Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu được thực hiện để xác định đặc điểm bệnh lý và ứng dụng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh gan thận mủ do Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) nuôi ở các tỉnh phía bắc Việt Nam.
Vietnam J Agri Sci 2020, Vol 18, No 2: 94-104 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2020, 18(2): 94-104 www.vnua.edu.vn ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ VÀ ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR CHẨN ĐOÁN BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ NHEO MỸ (Ictalurus punctatus) Trương Đình Hồi1*, Kim Văn Vạn1, Đào Lê Anh2, Nguyễn Thị Huyên2, Nguyễn Văn Tuyến1, Vũ Đức Mạnh1, Nguyễn Thị Hương Giang2, Trương Quang Lâm2, Nguyễn Thị Lan2 Khoa Thủy sản, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam * Tác giả liên hệ: tdhoai@vnua.edu.vn Ngày nhận bài: 28.10.2019 Ngày chấp nhận đăng: 24.02.2020 TÓM TẮT Nghiên cứu thực để xác định đặc điểm bệnh lý ứng dụng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh gan thận mủ Edwardsiella ictaluri gây cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) ni tỉnh phía bắc Việt Nam Để thực nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành thu thập phân tích mẫu cá nheo Mỹ bệnh, xác định triệu chứng, đặc điểm bệnh lý đại thể vi thể thông qua phương pháp quan sát lâm sàng phương pháp mơ bệnh học ứng dụng PCR chẩn đốn khẳng định mầm bệnh Kết nghiên cứu cho thấy cá bệnh có triệu chứng bơi lờ đờ, mang nhiều nhớt, xuất huyết nắp mang, gốc vây hậu môn Các đặc điểm bệnh lý đại thể cá bị bệnh gồm gan, thận có đốm mủ màu trắng, thành ruột biểu mô xuất huyết nặng Kết giám định PCR cho thấy cá bị bệnh nhiễm E ictaruli Kết nghiên cứu mô bệnh học mô mang, gan, thận ruột bị tổn thương nghiêm trọng Mang cá tăng sinh xuất huyết, gan thận cá bị hoại tử, cấu trúc lỏng lẻo, giảm số lượng tế bào xuất huyết Từ khóa: Edwardsiella ictaluri, bệnh lý, PCR, cá nheo Mỹ Pathological characterization and PCR application for diagnosis Edwardsiella ictaluri infecting Channel catfish (Ictalurus punctatus) ABSTRACT This study was conducted to determine the pathological characteristics and to apply PCR method to diagnose the disease caused by Edwardsiella ictaluri for Channel catfish (Ictalurus punctatus) in Northern provinces of Vietnam The infected Channel catfish was collected and determined the clinical symptoms, gross features and microscopic lesions using through clinical observation and histopathological methods Subsequently, PCR method was applied to confirmed the pathogen The results revealed that the diseased fish exhibited the symptoms of lethargy swimming, mucus in the gills, haemorrhage of gill operculum, fins, anus The liver and kidneys contained white spots, intestinal walls and epithelial cells were severe haemorrhage The evaluation by PCR showed that all affected fish was infected with E.ictaluri Histopathological examination revealed that the gill tissue, liver, kidney, and intestines were the most severely damaged organs Gills exhibited the hyperplasia and hemorrhage, while liver and kidneys are necrosis and loose structure, decreasing cells and severed haemorrhage Keywords: Ewardsiella ictaluri, pathoglogy, PCR, Channel catfish ĐẶT VẤN ĐỀ Cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus, Rafinesque, 1818) có tên tiếng anh Channel catfish, loài cá địa Châu Mỹ, phân bố phía nam Canada phía đơng bắc Mỹ phía bắc Mexico Cá nheo Mỹ gồm họ 94 45 lồi, chúng sống mơi trường nước sông, hồ ao Chúng chịu ngưỡng biến đổi mơi trường rộng, nhiệt độ thích hợp 24-30C chịu rét tốt (Gatlin & Stickney, 1982) Ngày nay, cá nheo Mỹ có 35 quốc gia giới di nhập phát triển Loài cá trở thành đối tượng thủy Trương Đình Hồi, Kim Văn Vạn, Đào Lê Anh, Nguyễn Thị Huyên, Nguyễn Văn Tuyến, Vũ Đức Mạnh, Nguyễn Thị Hương Giang, Trương Quang Lâm, Nguyễn Thị Lan sản quan trọng giới Cá nheo Mỹ nuôi nhiều Trung Quốc với sản lượng trung bình 255.000 tấn/năm (FAO, 2014) Loài cá du nhập vào miền Bắc Việt Nam từ năm 2010 Đây loài cá có giá trị dinh dưỡng cao, thịt cá thơm ngon, bổ dưỡng, nhiều khoáng chất canxi, phốt pho, sắt, vitamin Từ năm 2013, lồi cá ni thử nghiệm nhiều tỉnh miền Bắc cho kết tốt, cá sinh trưởng phát triển tốt điều kiện tự nhiên Việt Nam (Kim Văn Vạn, 2017) Hiện nay, nhiều sở sản xuất giống cá nước chủ động sản xuất giống cá nheo Mỹ ni nhiều hình thức nuôi ghép, nuôi thâm canh, nuôi lồng hay nuôi hệ thống nước chảy Do vậy, sản lượng loài cá ngày tăng nhanh cung cấp lượng lớn thực phẩm cho người tiêu dùng, mang lại thu nhập cao cho người nuôi Tuy nhiên, dịch bệnh cá nheo Mỹ diễn biến phức tạp, gây khó khăn thiệt hại lớn cho người ni, bệnh thường gặp gồm xuất huyết, lỡ loét, bệnh nội ngoại ký sinh (De la Cruz & cs., 2017; Hoai & cs., 2019; Wagner & cs., 2002) Những năm gần bệnh gan thận mủ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây cá nheo Mỹ nuôi Việt Nam ghi nhận bệnh gây thiệt hại lớn cho người nuôi Tuy nhiên đặc điểm bệnh gan thận mủ cá nheo Mỹ đặc biệt đặc điểm lâm sàng, đặc điểm mô bệnh học, phương pháp chẩn đoán bệnh gan thận mủ cho đối tượng nuôi chưa nghiên cứu sâu Các nghiên cứu trước bệnh mủ gan tập trung cá tra basa miền Nam, bệnh vi khuẩn E ictaluri gây hao hụt lên đến 90% (Crumlish & cs., 2002; Dung & cs., 2008) Với phát triển ngày mạnh mẽ cá nheo Mỹ tỉnh Miền Bắc Bắc Trung bộ, với tình trạng nhiễm mơi trường nước, bệnh gan thận mủ diễn biến phức tạp thời gian tới gây thiệt hại cho người ni Do vậy, cần có nghiên cứu liên quan đến tác nhân, đặc điểm bệnh lý phương pháp chẩn đốn bệnh để góp phần giúp người nuôi sớm nhận dạng, đề biện pháp phòng trị bệnh hiệu giảm thiểu thiệt hại tương lai PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Mẫu cá nheo Mỹ thương phẩm bị bệnh (kích cỡ 0,5-1,7kg) thu từ hộ ni cá ao, cá lồng khu vực phía bắc Việt Nam Môi trường Tryptic soya broth Tryptic soya Agar- (TSB TSA; Merck) Bộ thuốc nhuộm vi khuẩn Gram (Merck); Kit chiết tách DNA thương mại QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN), GoTaq PCR green (Promega) hóa chất, máy móc, thiết bị phịng thí nghiệm phục vụ chạy PCR, làm tiêu mơ học, phân tích kết số trang thiết bị dụng cụ cần thiết khác 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Địa điểm phương pháp thu mẫu Để thực nghiên cứu này, tiến hành thu thập 70 mẫu cá bị bệnh từ hộ nuôi cá nheo Mỹ Lý Nhân - Hà Nam (32 mẫu), Lương Tài - Bắc Ninh (22 mẫu), Ân Thi - Hưng Yên (16 mẫu) Thời gian thu thập từ tháng tháng 11 năm 2019 Mẫu vận chuyển phân tích phịng thí nghiệm Bệnh thủy sản, Khoa Thủy sản - Học viện Nông nghiệp Việt Nam phương pháp vận chuyển kín 2.2.2 Quan sát lâm sàng Cá phân tích sau chuyển tới phịng thí nghiệm Các triệu chứng lâm sàng quan sát ghi chép cẩn thận Sau đó, tiến hành giải phẫu cá dao kéo tiệt trùng để thu thập bệnh tích đại thể, ni cấy phân lập vi khuẩn theo mô tả Hoai & cs (2019), thu mẫu mô để làm tiêu mô bệnh học theo mô tả Hoai & cs (2014) 2.2.3 Phân lập vi khuẩn gây bệnh Dùng que cấy vô trùng thu mẫu vi khuẩn từ tiền thận cá bị bệnh, nuôi cấy vi khuẩn môi trường TSA TSA bổ sung 5% máu cừu Vi khuẩn nuôi cấy nhiệt độ 28C Các mẫu bệnh có nhiễm khuẩn quan sát hình dạng, màu sắc, kích thước khuẩn lạc Trong trường hợp có diện nhiều loại khuẩn lạc, xác định loại khuẩn lạc chiếm ưu loại thiểu số để sơ xác định loại khuẩn lạc 95 Đặc điểm bệnh lý ứng dụng phương pháp PCR chẩn đoán bệnh gan thận mủ cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) tác nhân chính, nhuộm Gram theo hướng dẫn nhà sản xuất kit nhuộm Gram (Merck) để xác định đặc tính Các chủng vi khuẩn phân lập sử dụng để thử đặc tính sinh hóa kit API 20E theo hướng dẫn nhà sản xuất (BioMerieux, Pháp) bảo quản môi trường TSB bổ sung 20% glycerol (v/v) giữ tủ âm sâu (-80C) 2.2.4 Giám định vi khuẩn gây bệnh phương pháp PCR DNA từ vi khuẩn (n = 70) tách chiết theo phương pháp sử dụng kit chiết tách DNA thương mại QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) Quy trình chiết tách DNA thực theo hướng dẫn nhà sản xuất Phản ứng PCR dùng để giám định chủng phân lập sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gene 16S rRNA vi khuẩn Edwardsiella ictaluries EiFd-1 (Forward) 5’- GTAGCAGGGAGAAAGCT TGC - 3’ EiRs-1 (Reverse) 5’- GAACGCTATT AACGCTCACACC - 3’ (Panangala & cs., 2007) Thành phần phản ứng PCR bao gồm: 5,5 nuclease-free water; 12,5µL 2X Go Taq green master mix (Promega); 1µL Mồi ngược (10 pmole EiFd-1-F); 1µL mồi xi (10 pmole EiFd1-R) 5µL khn mẫu DNA Đối chứng dương sử dụng phản ứng PCR chủng Edwardsiella ictaluri LMG 7860, chủng đối chứng dương chuẩn quốc tế phân lập từ cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) cung cấp từ Viện Nuôi trồng thủy sản II Chu trình nhiệt thực gồm bước bao gồm: Tiền biến tính nhiệt độ 94°C phút; Chu kỳ lặp lại 30 lần: Biến tính nhiệt độ 95°C 30 giây, gắn mồi 53°C 45 giây, tổng hợp kéo dài 72°C 30 giây; Hoàn thành 72°C phút Sản phẩm PCR điện di gel 1,2% (TBE 1X) với thang DNA chuẩn 100bp (marker) Sử dụng nguồn điện di hiệu điện 100V, cường độ 100mA, thời gian chạy điện di 30 phút Sản phẩm PCR dương tính cho vạch sáng 407bp 2.2.5 Thu mẫu mơ, làm tiêu phân tích biến đổi mô bệnh học Các quan phận 14 cá bị bệnh gan thận mủ chọn ngẫu nhiên từ số bị bệnh gan thận mủ (đã khẳng định PCR) cá khỏe mạnh (mẫu đối chứng) tiến hành làm tiêu mô học Mang, gan, thận, ruột cá bị bệnh thu cố định dung dịch buffer formalin 10%, sau đúc parafin, cắt mơ nhuộm Hematoxyline Eosin (HE) theo quy trình phương pháp Mumford & cs (2007) Các mẫu mô phân tích đặc điểm bệnh lý vi thể độ phóng đại 40, 100 400 lần để phát so sánh biến đổi mô học 2.3.6 Xử lý số liệu Tỷ lệ xuất triệu chứng, bệnh tích cá bệnh thu thập tính tốn phần mềm Microsoft Excel 2010 Bảng Triệu chứng bệnh tích cá nheo Mỹ bị bệnh gan thận mủ (n = 70) Triệu chứng bệnh tích cá bị bệnh Số cá có triệu chứng/bệnh tích Tỷ lệ (%) Triệu chứng Cá bỏ ăn, bơi lờ đờ 70 100 Mang có nhiều nhớt 60 85,7 Nắp mang xuyết huyết 48 68,5 Sưng xuất huyết lỗ hậu môn 44 62,8 Gốc vây ngực xuất huyết 40 57,1 Thân bị lở loét 12 17,1 Gan, thận có đốm mủ trắng 70 100 Xuất huyết ruột 58 82,8 Bụng chứa nhiều dịch vàng 44 62,8 Thận sưng 36 51,4 Bệnh tích 96 Trương Đình Đình Hồi, Kim V Văn Vạn, n, Đào Lê Anh, Nguy Nguyễn Thị Huyên, Nguyễn Nguy n Văn Tuyến, Tuy Vũ V Đức Mạnh, nh, Nguy Nguyễn Thị Hương Giang, Trương Quang Lâm, Nguyễn Nguy Thị Lan KẾT T QU QUẢ VÀ TH THẢO LUẬN 3.1 Đặc c điểm bệnh nh lý c a cá c nheo Mỹ ỹ bị bệnh nh gan th thận mủ Kiểm m tra 70 mẫu u cá thu từ hộ ni có dấu hiệu bị bệnh gan th thận mủ cho thấy th y cá nheo Mỹ mắcc b bệnh có biểu u hi triệu u chứng ch ng b bỏ ăn, bơi llờ đờ,, mang nhi nhiều u nhớt, nh xuấtt huy huyết xương nắ ắp p mang g gốcc vây, hi tượng xuấ ất huyếtt llở loét da thư thường xuất n Trong đó, cá b bỏ ăn, bơi lờ l đờ,, ng ngửa bụng trướớc chết, t, cá b bị xuấtt huyết huy gốcc vây, sưng xu xuất huyếtt llỗ hậu u môn, mang nhi nhiều nhớ ớt xuấtt huy huyết nắp p mang chiếm chi tỷ ỷ lệ cao triệu tri u ch chứng thường ng thấy th cá bị b bệnh Giả ải phẫu u cá b bị bệnh nh cho thấy th y gan thận th có đốm m hoại ho tử màu tr trắng ng th quan sát rõ bề mặtt gan th thận Các đốm đ mủ mềm, m nhũn, m số đ đốm mủ dễ vỡ nhiều u dịch d tác động đ nhẹ đ đồng ng nh t quan sát kính hiển hi vi Ru Ruột xuất huyết huy t xoang bụng b có nhiều nhi dịch ch vàng chi chiếm m tỷ t lệ cao (Bảng (B 1) Các triệu u ch chứng, bệnh nh tích đại đ i thể th cá nheo Mỹ M bị bệnh nh gan th thận n mủ m tỷ lệ % xuất n t triệệu chứng, bệ ệnh tích cụ ụ thể trình bảng 1, hình hình Ghi chú: A - Cá bơi lờ đ đờ, ngửa bụng ng lồng l ng nuôi; B - Mang nhiều nhi nhớớt, xuất huyết ết gốc g c vây; C - Mang nhiều nhớt, t, xương n nắp p mang xu xuấtt huyết; huy D - Xuất ất huy huyết lỗ hậu u môn Hình Triệu Tri chứng ng cá nheo M Mỹ ỹ bị bệnh nh gan th thận mủ ủ Ghi chú: A - Bụng ng tích nư nướcc vàng, gan có nhiều đốm ốm m mủ trắng; ng; B, C - Gan xu xuất nhiềm m đốm đ mủ, xuất huyết, tụ huyết; D- Th Thận n sưng, nhi nhiều đốm mủ trắng, tr xuấtt huy huyết tụ huyết; huy E, G - Ru Ruột xuất huyết, ết, niêm mạc m c xuất xu huyết Hình Bệ ệnh nh tích cá nheo Mỹ bị b bệnh nh gan th thận mủ 97 Đặc điểm bệnh lý ứng dụng phương pháp PCR chẩn đoán bệnh gan thận mủ cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) Theo người nuôi cá nheo Mỹ, cá bị bệnh gan thận mủ khó phát sớm, triệu chứng bệnh bên ngồi khơng đặc trưng, người dân phát bệnh cá bắt đầu có tượng chết rải rác, mổ khám nhận diện bệnh Trong trình thu mẫu tỉnh cho thấy bệnh gan thận mủ cá nheo Mỹ thường xuất rải rác quanh năm, bệnh xuất từ tháng đến tháng 11 hàng năm, tập trung nhiều tháng mùa hè nắng nóng từ tháng 6-9 Theo Francis-Floyd & cs (1987), vi khuẩn phát triển gây bệnh nhiệt độ từ 17 đến 32C, cá có triệu chứng bệnh rõ nhiệt độ nước >22C gây bùng phát dịch bệnh nhiệt độ nước ni dao động xung quanh 28C Điều hồn toàn phù hợp với đặc điểm phát triển bệnh gan thận mủ cá nheo Mỹ miền Bắc Việt Nam, từ tháng 11 năm trước đến tháng năm sau, nhiệt độ nước thấp, bệnh xuất Trong tháng 6-9 thời điểm nắng, nhiệt độ cao điều kiện cho vi khuẩn phát triển gây bùng phát dịch bệnh Hiện nay, số tác nhân gây bệnh gây tượng đốm mủ trắng nội tạng cá da trơn, cần phân biệt để chẩn đoán tác nhân gây bệnh Bệnh gan thận mủ cá tra chủ yếu E ictaluri (Crumlish & cs., 2002; Dung & cs., 2008), theo Đặng Thị Hoàng Oanh & Nguyễn Trọng nghĩa (2016) tác nhân gây bệnh gan thận mủ cá lóc (Channa striata) ni đồng sơng cửu long Aeromonas schubertii Ngồi số đốm trắng gan, thận cá da trơn bào tử sợi Myxobolus sp gây (Đồng Thanh Hà, 2009) Theo Đồng Thanh Hà (2009) bệnh gan thận mủ cá tra E ictaluri thường gây đốm mủ nhỏ, kích thước 1-2mm, cá bị bệnh, đốm trắng lớn thường bào nang bào tử sợi gây Tuy nhiên, theo quan sát chúng tôi, cá nheo Mỹ bị bệnh gan thận mủ, đốm mủ có kích thước dao động lớn, từ 1-8mm hồn tồn khơng có xuất bào tử sợi Đặc điểm khác biệt kích thước đốm mủ khác biệt loài cá nheo Mỹ cá tra, ngồi có khác biệt chủng vi khuẩn gây bệnh điều kiện môi trường miền Nam Bắc mà biểu bệnh loài cá khác 98 3.3 Kết phân lập, kiểm tra đặc điểm sinh hóa giám định vi khuẩn phương pháp PCR Vi khuẩn nuôi cấy từ cá bị bệnh môi trường ni cấy phần lớn có hình dạng khuẩn lạc nhỏ, không nhân, phát triển sau 48h môi trường TSA phát triển nhanh (24h) mơi trường TSA có bổ sung 5% máu cừu Các khuẩn lạc có màu trắng đục, rìa bằng, lồi (Hình 3A) Kết nhuộm Gram cho thấy vi khuẩn hình que, thon mảnh, trịn hai đầu bắt màu Gram âm (Hình 3B) Khoảng 3% khuẩn lạc cịn lại có kích thước lớn, nhuộm gram bắt màu Gram âm, dạng trực khuẩn Các vi khuẩn Aeromonas spp vi khuẩn hội mơi trường nước thường có thể cá nên dễ bắt gặp phân lập vi khuẩn từ thể cá (Wang & Silva, 1999) Với tỷ lệ phần trăm khuẩn lạc xuất đĩa thạch cho thấy vi khuẩn có khuẩn lạc nhỏ tác nhân gây bệnh Các chủng vi khuẩn nuôi cấy thuần, thử đặc tính sinh hóa tăng sinh để phục vụ giám định PCR Các chủng vi khuẩn (n = 70) đánh giá tác nhân gây bệnh gan thận mủ cho cá nheo Mỹ nuôi cấy để xác định sử dụng cho thử nghiệm Kết phản ứng sinh hóa sử dụng API 20E cho thấy chủng vi khuẩn phân lập có khả thủy phân lysine (dương tính LDC) ornithine (dương tính ODC), có khả lên men oxy hóa đường (dương tính D-glucose), 17/20 phản ứng cịn lại cho kết âm tính Kết hồn tồn phù hợp với đặc tính sinh hóa E ictaluri theo mô tả Hawke (1979) cá nheo mỹ Đặng Thị Hoàng Oanh & Nguyễn Trúc Phương (2010) (Bảng 2) Kết giám định chủng vi khuẩn phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu EiFd1F/EiFd-1R để phát DNA vi khuẩn E ictaluri cho thấy 100% chủng cho kết PCR dương tính với DNA vi khuẩn E ictaluri cho sản phẩm PCR có độ dài 407bp (Hình 4) Trương Đình Đình Hồi, Kim V Văn Vạn, n, Đào Lê Anh, Nguy Nguyễn Thị Huyên, Nguyễn Nguy n Văn Tuyến, Tuy Vũ V Đức Mạnh, nh, Nguy Nguyễn Thị Hương Giang, Trương Quang Lâm, Nguyễn Nguy Thị Lan Bảng ng Kếtt qu thử sinh hóa ch chủng Edwardsiella ictaluri phân lập l từ cá bệnh b Các ch tiêu sinh hóa Các chủng ch ng vi khu khuẩn phân lập p cá bệnh b (n = 70)) Edwardsiella ictaluri CAF255* - - Trực khuẩn Trực khuẩn n Tính di động ng + + ONPG - - ADH - - LDC + + ODC + + Citrate utilization - - H2S Production - - Urease - - TDA - ND Indole production - - Voges-Proskauer Proskauer - - Gelatin - - D-glucose glucose + + D-mannitol mannitol - - Inositol - - D-sorbitol sorbitol - - L-rhamnose rhamnose - - D-sucrose sucrose - - D-melibiose melibiose - - Amygdalin - - L-arabinose arabinose - - Nhuộm m gram Hình dạng ng Tạo axit từ Ghi chú: * - Đặng Thị Hoàng Oanh Nguyễn Nguy n Trúc Phương (2010); ND - Không xác đ định nh Hình Hình d ạng khuẩn n lạc l c nhu nhuộm m gram chủng ch ng vi khu khuẩn E ictaluri Ei-VN19 VN19-6 thu từ t cá nheo M Mỹ bị bệnh nh gan thận th n m mủ 99 Đặc điểm mb bệnh lý ứng ng d dụng phương ng pháp PCR ch chẩn đoán bệnh nh gan thận th mủ ủ cá nheo Mỹ M (Ictalurus Ictalurus punctatus) punctatus Ghi chú: M: Marker; Gi Giếng 1-7: chủ ủng vi khuẩn nđ đại diện n thu từ t cá nheo bịị bệnh; Giếng ng 8: Đối chứng ng âm; Giếng ng 9: Đ Đối chứng ng dương ch chủng ng vi khuẩn khu n E ictaluri LMG 7860 Hình Kếtt qu chạy y PCR chủng ng vi khu khuẩn n đại đ diện n phân llập từ cá nheo Mỹ M bị bệ ệnh gan thậ ận mủ Từ đ đặcc tính hình thái khuẩn khu lạc, kếtt qu nhuộm m Gram k kếtt qu giám định nh b ng PCR, nói rằ ằng ng cá nheo M Mỹ bị bệnh nh gan thận th mủ ủ E ictaluri gây Theo Waltman & cs (1986) (1986), chủng ng E ictaluri phân lập từ số loài cá khác có đ độ tương đồng ng cao ccấu trúc gen C Cặp mồi đặ ặc hiệu u EiFd-1F/EiFd-1R EiFd 1R đ để phát n DNA ccủa a vi khu khuẩn E ictaluri đư sử dụng ng đ để chẩn n đoán b bệnh nh gan thận th mủ cá tra, cá rô phi cá nheo M Mỹ nghiên ccứu Mặcc dù v vậy, y, gi a chủng ch ng vi khu khuẩn E ictaluri gây bệnh nh cho lồi cá khác có khác v đặcc tính di truyền truy n ccần có nghiên ccứu tiếp p theo, đ đặcc biệt bi giảii trình tự gen ccủa a ch chủng gây bệnh nh loài cá khác đ để làm rõ v vấn đề 3.4 Mộtt ssố đặc điể ểm mô bệnh nh học h a cá nheo Mỹ ỹ mắc bệnh nh gan th thận n mủ m Để nghiên ccứu uđ đặc điểm bệnh nh lý vi thể th cá bị bệnh, nh, 14 m mẫu u mô đư đượcc thu từ t cá nheo M Mỹ bị bệnh nh gan th thận mủ giám định nh b ng PCR 01 cá khỏỏe mạnh đượợc sử dụng ng để đ làm tiêu b mô học c Nh Những biến n đ đổi mô họ ọc mang, gan, thận, ruộột a cá nheo M Mỹ mắcc bệnh b nh gan th thận mủ đượcc so sán sánh vớới cá khỏe e mạnh m nh đư trình bày hình đ đến n hình 20 Kếtt qu kiểm m tra bi biến đổii mô bệnh b họọc cá mắc bệnh nh gan th thận n m mủ cho thấy y mang cá tăng sinh, mô mang xu xuấtt huy huyếtt phù nề n 100 mang cá khỏe kh e tơ mang sơ cấp, c thứ ứ cấp số lượng ng tế t bào mang phân bố b đều, u, không gian a tơ mang th thứ cấp p rõ nhiề nhiều khoảng trống ng giúp cho q trình hơ hấp h thuận n lợi l (Hình 5, 8) Mang tăng sinh, phù nề nề nhiều nhớ ớtt làm cho cá thi thiếu u oxy, sức s khỏee nguyên nhân làm cho cá chết ch nhiều u Gan cá bệnh xuấ ất nhiều u ttế bào đạii thực th c bào, nhiều nhi vùng xuấ ất huyết, tụ máu, giảm m số s lượng tếế bào gan, thối hóa kèm theo ho hoại tử nghiêm trọng tr (Hình 10 12) Thận Th n cá xuất xu nhiềều vùng bị thoái hóa, xuất xu t huy huyếtt tụ t huyết, t, vùng bị b hoạ ại tử ống thậ ận bị tổn n thương nặng n nềề (Hình 14 16) Thành ru ruột xuấtt huyết, huy t, trơn c ruột cấu u trúc lỏng l lẻẻo, biểu u mô lông nhung c ruột bị đứtt nát, thối hóa, lan tràn vi khuẩn khu n gây bệnh b hồng ng cầu c u ph phản ảnh nh đặc đ điểm m bệnh b tích đạii thể th ruộtt cá b bị bệnh nh (Hình (Hình 19 20) Cho đến n nay, ch có m mộtt nghiên cứu c mơ bệnh b học a cá nheo Mỹ Mỹ nhiễm E ictaluri Miyazaki & Plumb (1985) thực hiện, n, nhiên kết k nghiên cứu c nêu đặ ặc điểm m mô bệnh b học cơ, thận th n mô máu cá Hi Hiệ ện tượng ng cá bị b lở loét hoại ho tử da đư Miyazaki & Plumb (1985) mô tả t kỹ,, nhiên nghiên cứu c u này, tỷ t lệ cá có hi tượng ng llở loét hoại ho tử chiếm chi tỷ lệ thấp th p (17,1%) Các đ đặcc điểm biến bi đổi mô bệnh nh học h thậ ận cá bệnh nh nghiên cứu c Miyazaki & Plumb (1985) tương đồng đ so vớii kết k nghiên ccứu u Trương Đình Đình Hồi, Kim V Văn Vạn, n, Đào Lê Anh, Nguy Nguyễn Thị Huyên, Nguyễn Nguy n Văn Tuyến, Tuy Vũ V Đức Mạnh, nh, Nguy Nguyễn Thị Hương Giang, Trương Quang Lâm, Nguyễn Nguy Thị Lan Hình Mang cá nheo M Mỹ khỏ ỏe, e, tơ mang sơ cấp p th thứ cấp pr rộng ng thống (HE × 40) Hình Mang cá nheo Mỹ M khỏe, tế t bào mang có cấu c u trúc, ssố lượng lư ng kích thước thư bình thường thư ng phân bố ố u tơ mang th thứ cấp (HE ×100) Hình Mang cá nheo M Mỹ bị bệnh, b nh, tơ mang tăng sinh, mang xu xuất huyếtt nặng n (HE × 100) Hình Mang cá bệnh,, tơ mang tăng sinh xuấtt huy huyếtt lan tràn (HE × 400) Hình Gan cá bình thư thường, ng, cấu c u trúc, m mật độ phân b bố tế bào gan đ u nhu mơ gan (HE × 100) Hình 10 Gan cá b bệnh, nh, nhu mô gan hoại ho tử, xuất xu huyết, t, ttế bào gan thưa thớt, th t, cấu c trúc lỏng l lẻo o (mũi tên đen), s diệ ện E ictaluri mô (mũi tên vàng) (HE × 100) 101 Đặc điểm mb bệnh lý ứng ng d dụng phương ng pháp PCR ch chẩn đoán bệnh nh gan thận th mủ ủ cá nheo Mỹ M (Ictalurus Ictalurus punctatus) punctatus Hình 11 Gan cá bình thư thường, ng, tế t bào o hình đa giác, nhân rõ phân b bố u nhu mơ gan (HE × 400) Hình 12 Gan cá b bệnh, số lượng tế bào gan giảm, m, cấu c u trúc llỏng lẻo, o, hoại ho tử xuất xu huyết lan tràn (mũi tên đen), s diệ ện E ictaluri mơ (mũi tên vàng) (HE ( × 400) Hình 13 Thận n cá bình thư thường, ng, số s lượng ng cấ ấu trúc ống ng th thận rõ (HE HE × 40 ) Hình 14 Thận n cá b bệnh, nh, thận th bị hoại ho tử, số lượ ợng ống thậ ận giảm, cấ ấu trúc ống ng thận th bị biến bi dạng, ng, xu xuất huyếtt lan tràn (mũi tên đen), s n di diện E ictaluri mô (mũi tên vàng) (HE × 40) KẾT T LU LUẬN Cá nheo M Mỹ bị b bệnh nh gan thận th mủ thư thường bơi lờ đờờ,, mang nhi nhiều nhớt, t, xuất xu huyếtt n nắp mang, gốc ốc vây h hậ ậu u môn Các nội n i quan gan, thận n có nhi nhiều u đ đốm mủ trắ ắng hoạii ttử, ruột xuấtt huy huyết Về mô b bệnh học, c, mang cá b bệnh có biểu u hi n tăng sinh mạnh nh xuất xu huyếtt lan tràn Ruộột bị xuấtt huy huyếtt thành ruột ru bị đứt nát Gan, th thận bị hoạ ại tử, cấu u trúc nhu mô llỏng lẻoo kèm theo hi tượợng xuấtt huyết huy tụ huy huyết 102 Các chủng ng vi khu khuẩn từ cá bệnh nh có khuẩn khu lạc nhỏ ỏ,, không nhân, tr trắng ng đục, đ rìa bằng, lồi, vi khuẩn khu dạng ng tr trực khuẩn n bắt b t màu Gram âm Các chủng ch ng vi khu khuẩn n đư thử đặc tính sinh hóa giám đ định ng PCR với v i 100% mẫu m dương tính với v i E ictaluri Những ng thông tin từ t kếtt qu nghiên ccứu u sở s để người ngư nuôi phát hi sớm m b bệnh, đề phương phương pháp chẩn ch đốn phịng tr trị bệnh nh phù hợp, h p, giảm gi thiểu thiệ ệt hại dịch ch b bệnh nh gây tương lai Trương Đình Đình Hồi, Kim V Văn Vạn, n, Đào Lê Anh, Nguy Nguyễn Thị Huyên, Nguyễn Nguy n Văn Tuyến, Tuy Vũ V Đức Mạnh, nh, Nguy Nguyễn Thị Hương Giang, Trương Quang Lâm, Nguyễn Nguy Thị Lan Hình 15 Th Thận n cá bình thư thường, ng, cấu c u trúc ống thận n rõ, ttế bào ống thận n phân bố b đ (HE HE × 100) Hình 16 Thận Th n cá b bệnh, nh, nhu mô bị b hoại ho tử, ống ng thận th bị m cấu u trúc, nhân thối hóa, nhu mơ thận th n xu xuất huyếtt lan tràn (HE HE × 100) Hình 17 Ruộtt cá bình thư thường, ng, thành ru ruột cấu u trung r rắn chắc, c, bi biểu u mô lông nhung rõ cấu u trúc (HE × 40) Hình 18 Ruộ ộtt cá bình thường, thư ng, thành ruột ru cấu u trung rắn r n ch chắc, biểu u mô lông nhung rõ c cấu trúc (HE HE × 100) Hình 19 Ruộtt cá b bị bệnh, nh, thành ruột ru lỏ ỏng lẻo lông nhung rách nát, xu xuấtt huyết huy t c thành ru ruộtt bi biểu mô ruộ ột (HE × 40)) Hình 20 Ruộ ột cá bị bệnh, nh, thành ruột ru giãn ra, cấu u trúc vịng llỏng ng lẻo, l o, lơng nhung rách nát, xuấ xuất huyếtt c thành ruột ru biểu u mơ ru ruột (HE ( × 100) 103 Đặc điểm bệnh lý ứng dụng phương pháp PCR chẩn đoán bệnh gan thận mủ cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) LỜI CẢM ƠN Để thực nghiên cứu này, tác giả nhận kính phí từ đề tài trọng điểm (T2018-03-12TĐ) Học viện Nông nghiệp Việt Nam tài trợ Nhóm tác giả xin chân thành cảm ơn hỗ trợ em sinh viên Khoa Thủy sản, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam chủ trang trại nuôi cá nheo Mỹ Hưng Yên, Bắc Ninh Hà Nam giúp đỡ tạo điều kiện trình điều tra, thu mẫu để hồn thành nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Crumlish, Dung M., Turnbull T., Ngoc J., N & Ferguson H (2002) Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvage), cultured in the Mekong Delta, Vietnam Journal of fish diseases 25: 733-736 Đặng Thị Hoàng Oanh & Nguyễn Trọng Nghĩa (2016) Xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ cá lóc (Channa striata) ni đồng sơng cửu long Tạp chí nơng nghiệp phát triển nơng thơn 9: 82-89 De la Cruz N.I., Rabago J.L., Monreal A.E., Colín V.H., Aguirre G., Merino J.O., Carmona S.D., Rangel J.A., Horta J.V & Venegas C.S (2017) Diagnosis and frequency of parasites in channel catfish (Ictalurus punctatus) on northeastern and gulf coast farms Mexico 5(3): 98-103 Dung T.T., Haesebrouck F., Tuan N.A., Sorgeloos P., Baele M & Decostere A (2008) Antimicrobial susceptibility pattern of Edwardsiella ictaluri isolates from natural outbreaks of bacillary necrosis of Pangasianodon hypophthalmus in Vietnam Microbial drug resistance 14: 311-316 Đồng Thanh Hà (2009) Nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh “mủ gan thận” cá tra (Pangasius hypophthalmus) nuôi bến tre Kỷ yếu hội nghị sinh viên NCKH 2008-2009 Trường Đại học Thủy sản Nha Trang 104 FAO (2014) The State of Food and Agriculture Innovation in family farming Francis-Floyd R., Beleau M., Waterstrat P & Bowser P (1987) Effect of water temperature on the clinical outcome of infection with Edwardsiella ictaluri in channel catfish Journal of the American Veterinary Medical Association 191: 1413-1416 Gatlin D.M & Stickney R.R (1982) Fall‐winter growth of young channel catfish in response to quantity and source of dietary lipid Transactions of the American Fisheries Society 111: 90-93 Hoai T.D., Trang T.T., Van Tuyen N., Giang N.T.H & Van Van K (2019) Aeromonas veronii caused disease and mortality in channel catfish in Vietnam Aquaculture 513: 734425 Hoai T.D., Hoai N.T, Phuong N.T.M & Hau N.T (2014) Histopathological features of tilapias cultured in Nothern Vietnamese provinces naturally infected with Streptococcus sp J Sci & Devel 12: 360-371 Miyazaki T & Plumb J (1985) Histopathology of Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque) Journal of Fish Diseases 8: 389-392 Panangala V.S., Shoemaker C.A., Van Santen V.L., Dybvig K & Klesius P.H (2007) Multiplex-PCR for simultaneous detection of bacterial fish pathogens, Flavobacterium columnare, Edwardsiella ictaluri, and Aeromonas hydrophila Diseases of Aquatic Organisms 74: 199-208 Kim Văn Vạn (2017) Xây dựng mô hình ni cá nheo mỹ (Ictalurus punctatus) ao Hưng n Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 15(6): 738-745 Wagner B.A., Wise D.J., Khoo L.H & Terhune J.S (2002) The epidemiology of bacterial diseases in food‐size channel catfish Journal of Aquatic Animal Health 14: 263-272 Waltman W., Shotts E & Hsu T (1986) Biochemical characteristics of Edwardsiella ictaluri Appl Environ Microbiol 51: 101-104 Wang C & Silva J.L (1999) Prevalence and characteristics of Aeromonas species isolated from processed channel catfish Journal of Food Protection 62: 30-34 ... mủ 97 Đặc điểm bệnh lý ứng dụng phương pháp PCR chẩn đoán bệnh gan thận mủ cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) Theo người nuôi cá nheo Mỹ, cá bị bệnh gan thận mủ khó phát sớm, triệu chứng bệnh bên... (mũi tên vàng) (HE × 100) 101 Đặc điểm mb bệnh lý ứng ng d dụng phương ng pháp PCR ch chẩn đoán bệnh nh gan thận th mủ ủ cá nheo Mỹ M (Ictalurus Ictalurus punctatus) punctatus Hình 11 Gan cá bình... VÀ TH THẢO LUẬN 3.1 Đặc c điểm bệnh nh lý c a cá c nheo Mỹ ỹ bị bệnh nh gan th thận mủ Kiểm m tra 70 mẫu u cá thu từ hộ ni có dấu hiệu bị bệnh gan th thận mủ cho thấy th y cá nheo Mỹ mắcc b bệnh
