp di truyền ngƣời Việt Nam? ?? Đề tài đƣợc thực phòng thí nghiệm Phân tích di truyền thuộc Trung tâm... đầu gen MLH1 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng Việt Nam góp phần cung cấp liệu đột biến gen mở hƣớng nghiên cứu gen MMR khác, ứng dụng chẩn đoán sớm ung thƣ ruột kết không polyp di truyền Việt Nam