Luận văn sàng lọc đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thư ruột kết không polyp di truyền ở người việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Lê Thị Lan Anh SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN SỬA CHỮA BẮT CẶP SAI MLH1 LIÊN QUAN ĐẾN UNG THƯ RUỘT KẾT KHÔNG POLYP DI TRUYỀN Ở NGƯỜI VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Hồng Vân Hà Nội LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Hồng Vân - người thầy tận tình hướng dẫn, bảo, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ suốt trình học tập, rèn luyện nghiên cứu trường Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới ThS Trần Thị Thùy Anh, người thầy giúp đỡ bảo nhiều kiến thức kinh nghiệm nghiên cứu khoa học kể từ bắt đầu tiến hành nghiên cứu thực luận văn khoa học Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thể thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên; anh, chị, em Phòng Sinh học thụ thể phát triển thuốc thuộc phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ Enzym Protein tạo điều kiện sở, vật chất giúp đỡ suốt trình nghiên cứu đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Khoa Sinh học Ban chủ nhiệm Khoa Sinh học dạy, truyền đạt cho nhiều kiến thức quý báu tạo cho có môi trường học tập nghiên cứu thuận lợi Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới gia đình bạn bè, người động viên, ủng hộ suốt trình học tập nghiên cứu khoa học Học viên Lê Thị Lan Anh MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 1.1 Di truyền ung thư 11 1.1.1 Khái niệm ung thư 11 1.1.2 Gen ung thư gen ức chế khối u .11 Hình Các đường hình thành ung thư đại trực tràng [3] 13 1.2 Hội chứng ung thư ruột kết 13 1.3 Hội chứng ung thư ruột kết không polyp di truyền (Hội chứng Lynch) 14 1.3.1 Đặc điểm di truyền HNPCC 15 1.4 Cơ sở phân tử HNPCC 20 1.4.2 Cơ chế sửa chữa ADN bắt cặp sai (MMR - Mismatch Repair) 22 1.4.4 Gen MLH1 29 1.5 Một số kỹ thuật di truyền sử dụng nghiên cứu HNPCC 32 Những phương pháp thường dùng kể đến RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction), RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeat), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), PCRRFLP (Restricted Fragment Length Polymorphism), PCR-SSCP (Single Strand Conformation Polymorphisms) 33 1.5.1 Kỹ thuật PCR .33 1.5.2 Kỹ thuật PCR phiên mã ngược (RT-PCR: Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) 33 1.5.3 Kỹ thuật phân tích trình tự lăp lại đơn giản (SSR - Simple Sequence Repeat) 34 1.5.5 Kỹ thuật phân tích đa hình sợi đơn (SSCP: Single Strand Conformation Polymorphism) .35 1.5.6 Phương pháp giải trình tự ADN 37 1.6.1 Mục tiêu nghiên cứu 38 1.6.2 Nội dung nghiên cứu đề tài 38 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 Vật liệu nghiên cứu 39 2.2.1 Thu thập bảo quản mẫu 40 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .46 3.1 Tách chiết ADN tổng số 46 3.2 Phản ứng PCR 48 3.3.Kết phân tích SSCP 57 3.5 Kết giải trình tự ADN so sánh trình tự 71 Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 I KẾT LUẬN II KIẾN NGHỊ 77 78 DANH MỤC BẢNG Bảng Độ thâm nhập đột biến MLH1 MSH2 bệnh nhân ung thư Bảng Thống kê bệnh ung thư liên quan đến HNPCC Bảng Các gen MMR liên quan tới HNPCC Bảng Cấu trúc gen MMR Bảng Tỉ lệ đột biến thường gặp hai gen MLH1 MSH2 bệnh nhân HNPCC Bảng Các thành phần phản ứng PCR Bảng Trình tự mồi tương ứng exon 8, 13, 14, 16, 17, 18, 19 gen MLH1 Bảng Thành phần PAGE 12% cho 10 ml dung dịch Bảng Thành phần tham gia phản ứng cắt exon 16, 18 19 gen MLH1 Bảng 10 Chu trình nhiệt PCR tối ưu exon 8, 13, 14, 16, 17, 18 19 gen MLH1 Lê Thị Lan Anh Cao học K18 DANH MỤC HÌNH Hình Các đường hình thành ung thư đại trực tràng Hình Các phân nhóm ung thư ruột kết Hình Sửa chữa bắt cặp sai trình tự vi vệ tinh Hình Cơ chế sửa chữa bắt cặp sai E.coli Hình Sửa chữa ADN bắt cặp sai người Hình Con đường dẫn đến ung thư di truyền người thông qua đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR) Hình Tỷ lệ loại đột biến phát gen MLH1, MSH2 MSH6 Hình Vị trí MLH1 NST số Hình Sơ đồ gen MLH1 Hình 10 Sơ đồ protein mã hóa MLH1 Hình 11 Kết phân tích SSCP exon gen AR Hình 12 (A) Kết tách ADN tổng số từ mẫu mô (B) Kết tách ADN tổng số từ mẫu máu Hình 13 Sản phẩm PCR exon gen MLH1 với nhiệt độ gắn mồi: 600C, 60,50C, 610C, 61,50C Hình 14 (A), (B) Sản phẩm PCR exon gen MLH1 Hình 15 (A), (B) Sản phẩm PCR exon 13 gen MLH1 Hình 16 (A), (B) Sản phẩm PCR exon 14 gen MLH1 Hình 17 (A), (B) Sản phẩm PCR exon 16 gen MLH1 Hình 18 (A), (B) Sản phẩm PCR exon 17 gen MLH1 Hình 19 (A), (B) Sản phẩm PCR exon 18 gen MLH1 Hình 20 (A), (B) Sản phẩm PCR exon 19 gen MLH1 Hình 21 (A), (B) Kết phân tích SSCP exon gen MLH1 Hình 22 (A), (B) Kết phân tích SSCP exon 13 gen MLH1 Hình 23 (A), (B) Kết phân tích SSCP exon 14 gen MLH1 Hình 24 Kết phân tích SSCP exon 16 gen MLH1 Hình 25 Kết phân tích SSCP exon 17 gen MLH1 Hình 26 Kết phân tích SSCP exon 18 gen MLH1 Hình 27 Kết phân tích SSCP exon 19 gen MLH1 Hình 28 Kết PCR-RFLP mẫu máu từ 20 thành viên gia đình mắc hội chứng ung thư ruột kết không polyp di truyền Nhật Bản Hình 29 Dự đoán kết phản ứng cắt exon 16 gen MLH1 enzym MspI Hình 30 Sản phẩm cắt exon 16 sản phẩm PCR exon 16 điện di gel agarose 2% Hình 31 Dự đoán sản phẩm cắt exon 19 enzym CviQI Hình 32 Sản phẩm cắt exon 19 enzym CviQI điện di gel polyacrylamide 12% Hình 33 Dự đoán sản phẩm cắt exon 18 gen MLH1 enzym CviQI Hình 34 (A), (B), (C), (D) Sản phẩm cắt exon 18 enzym CviQI điện di gel polyacrylamide 12% Hình 35 (A) Kết so sánh trình tự exon 13 đối chứng bệnh nhân số (B) Trình tự ngược exon 13 gen MLH1 cho thấy có đột biến thay vị trí 203 G>A Hình 36 (A) Kết so sánh trình tự exon 14 đối chứng bệnh nhân số 19 (B) Trình tự xuôi exon 14 gen MLH1 cho thấy có đột biến thay vị trí 176C>G đột biến thay vị trí 185T>A Hình 37 So sánh trình tự exon 18 từ mẫu mô ung thư bệnh nhân 20 mô người bình thường Hình 38 Kết so sánh trình tự exon 18 từ mẫu máu mẫu mô bệnh nhân số 19 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt ADN ARN RNase APS BLB bp dNTP EDTA FAP HNPCC Kb LOH MMR MSI NST PCR RFLP RT-PCR SNP SSCP SSR TLB TAE TE TEMED Tiếng Anh Deoxyribonucleic Acid Ribonucleic Acid Ribonuclease Ammonium persulphate Blood Lysis Buffer base pair Deoxyribonucleotide Triphosphate Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Familial Adenomatous Polyposis Hereditary Non – Polyposis Colorectal Cancer Kilobase Loss of Heterozygosity Mismatch Repair Microsatellite Instability Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism Reverse Transcription PCR Single Nucleotide Polymorphism Single Strand Conformation Polymorphism Simple Sequence Repeat Tissue Lysis Buffer Tris – Acetic acid – EDTA Tris – EDTA N,N,N’,N’- tetramethylenediamine Tiếng Việt Axit deoxyribonucleic Axit ribonucleic Ribonuclease Dung dịch đệm phân giải tế bào máu cặp bazơ nitơ Deoxyribonucleotit triphotphat Hội chứng u tuyến polyp theo dòng họ Ung thư ruột kết không polyp di truyền Kilobazơ Mất tính dị hợp tử Sửa chữa bắt cặp sai Tính bất ổn vi vệ tinh Nhiễm sắc thể Phản ứng chuỗi nhờ polymeraza Tính đa hình độ dài đoạn giới hạn PCR phiên mã ngược Tính đa hình đơn nucleotit Phân tích đa hình cấu hình sợi đơn Trình tự lặp lại đơn giản Dung dịch đệm phân giải tế bào mô Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 MỞ ĐẦU Trong 20 năm qua, phát minh to lớn di truyền học phân tử góp phần thúc đẩy phát triển mạnh mẽ công nghệ sinh học Các kỹ thuật tách dòng gen, tạo ADN tái tổ hợp, giải trình tự gen nhiều kỹ thuật sinh học phân tử khác ngày ứng dụng rộng rãi có hiệu việc phát hiện, chẩn đoán điều trị bệnh, có bệnh ung thư Sự phát ung thư bệnh di truyền coi thắng lợi sinh y học đại Nhiều nỗ lực nghiên cứu không ngừng nghỉ hiệu giúp xác định chi tiết biến đổi di truyền nhân tố trực tiếp gây ung thư, hình thành khối u, sau tăng sinh lan rộng chúng Tỷ lệ mắc bệnh ung thư có xu hướng gia tăng phần lớn nước giới Hiện tại, qua thống kê cho thấy toàn cầu có khoảng 22,4 triệu người sống chung với bệnh ung thư Theo Tổ chức Y tế Thế giới, ước tính hàng năm giới có khoảng 10,1 triệu trường hợp mắc ung thư Các ung thư hàng đầu giới nam giới ung thư phổi, dày, đại trực tràng, tiền liệt tuyến, gan; Ở nữ giới ung thư vú, đại trực tràng, cổ tử cung, dày phổi Cũng theo Tổ chức Y tế Thế giới, ước tính năm có khoảng 6,7 triệu người chết ung thư Tỷ lệ chết ung thư chiếm 12% số nguyên nhân gây tử vong người [28] Riêng Việt Nam, năm phát khoảng 200.000 người khoảng 75.000 người chết bệnh ung thư [47] Trong số bệnh ung thư thường gặp người, ung thư đại trực tràng loại ung thư tương đối phổ biến, chiếm khoảng 11,5% tổng số trường hợp ung thư chiếm tới 15,2% tổng số trường hợp tử vong ung thư Loại ung Lê Thị Lan Anh Cao học K18 Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 thư thường gặp nhiều nước phát triển có xu hướng tăng nhanh nước phát triển Nguy ung thư đại trực tràng tăng cao người có tiền sử viêm đại tràng gia đình, dòng họ có người bị ung thư đại trực tràng [3] Ung thư ruột kết không polyp di truyền (HNPCC - Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer), gọi hội chứng Lynch chiếm 15% trường hợp ung thư đại trực tràng Đây hội chứng di truyền trội gen nhiễm sắc thể thường gây Những đột biến gây bất hoạt tế bào mầm gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR) bao gồm gen MLH1, MSH2, MSH6 PMS2, dẫn đến thay đổi hoạt tính protein, làm bất hoạt hệ thống sửa chữa bắt cặp sai nguyên nhân gây HNPCC Nhiều nghiên cứu cho thấy, đột biến gen MLH1 chiếm khoảng 50% số đột biến xác định gen MMR [2, 5] Trên giới có nhiều nghiên cứu gen MLH1 thực nhiều quần thể người khác Tại Việt Nam, xét nghiệm di truyền chẩn đoán ung thư nói chung ung thu đại trực tràng nói riêng chưa thực Việc phát biến đổi di truyền gen MMR liên quan đến ung thư đại trực tràng có khuynh hướng di truyền, nhằm đưa kết nghiên cứu bước đầu gen MLH1 bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam góp phần cung cấp liệu đột biến gen mở hướng nghiên cứu gen MMR khác, ứng dụng chẩn đoán sớm ung thư ruột kết không polyp di truyền Việt Nam cần thiết Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, tiến hành thực đề tài “Sàng lọc đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thư ruột kết không polyp di truyền người Việt Nam” Đề tài thực phòng thí nghiệm Phân tích di truyền thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sống, Khoa Sinh học Phòng Sinh học thụ thể phát triển thuốc thuộc phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ Enzym Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Lê Thị Lan Anh Cao học K18 Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 Lê Thị Lan Anh 10 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 34 AGCGTTTACG TACCCTCATG TCCCTGCTCA TTAATTTCTT CCTGGAGACT CAAAACACTA ********** ********** ********** ********** ********** ********** AGCGTTTACG TACCCTCATG TCCCTGCTCA TTAATTTCTT CCTGGAGACT CAAAACACTA ĐC 94 GTGAGGTTAA TGATCCTTCT CCGGGGGGTA CAAGCTGCAG TCATTTCCTT TCGGGAATCA ********** ********** ********** ********** ********** ********** GTGAGGTTAA TGATCCTTCT CCGGGGGGTA CAAGCTGCAG TCATTTCCTT TCGGGAATCA ĐC 154 TCTTCCACCA TTTCCACATC AGAATCTTCC CGATGTCTCT TTCTGCAATG AAGAAA ********** ********** ********** ********** ********* ***** TCTTCCACCA TTTCCACATC AGAATCTTCC CGATGTCTCT TTCTGCAATA AAGAA 13T6-R 13T6-R ĐC 13T6-R (A) (B) Hình 35 (A) Kết so sánh trình tự exon 13 đối chứng bệnh nhân số (mẫu 13T6-R) (B) Trình tự ngược exon 13 gen MLH1 cho thấy có đột biến thể dị hợp tử thay vị trí 203 G>A (vị trí mũi tên) 3.5.2 Kết phân tích trình tự exon 14 từ mẫu T19 Như kết phần phân tích SSCP exon 14 cho thấy, mẫu T19 có biểu mô hình phân ly bất thường so với đối chứng Do vậy, phân tích trình tự ADN exon 14 gen MLH1 thu từ người Kết trình bày Hình 36 Khi so sánh với trình tự ADN đối chứng, nhận thấy có hai biến đổi trình tự gen bệnh nhân 19 so với đối chứng Chúng phát thấy có thay đổi nucleotit C>G vị trí 176 (mũi tên thứ Hình 36B) Ngoài ra, vị trí 185 exon này, nucleotit T bị thay nucleotit A (vị trí mũi tên thứ hai Hình 36B) 18 68 TTTGTTTTGC AGTTCTCCGG GAGATGTTGC ATAACCACTC CTTCGTGGGC ********** ********** ********** ********** ********** TTTGTTTTGC AGTTCTCCGG GAGATGTTGC ATAACCACTC CTTCGTGGGC ĐC TGTGTGAATC CTCAGTGGGC CTTGGCACAG CATCAAACCA AGTTATACCT TCTCAACACC ĐC Lê Thị Lan Anh 72 14T19-F Cao học K18 Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 ********** ********** ********** ********** ********** ********** TGTGTGAATC CTCAGTGGGC CTTGGCACAG CATCAAACCA AGTTATACCT TCTCAACACC 128 ACCAAGCTTA GGTAAATCAG CTAAGTGTGT GAACAAGCAG AGCTACTACA ACAATGGTAC ********** ********** ********** ********** ******** * ******* * ACCAAGCTTA GGTAAATCAG CTGAGTGTGT GAACAAGCAG AGCTACTAGA ACAATGGAA 14T19-F ĐC 14T19-F (A) (B) Hình 36 (A) Kết so sánh trình tự exon 14 đối chứng bệnh nhân số 19 (mẫu 14T19) (B) Trình tự xuôi exon 14 gen MLH1 cho thấy có đột biến thay vị trí 176C>G đột biến thay vị trí 185T>A 3.5.3 Phân tích trình tự exon 18 từ mẫu T20 Kết giải trình tự exon 18 mẫu T20 cho thấy không phát thay đổi trình tự nucleotit bệnh nhân so với người bình thường So sánh trình tự thể Hình 37 10 18 GTGTGCAT ******** GTGTGCAT ĐC CACCACTGTA CCTGCTGGCC TGAGAGGGTC GACTCCTCAG ATATGTACTG CTTCCGGATG ********** ********** ********** ********** ********** ********** CACCACTGTA CCTGCTGGCC TGAGAGGGTC GACTCCTCAG ATATGTACTG CTTCCGGATG ĐC Lê Thị Lan Anh 73 18T20-R 18T20-R Cao học K18 Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 78 GAATAGAACA TAGCGCATTC TTTACTGAGG CTTTCAAAAC ATTCCTTTTC TTCGTCCCAA ********** ********** ********** ********** ********** ********** GAATAGAACA TAGCGCATTC TTTACTGAGG CTTTCAAAAC ATTCCTTTTC TTCGTCCCAA ĐC TTCACCTGGT CCAAAGAAAT TCAATACCTC AAAATAGGTA CGAATTTAAA CATTCTCATT ********** ********** ********** ********** ********** ********** TTCACCTGGT CCAAAGAAAT TCAATACCTC AAAATAGGTA CGAATTTAAA CATTCTCATT ĐC 138 CTAAACGGAG ATCACAGACT AC ********** ********** ** CTAAACGGAG ATCACAGACT AC ĐC 198 18T20-R 18T20-R 18T20-R Hình 37 So sánh trình tự exon 18 mẫu mô ung thư bệnh nhân 20 mô người bình thường Để khẳng định mức độ xác việc giải trình tự exon 18 xem xét biến đổi trình tự nucleotit mẫu máu mô ung thư, so sánh trình tự ADN exon 18 thu từ mô trình tự ADN exon 18 từ máu bệnh nhân số 19 Kết trình bày Hình 38 Chúng nhận thấy có tương đồng 100% ADN exon 18 hai mô Kết cho thấy phát sinh khối u mô đại trực tràng bệnh nhân chưa thấy có mối liên quan với biến đổi exon 18 gen MLH1 Để có kết luận chắn điều này, cần giải trình tự phân đoạn khác gen MLH1 10 GCATC ACCACTGTAC CTGCTGGCCT GAGAGGGTCG ACTCCTCAGA ***** ********** ********** ********** ********** GCATC ACCACTGTAC CTGCTGGCCT GAGAGGGTCG ACTCCTCAGA 18T19-R TATGTACTGC TTCCGGATGG AATAGAACAT AGCGCATTCT TTACTGAGGC TTTCAAAACA ********** ********** ********** ********** ********** ********** TATGTACTGC TTCCGGATGG AATAGAACAT AGCGCATTCT TTACTGAGGC TTTCAAAACA 18T19-R 16 57 61 Lê Thị Lan Anh 74 18B19-R 18B19-R Cao học K18 Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 117 121 177 181 TTCCTTTTCT TCGTCCCAAT TCACCTGGTC CAAAGAAATT CAATACCTCA AAATAGGTAC ********** ********** ********** ********** ********** ********** TTCCTTTTCT TCGTCCCAAT TCACCTGGTC CAAAGAAATT CAATACCTCA AAATAGGTAC 18T19-R GAATTTAAAC ATTCTCATTC TAAACGGAGA TCACACGACT ACTTTT ********** ********** ********** ********** ****** GAATTTAAAC ATTCTCATTC TAAACGGAGA TCACACGACT ACCTTT 18T19-R 18B19-R 18B19-R Hình 38 Kết so sánh trình tự exon 18 mẫu máu mẫu mô từ bệnh nhân số 19 Theo nghiên cứu G Isidro cộng (2003), quần thể người Bồ Đào Nha, có hai đột biến thay nucleotit vị trí 2074, làm thay đổi ba 674 (G>C, làm thay Cysteine thành Arginine), vị trí 2089 làm thay đổi ba 689 (T>C tương ứng thay Glycine thành Arginine) exon 18 gen MLH1 Khi nghiên cứu đột biến exon 18 này, Young cộng (2004) phát hai đột biến thay vị trí 2104 2001 số bệnh nhân người Hàn Quốc [60] Năm 2008, H Zang cộng phát đột biến exon 18 gen MLH1 vị trí 2101 2038 bệnh nhân người Trung Quốc Hầu hết đột biến exon 18 đột biến thay nucleotit làm thay đổi điện tích làm thay đổi cấu hình không gian protein MLH1 vị trí nhận biết với protein PMS2 Lê Thị Lan Anh 75 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 [61] Trong điều kiện hạn chế thời gian, chưa phân tích đuợc toàn trình tự exon gen MLH1 (19 exon) exon nhân Một số phát thay đổi trình tự nucleotit phân đoạn phân tích kết ban đầu Tuy nhiên, khẳng định kỹ thuật PCR-SSCP giải trình tự ADN hoàn toàn áp dụng việc sàng lọc đột biến gen MLH1 nhóm gen sửa chữa bắt cặp sai liên kết chặt với hội chứng HNPCC dạng ung thư khác Việt Nam Lê Thị Lan Anh 76 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I KẾT LUẬN Từ kết thu với việc ứng dụng kỹ thuật PCR-SSCP PCRRFLP phân tích đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thư đại trực tràng không polyp di truyền, đưa kết luận sau: Đã tách chiết thành công ADN tổng số từ 50 mẫu mô 20 mẫu máu bệnh phẩm Đã nhân thành công exon quan tâm gen MLH1, bao gồm việc thiết kế cặp mồi đặc hiệu tối ưu hóa phản ứng PCR Đã phát mẫu phân đoạn gen MLH1 từ bệnh nhân có mô hình phân tích băng điện di khác biệt exon 13 (mẫu 13T6) exon 14 (mẫu 14T18 14T19) gen MLH1 so sánh với đối chứng, sử dụng kỹ thuật PCR-SSCP Đã phát mẫu phân đoạn gen MLH1 từ bệnh nhân có mô hình phân tích băng điện di khác biệt exon 18 gen MLH1 từ bệnh nhân số 19 bệnh nhân số 20 so sánh với đối chứng, sử dụng kỹ thuật PCRRFLP Đã phát đột biến thể dị hợp tử thay nucleotit G>A vị trí 203 exon 13 từ mẫu mô bệnh phẩm bệnh nhân số (mẫu 13T6), đột biến thay nucleotit C>G vị trí 176 đột biến thay T>A vị trí 185 thuộc exon 14 gen MLH1 từ mẫu mô bệnh phẩm người số 19 (mẫu 14T19) giải trình tự gen Những sai khác mô hình điện di SSCP RLFP thay đổi trình tự nucleotit phát mẫu mô, không phát mẫu máu tương ứng Điều chứng tỏ đột biến mà xác định đột biến soma Lê Thị Lan Anh 77 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 II KIẾN NGHỊ Trên sở kết nghiên cứu này, có số kiến nghị sau: Tiếp tục tiến hành phân tích đột biến exon lại gen MLH1 kỹ thuật PCR-SSCP kỹ thuật di truyền khác (SSR, HET, DGGE ) để xác định dạng đột biến thuộc gen MLH1 có bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam Mở rộng nghiên cứu gen MMR khác (MSH2, MSH6…) nhằm xây dựng sở liệu đột biến gen MMR người Việt Nam Lê Thị Lan Anh 78 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trịnh Đình Đạt (2009), Công nghệ sinh học, Tập 4, NXB Giáo Dục, Hà Nội Võ Thị Thương Lan (2007), Một số vấn đề sinh học phân tử, NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2009), Cơ sở Di truyền học Phân tử Tế bào, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý ứng dụng, NXB Khoa Học Kỹ Thuật Tiếng Anh Aaltonen L, Peltomaki P, Leach FS, Sistonen P, Pylkkanen L, Mecklin J-P, Jarvinen H, et al (1993), “Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer”, Science, 260: 812-816 Aarnio M, Mecklin JP, Aaltonen LA, Nystrom-Lahti M, Jarvinen HJ (1995), “Life-time risk of different cancers in hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC) syndrome”, Int J Cancer, 20: 430-43 Aarnio M, Sankila R, Pukkala E, Salovaara R, Aaltonen L, de la Chapelle A, Peltomaki P, Mecklin J-P, Jarvinen H (1999), “Cancer risk in mutation carriers of DNA mismatch repair genes”, Int J Cance, 81: 214–218 Annie Yu H-J, Lin K.M, Lynch H.T (2003), “Hereditary non-polyposis colorectal cancer: preventive management”, Cancer Treat Rev, 29: 461-470 An ZW, Xie LL, Cheng H, Zhou Y, Zhang Q, He XG, Huang HS (2009), “A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment”, Anal Biochem, 391(1): 77-9, Epub Lê Thị Lan Anh 79 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 2009 May 12, PubMed PMID: 19442642 10 Boland CR, Thibodeau SN, Hamilton SR, et al (1998), “National Cancer Institute workshop on microsatellite instability for cancer detection ang familial predisposition: Development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer”, Cancer Res, 58: 5248-5257 11 Burt RW et al (1996), Prevention and early detection of CRC, London: Saunders, 171–194 12 Cecily P Vaughn, Elaine Lyon, Wade S Samowitz (2008), “Confirmation of Single Exon Deletions in MLH1 and MSH2 Using Quantitative Polymerase Chain Reaction”, Journal of Molecular Diagnostics, Vol.10, No.4 13 Cunningham JM, Kim CY, Christensen ER, Tester DJ, Parc Y, Burgart LJ, Halling KC, McDonnell SK, Schaid DJ, Walsh Vockley C, Kubly V, Nelson H, Michels VV, Thibodeau SN (2001), “The frequency of hereditary defective mismatch repair in a prospective series of unselected colorectal carcinoma”, Am J Hum Genet, 69: 780-790 14 De la Chapelle A (2004), “Genetic predisposition to colorectal cancer”, Nat Rev Cancer, 769-780 15 De la Chapelle A (2005), “The incidence of Lynch syndrome”, Fam Cancer, 4(3), 233-237 16 Dietmaier W, Wallinger, Bocker T, Kullmann F, Fishel R, Ruschoff J (1997), “Diagnostic microsatellite instabillity: definition and corelation with mismatch repair protein expression”, Cancer Res, 57: 4749-4756 17 Fred Burz (2008), Principles of cancer genetics, Springer, 1st ed 18 Griffiths AJF, Miller JH, Suzuki DT, et al (2000), An Introduction to Genetic Analysis, 7th edition, W H Freeman, New York 19 Girado A, Gomez A, Salguero G, Garcia H, Aristizabal F, Gutierrez O, Angel Lê Thị Lan Anh 80 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 L.A, Padron J, Martinez H, Malaver O, Florez L, Barvo R (2005), “MLH1 and MSH2 mutations in Colombian families with hereditary non-polyposis colorectal cancer (Lynch syndrome) description of four novel mutations”, Fam Cancer, 4: 285-290 20 Han HJ, Maruyama M, Baba S, Park JG, Nakamura Y (1995), “Genomic structure of human mismatch repair gene hMLH1, and its mutation analysis patients with hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC)”, Hum Mol Genet, 4: 237-242 21 Hendriks YM, de Jong AE, Morreau H, et al (2006), “Diagnostic approach and management of Lynch syndrome (hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma): a guide for clinicians”, CA Cancer J Clin, 56(4): 213-238 22 Herman JG, Umar A, Polyak K, et al (1998), “Incidence and functional consequence of hMLH1 promotor hypermethylation in colorectal carcinoma”, Proc Nalt Acad Sci USA, 95: 6870-6875 23 Huang J, Kuismanen SA, Liu T, et al (2001), “MSH6 and MSH3 are rarely involved in genetic predisposition to nonpolypotic colon cancer”, Cancer Res, 61(4): 1619-1623 24 Iaccarino I, Marra G, Palombo F, Jiricny J (1998), “hMSH2 and hMSH6 play distinct roles in mismatch binding and contribute differently to the ATPase activity of hMutSalpha”, EMBO J, 17(9): 2677-2686 25 Ionov Y, Peinado MA, Malkhosyan S, Shibata D, and Perucho M (1993), “Ubiquitous somatic mutations in simple repeated sequence reveal a new mechanism for colonic carcinogenesis”, Nature (Lond), 363: 558-561 26 Jiricny J (2000), “Mediating mismatch repair”, Nat Genet, 24(1): 6-8 27 Kane MF, Massimo L, Giada GM, Lipman J, Mishra R, Goldman H, Jessup J M, and Kolodner R (1997), “Methylation of the hMLH1 promoter correlates with lack of expression of hMLH1 in sporadic colon tumors and mismatch Lê Thị Lan Anh 81 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 repair-defective human tumor cell lines”, Cancer Res, 57: 808-811 28 Knudson AG (1996), “Hereditary cancer: two hits revisited”, J Cancer Res Clin Oncol, 122: 135-140 29 Kolodner RD, Marsischky GT (1999), “Eukaryotic DNA mismatch repair”, Curr Opin Genet Dev, 9(1): 89-96 30 Liu B, Parsons R, Papadopoulos N, Nicolaides NC, Lynch HT, Watson P, Jass LR, Dunlop M, Wyllie A, Peltomaki P, de la Chapelle A, Hamilton SR, Vogelstein B, and Kinzler KW (1996), “Analysis of mismatch repair genes in hereditary non-polyposis colorectal cancer patients” Nat Med, 2:169-174 1996 31 Loukola A, Vilkki S, Singh J, Launonen V, Aaltonen LA (2000), “Germline and somatic mutation analysis of MLH3 in MSI-positive colorectal cancer”, Am J Pathol, 157(2): 347-352 32 Lynch HT, de la Chapelle A (2003) “Hereditary colorectal cancer”, N Engl Med, 348: 919-932 33 Lynch HT, Smyrk T, Watson P, Lanspa SJ, Boman BM, Lynch PM, Lynch JF, Cavalieri (1991), “Hereditary colorectal cancer” Semin Oncol, 18: 337 – 366 34 Lynch HT, de la Chapelle A (1999), “Genetic susceptibility to nonpolyposis colorectal cancer”, J Med Genet; 36: 801-818 35 Manuel Perucho, (2000), “Genetic and Epigenetic Modification of MLH1”, American Journal of Pathology, 157: 1052-1053 36 Marra G, Boland CR (1995), “Hereditary nonpolyposis colorectal cancer: the syndrome, the genes and historical perspectives”, J Natl Cancer Inst 87: 1114112 37 Minna Nystrom-Lahti, Ramon Parsons, Pertti Sistonen, Lea Pylkkanen, Lauri A Aaltonen, Fredrick S Leach, Stanley R Hamilton, Patrice Watson, Earlene Bronson, Ramon Fusaro, Jennifer Cavalieri, Jane Lynch, Stephen Lanspa, Tom Smyrk, Patrick Lynch, Thomas Drouhard, Kenneth W Kinzler, Bert Vogelstein, Lê Thị Lan Anh 82 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 Henry T Lynch, Albert de la Chapelle, and Paivi Peltomaki (1994), “Mismatch Repair Genes on Chromosomes 2p and 3p Account for a Major Share of Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer Families Evaluable by Linkage”, Am J Hum Genet, 55(4): 659–665 38 Modrich P (2006), “Mechanisms in eukaryotic mismatch repair”, J Biol Chem, 281(41): 30305-30309 39 Ohmiya N, Matsumoto S, Yamamoto H, Baranovskaya S, Malkhosyan SR, Perucho M (2001), “Germline and somatic mutations in hMSH6 and hMSH3 in gastrointestinal cancers of the microsatellite mutator phonotype”, Gene, 272(12): 301-313 40 Orita M, Iwahana H, Kanazawa H, Hayashi K, Sekiya T, (1989), “Detection of polymorphism of human DNA by gel electrophoresis as single strand conformation polymorphism”, Proc Natl Acad Sci USA, 86: 2766-2770 41 Papp J, Kovacs ME, Olah E (2007), “Germline MLH1 and MSH2 mutational spectrum including frequent large genomic aberrations in Hungarian hereditary non-polyposis colorectal cancer families: implications for genetic testing”, World J Gastroenterol,13(19): 2727-2732 42 Peltomaki P (2001), “Deficient DNA mismatch repair: a common etiologic factor for colon cancer”, Hum Mol Genet, 10: 735-740 43 Peltomaki P (2005), “Lynch syndrome genes”, Fam Cancer, 4(3): 227-232 44 Peltomaki P, Vasen H (2004), “Mutations associated with HNPCC predisposition-update of ICG-HNPCC/INSIGHT mutation databases”, Dis Markers, 20: 269-276 45 Sambrook J, Russell DW (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed, Cold Spring Harbor Laboratoty Press, Cold Spring Harbor, New York 46 Shin KH, Ku JL, Park JG (2002), “Mutational analysis of promoters of mismatch repair genes hMSH2 and hMLH1 in hereditary nonpolyposis Lê Thị Lan Anh 83 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 colorectal cancer and early onset colorectal cancer patients: identification of three novel germ-line mutations in promoter of the hMSH2 gene”, Cancer Res, 62: 38-42 47 Stewart B W ADN Kleihues P (2003), “World Cancer Report”, IARC Press, Lyon 48 Sunnucks P, et al (2000), “SSCP Is Not So Difficult: The Application and Utility of Single-Stranded Conformation Polymorphism in Evolutionary Biology and Molecular Ecology”, Molecular Ecology, 9: 1699-710 49 Thibodeau Sn, Bren G, Schaid D (1993), “Microsattellite instability in cancer of the proximal colon”, Science, 260: 816-819 50 Umar A, Boland CR, Terdiman JP, Syngal S, de la Chapelle A, Ruschoff J, et al (2004), “Revised Bethesda Guideline for heteitary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch Syndrome) and microsatellite instability”, J Natl Cancer Inst, 96: 261-268 51 Umar A, Rinsinger JI, Hawk ET, Barrett JC (2004), “Testing guidelines for hereditary non-polyposis colorectal cancer”, Nat Rev Cancer, 153-158 52 Vasen HF, Mecklin JP, Khan PM, Lynch HT (1991), “The International Collaborative Group on Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer (ICGHNPCC)”, Dis Colon Rectum, 34(5): 424-425 53 Vasen HF, Watson P, Mecklin JP, Lynch HT (1999), “New clinical criteria for hereditary colorectal cancer (HNPCC, Lynch syndrome) proposed by the International collaborative group on HNPCC”, Gastroenterology, 116: 14531456 54 Warthin AS (1925), “The further of study of a cancer family”, J Cancer Res, 279 – 286 55 Watson P, Lynch HT (1993), “Extracolonic cancer in hereditary nonpolyposis colorectal Cancer”, Cancer, 71: 677-685 Lê Thị Lan Anh 84 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 56 Weber T (1996), “Clinical surveillance recommendations for HNPCC”, Cancer, 348-465 57 Weijnen J, Khan PM, Vasen H, van der Klift H, et al (1997), “Hereditary nonpolyposis colorectal cancer families not complying with the Amsterdam criteria show extremely low frequency of mismatch –repair –gene mutations”, Am J Hum Genet, 61: 329-335 58 Wijnen J, Khan PM, Vasen H, Menko F, vander Klift H, van den Broek M, van Leuuwen-Cornelisse I, Nagengast F, Meijers-Heijboer EJ, Linhout D, Griffioen G, Cats A, Kleibeuker J, Varesco L, Bertario L, Bisgaard ML, Morh J, Kolodner R, Fodde (1996), “Majority of hMLH1 mutations responsible for hereditary nonpolyposis colorectal cancer cluster at the exonic region 15-16”, Am J Ham genet, 58: 300-307 59 Yamashita K, Dai TY, Yamamoto F, Perucho (2003), “Genetics supersedes epigenetics in colon cancer phenotype”, Cancer cell, 4: 121-131 60 Young KS, Seung CH, Joo HS, Sung HH, Ja LK, Byong CY, Il JK, Jae GP, (2004), “Germline mutations in MLH1, MSH2 and MSH6 in Korean HNPCC families”, Human mutation, Mutation in brief, 748 61 Zhang J, Lindroos A, Ollila S, et al (2006), “Gene conversion is a frequent mechanism of inactivation of the wild-type allele in cancers from MLH1/MSH2 deletion carriers”, Cancer Res, 66(2): 659-664 Trang web 62 http://atlasgeneticsoncology.org/Genes/MLH1ID149ch3p21.html 63 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ 64 http://www.protocol-online.org/prot/Protocols/Single-Strand-Conformation Polymorphism SSCP Analysis-by-Nondenaturing-PAGE-3468.html Lê Thị Lan Anh 85 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 65 http://www.springerimages.com/Images/Biomedicine/1-10.1007_s10689-0089200-1-3 66 http://www.springerimages.com/Images/LifeSciences/1-10.1007_s11010-0089761-1-1 Lê Thị Lan Anh 86 Cao học K18 [...]... gen ung thư ở các tế bào khối u là căn nguyên của phát sinh ung thư [17] 1.1.2 Gen ung thư và gen ức chế khối u Gen ung thư (oncogenes) có thể định nghĩa là dạng gen đột biến làm tăng nguy cơ ung thư hoặc làm thúc đẩy sự phát sinh ung thư Các gen ung thư cũng có thể được coi như các dạng alen đặc biệt của các gen bình thư ng xuất hiện do kết quả của đột biến [3] Lê Thị Lan Anh 11 Cao học K18 Luận văn. .. lượng đột biến được phát hiện nhiều nhất trong số 6 gen liên quan đến HNPCC So với các gen khác thuộc hệ thống sửa chữa bắt cặp sai MMR, khả năng đột biến xảy ra ở gen MLH1 gây nên hội chứng Lynch là tương đối cao (50%) Theo thống kê, hiện nay đã phát hiện hơn 225 đột biến trong gen MLH1 ở các bệnh nhân HNPCC, kiểu đột biến chủ yếu được tìm thấy là các đột biến thay thế (đột biến vô nghĩa, đột biến sai. .. HNPCC là kết quả của tính bất ổn di truyền bởi những con đường sửa chữa đột biến bị bất hoạt (Hình 6) [17] Lê Thị Lan Anh 26 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 Hình 6 Con đường dẫn đến ung thư di truyền ở người thông qua đột biến các gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR) Tất cả các hệ thống sửa chữa ADN, bao gồm cả MMR gồm sự phối hợp hoạt tính của nhiều protein Những đột biến gây bất hoạt ở tế... ruột kết [11] Ung thư đại trực tràng di truyền lại được chia thành 3 nhóm chính: Sinh polyp u tuyến theo dòng họ (FAP), Ung thư ruột kết không polyp di truyền (HNPCC - Hội chứng Lynch) và Hội chứng giống Lynch Hội chứng Lynch được lấy theo tên nhà khoa học đầu tiên công bố về căn bệnh này 1.3 Hội chứng ung thư ruột kết không polyp di truyền (Hội chứng Lynch) Ung thư ruột kết không polyp di truyền (HNPCC... điểm di truyền của HNPCC HNPCC là một hội chứng di truyền trội trên nhiễm sắc thể thư ng, gây nên bởi những đột biến dòng mầm gây bất hoạt ở những gen tham gia vào hệ thống sửa chữa bắt cặp sai (MMR): MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2, trong đó chủ yếu là gen MLH1 và MSH2 [14] Đa số các đột biến ở gen MLH1 và MSH2 là đột biến vô nghĩa, nhầm nghĩa hoặc đột biến dịch khung cũng như các thay đổi ảnh hưởng đến vị... được quan sát thấy trong ung thư ruột kết, nơi các môi trường mô đệm bất thư ng ảnh hưởng đến sự phát triển và tăng trưởng của các tế bào biểu mô, dẫn đến sự hình thành ung thư (Hình 1) Hình 1 Các con đường hình thành ung thư đại trực tràng [3] 1.2 Hội chứng ung thư ruột kết Ung thư ruột kết hay còn gọi là ung thư đại trực tràng là một loại ung thư biểu mô rất thư ng gặp Đây là một trong những bệnh ung. .. bệnh ở độ tuổi 18 - 20 [47] Ung thư đại trực tràng (Colorectal cancer – CRC) được chia thành 3 dạng chính là rải rác, gia đình và di truyền Trong đó, ung thư ruột kết rải rác (không di truyền) chiếm 65-85%, ung thư ruột kết gia đình chiếm tỉ lệ 10%-30% và ung thư đại trực tràng di truyền chiếm khoảng 5% trong tổng số các dạng ung thư ruột kết (Hình 2) Hình 2 Các phân nhóm chính của ung thư ruột kết. .. biệt hóa tế bào Các gen tiền ung thư có thể được kích hoạt và trở thành gen ung thư thông qua đột biến điểm, sao chép hoặc chuyển đoạn Các gen ung thư được di truyền trội, vì chỉ có một đột biến là đủ gây ra thay đổi chức năng tế bào, tuy nhiên, các gen ung thư hiếm khi là nguyên nhân gây ra sự nhạy cảm di truyền ung thư Mặt khác, gen ức chế khối u là những gen khi bị bất hoạt không còn ức chế sự sinh... Các đột biến làm mất chức năng của các gen này bao gồm đột biến dịch khung, đột biến vô nghĩa, nhầm nghĩa và trong trường hợp của gen MLH1 và MSH2 có thể liên quan đến mất các vùng mã hóa lớn (Hình 7) Lê Thị Lan Anh 28 Cao học K18 Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 Hình 7 Tỷ lệ các loại đột biến phát hiện ở gen MLH1, MSH2 và MSH6 [14] Như vậy, gen MLH1 là gen quan trọng nhất trong nghiên cứu ung thư. .. bazơ bắt cặp sai tránh được sự phát hiện của MMR trong quá trình sao chép ADN [3] Khoảng 15% các trường hợp ung thư đại trực tràng được thống kê là mang các sai hỏng trong MMR Những đột biến gây bất hoạt tế bào mầm ở một trong sáu gen liên quan đến con đường sửa chữa bắt cặp sai (MLH1, MSH2, MSH3, MSH6, PMS1 và PMS2) là nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng không polyp di truyền (HNPCC) [3] Khi các gen