Nghiên cứu chế tạo đột biến điểm nhằm sàng lọc đột biến ở gen ND6 và MT TK liên quan đến bệnh ty thể 21

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÕ THỊ PHƢƠNG NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN ĐIỂM NHẰM SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN Ở GEN ND6 VÀ MT-TK LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH TY THỂ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÕ THỊ PHƢƠNG NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN ĐIỂM NHẰM SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN Ở GEN ND6 VÀ MT-TK LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH TY THỂ Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 01 21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân Hà Nội – 2015 LỜI CẢM ƠN Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân, người thầy tâm huyết, ln tận tình dìu dắt, hướng dẫn, khích lệ từ ngày bắt đầu làm quen với khoa học Cô tạo điều kiện tốt giúp tơi hồn thành luận văn này, dành nhiều thời gian trao đổi chia sẻ với kiến thức, kinh nghiệm nhờ tơi trưởng thành nhiều Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Trần Thị Thùy Anh, người thầy đồng hành, sát cánh suốt q trình tơi thực đề tài, đồng thời chia sẻ với nhiều kinh nghiệm quý báu q trình học tập sống Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến thầy, cô giáo Bộ môn Di truyền học – Trường Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN dạy dỗ, bảo suốt q trình tơi học tập làm việc nghiên cứu môn, giúp tiếp cận nhiều kiến thức kĩ thuật Tơi xin gửi lời cảm ơn tới phịng thí nghiệm thuộc Bộ mơn Di truyền học, phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme Protein, Trung tâm nghiên cứu Khoa học sống tạo điều kiện trang thiết bị vật chất cho tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, anh chị em phịng thí nghiệm mơn Di truyền học, ln giúp đỡ, khích lệ, động viên để tơi có ngày hơm Tơi xin chân thành cảm ơn! Học viên Võ Thị Phƣơng MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH .v DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT viii MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Cấu trúc chức ty thể người 1.1.1 Cấu trúc ty thể 1.1.2 Chức ty thể .5 1.2 Hệ gen ty thể chế di truyền gen ty thể .7 1.2.1 Hệ gen ty thể 1.2.2 Cơ chế di truyền theo dòng mẹ gen ty thể 10 1.2.3 Heteroplasmy homoplasmy 12 1.3 Đột biến gen ty thể bệnh liên quan 13 1.3.1 Đột biến gen ty thể 13 1.3.2 Một số hội chứng phổ biến đột biến gen ty thể gây 15 1.3.2.1 Hội chứng LHON (Leber’s hereditary optic neuropathy – hội chứng liệt thần kinh thị giác di truyền Leber) 15 1.3.2.2 Hội chứng MERRF (Myoclonic Epilepsy and Ragged Red Fibers – bệnh động kinh co giật với sợi đỏ rải rác) 15 1.3.2.3 Hội chứng MELAS (Mitochodrial encephalomyopathy lactic acidosis and stroke-like episodes – bệnh viêm não giật có tăng axit lactic máu giả tai biến mạch)………………………………………………………………………………16 1.3.2.4 Hội chứng Leigh (Leigh syndrome – bệnh viêm não tủy cấp di truyền theo Leigh)………………………………………………………………………………16 1.4 Gen MT-TK đột biến A8344G, T8356C, G8363A .16 1.4.1 Gen MT-TK 16 1.4.2 Đột biến A8344G, T8356C, G8363A 17 1.5 Gen ND6 đột biến T14484C 18 1.5.1 Gen ND6 18 i 1.5.2 Đột biến T14484C 19 1.6 Một số phương pháp tạo đột biến điểm định hướng 20 1.6.1 Phương pháp Kunkel 20 1.6.2 Tạo đột biến điểm định hướng phương pháp thiết kế vector tái tổ hợp 20 1.6.3 Tạo đột biến điểm định hướng phương pháp PCR 21 1.6.3.1 Sử dụng PCR truyền thống 21 1.6.3.2 Sử dụng Primer extention 21 1.6.3.3 Sử dụng PCR đảo (Inverse PCR) 22 1.7 Một số phương pháp phát đột biến điểm 23 1.7.1 Phát đột biến điểm ADN ty thể PCR- RFLP .23 1.7.2 Phát đột biến điểm ty thể xác định trình tự gen 24 1.7.3 Phát đột biến điểm ty thể phương pháp SSCP (Single-stranded conformational polymorphism) 25 1.8 Tình hình nghiên cứu đột biến ADN ty thể Việt Nam 25 1.9 Mục tiêu nội dung nghiên cứu đề tài 26 1.9.1 Mục tiêu 26 1.9.2 Nội dung nghiên cứu 26 CHƢƠNG – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Đối tượng nghiên cứu 27 2.1.1 Mẫu bệnh phẩm 27 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ địa điểm nghiên cứu 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Tách chiết ADN tổng số 28 2.2.1.1 Quy trình tách chiết 28 2.2.1.2 Kiểm tra định lượng ADN tách chiết 29 2.2.2 Nhân đoạn gen từ nucleotide 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582 kĩ thuật PCR (polymerase chain reaction) 29 2.2.3 Kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism) 32 ii 2.2.4 Nhân dòng sản phẩm PCR từ khn ADN bình thường (khơng chứa đột biến quan tâm) 2.2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả biến E.coli DH5α 2.2.4.2 Phản ứng gắn đoạn ADN nhân PCR vào vector PTZ57R/T 2.2.4.3 Biến nạp phương pháp sốc nhiệt vào tế bào E coli khả biến 2.2.4.5 Tách chiết plasmid 2.2.4.6 Giải trình tự plasmid nhân dòng 2.2.5 Thiết kế đối chứng dương cho phản ứng sàng lọc 2.2.5.1 Thiết kế mồi tạo đột biến điểm định hướng 2.2.5.2 PCR plasmid chứa đoạn gen 14455-14578; 8155-8366; 8166-8385; 8342-8582 với cặp mồi chứa vị trí đột biến tương ứng 2.2.5.3 Đóng vòng sản phẩm PCR sử dụng T4-ligase 2.2.5.4 Biến nạp plasmid đóng vòng vào tế bào khả biến E coli DH5α tách chiết plasmid từ khuẩn lạc mang đoạn gen đột biến 2.2.6 Sàng lọc kiểm tra có mặt đột biến T14484C, A8344G, T8356C, G8363A 128 mẫu bệnh phẩm 2.2.7 Điện di gel agarose 2.2.8 Điện di gel polyacrylamide 2.2.9 Giải trình tự CHƢƠNG – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kiểm tra ADN tổng số mẫu bệnh phẩm 3.2 Kết nhân PCR đoạn gen từ nucleotide 14455-14578, 81558366, 8166-8385, 8342-8582 45 3.3 Nhân dịng đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582 khơng chứa đột biến vào vector PTZ57R/T 3.3.1 Kiểm tra khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp PCR trực tiếp 3.3.2 Tách kiểm tra plasmid mang đoạn gen nhân dòng 3.3.3 Giải trình tự đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582 nhân dòng 51 iii 3.3.3.1 Trình tự đoạn gen 14455-14578 51 3.3.3.2 Trình tự đoạn gen 8155-8366 51 3.3.3.3 Trình tự đoạn gen 8166-8385 ngẫu nhiên phát đột biến 9bp gen MT-TK 52 3.3.3.4 Trình tự đoạn gen 8342-8582 54 3.4 Tạo đột biến điểm nhân tạo A8344G, T8356C, G8363A, T14484C .55 3.4.1 PCR plasmid chứa đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 83428582 với cặp mồi chứa điểm đột biến tương ứng 55 3.4.2 Đóng vịng plasmid dạng thẳng kiểm tra kết biến nạp 56 3.4.3 Kết điện di cắt enzyme giới hạn sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc 58 3.4.4 Tách kiểm tra plasmid chứa đoạn gen mang đột biến .59 3.4.4.1 Tách plasmid chứa đoạn gen mang đột biến 59 3.4.4.2 Kiểm tra plasmid chứa đoạn gen mang đột biến 60 3.4.5 Giải trình tự plasmid chứa đoạn gen mang đột biến 61 3.4.5.1 Trình tự đoạn gen 14455-14578 có chứa vị trí đột biến T14484C 62 3.4.5.2 Trình tự đoạn gen 8155-8366 có chứa vị trí đột biến A8344G 63 3.4.5.3 Trình tự đoạn gen 8166-8385 có chứa vị trí đột biến T8356C 64 3.4.5.4 Trình tự đoạn gen 8342-8582 có chứa vị trí đột biến G8363A 66 3.5 Khẳng định có mặt đột biến A8344G, T8356C, G8353A, T14484C PCR-RFLP 67 3.5.1 Sàng lọc đột biến T14484C 68 3.5.2 Sàng lọc đột biến A8344G 69 3.5.3 Sàng lọc đột biến T8356C 70 3.5.4 Sàng lọc đột biến G8363A 71 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc ty thể Hình 1.2 Cấu trúc màng ty thể Hình 1.3 Ty thể trình trao đổi lượng tế bào Hình 1.4 Hệ gen ty thể người Hình 1.5 Thuyết nút cổ chai di truyền Hình 1.6 Sơ đồ đột biến gen ty thể liên quan đến số bệnh phổ biến Hình 1.7 Tạo đột biến điểm (thay thế) định hướng sử dụng PCR truyền thống Hình 1.8 Tạo đột biến điểm định hướng sử dụng PCR primer extention Hình 1.9 Tạo đột biến điểm định hướng sử dụng PCR đảo Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu sàng lọc số đột biến gen ND6 MT-TK liên quan đến bệnh đột biến gen ty thể Hình 2.2 Bản đồ vector PTZ57R/T vị trí đa điểm cắt Hình 2.3 Quy trình tạo đột biến điểm định hướng Hình 2.4 PCR plasmid đích với cặp mồi đột biến nối đầu sản phẩm PCR Hình 3.1 Điện di sản phẩm ADN tổng số từ mẫu máu bệnh nhân Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 81668385, 8342-8582 46 Hình 3.3 Khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen 14455-14578, 81558366, 8166-8385 8342-8582 Hình 3.4 Điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đoạn chèn cặp mồi vector Hình 3.5 Kết tách chiết plasmid nhân dịng Hình 3.6 So sánh trình tự đoạn gen 14455-14578 nhân dịng với trình tự gen chuẩn51 Hình 3.7 So sánh trình tự đoạn gen 8155-8366 với trình tự gen chuẩn Hình 3.8 So sánh trình tự đoạn gen 8166-8385 với trình tự gen chuẩn Hình 3.9 So sánh trình tự đoạn gen 8342-8582 với trình tự gen chuẩn Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm PCR plasmid đích với cặp mồi tạo đột biến Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm PCR trực tiếp kiểm tra khuẩn lạc Hình 3.12 Kết điện di cắt enzyme giới hạn sản phẩm PCR trực tiếp kiểm tra khuẩn lạc với mồi LHTC (A), MRAG (B), MRTC (C), MRGA (D) v Hình 3.13 Kết tách plasmid mang đoạn gen 14455-14578 (A), 8166-8385 (B), 8155-8366 (C), 8342-8582 (D) chứa vị trí đột biến T14484C, A8344G, T8356C, G8363A 60 Hình 3.14 Kết điện di sản phẩm PCR plasmid tách chiết với cặp mồi LHTC, MRTC, MRAG, MRGA M13 61 Hình 3.15 Kết so sánh trình tự plasmid chứa đoạn gen 14455-14578 sau tạo đột biến với trình tự plamid trước tạo đột biến trình tự gen tham chiếu NC_012920.1 62 Hình 3.16 Một phần trình tự tạo đột biến T14484C 63 Hình 3.17 Kết so sánh trình tự plasmid chứa đoạn gen 8155-8366 sau tạo đột biến với trình tự plamid trước tạo đột biến trình tự gen tham chiếu NC_012920.1 63 Hình 3.18 Một phần trình tự tạo đột biến A8344G 64 Hình 3.19 Kết so sánh trình tự plasmid chứa đoạn gen 8166-8385 sau tạo đột biến với trình tự plamid trước tạo đột biến trình tự gen tham chiếu NC_012920.1 65 Hình 3.20 Một phần trình tự tạo đột biến T8356C 65 Hình 3.21 Kết so sánh trình tự plasmid chứa đoạn gen 8342-8582 sau tạo đột biến với trình tự plamid trước tạo đột biến trình tự gen tham chiếu NC_012920.1 66 Hình 3.22 Một phần trình tự tạo đột biến G8363A 67 Hình 3.23 Kết PCR-RFLP mẫu đối chứng âm đối chứng dương đột biến T14484C 68 Hình 3.24 Kết PCR-RFLP mẫu đối chứng âm đối chứng dương đột biến A8344G 69 Hình 3.25 Kết PCR-RFLP mẫu đối chứng âm đối chứng dương đột biến T8356C 70 Hình 3.26 Kết PCR-RFLP mẫu đối chứng âm đối chứng dương đột biến G8363A 71 vi 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Trương Thị Huệ, Phạm Minh Huệ, Lê Ngọc Yến, Phạm Thị Vân Anh, Ngô Diễm Ngọc, Phan Tuấn Nghĩa (2012), “Phát đoạn bp hệ gen ty thể số bệnh nhân nghi hội chứng não”, Tạp chí Sinh học 34 (2), tr 246-252 Trương Thị Huệ, Nguyễn Văn Liệu, Phạm Vân Anh, Nguyễn Thị Vân Anh, Phan Tuấn Nghĩa (2012), “Phát định lượng đột biến A3243G hệ gen ty thể hội chứng MELAS”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 10 (3), tr 421-427 Lê Thị Bích Thảo, Đỗ Quỳnh Hoa, Nguyễn Bích Nhi, Nơng Văn Hải, Phan Văn Chi, Phạm Thị Vân Anh, Ninh Thị Ứng (2004), “Xác định đột biến A3243G gen tARN Leu ty thể từ bệnh nhân mắc bệnh ty thể”, Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học toàn quốc Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, tr 463-465 Phạm Hùng Vân, Hoàng Hiếu Ngọc Võ Quang Hồng Điểm (2010), "Các trường hợp bệnh lý thần kinh nhãn cầu Leber xác định kỹ thuật giải trình tự ADN ty thể tách chiết từ bạch cầu bệnh nhân để phát đột biến gây bệnh", Kỷ yếu hội nghị Sinh học phân tử hóa sinh y học, tr 285-289 Tài liệu tiếng Anh Anderson S., Bankier A.T., Barrell B.G., deBruijin M.H., Coulson A.R., Drouin J., Eperon I.C., Nierlich D.P., Rose B.A., Sanger F., Schreier P.H., Smith A.J.H., Staden R., Young I G (1981), “Sequence and organization of the human mitochondrial genome”, Nature 290, pp 457-465 Ballana E, Govea N, de Cid R, Garcia C, Arribas C, Rosell J and Estivill X (2008), “Detection of unrecognized low-level ADN ty thể heteroplasmy may explain the variable phenotypic expressivity of apparently homoplasmic ADN ty thể mutations”, Human Mutation, 29(2), pp.248-257 Bai R.K., Wong L.J.C (2004), “Detection and quantification of heteroplasmic mutant mitochondrial ADN by real-time amplification refractory mutation system quantitative PCR analysis: A single-step approach”, Clin Chem 50, pp 996–100 Berdanier C D (2005), Mitochondria in healthy and disease, 619 pp Taylor and Francis CRC Press, Boca Raton 74 Chen G, W Li, WD DU, HM Cao, HY Tang, XF Tang, ZW Sun, H Zhao, QH Jin, JL Zhao and XJ Zhang (2008), “Development of a DNA biochip for detection of known mtDNA mutations associated with MELAS and MERRF syndromes”, Yi Chuan, 30(10):1279-86 10 Chinnery P.F (2006) “Mitochondrial ADN in Homo Sapiens”, Nucleic Acids Mol Biol 18, pp 3-11 11 Chinnery P.F., Brown D.T., Andrew R.m., Singh- Kler R, Riordan- Eva P, Lindley J, Applegarth D.A., Turnbull D.M., Howell N (2001), “The mitochondrial ND6 gene is a hot spot for mutations that cause Leber's hereditary optic neuropathy”, Brain, 124(1), pp 209-218 12 Cleveland C H (2010), “Mutation”, Encyclopedia of Earth, National Council for Science and the Environment, Washington DC, 290, 457-65 13 Fawcett D.W (1981), The Cell, W B Saunders Company, NewYork 14 Finnila S, S Tuisku, R Herva, K Majamaa (2001), “A novel mitochondrial DNA mutation and a mutation in the Notch3 gene in a patient with myopathy and CADASIL”, J Mol Med 79, 641-647 15 Genetics Home Reference, National Institute of Health, Retrieved 16 October 2013 16 Giles R.E, H Blanc, H M Cann and D.C Wallace (1980), “Maternal inheritance of human mitochondrial DNA”, Proc Natl Acad Sci USA, 77, 6715–6719 17 Gropman A.L (2004), “The neurological presentations of childhood and adult mitochondrial disease: established syndromes and phenotypic variations”, Mitochondrion 4, pp 503–520 18 Guan M.X (2011), “Mitochondrial 12S rARN mutations associated with aminoglycoside ototoxicity”, Mitochondrion 11, pp 237–245 19 Gvozdjáková A (2008), Mitochondrial medicine, Springer Science + Business Media B.V 20 Helen AL Tuppen, L Emma, Blakely, M Douglass, Turnbull, W Robert W and Taylor (2009), “Mitochondrial ADN mutations and human disease, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, Volume 1797, Issue 2, Pages 113–128 21 Ho SN, Hunt HD, Horton RM, et al (1989) Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction Gene, 77(1):51–59 75 22 Ivanova R, A strinidis, V Lepage, S Djoulah, E Wijnen, Vu Trieu An, J Hors and D Charron (1999),“Mitochondrial DNA polymorphism in the Vietnamese population”, J Eur Immunogenet, 26, 417-422 23 Kirby D.M., Milovac T., Thorburn D.R (1998), “A failse -positive diagnosis for the common MELAS (A3243G) mutation caused a novel variant (A3426G) in the ND1 gene mitochondria ADN”, Mol Diagn 3, pp 211-216 24 Klopstock T., P P Yu-Wai-Man, K Dimitriadis, J Rouleau, S Heck, M Bailie, A Atawan, S Chattopadhyay, M Schubert, A Garip, M Kernt, D Petraki, C Rummey, M Leinonen, G Metz, P P G Griffiths, T Meier, P F Chinnery (25 July 2011), “A randomized placebo-controlled trial of idebenone in Leber's hereditary optic neuropathy”, Brain, 134 (9), pp.2677 25 Koga Y., Y Akita, J Nishioka, et al (2007), “MELAS and L-arginine therapy”, Mitochondrion 7, pp 133–139 26 Kunkel T A (1985), “Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection", Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 82 (2), pp.488-492 27 Liu C S., W L Cheng, Y Y Chen, Y.S Ma, C Y Pang and Y H Wei (2005), “High prevalence of the COII/tRNALys intergenic 9-bp deletion in mitochondrial DNA of Taiwanese patients with MELAS or MERRF syndrome”, Ann N.Y Acad Sci., 1042: 82-87 28 Lu C.Y., Tso D.J, Yang T., Jong Y.J., Wei Y.H (2002),“Detection of DNA mutations associated with mitochondrial diseases by Agilent 2100 bioanalyzer”, Clin Chimica Acta 318, pp 97-105 29 Man P Y., D.M Turnbull and P.F Chinnery (2002), “Leber hereditary optic neuropathy”, J Med.Genet, 39, pp.162–169 30 Mingkun Li, Anna Schönberg, Michael Schaefer, Roland Schroeder, Ivane Nasidze and Mark Stoneking (2010), “DetectingHeteroplasmy from HighThroughput Sequencing of Complete Human Mitochondrial DNA Genomes”, The American JouARNl of Human Genetics, 87(2), pp.237–249 76 31 Muyrers J P., Y Zhang and A F StewarT (2001), “Recombinogenic engineering-new options for cloning and manipulating ADN”, Trends Biochem Sci, 26, pp.325-331 32 Naviaux R K (2000), “Mitochondrial ADN disorders” Eur J Pediatr, 159 Suppl 3, S 219-26 33 Nelson D.L., Cox M.M (2008), Lehninger principles of biochemistry, Worth publishers, Inc 34 Nikoskelainen E K., K Huopnen, V Juvonen, et al (1996), “Ophthalmoscopic findings in Leber hereditary optic neuropathy, with special reference to ADN ty thể mutations”, Ophthalmology,103, pp.504-514 35 Ochman H, Gerber AS, and Hartl DL (1988) Genetic applications of an inverse polymerase chain reaction Genetics, 120(3): 621–623 36 Ogle R F., J Christodoulou, E Fagan, et al (1997), “Mitochondrial myopathy with tARN (Leu(UUR)) mutation and complex I deficiency responsive to riboflavin”, J Pediatr 130, pp 138-145 37 Ojala D., Montoya J., Attardi G (1981), “tARN punctuation model of ARN processing in human mitichonria”, Nature 290, pp 470-474 38 Orita, M., Iwahana H., Kanazawa H., Hayashi K., and Sekiya T (1989), “Detection of polymorphisms of human ADN by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 86 (8), pp 2766-2770 39 Pavlakis S G., P C Phillips, S DiMauro, D C De Vivo and L P.Rowland (1984), “Mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes: a distinctive clinical syndrome”, Ann Neurol, 16 (4), pp.481-488 40 Poulton J., Macaulay V., Marchington D.R (1998), “Mitochondrial Genetics 98 is the bottleneck cracked”, Am J Hum Genet 62, pp 752-757 41 Reikofski J and Tao BY (1992),“Polymerase chain reaction (PCR) techniques for site-directed mutagenesis”,Biotechnol Adv, 10(4), pp 535–547 42 Roberta Virgilio, Dario Ronchi, Andreina Bordoni, Elisa Fassone, Sara Bonato, Chiara Donadoni, Giuseppe Torgano, Maurizio Moggio, Stefania Corti, Nereo Bresolin, Giacomo P Comi (2009), “Mitochondrial ADN G8363A mutation in the 77 tARNLys gen: Clinical, biochemical and pathological study”, JouARNl of the Neurological Sciences Volume 281, 85–92 43 Robert W Taylor, Doug M Turnbull (2007), “Mitochondrial ADN mutations in human disease”, Nature Reviews Genetics, 6(5), pp.389-402 44 Rodriguez M C , J R MacDonald, D J Mahoney, G Parise, M F Beal, M A Tarnopolsky (2007), “Beneficial effects of creatine, CoQ10, and lipoic acid in mitochondrial disorders”, Muscle Nerve 35(2), pp 235-42 45 Sambrook J and Rusel D.W (2001), Molecular Cloning: A laboratory manual, 3rd edition, Vol 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 46 Salvatore Dimauro & Guido Davidzon (2005), “Mitochondrial ADN and disease”, Annals of Medicine, 37: 222–232 47 Schneider A., Marechal-Drouard L (2000) “Mitochondrial tARN import: are there distinct mechanisms?”, Cell Biol 10, pp 509-513 48 Shanskea S., Wong L.J.C.(2004), “Molecular analysis for mitochondrial ADN disorders”, Mitochondrion 4, pp 403-415 49 Shoffner, J M., Wallace, D C (1992), “Mitochondrial genetics: principles and practice” (Editorial) Am J Hum Genet, 51: 1179-1186 50 Tajima H., Sueoka K., Moon S.Y., Nakabayashi A Sakurai T., Murakoshi Y., Watanabe H., Iwata S., Hashiba T., Kato S., Goto Y., Yoshimura Y (2007), “The development of novel quantification assay for mitochondrial DNA heteroplasmy aimed at preimplantation genetic diagnosis of Leigh encephalopathy”, J Assist Reprod Genet 24, pp 227-232 51 Tuppen H A L et al (2010), “Mitochondrial DNA mutations and human disease”, Biochimica et Biophysica Acta1797, pp.113–128 52 Varlamov, D.A., A.P Kudin, S.Vielhaber, et al (2002), “Metabolic consequences of a novel missense mutation of the mtDNA CO I gene”, Hum Mol Genet, 11:1797–1805 53 Wallace DC (1999), “Mitochondrial Diseases in Man and Mouse”, Science, 283: 1482-1488 78 54 Wallace D C., G Singh, M.T Lott, J.A Hodge, T.G Schurr, A.M Lezza, L.J Elsas II and E.K Nikoskelainen (1988), “Mitochondrial ADN mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy”, Science, 242, pp.1427–1430 55 Wong L.J (2007), “Diagnostic challenges of mitochondrial ADN disorders”, Mitochondrion, 7, pp 45–52 56 Wrischnik L.A., R.G Higuchi, M Stoneking, et al (1987), “Length mutations in human mitochondrial DNA: direct sequencing of enzymatically amplified DNA”, Nucleic Acids Res, 15:529–542 57 Yao Y G., W S Watkins and Y P Zhang (2000), “Evolutionary history of the mtDNA 9-bp deletion in Chinese populations and its relevance to the peopling of east and south east Asia”, Hum Genet, 107: 504-512 58 Zhuo G., G Feng, J Leng, L Yu and Y Jiang (2010),“A 9-bp deletion homoplasmy in women with polycystic ovary syndrome revealed by mitochondrial genome-mutation screen”, Biochem Genet, 48: 157-163 Trang web: 59 http://www.med.miami.edu/news/view.asp?id=1098 60 http://www.ifond.org/projects.php3 61 http://cronodon.com/BioTech/Respiration.html 62 http://www.nature.com/scitable/content/a-schematic-illustration-of-the-basicstructural-61487 63 http://www.nature.com/scitable/content/the-mitochondrial-genetic-bottleneck7260 79 PHỤ LỤC Lí lịch mẫu nghiên cứu STT ID 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 84 ... ADN mang đột biến cần thiết tạo Do vậy, thực đề tài ? ?Nghiên cứu tạo đột biến điểm nhằm sàng lọc đột biến gen ND6 MT- TK liên quan đến bệnh ty thể? ?? nhằm tạo số đối chứng dương mang đột biến cần... HỌC TỰ NHIÊN VÕ THỊ PHƢƠNG NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN ĐIỂM NHẰM SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN Ở GEN ND6 VÀ MT- TK LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH TY THỂ Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 01 21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA... gen chuỗi nhẹ mã hóa cho tARN chuỗi polypetide [8] Bảng 1.1 Các gen hệ gen ty thể [8] Gen MTATP6 MTATP8 MTCO1 MTCO2 MTCO3 MTCYB MTND1 MTND2 MTND3 MTND4 MTND4L MTND5 MTND6 MTRNR1 MTRNR2 MTTA MTTC