Các phương pháp chẩn đoán dịch tả lợn Châu Phi, chẩn đoán phân biệt với dịch tả lợn cổ điển và một số bệnh đỏ khác

Bài viết trình bày khái niệm bệnh dịch tả lợn châu Phi; tác nhân gây bệnh; triệu chứng, bệnh tích của bệnh dịch tả lợn châu Phi; phương thức truyền lây; các phương pháp xét nghiệm phòng thí nghiệm; khuyến nghị công tác chẩn đoán xét nghiệm bệnh dịch tả lợn châu Phi. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết!

KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN DỊCH TẢ LN CHÂU PHI, CHẨN ĐOÁN PHÂN BIỆT VỚI DỊCH TẢ LN CỔ ĐIỂN VÀ MỘT SỐ BỆNH ĐỎ KHÁC Nguyễn Đăng Thọ Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương – Cục Thú y I Khái niệm bệnh dịch tả lợn châu Phi Bệnh dịch tả lợn châu Phi (DTLCP) bệnh truyền nhiễm lợn nuôi lợn rừng thuộc lứa tuổi Bệnh cấp tính có đặc điểm sốt cao, xuất huyết hệ lưới nội mô tỷ lệ chết cao Lợn lồi động vật ni cảm nhiễm với virus DTLCP Lợn hoang dã châu Âu cảm nhiễm với virus DTLCP, có biểu lâm sàng tỷ lệ chết tương tự lợn nhà Ngược lại, lợn hoang dã châu Phi lợn nòi (Phacochoerus aethiopicus), lợn rừng (Potamochoerus porcus) lợn rừng khổng lồ (Hylochoerus meinertzhageni) đề kháng với virus DTLCP, chúng thường khơng có biểu bệnh Những lồi lợn hoang dã đóng vai trị vật chủ mang trùng virus DTLCP châu Phi Các loại ve thân mềm thuộc giống Ornithodoros, đặc biệt O moubata O erracticus vector chứa bệnh truyền bệnh DTLCP Bệnh DTLCP không lây sang người gây chết nhiều lợn mà khơng có vacxin II Tác nhân gây bệnh - Virus DTLCP tác nhân gây bệnh DTLCP, thuộc họ Asfarviridae, giống Asfivirus Hiện nay, virus DTLCP thành viên họ Asfarviridae Virus DTLCP virus ADN, vỏ bọc hình khối đa giác phức tạp, có nhiều điểm tương đồng với virus iridovirus virus đậu Virus có 28 protein cấu trúc 100 protein lây nhiễm, 50 số có phản ứng với huyết lợn nhiễm bệnh khỏi bệnh - Virus DTLCP tìm thấy máu, quan, dịch tiết từ lợn nhiễm bệnh chết bệnh Lợn sau khỏi bệnh thể mạn tính, mang virus suốt đời Sức đề kháng virus gây bệnh dịch tả lợn châu Phi (nguồn: FAO) Bệnh phẩm Thời gian ASFV tồn Thịt, xương dính thịt 105 ngày Thịt muối 182 ngày Thịt nấu chín (30 phút 70 C) Thịt khô 300 ngày Thịt hun khói 30 ngày Thịt đơng đá 1000 ngày Thịt ướp lạnh 110 ngày Nội tạng 105 ngày Da /mỡ (làm khô) 300 ngày Máu bảo quản 40C 18 tháng Phân nhiệt độ phòng (chuồng) 11 ngày Máu thối rữa 15 tuần Các ô chuồng bị nhiễm tháng 71 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 - Virus có sức đề kháng cao, tồn chất tiết, dịch tiết, xác động vật, thịt lợn chế phẩm từ thịt lợn xúc xích, giăm bơng, salami Virus có khả chịu nhiệt độ thấp, đặc biệt sản phẩm thịt lợn sống nấu nhiệt độ không cao nên virus chịu thời gian dài 3-6 tháng; virus bị tiêu diệt 56°C 70 phút 60°C 20 phút Virus sống máu phân hủy 15 tuần; máu khô 70 ngày; phân nhiệt độ phòng 11 ngày; máu lợn 4°C 18 tháng; thịt dính xương 39°C 150 ngày; giăm 140 ngày 50°C tồn Trong mơi trường khơng có huyết thanh, virus bị phá hủy pH 11,5 Mơi trường có huyết thanh, virus tồn pH = 13,4 ngày Căn thông tin sức đề kháng virus gây bệnh DTLCP, việc thiết lập danh mục sản phẩm động vật nhằm kiểm dịch nội địa nhập tập trung riêng cho giai đoạn nổ dịch cần thiết Virus tồn lâu sản phẩm cho dù qua chế biến sơ thịt muối, thịt xơng khói… Những thơng tin hữu ích q trình truyền thơng, tun truyền nhận thức phòng chống dịch bệnh III Phương thức truyền lây - Virus DTLCP lây nhiễm thông qua tiếp xúc trực tiếp lợn ốm lợn khỏe mạnh, qua đường tiêu hóa, qua tiếp xúc trực tiếp gián tiếp với vật thể nhiễm virus như: chuồng trại, phương tiện vận chuyển, dụng cụ, đồ dùng, quần áo nhiễm virus ăn thức ăn thừa lẫn thịt lợn nhiễm bệnh bị ve mềm cắn - Tại Trung Quốc, nghiên cứu dịch tễ 68 ổ dịch có ngun nhân làm bệnh DTLCP lây lan, bao gồm: 46% phương tiện vận chuyển người không thực vệ sinh, phun thuốc khử trùng tiêu độc; 34% sử dụng thức ăn dư thừa 19% vận chuyển lợn sống sản phẩm lợn vùng 72 IV Triệu chứng, bệnh tích bệnh dịch tả lợn châu Phi Bệnh DTLCP có đặc điểm gây chết lợn đột ngột Lợn tất lứa tuổi, tính biệt mắc bệnh Lợn tách đàn, ví dụ lợn mẹ lợn theo mẹ khơng bị mắc bệnh mức độ lây nhiễm bệnh DTLCP thấp Thực tế, bệnh DTLCP có tỷ lệ gây chết cao lây nhiễm so với bệnh truyền lây qua biên giới khác lở mồm long móng Một số giống lợn địa châu Phi kháng lại bệnh DTLCP mức độ định Lợn hoang dã lợn ni có biểu bệnh tương tự Biểu lâm sàng virus DTLCP gây khác tùy thuộc vào nhiều yếu tố: độc lực virus, giống lợn bị nhiễm bệnh, đường truyền lây, liều nhiễm tình trạng lưu hành dịch khu vực Về độc lực, virus DTLCP chia thành nhóm chính: nhóm độc lực cao, độc lực trung bình độc lực thấp Các thể bệnh DTLCP thay đổi từ thể q cấp tính đến khơng biểu triệu chứng Các chủng độc lực cao gây bệnh cấp cấp tính, chủng độc lực trung bình gây bệnh thể cấp tính cấp tính Các chủng độc lực thấp vùng dịch địa phương gây triệu chứng nhẹ liên quan đến bệnh thể cận lâm sàng mạn tính Tỷ lệ mắc bệnh tùy thuộc vào chủng virus đường truyền lây Mặc dù khơng biết xác, thời gian ủ bệnh tự nhiên dao động từ 4-19 ngày Thời gian phát bệnh dao động từ ngày sau lây nhiễm, thể cấp tính, đến nhiều tuần, chí nhiều tháng, thể mạn tính Tỷ lệ chết tùy thuộc vào độc lực virus, dao động từ 100% chủng độc lực cao đến 20% chủng độc lực thấp gây Ở thể mạn tính, bệnh gây tử vong chủ yếu lợn mang thai lợn con, lợn mắc bệnh kế phát bị suy yếu lý khác Tỷ lệ sống sót sau nhiễm chủng virus độc lực cao khu vực có dịch lưu hành cao lợn thích nghi với chủng virus Triệu chứng Virus DTLCP gây nhiều thể bệnh khác KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 từ cấp, cấp tính đến mạn tính mang trùng khỏe mạnh Lợn bệnh biểu triệu chứng không khác biệt so với triệu chứng bệnh dịch tả lợn cổ điển (đã có Việt Nam) Do đó, việc chẩn đốn DTLCP khó xác định phân biệt triệu chứng lâm sàng, cần lấy mẫu gửi phịng thí nghiệm để xét nghiệm phát virus DTLCP Thể cấp tính (Peracute) virus độc lực cao, lợn chết nhanh, sốt cao 41 - 42 °C, chết đột ngột vòng 1-3 ngày trước có triệu chứng lâm sàng, thường khơng biểu triệu chứng, bệnh tích rõ ràng Thể cấp tính chủ yếu xuất vùng bệnh xuất lần đầu Thể cấp tính (Acute) virus có độc lực cao gây ra, lợn sốt cao (41-42°C) Trong 2-3 ngày đầu tiên, giảm bạch cầu giảm tiểu cầu Lợn không ăn, lười vận động, ủ rũ, nằm chồng đống, lợn thích nằm chỗ có bóng râm gần nước Lợn có biểu đau vùng bụng, lưng cong, di chuyển bất thường, số vùng da trắng chuyển sang màu đỏ, đặc biệt vành tai, đuôi, cẳng chân, da phần vùng ngực bụng, có màu sẫm xanh tím Trong 1-2 ngày trước vật chết, có triệu chứng thần kinh, di chuyển không vững, nhịp tim nhanh, thở gấp, khó thở có bọt lẫn máu mũi, viêm mắt, nôn mửa, tiêu chảy lẫn máu táo bón, phân cứng đóng viên có kích thước nhỏ, có chất nhầy máu, da tím tái sau 24-48h Lợn chết vòng 6-13 20 ngày Lợn mang thai sảy thai giai đoạn, tỷ lệ chết cao, lên tới 100% Lợn khỏi bệnh nhiễm virus thể mạn tính thường khơng có triệu chứng, vật chủ mang ASFV thải virus môi trường Lợn nôn, nằm ủ rũ, chồng đống Da chuyển đỏ mông Da chuyển đỏ tai Chảy máu hậu môn Thể cấp tính (Subacute) gây virus có độc tính trung bình Chủ yếu tìm thấy châu Âu, lợn biểu triệu chứng Lợn cong lưng đau bụng không nghiêm trọng Lợn sốt nhẹ sốt lúc tăng lúc giảm, giảm ăn, sụt cân, ủ rũ, viêm toàn phổi nên khó thở, ho có đờm, 73 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 phổi bội nhiễm vi khuẩn kế phát, viêm khớp, vận động khó khăn Bệnh kéo dài 5-30 ngày, máu ứ tim (cấp tính suy tim) lợn chết, lợn mang thai sẩy thai, lợn chết vòng 15-45 ngày, tỷ lệ chết khoảng 30-70% Lợn khỏi bị bệnh mạn tính Thể mạn tính (Chronic form) gây virus có độc tính trung bình thấp Chủ yếu tìm thấy Angola châu Âu Lợn có nhiều triệu chứng khác nhau, chẳng hạn giảm cân, sốt khơng ổn định, có triệu chứng hơ hấp, hoại tử da, viêm loét da mạn tính, viêm khớp, viêm tim, viêm phổi dính sườn, viêm khớp khác giai đoạn phát triển Triệu chứng kéo dài B A F G 2-15 tháng, có tỷ lệ tử vong thấp, lợn khỏi bệnh sau nhiễm virus trở thành dạng mạn tính Bệnh tích Thể cấp tính: Xuất huyết nhiều hạch lympho dày, gan thận Thận có xuất huyết điểm, lách to có nhồi huyết Da có màu tối phù nề, da vùng bụng chân có xuất huyết Có nhiều nước xung quanh tim xoang ngực xoang bụng, có điểm xuất huyết nắp quản, bàng quang bề mặt quan bên trong; phù nề cấu trúc hạch lâm ba đại tràng phần tiếp giáp với túi mật, túi mật sưng C D H E I A - B: Hạch sưng xuất huyết, C: Ruột xuất huyết, D: Nắp quản xuất huyết, E: Nhiều dịch xoang thể, F: Xung quanh tim, tim xuất huyết, G-H: Thận xuất huyết đinh ghim, I: Lá lách sưng to Thể mạn tính: Có thể gặp xơ cứng phổi có ổ hoại tử hạch, hạch phổi sưng, viêm dính màng phổi 74 V Chẩn đốn phân biệt Bệnh DTLCP lúc biểu tất triệu chứng lâm sàng KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 đề cập Chẩn đốn lâm sàng gặp khó khăn giai đoạn sớm bệnh có số lượng nhỏ động vật bị mắc bệnh Chẩn đốn bệnh DTLCP thường mang tính đốn, triệu chứng nhầm lẫn với bệnh khác Hơn nữa, nhiều bệnh lợn gây tỷ lệ tử vong tương tự ổ bệnh DTLCP cấp tính Do vậy, khơng có chẩn đốn mang tính kết luận có kết xác nhận phịng thí nghiệm Tuy nhiên, chẩn đốn phân biệt có ý nghĩa định hướng cho xét nghiệm phịng thí nghiệm Do chẩn đốn phân biệt bệnh DTLCP, cần xem xét số bệnh sau: Bệnh dịch tả lợn cổ điển (CSF) Chẩn đoán phân biệt quan trọng A bệnh DTLCP bệnh dịch tả lợn cổ điển hay gọi dịch tả lợn loại pestivirus thuộc họ Flaviridae gây Giống bệnh DTLCP, bệnh DTL có nhiều thể bệnh lâm sàng khác Thể cấp tính có biểu lâm sàng tổn thương bệnh lý giống hệt thể cấp tính DTLCP đặc trưng tỷ lệ tử vong cao Các biểu lâm sàng bao gồm sốt cao, bỏ ăn, ủ rũ, xuất huyết (ở da, thận, hạch amidan, bàng quang), viêm kết mạc, biểu hô hấp, yếu, nằm co giật, da tím tái chết vịng 2-10 ngày Cách để chẩn đoán phân biệt bệnh thơng qua xét nghiệm phịng thí nghiệm Khơng nên cố gắng tiêm phịng bệnh dịch tả lợn có kết xét nghiệm âm tính DTLCP bệnh DTLCP dễ dàng lây lan rộng người không tập huấn chiến dịch tiêm phịng B C A: Da tím tái, B: Hạch ruột sưng, xuất huyết, C: Lách nhồi huyết Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (PRRS) Hạch sưng, xuất huyết lợn nhiễm virus PRRS độc lực cao Còn gọi bệnh tai xanh, PRRS đặc trưng viêm phổi lợn vỗ béo lợn thịt sảy thai lợn nái Bệnh thường kèm theo sốt, đỏ da đặc biệt biến màu tai, đơi có tiêu chảy Mặc dù tỷ lệ tử vong PRRS không cao, chủng virus PRRS độc lực cao làm suy giảm đàn lợn Trung Quốc, Việt Nam Đông Âu năm qua, liên quan đến tỷ lệ tử vong cao, sốt cao, thờ ơ, chán ăn, ho, khó thở tím tái/xanh (ở tai, chân đáy chậu) Bệnh tích bao gồm tổn thương phổi (viêm phổi kẽ) tổ chức lympho (teo tuyến ức sưng xuất huyết hạch bạch huyết) xuất huyết đinh ghim thận Bệnh đóng dấu lợn Bệnh vi khuẩn Erysipelothrix 75 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 rhusiopathiae gây ra, ảnh hưởng đến lợn lứa tuổi có khả ảnh hưởng đến lợn trang trại quy mô nhỏ quy mơ lớn có tính chất thương mại tập trung Bệnh biểu dạng cấp tính cấp tính Dạng cấp tính thường thấy lợn con, đặc trưng chết đột ngột, tỷ lệ tử vong thường thấp nhiều so với DTLCP Sau ngày nhiễm bệnh, lợn xuất tổn thương da hình kim cương đặc trưng liên quan đến viêm mạch hoại tử (mạch máu bị sưng viêm) Ở lợn trưởng thành, thường biểu lâm sàng bệnh Giống DTLCP cấp tính, lách bị sung huyết to rõ rệt Các tổn thương bệnh lý khác bao gồm sung huyết phổi hạch bạch huyết ngoại vi, xuất huyết vỏ thận, tim viêm dịch dày Phân lập vi khuẩn xác nhận kết chẩn đoán lợn đáp ứng tốt với điều trị penicillin Những biến đổi vi thể bệnh đóng dấu lợn khác với biến đổi điển hình DTLCP dấu hiệu thần kinh (run rẩy, co giật, tê liệt) thường chết vòng 24-36 Lợn lớn (hơn hai tháng tuổi) có triệu chứng tương tự, thường có dấu hiệu hơ hấp nơn, tử vong Lợn nái lợn đực chủ yếu biểu dấu hiệu hô hấp, lợn nái mang thai sảy thai sinh lợn yếu ớt, run rẩy Tổn thương hoại tử điểm viêm não xảy não, tiểu não, tuyến thượng thận nội tạng khác phổi, gan lách Ở thai nhi lợn nhỏ, có đốm trắng gan đặc trưng nhiễm virus Lợn biểu thần kinh mắc bệnh Aujeszky Bệnh phó thương hàn (Salmonellosis) Tổn thương da hình kim cương đặc trưng bệnh đóng dấu lợn Bệnh Aujeszky Bệnh Aujeszky, gọi giả dại, gây vấn đề sinh sản thần kinh nặng động vật bị ảnh hưởng, thường dẫn đến tử vong Mặc dù gần tất động vật có vú bị nhiễm bệnh, lợn thường bị ảnh hưởng nhiều vật chủ chứa virus Động vật non bị ảnh hưởng nhiều nhất, với tỷ lệ tử vong đến 100% hai tuần Lợn thường bị sốt, ngừng ăn có 76 Lợn mắc bệnh phó thương hàn có biểu xanh tím tai Lợn thường đối tượng bị ảnh hưởng Nếu điều trị kịp thời, vật đáp ứng với điều trị kháng sinh Chẩn KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 đốn xác định ni cấy phân lập vi khuẩn Các triệu chứng giống với DTLCP bao gồm sốt, chán ăn, rối loạn hô hấp tiêu hóa sung huyết giết mổ Động vật chết 3-4 ngày sau nhiễm bệnh Lợn chết bệnh Salmonellosis nhiễm trùng huyết có biểu xanh tím tai, chân, bụng Bệnh tích mổ khám bao gồm xuất huyết đinh ghim thận bề mặt tim, lách to (nhưng có màu bình thường), sưng hạch bạch huyết màng treo ruột, gan sưng to phổi sung huyết Nôn Tiêu chảy x x x x x DTL x x x x x x x Tai xanh x x x x x x x Đóng dấu x x x x Phó thương hàn x x x x x Aujeszky x x x x x x Sảy thai Khó thở x Chết đột ngột Tổn thương da từ đỏ sang tím x Tỷ lệ chết cao Mệt mỏi x Tiêu chảy có máu Bỏ ăn DTLCP Sốt Bệnh Có vacxin Tóm tắt khác biệt biểu lâm sàng số bệnh lợn x x x x x x x Viêm kết mạc, điều hịa Có biểu hệ thống thần kinh trung ương heo con, tư gập Táo bón tiến triển đến tiêu chảy màu vàng xám Biểu lâm sàng dài x Cường độ suy hô hấp x Thường gặp lợn đạt trọng lượng xuất bán Tổn thương da hình kim cương đặc trưng x x x Khác biệt lâm sàng Tiêu chảy màu vàng Dấu hiệu hệ thần kinh trung ương bao gồm run, yếu, liệt co giật x Biểu khác nhau, phụ thuộc phần lớn vào tình trạng miễn dịch mẹ tuổi lợn bị ảnh hưởng Hạ thân nhiệt, run rẩy điều hòa, co giật Viêm mũi hắt 77 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 Lá lách mở rộng từ đỏ sẫm sang đen & bở Xuất huyết thận Xuất huyết hạch lympho Hạch lympho sưng to Xuất huyết niêm mạc Nhiều dịch xoang thể quanh tim Viêm phổi Tóm tắt khác biệt tổn thương bệnh lý số bệnh lợn x x x x x x x DTL x x x x Tai xanh x x x Đóng dấu x Phó thương hàn x Bệnh DTLCP Khác biệt tổn thương bệnh lý Các nốt hoại tử “cúc áo” niêm mạc đường tiêu hóa, nắp quản quản Viêm não Lợn bị DTL giảm cân nhanh chóng Màu nhợt nhạt rìa lách Viêm phổi kẽ Khơng có lách sưng to Teo tuyến ức x Viêm khớp viêm nội tâm mạc thực vật Xuất huyết màng phổi phúc mạc Các hạch bạch huyết ngoại vi bị ảnh hưởng (chứ dày thận) x Viêm ruột viêm não Viêm nội tâm mạc hoại tử Hoại tử điểm hạt kê gan Không có tổn thương mạch máu lách hạch lympho Aujeszky x Tổn thương hoại tử điểm viêm não xảy não, tiểu não, tuyến thượng thận nội tạng khác phổi, gan lách Ở bào thai lợn nhỏ, có đốm trắng gan đặc trưng nhiễm bệnh nhiễm virus Viêm ruột hoại tử VI Các phương pháp xét nghiệm phịng thí mẫu hạch lâm ba (Lympho) bẹn, hạch hàm; hạn chế lấy phủ tạng (lách, thận ) để tránh mổ phanh rộng gây ô nhiễm, lây nhiễm mầm bệnh môi trường nghiệm Lấy mẫu xét nghiệm Lấy mẫu ổ dịch bệnh, nghi ổ dịch để xét - Chỉ nên lấy 3-5 mẫu ổ dịch bệnh, Đối với lợn sống (đang ốm, sốt) lấy mẫu máu chống đông bổ sung EDTA 0,5% nghi dịch bệnh Đối với lợn chết, nên lấy Nếu lấy mẫu huyết để kiểm tra kháng nghiệm dịch bệnh: 78 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 thể, nên lấy vòng 8-21 ngày sau lợn nhiễm bệnh - Mẫu bảo quản nhiệt độ 4°C Lấy mẫu giám sát dịch bệnh: Lấy mẫu máu chống đông, số lượng theo quy định hành kiểm dịch, kiểm sốt dịch bệnh Chẩn đốn phịng thí nghiệm bệnh Dịch tả lợn châu Phi Bệnh DTLCP khơng có vacxin phịng bệnh, việc phát sớm xác bệnh quan trọng để áp dụng biện pháp vệ sinh nghiêm ngặt kiểm soát an ninh sinh học nhằm ngăn ngừa lây lan bệnh Chẩn đốn bệnh DTLCP có nghĩa xác định vật bị bị nhiễm virus DTLCP Bởi vậy, chẩn đoán phù hợp phải bao gồm việc phát định danh kháng nguyên DNA kháng thể đặc hiệu virus DTLCP nhằm hỗ trợ thơng tin hữu ích cho chương trình khống chế tốn dịch bệnh Khi lựa chọn phương pháp xét nghiệm, cần ý xem xét đến diễn biến bệnh Mỗi vật giai đoạn bệnh khác nhau, xét nghiệm virus kháng thể nên tiến hành ổ dịch chương trình khống chế toán dịch bệnh Thời gian ủ bệnh lây nhiễm tự nhiên báo cáo khác nhau, dao động từ 4-19 ngày Khoảng ngày trước xuất triệu chứng, lợn nhiễm virus DTLCP bắt đầu thải lượng lớn virus Bài thải virus khác tùy thuộc vào độc lực chủng virus DTLCP gây bệnh Sự đáp ứng kháng thể xảy từ 7-9 ngày sau lây nhiễm sau kháng thể phát đời lợn VIRUS VÀ VIRUS KHÁNG THỂ KHÁNG THỂ VÀ THỈNH THOẢNG VIRUS HUYẾT Biểu lâm sàng Sống sót CÁC GIAI ĐOẠN SAU KHI NHIỄM VIRUS DTLCP Ở LỢN Kết xét nghiệm dương tính virus (kháng nguyên) cho biết lợn xét nghiệm nhiễm bệnh thời gian lấy mẫu Trái lại, kết xét nghiệm dương tính kháng thể DTLCP nói lên lợn xét nghiệm nhiễm bệnh bị nhiễm bệnh phục hồi (và có kháng thể đời) Từ năm 2015, kết xét nghiệm huyết học quần thể lợn hoang dã Đông Âu 79 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 cho thấy số lợn phục hồi sau nhiễm virus DTLCP số trường hợp định, trì tình trạng nhiễm bệnh cận lâm sàng Do xét nghiệm kháng thể cung cấp thơng tin cần thiết cho chương trình khống chế tốn bệnh DTLCP 2.1 Xét nghiệm virus 2.1.1 Phương pháp PCR Phương pháp PCR sử dụng để phát gen virus DTLCP mẫu lợn (máu, huyết thanh, phủ tạng ) Các mảnh DNA virus phản ứng PCR khuếch đại tới mức phát Các xét nghiệm PCR chuẩn cho phép phát DNA virus sớm, chí trước vật có biểu triệu chứng lâm sàng Phương pháp PCR cho kết xét nghiệm vài sau mẫu tới phịng thí nghiệm Độ nhạy độ đặc hiệu phương pháp PCR không thua so với phương pháp phân lập virus Phương pháp PCR cho độ nhạy độ đặc hiệu cao hẳn so với phương pháp phát kháng nguyên khác Ag/ ELISA FAT Tuy nhiên độ cực nhạy khiến cho phương pháp PCR dễ bị sai lệch tạp nhiễm chéo Vì kỹ thuật chống tạp nhiễm phải áp dụng triệt để để giảm thiểu kiểm soát rủi ro Các phương pháp PCR thường (Aguero et al., 2003) Realtime PCR (King et al., 2003) theo khuyến cáo OIE (2016) đánh giá đầy đủ thời gian dài cơng cụ hữu ích cho cơng tác chẩn đốn thường quy bệnh DTLCP Nhiều quy trình Realtime PCR khác (Fernández-Pinero et al., 2012 Tignon et al., 2011) chứng minh có độ nhạy cao so với quy trình OIE khuyến cáo việc phát gen virus DTLCP lợn mang trùng Các mồi mẫu dò sử dụng cho kỹ thuật phân tử thiết kế dựa vùng gen P72, vùng gen có tính ổn định cao virus DTLCP nghiên cứu nhiều Hầu hết chủng virus thuộc 22 genotype có gen P72 biết phát phương pháp PCR này, chí mẫu vơ hoạt thối hóa PCR phương pháp lựa chọn cho trường hợp bệnh DTLCP cấp, cấp tính, cấp tính Hơn nữa, PCR phát gen virus, nên phát dấu vết virus kể không phân lập virus sống cơng cụ hữu ích để phát DNA virus DTLCP lợn bị nhiễm với chủng virus DTLCP có độc lực trung bình thấp Mặc dù PCR không cho biết thông tin lây nhiễm cho biết thông tin định lượng virus Phương pháp Realtime PCR phát virus DTLCP theo OIE (King et al., 2003) Đoạn mồi mẫu dò thiết kế dựa vùng ổn định gen P72 sau: Trình tự đoạn mồi mẫu dò STT Tên Mồi xuôi ASFV 5’-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-3’ Mồi ngược ASFV 5’-GATACCACAAGATCRGCCGT-3’ Đoạn dò ASFV 5’- FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-3’ 80 Trình tự KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 Sơ đồ gen virus DTLCP (Alonso et al., 2018) Bộ primer probe phương pháp Realtime PCR (King, 2003) xuôi thiết kế dựa vùng ổn định gen P72 virus DTLCP nhắm vào đoạn sản phẩm 250bp Đoạn gen P72 virus DTLCP thu thập từ ổ dịch Hưng Yên ngày 1/2/2019 81 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 + Master mix mẫu Chuẩn bị Master mix cho phản ứng Realtime PCR STT phát virus DTLCP theo kít Platinum® Quantitative PCR SuperMix-UDG, Cat.No: 11730-017 Thành phần Nồng độ Thể tích cho phản ứng (µl) Nước khơng có RNA/DNA 5,5 Dung dịch SuperMix 12,5 Mồi xi ASFV 20 µM 0,5 Mồi ngược ASFV 20 µM 0,5 Đoạn dị ASFV µM Tổng thể tích dung dịch đệm thực phản ứng 20 Mẫu DNA Tổng thể tích dung dịch thực phản ứng 25 Sau chuẩn bị xong, đưa ống PCR có chứa master mix mẫu vào máy PCR để chạy phản ứng theo chu kỳ luân nhiệt sau: Cài đặt chu kỳ luân nhiệt chạy phản ứng Realtime PCR Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 50 C phút (*) 95 C phút (*) 95oC 15 giây 60oC 60 giây (Ghi nhận tín hiệu quang bước này) o o 45 Máy Realtime PCR kết phản ứng Realtime PCR, mẫu dương tính xuất đường cong khuếch đại + Đọc kết quả: Kết phản ứng Realtime PCR 82 xác định dựa vào chu kỳ ngưỡng (Cycle threshold: Ct) KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 - Mẫu có giá trị Ct < 40 xem dương tính - Mẫu khơng có giá trị Ct âm tính - Mẫu có giá trị Ct khoảng 40 ≤ Ct ≤ 45 xem nghi ngờ Những mẫu nghi ngờ cần thực lại xét nghiệm sử dụng phương pháp xét nghiệm tương đương khác để khẳng định kết Những điểm ý phương pháp PCR Vì phương pháp PCR có độ nhạy cao, nên điều ý suốt trình thực nguy tạp nhiễm chéo kết dương tính giả xảy tình Sự tạp nhiễm virus DTLCP có mẫu đối chứng dương đưa vào chiết tách DNA, DNA virus lần khuếch đại PCR trước Vì nhân viên thực xét nghiệm PCR cần phải tuân thủ nghiêm ngặt nội quy làm việc để giảm thiểu nguy tạp nhiễm: - Tất công đoạn phương pháp PCR phải thực khu vực riêng rẽ, sử dụng thiết bị, dụng cụ riêng: khu chuẩn bị mẫu, khu chiết tách DNA, khu chuẩn bị hỗn hợp PCR khu vực loại bỏ sản phẩm PCR - Nhân viên xét nghiệm phải sử dụng găng tay khu vực PCR - Bất di chuyển sang khu vực PCR khác, nhân viên xét nghiệm phải bỏ găng tay cũ găng tay - Vật tư phải sử dụng riêng cho công đoạn PCR - Ln sử dụng đầu típ cho mẫu khác - Không mở ống chứa sản phẩm PCR phịng PCR khác ngồi khu vực phân tích điện di 2.1.2 Phương pháp phân lập Phân lập virus thực cách cấy mẫu bệnh phẩm lên mơi trường tế bào sơ cấp có nguồn gốc từ lợn tế bào bạch cầu đơn nhân, đại thực bào Nếu mẫu có virus DTLCP, chúng nhiễm, nhân lên tế bào mẫn cảm gây bệnh tích tế bào (CPE) tế bào bị nhiễm Phần lớn chủng virus DTLCP gây phản ứng hấp phụ hồng cầu tế bào hồng cầu lợn có tính chất bám vào tế bào nhiễm virus DTLCP Tính chất đặc hiệu cho virus DTLCP khơng có loại virus khác lợn gây hấp phụ hồng cầu môi trường tế bào Do gây nhiễm tế bào, lượng hồng cầu lợn cho vào để tạo phản ứng hấp phụ hồng cầu Hiện tượng hấp phụ hồng cầu bám gắn nhiều tế bào hồng cầu lợn lên tế bào bị nhiễm virus tạo nên hình hoa hồng Tuy nhiên số trường hợp không xuất hấp phụ hồng cầu, cần ý CPE độc tố tế bào bắt nguồn từ mẫu, loại virus khác Aujeszky’s disease hay chủng virus DTLCP không gây hấp phụ hồng cầu Trong trường hợp này, cần sử dụng phương pháp phát kháng nguyên khác FAT PCR để xác chẩn Nếu kết FAT PCR âm tính, sử dụng dịch ni cấy để cấy chuyển sang môi trường tế bào tiếp đời 3-5 lần để kiểm tra lại chắn khơng có virus DTLCP Những điểm ý phương pháp phân lập - Phương pháp tốn nhiều thời gian cơng sức Để có kết chẩn đốn DTLCP đúng, phương pháp tốn 5-10 ngày phản ứng hấp phụ hồng cầu xảy lần gây nhiễm Nếu việc chẩn đốn khơng thể đợi đến 15-30 ngày, phương pháp không khuyến cáo để sử dụng cho chẩn đoán ban đầu Phương pháp sử dụng để xác chẩn kết phương pháp PCR phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp - Sự xuất bệnh tích tế bào mà khơng có phản ứng hấp phụ hồng cầu có mặt loại virus khác, độc tố virus DTLCP không gây hấp phụ hồng cầu Điều khiến cho việc chẩn đoán bệnh DTLCP 83 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH PHÂN LẬP Huyết Bạch cầu (1) Chuẩn bị bạch cầu Ly tâm máu khử fibrin Hồng cầu Nuôi tế bào bạch cầu môi trường tế bào từ 3-4 ngày (2) Nuôi tế bào (3) Gây nhiễm virus DTLCP bổ sung hồng cầu Tế bào bạch cầu sau 3-4 ngày nuôi cấy (4) Kết quả: Tế bào bạch cầu nhiễm virus có hồng cầu bám xung quanh, sớm 14-16h sau nhiễm gặp khó khăn cần xác chẩn lại phương pháp PCR - Phương pháp cần sử dụng hồng cầu 84 huyết từ vật cung cấp bạch cầu làm tế bào để tránh tượng hấp phụ hồng cầu không đặc hiệu KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 - Các nghiên cứu trước chứng minh mẫu bảo quản dễ gây phản ứng sai lệch không phân lập virus Các mẫu phải bảo quản lạnh trình vận chuyển lưu giữ - Phương pháp địi hỏi phịng thí nghiệm phải có kỹ thuật tế bào phịng ni động vật 2.1.3 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (DIF) Phương pháp DIF sử dụng để phát virus DTLCP mô lợn nghi nhiễm bệnh Nguyên tắc phương pháp sử dụng kính hiển vi để phát kháng nguyên virus tiêu smear tiêu cắt lạnh tổ chức lợn nghi nhiễm bệnh Các kháng nguyên tế bào kháng thể đặc hiệu gắn huỳnh quang phát Các hạt thể vùi màu huỳnh quang xuất tế bào chất tế bào nhiễm bệnh Phương pháp DIF sử dụng để phát kháng nguyên virus DTLCP môi trường tế bào bạch cầu mà khơng có tượng hấp phụ hồng cầu dùng để nhận diện chủng virus không gây hấp phụ hồng cầu Nó phân biệt CPE virus DTLCP virus khác Aujeszky độc tố DIF phương pháp có độ nhạy cao trường hợp cấp cấp tính Tuy nhiên trường hợp cấp tính mạn tính, DIF có độ nhạy giảm đáng kể (40%), điều liên quan đến có mặt phức hợp kháng nguyên – kháng thể mô lợn bệnh ngăn không cho phản ứng kháng nguyên kháng thể (conjugate) xảy 2.1.4 Phương pháp ELISA kháng nguyên Kháng nguyên virus phát phương pháp ELISA, khuyến cáo sử dụng thể bệnh cấp tính Tương tự phương pháp DIF, phương pháp ELISA kháng nguyên có độ nhạy giảm đáng kể Điều phức hợp kháng nguyên – kháng thể mô lợn bệnh làm cho tương tác kháng nguyên kháng thể giảm Do vậy, phương pháp ELISA kháng nguyên khuyến cáo sử dụng phương pháp xét nghiệm cho đàn sử dụng kết hợp với phương pháp xét nghiệm kháng nguyên khác 2.2 Xét nghiệm kháng thể Xét nghiệm kháng thể khuyến cáo cho thể bệnh cấp tính mạn tính, cho chương trình tốn xét nghiệm quy mơ lớn nhiều lý sau: - Kháng thể thường sản sinh nhanh chóng lợn nhiễm bệnh Ở lợn này, kháng thể phát mẫu huyết từ lợn sau nhiễm từ 7-10 ngày - Vacxin chưa sẵn có cho bệnh DTLCP, điều có nghĩa kháng thể đặc hiệu virus DTLCP nhiễm bệnh - Ở lợn phục hồi sau nhiễm bệnh, kháng thể đặc hiệu phát nhiều tháng chí đời số lợn 2.2.1 Phương pháp ELISA Phương pháp ELISA phương pháp hữu ích sử dụng rộng rãi để chẩn đoán huyết nhiều bệnh động vật khác Một số tính chất bật phương pháp số độ nhạy độ đặc hiệu cao, tốc độ nhanh chi phí thấp Các quần thể động vật lớn xét nghiệm thời gian ngắn nhờ thiết bị tự động có sẵn ngày Kỹ thuật cho phép đọc kết dễ dàng Kỹ thuật sử dụng nhiều để phát kháng thể DTLCP ELISA, kỹ thuật dựa vào kháng thể hay kháng nguyên có gắn enzyme, cộng hợp (conjugate) vừa có hoạt động kháng thể enzyme Là thành phần (kháng ngun kháng thể) có gắn enzyme khơng hịa tan, phản ứng kháng nguyên - kháng thể cố định dễ dàng phát triển việc cho thêm chất (substrate) để đọc máy quang phổ kế 85 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 Trình tự bước phản ứng ELISA gián tiếp phát kháng thể bệnh DTLCP Phương pháp ELISA gián tiếp OIE (2012) khuyến cáo sử dụng để phát kháng thể bệnh DTLCP Kỹ thuật đánh giá đầy đủ qua thời gian với độ nhạy độ đặc hiệu lên tới 95,8% 97,3% Phương pháp xét nghiệm số lượng mẫu lớn thời gian ngắn ELISA gián tiếp sử dụng kháng nguyên bán khiết, hịa tan bào tương từ mơi trường nuôi cấy virus DTLCP Chủng virus sử dụng cho sản xuất kháng nguyên chủng virus Tây Ban Nha, phân lập năm 1970 (E70) thích nghi phát triển dòng tế bào ổn định khỉ (MS cell line) Kháng nguyên cố định đĩa ELISA Mẫu có kháng thể DTLCP nhận diện kháng nguyên để bám vào hình thành nên phức hợp kháng nguyên – kháng thể Sau đó, cộng hợp cho vào tìm đến phức hợp kháng nguyên – kháng thể để cố định vào Đĩa ELISA sau rửa nhiều lần dung dịch đệm, tất thành phần đĩa không cố định bị loại bỏ Sau chất thêm vào để đọc kết quả: giếng có phát màu có kháng thể DTLCP Tuy nhiên cần sử dụng máy ELISA đo mật độ quang học (OD) kết xác Những điểm cần ý Mặc dù phương pháp ELISA gián tiếp OIE chứng minh có độ nhạy đặc hiệu 86 để phát kháng thể DTLCP, phương pháp có điểm cần ý: - Huyết khơng bảo quản tốt gây phản ứng dương tính giả kháng thể huyết bám vào giếng đĩa ELISA dạng khơng đặc hiệu, gây kết dương tính giả, chí khơng có kháng ngun cố định đĩa Những huyết xét nghiệm phương pháp tham chiếu khác Immunoblotting hay miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (Immunoperoxidase) Mặc dù trường hợp dương tính giả chẩn đốn thấp cẩn thận việc thu thập bảo quản mẫu cần ý Trong trường hợp khơng có điều kiện bảo quản mẫu tốt, khả gây dương tính giả cần xem xét phân tích mẫu phương pháp ELISA gián tiếp - Loại đĩa sử dụng để phủ kháng nguyên: chất liệu nhựa đĩa quan trọng độ nhạy độ đặc hiệu phương pháp Các nghiên cứu châu Âu cho thấy phương pháp có độ nhạy tốt sử dụng đĩa Polysorp 96 wells hãng Nunc - Loại cộng hợp (conjugate): nghiên cứu châu Âu chứng minh loại cộng hợp quan trọng độ nhạy phương KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 pháp ELISA Sử dụng cộng hợp có Peroxidase hãng PIERCE, làm tăng độ nhạy ELISA 2.2.2 Phương pháp immunoblotting (IB) IB xét nghiệm nhanh nhạy để phát phân tích protein cách sử dụng tính đặc hiệu vốn có nhận diện kháng nguyên – kháng thể Nó bao gồm q trình hịa tan, tách điện di, chuyển protein lên màng (thường màng nitrocellulose) Màng phủ kháng thể thứ đặc hiệu với mục tiêu đích với kháng thể thứ có đánh dấu Để chuẩn bị test IB xét nghiệm kháng thể DTLCP, protein virus DTLCP phân tách điện di SDS-PAGE, chuyển lên màng lọc nitrocellulose với cường độ dịng điện khơng đổi Sau màng lọc cắt thành băng nhỏ làm bão hịa vị trí bám protein cịn lại Sau làm bão hòa, huyết đưa lên băng kháng nguyên để kháng thể phản ứng với kháng nguyên Để đọc kết quả, cộng hợp protein A (conjugate) peroxidase chất 4-chloro-1-naphtol tiếp tục cho vào, trường hợp mẫu có kháng thể đặc hiệu virus DTLCP, phản ứng peroxidase nhìn thấy Phương pháp IB OIE (2012) khuyến cáo sử dụng để xác chẩn mẫu dương tính hay nghi ngờ ELISA trường hợp mẫu bảo quản không bảo quản Kỹ thuật đánh giá đầy đủ có độ nhạy độ đặc hiệu 98% Phương pháp cho phép phát vật nhiễm bệnh mà không biểu triệu chứng lâm sàng Các bước thực phản ứng immunoblotting (IB) Những điểm cần ý: Trong năm qua, nhiều mẫu huyết xét nghiệm phương pháp IB cho kết tốt, có số điểm cần cân nhắc: - Phản ứng dương tính giả: huyết từ động vật tiêm vacxin với bệnh khác bị dương tính giả phản ứng với protein tế bào có mặt băng IB chuẩn bị với virus DTLCP bán khiết Trong trường hợp này, huyết cần phải xét nghiệm phương pháp khác Immunoperoxidase gián tiếp Immunofluorescence gián tiếp - Loại cộng hợp (conjugate): nghiên cứu châu Âu chứng minh loại cộng hợp quan trọng độ nhạy phương pháp Protein A peroxidase conjugated khuyến cáo sử dụng 87 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 Phản ứng immunoblotting băng kháng nguyên DTLCP 2.2.3 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang (immunofluorescence) gián tiếp Phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp phương pháp chẩn đoán huyết học Trong phương pháp này, độ nhạy kỹ thuật vi thể độ đặc hiệu kỹ thuật miễn dịch kết hợp Phương pháp sử dụng cộng hợp (conjugate) gắn huỳnh quang kháng IgG huyết mẫu DTLCP cần lấy mẫu gửi đến Phịng thí nghiệm uy tín để xét nghiệm xác định nguyên nhân bệnh, xác định dương tính, khơng thực điều trị lợn bệnh, lợn nghi mắc bệnh; cần báo cáo quyền địa phương thú y sở để tiêu hủy sớm toàn đàn lợn, thực vệ sinh, khử trùng tiêu độc, áp dụng biện pháp an toàn sinh học - Đối với kiểm dịch vận chuyển, cần lấy mẫu xét nghiệm theo quy định thông tư 07/2016/TT-BNNPTNT Tuy nhiên cần đề nghị quan chức cho phép xét nghiệm mẫu gộp (tối đa mẫu) để giảm chi phí - Để xác định bệnh DTLCP Việt Nam, cần áp dụng phương pháp xét nghiệm kháng nguyên Các phương pháp xét nghiệm kháng thể khơng có ý nghĩa nhiều giai đoạn Việt Nam Sự tương tác thành phần phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp V Khuyến nghị cơng tác chẩn đốn xét nghiệm bệnh Dịch tả lợn châu Phi - Hiện chưa có vacxin thuốc điều trị DTLCP, người chăn nuôi, giải pháp chăn nuôi an tồn sinh học, thực biện pháp phịng bệnh tổng hợp, đồng bộ, giải pháp hữu hiệu phòng, chống bệnh DTLCP - Đàn lợn phát nghi nhiễm, mắc bệnh 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO Alonso, C., Borca, M., Dixon, L., Revilla, Y., Rodriguez, F., Escribano, J.M., and ICTV Report Consortium. 2018, ICTV Virus Taxonomy Profile: Asfarviridae,  Journal of General Virology, 99: 613–614 Beltrán-Alcrudo, D., Arias, M., Gallardo, C., Kramer, S & Penrith, M.L 2017.African swine fever: detection and diagnosis – A manual for veterinarians FAO Animal Production andHealth Manual No 19 Rome Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO)./  ... nhiên, chẩn đốn phân biệt có ý nghĩa định hướng cho xét nghiệm phịng thí nghiệm Do chẩn đoán phân biệt bệnh DTLCP, cần xem xét số bệnh sau: Bệnh dịch tả lợn cổ điển (CSF) Chẩn đoán phân biệt quan... nhiễm bệnh, kháng thể đặc hiệu phát nhiều tháng chí đời số lợn 2.2.1 Phương pháp ELISA Phương pháp ELISA phương pháp hữu ích sử dụng rộng rãi để chẩn đoán huyết nhiều bệnh động vật khác Một số tính... phân biệt quan trọng A bệnh DTLCP bệnh dịch tả lợn cổ điển hay gọi dịch tả lợn loại pestivirus thuộc họ Flaviridae gây Giống bệnh DTLCP, bệnh DTL có nhiều thể bệnh lâm sàng khác Thể cấp tính có