ĐIỀU CHẾ KHÁNG HUYẾT THANH THỎ KHÁNG VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI - ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN NHANH BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA NUÔI CÔNG NGHIỆP

ĐIỀU CHẾ KHÁNG HUYẾT THANH THỎ KHÁNG VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI - ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN NHANH BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA NUÔI CÔNG NGHIỆPĐIỀU CHẾ KHÁNG HUYẾT THANH THỎ KHÁNG VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI - ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN NHANH BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA NUÔI CÔNG NGHIỆP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH ********* TRẦN THỊ HUYỀN ĐIỀU CHẾ KHÁNG HUYẾT THANH THỎ KHÁNG VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI - ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN NHANH BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA NUÔI CÔNG NGHIỆP LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP (NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC) Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH ********* TRẦN THỊ HUYỀN ĐIỀU CHẾ KHÁNG HUYẾT THANH THỎ KHÁNG VI KHUẨN EDWARSIELLA ICTALURI - ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐỐN NHANH BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ NI CƠNG NGHIỆP Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Hữu Thịnh Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2010 LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tôi tên Trần Thị Huyền, sinh ngày 28 tháng 10 năm 1981 huyện Hưng Hà, tỉnh Thái Bình Con ơng Trần Đình Hùng bà Trần Thi Hải Tốt nghiệp phổ thông trường Trung học phổ thông Nguyễn Trung Trực, thành phố Hồ Chí Minh, năm 1998 Tốt nghiệp Đại Học ngành Thủy Sản, hệ Chính Quy Đại Học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh Sau làm việc trường Đại Học Cơng Nghiệp thành phố Hồ Chí Minh, chức vụ Giảng Viên Tháng 09 năm 2006 theo học cao học ngành Công Nghệ Sinh Học Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh Đã lập gia đình : Chồng Đỗ Ngọc Vinh, năm kết hôn 2007 Địa liên lạc: 40/458 A Lê Đức Thọ, phường 17, quận Gò Vấp, thành phố Hồ Chí Minh Điện thoại: 0937594879 Email: huyensh06@yahoo.com LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình Ngày tháng năm 2010 Trần Thị Huyền LỜI CẢM ƠN Con xin gửi đến Bố Mẹ lòng biết ơn vơ vàn Bố Mẹ giúp đỡ cho thêm niềm tin nghị lực phấn đấu không ngừng sống Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Hữu Thịnh tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện cho em suốt thời gian thực đề tài Xin chân thành cảm ơn Thầy Cô môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh giúp đỡ em hoàn thành luận văn Em gửi lời cảm ơn đến đồng nghiệp trường Đại Học Cơng Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh ln động viên, giúp đỡ tạo điều kiện cho em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu Cám ơn tất bạn, anh chị em lớp cao học Công Nghệ Sinh Học giúp đỡ, làm việc trình học tập nghiên cứu Cuối em xin cảm ơn chồng Đỗ Ngọc Vinh động viên tinh thần, an ủi chia sẻ sống cho em có thêm thời gian để hoàn thành suốt thời gian năm học tập thực thành công luân văn tốt nghiệp thạc sĩ TÓM TẮT Đề tài “ Điều chế kháng huyết thỏ kháng Edwardrsiella ictaluri - Ứng dụng chẩn đoán nhanh diện edwardsiellosis cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” nghiên cứu trường Đại Học Cơng Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh từ tháng năm 2008 đến tháng năm 2010 Mục đích nghiên cứu phát triển kỹ thuật Dot-ELISA để phát E ictaluri cá tra phơi nhiễm edwardsiellosis kháng huyết thỏ Kháng huyết sản xuất cách tạo miễn dịch thỏ hỗn hợp vi khuẩn E ictaluri bị bất hoạt formalin tá chất Freund’s Complete Kháng huyết chuyên biệt cho E ictaluri hiệu giá ngưng kết thu đạt đến 1/512 Kỹ thuật Dot-ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ứng dụng để phát E ictaluri cá tra gây nhiễm bệnh thực nghiệm Kết cho thấy kỹ thuật phát E ictaluri với giới hạn phát 2.9 x 105 tế bào/ml Độ nhạy, độ chuyên biệt, giá trị âm tính, dương tính giả 100%, 100%, 0%, 0% Đối với mẫu cá có triệu chứng bệnh “gan thận mủ” thu An Giang, phương pháp Dot-Elisa có tỉ lệ phát E.ictaluri cao 93,3% Trong phương pháp ngưng kết nhanh phiến kính kit sinh hóa 14GNR cho kết thấp đạt 81,7 90% Tóm lại, kháng huyết thỏ có có đáp ứng miễn dịch tốt việc sử dụng kháng huyết phương pháp Dot-Elisa đáp ứng yêu cầu công cụ hiệu cho chẩn đoán phát nhanh E ictaluri cá tra bị lây nhiễm vi khuẩn ABSTRACT Study entitled as “Producing rabbit antiserum against Edwardrsiella ictaluri – Application in quick diagnosis of edwardsiellosis in tra catfish (Pangasianodon hypophthalmus)” was conducted at HoChiMinh City University of Industry from September, 2008 to August, 2010 This study was aimed to develop Dot-ELISA technique to detect E ictaluri in edwardsiellosis suffered catfish by using rabbit antiserum Rabbit antiserum was produced by immunizing rabbit with a mixture of formalin killed cell of E ictaluri and Freund’s Complete Adjuvant The collected serum was specific for E ictaluri and its agglutination titer was up to 512 DotELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) technique was developed to detect E ictaluri in experimentally infected catfish Results showed that this technique could detect E ictaluri at the detection limit of 2.9 x 105 cell/ml Its sensitivity and specification, false negative/positive results and detection level was 100, 0, and 100%, respectively Edwardsiellosis suffered catfish from An Giang Province were sampled for detection of the bacterium by Dot-ELISA, slide agglutination techniques and IDS 14GNR biochemical kit The highest detection level was 93.3% for Dot-ELISA Meanwhile, those of slide agglutination and IDS 14GNR kit were lower and only reached 81.7 and 90.0 %, respectively In conclusions, rabbit antiserum was successfully produced and its application in Dot-ELISA technique could considered as an effective method for quick detection of E ictaluri in edwardsiellosis suffered catfish MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG MỤC LỤC i DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH SÁCH CÁC BẢNG v DANH SÁCH CÁC HÌNH vi Chương GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Yêu cầu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bệnh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cá nuôi 2.1.1 Trên giới 2.1.2 Việt Nam 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 Vi Khuẩn Edwardsiella ictaluri Khái quát Hình thái vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Đặc điểm sinh hóa 2.3 Đặc điểm kháng nguyên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 10 2.4 2.4.1 2.4.2 2.4.3 Một Số Phương Pháp Phát Hiện Edwardsiella ictaluri 11 Phương pháp phân lập – định danh 11 Phương pháp huyết học 12 Phương pháp PCR 14 2.5 Phương pháp Dot-ELISA 14 i 2.5.1 Khái niệm Dot-ELISA 15 2.5.2 Một số nghiên cứu ứng dụng phương pháp Dot-ELISA 15 Chương 18 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 18 3.1.1 Thời gian 18 3.1.2 Địa điểm 18 3.2 Vật liệu nghiên cứu 18 3.2.1 Dụng cụ - Thiết bị 18 3.2.2.1 Hóa chất cho ni cấy vi khuẩn 23 3.2.2.2 Hóa chất dùng cho phản ứng ngưng kết kháng nguyên - kháng thể 23 3.2.2.3 Hóa chất dùng cho Dot-Elisa 23 3.3 Nội dung nghiên cứu 20 3.4 Các phương pháp nghiên cứu .21 3.4.1 Phương pháp nuôi cấy thu sinh khối vi khuẩn Edwardsiella ictaluri dạng FKC (Formalin Killed Cell) 21 3.4.1.1 Phương pháp nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn 21 3.4.1.2 Phương pháp tạo FKC 21 3.4.2 Phương pháp tạo miễn dịch thỏ 22 3.4.3 Phương pháp lấy máu - thu huyết thỏ 23 3.4.4 Phương pháp thực phản ứng ngưng kết nhanh phiến kính, 24 3.4.5 Phương pháp xác định hiệu vi giá ngưng kết huyết thỏ 24 3.4.6 Phương pháp xác định vi khuẩn Edwardsiella ictaluri dạng FKC Dot-Elisa 25 3.4.7 Phương pháp xác định giới hạn phát giới hạn định lượng 27 3.4.8 Phương pháp gây bệnh nhiễm bệnh thực nghiệm cho cá tra giống với vi khuẩn Edwardsiella ictalri 27 3.4.9 Phương pháp phân phân lập – phát Edwardsiella ictalri 28 3.5 Bố trí thí nghiệm phương pháp thực 29 3.5.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát độ pha loãng kháng huyết thỏ cho phản ứng ngưng kết với KFC E ictaluri vi khuẩn E ictaluri 29 3.5.2 Thí nghiệm 2: Xác định hiệu giá ngưng kết nhanh kháng huyết thỏ với FKC E ictaluri vi khuẩn E ictaluri phiến kính 30 3.5.3 Thí nghiệm 3: Thực phương pháp Dot-ELISA cho phát vi khuẩn E ictaluri dạng FKC 30 ii 3.5.4 Thí nghiệm : Thực kỹ thuật Dot-ELISA cho phát vi khuẩn E ictaluri 31 3.5.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát mật độ vi khuẩn E ictaluri cho thí nghiệm phát phương pháp Dot-ELISA 31 3.5.6 Thí nghiệm 6: Thử nghiệm phương pháp Dot-ELISA phát vi khuẩn E ictaluri diện cá tra giống gây bệnh “gan thận mủ” thực nghiệm 32 3.5.7 Thí nghiệm 7: Ứng dụng chẩn đoán phát diện vi khuẩn Edwarsiella ictaluri có mẫu bệnh cá tra 36 Chương 37 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 4.1 Xác định hiệu giá vi ngưng kết kháng huyết thỏ vi khuẩn vi khuẩn Edwardsiella ictaluri dạng FKC vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 37 4.1.1 Kết hiệu giá ngưng kết sau ngày 37 4.1.2 Kết hiệu giá ngưng kết sau 14 ngày 40 4.2 Xác định hiệu giá ngưng kết nhanh phiến kính kháng huyết thỏ với FKC E ictaluri E ictaluri sống 42 4.3 Thử nghiệm Dot- ELISA phát FKC E ictaluri 44 4.4 Thử nghiệm phương pháp Dot-ELISA cho phát E ictaluri sống 47 4.5 Khảo sát mật độ vi khuẩn E ictaluri cho thí nghiệm phát 49 4.6 Kiểm chứng phương pháp Dot-ELISA mẫu cá tra giống gây bệnh thực nghiệm 52 4.7 Kiểm chứng phương pháp Dot-ELISA mẫu cá tra giống mắc bệnh gan thận mủ ao nuôi 56 Chương 59 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59 5.1 Kết Luận 59 5.2 Đề nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 iii 4.7 Kiểm chứng phương pháp Dot-ELISA mẫu cá tra giống mắc bệnh gan thận mủ ao nuôi Khi chẩn đoán lây nhiễm đặc biệt dựa phát tác nhân gây nên chứng minh phương pháp tốt nhất, phương pháp thực thí nghiệm hữu dụng cho chẩn đoán lây nhiễm E ictaluri dựa trường hợp cá có triệu chứng bệnh hay cá chết phòng thí nghiệm xa nơi thu mẫu (Oktayvà ctv, 2008) Thí nghiệm thực lập lại tương tự thí nghệm 6, kết kiểm tra 60 mẫu cá tra giống có biểu bệnh gan thận mủ phương pháp Dot-ELISA tỉnh Anh Giang trình bày qua bảng 4.8 hình 4.10 Bảng 4.8: Kết xác định diện vi khuẩn E ictaluri có mẫu cá bệnh thu An Giang Kết Dot-ELISA Ngưng kết nhanh IDS 14 GNR Dương tính 56 49 54 Âm tính 11 Tổng mẫu 60 60 60 Tỉ lệ phát 93,3% 81,7% 90% Hình 4.10: Kết xác định diện vi khuẩn E ictaluri có mẫu cá bệnh An Giang 56 Ghi M: mẫu cá bệnh; ĐC: mẫu cá đối chứng Qua bảng 4.8, với kết xử lý xử lý thống kê phương pháp McNemar với trắc nghiệm X2 chứng tỏ tỉ lệ dương tính phương pháp Dot-ELISA phương pháp IDS 14 GNR khơng có khác biệt thống kê mức ý nghĩa 5% Và kết tương tự hai phương pháp ngưng kết nhanh IDS 14 GNR Tất 60 mẫu cá kiểm tra phương pháp Trong tổng số 60 mẫu kiểm tra cho thấy phương pháp Dot-ELISA xác định có 56 mẫu (93,3%) dương tính IDS 14 GNR xác định 54 (90%) ngưng kết nhanh 49 (81,7%) Từ liệu cho thấy, Dot-ELISA phát kháng nguyên E ictaluri quan cá gây bệnh thực nghiệm với tỉ lệ 100%, 93,3 % mẫu cá bệnh thu tỉnh An Giang Kết trùng hợp với phương pháp nuôi cấy từ mô bệnh sử dụng kit IDS 14 GNR để xác định diện E ictaluri với mã số 6001 Và E ictaluri số vi khuẩn khác thường có mặt đồng thời khắp nơi, sống với mơi trường nước, nhiễm hay bội nhiễm vào cá tra bệnh dẫn đến xảy tượng mật độ E ictaluri không đủ cho thí nghiệm phát nên tỉ lệ phát giảm Mặc dù vậy, với hiệu giá ngưng kết 1/512 sử dụng phương pháp Dot-ELISA cho tỉ lệ phát E ictaluri cao so với hai phương pháp lại Do đó, phương pháp hiệu cho phòng thí nghiệm với quy mô nhỏ Những nơi không cần trang thiết bị cao cấp đòi hỏi kỹ thuật viên có chun mơn cao Riêng phương pháp ngưng kết nhanh phiến kính, tỉ lệ phát thấp 81,7%, kết cá bệnh thu An giang có tượng bội nhiễm vi khuẩn, mẫu cấy xen lẫn vi khuẩn khác dẫn đến khả phát giảm Trên điều kiện đề cập cho thấy phương pháp hiệu so với phương pháp Dot-ELISA so sánh với phương pháp nuôi cấy truyền thống khác độ nhạy khoảng thời gian để định danh vi khuẩn E ictaluri 57 Mặc dù có nhiều báo cáo liên quan đến phương pháp miễn dịch hay phương pháp phân tử cho chẩn đoán diện E ictaluri với độ đặc hiệu độ nhạy cao Tuy nhiên, vấn đề chung sử dụng phương pháp phát trực tiếp diện vi khuẩn có mẫu diện chất hạn chế (Somsak John, 1993; Lelania ctv, 2003) Và hầu hết phương pháp yêu cầu phải nuôi tăng sinh vi khuẩn trước Sau nuôi tăng sinh môi trường chọn lọc từ đến làm gia tăng độ nhạy phương pháp phát vi sinh vật (Roxanna ctv, 2003) Hơn nữa, phương pháp đòi hỏi thiết bị đắt tiền nhân viên kỹ thuật có kinh nghiệm chắn Tóm lại, thay đổi so phương pháp nuôi cấy truyền thường kéo dài thời gian khoảng – ngày để có kết định tính vi khuẩn, Dot ELISA chứng minh có lợi độ nhạy độ đặc hiệu với với khả phát vi khuẩn diện nhiều mẫu bệnh khoảng thời gian ngắn từ đến (Heberling Kalter, 1986; Oktay ctv, 2008), điều tạo nên thuận lợi khác biệt riêng cho phương pháp làm giảm thời gian chi phí kiểm tra mẫu bệnh cá Cuối cùng, giới hạn mục đích chẩn đốn lây nhiễm vi khuẩn dựa kết độ đặc hiệu hiệu giá kháng thể kháng huyết thỏ thu được, phương pháp Dot-ELISA ứng dụng cho mục đích trả lời sớm câu hỏi có hay khơng có E ictaluri mẫu cá tra Và khơng có nghiên cứu đánh giá liên quan độ nhạy với đổi màu vệt chuyển thấm thời gian lây nhiễm vi khuẩn, kháng huyết cần cho chẩn đốn khơng cần thiết 58 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết Luận Từ kết thu từ thí nghiệm, chúng tơi đưa số kết luận sau  Trong phản ứng vi ngưng kết, kháng huyết thỏ chứng tỏ đặc hiệu với riêng vi khuẩn E ictaluri so sánh với hai vi khuẩn E tarda A hydrophilla hồn tồn khơng có phản ứng vi ngưng kết xảy Và hiệu giá ngưng kết cao đạt 1/512  Với kháng thể huyết thỏ thu kháng thể thứ cấp liên kết enzyme HRP, Dot-ELISA phát diện E ictaluri mật độ tối thiểu 2,9.105 CFU/ml, mật độ thấp so với phương pháp khác  Dot-ELISA có khả phát vi khuẩn E ictaluri từ mẫu cá bệnh thực nghiệm với độ nhạy độ đặc hiệu 100%, tỉ lệ âm tính dương tính giả 0%, tỉ lệ phát 100%  Dot-ELISA thực thành công cho phát diện E ictaluri từ mẫu cá có dấu hiệu bệnh “gan thận mủ” thu ngẫu nhiên tỉnh An Giang 4.2 Đề nghị  Thử nghiệm gia tăng khoảng thời gian từ 14 thành 48 hay 72 ngày gây miễn dịch thỏ nhằm thu kháng huyết có hiệu giá ngưng kết cao 59  Thực phương pháp Dot-Elisa cho phát vi khuẩn E ictaluri nhiều mẫu cá tra bệnh “gan thận mủ” thu tỉnh khác nhau, thời điểm khác năm Từ đưa thơng số cần thiết nhằm tối ưu hóa độ nhạy độ đặc hiệu phương pháp  Tiến hành thực thu kháng thể IgG kháng huyết thỏ để phương pháp Dot-ELISA có kết xác  Tiến hành nghiên cứu phân tách lớp lipid A- nội độc tố vi khuẩn E ictaluri cho phản ứng Dot-ELISA đặc hiệu 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nguyễn Văn Dung, 2006 Tạo kháng thể đa dòng để phát triển quy trình Elisa phát Listeria monocytogenes thực phẩm Khóa luận cử nhân khoa học, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp.Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Hùng, Lê Đình Hùng, Huỳnh Lê Tâm, 2004 Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản Nhà xuất nông nghiệp Hà Nội Lê Văn Hùng, 2002 Giáo Trình Miễn Dịch Học Thú Y Nhà xuất nông nghiệp Trang 56 – 65 Đỗ Ngọc Liên, 2004 Thực hành Hóa Sinh Miễn Dịch Nhà xuất Đại Học Quốc Gia Hà Nội Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, 2004, Bệnh học Thủy Sản, Nhà xuất nông nghiệp Ngô Thị Vân Kiều, 2008 Xây dựng phương pháp định lượng nhanh Clostridium perfringens thực phẩm dựa biểu enzyme Bgalactosidase acid phosphatase Khóa luận tốt nghiệp cử nhân công nghệ sinh học, Trường Đại học Nơng Lâm Tp.Hồ Chí Minh Nguyễn Văn Hữu, Ngơ Quang Luận, 2005 Điều chế kháng huyết thỏ khảo sát đáp ứng miễn dịch cá rô phi đỏ vi khuẩn Streptococcus sp Khóa luận tốt nghiệp cử nhân công nghệ sinh học, Trường Đại học Nơng Lâm Tp.Hồ Chí Minh Trần Thị Minh Tâm, 2003 Nghiên cứu bệnh đốm trắng cá tra (Pangasius hypophthalmus) nuôi công nghiệp Báo cáo tổng kết- Viện NTTS II 61 Nguyễn Hữu Thịnh, Trương Thanh Loan, 2007, Phân lập khảo sát đặc điểm kháng kháng sinh Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra, Pangasius hypophthalmus, ni thâm canh, Tạp chí KHKT Nơng Lâm Nghiệp số & 2/2007 10 Trần Linh Thước, 2002 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm, mỹ phẩm Nhà xuất giáo dục 11 T T Dung, N T N Ngọc, N Q Thịnh, D T M Thy, M Crumlish H W Ferguson, 2003 Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm trắng gan cá Tra (Pangasius hypophthalmus) nuôi thâm canh đồng sông Cửu Long Đại học Cần Thơ Viện Thủy Sản, Đại học Stirling , trang 413-415 TIẾNG ANH 12 Andrea C., Kinya K , and Kazuma Y., 1998 Serological Charaterization of Atypical Strain of Edwardsiella tarda Isolated from Sea Breams Fish Pathology 33(4): 265-274 13 Ambrosio J., Martínez-Govea A., L Gutiérrez-Cogco, and Flisser A., 2001 Identification and Strain Differentiation of Vibrio cholerea by using polyclonal antibodies against outer membranes proteins Clinical and Diagnosistic Laboratory Immunology (4): 768-771 14 Austin B , Austin D.A , 1989 Methods for the microbiological examination of fish and sellfish Department of Brewing and Biological sciences 15 Craig J.L., Seyed H.G., J Russel H., and Dexter T.T., 1993 Plasmid and Serological differences between Edwarsiella ictaluri strains Applied and Enviromental Microbiology 59 (9): 2830 –2836 16 Clive D., 2002 A guide to protein isolation Kluwer Academic Publishers New York , Moscow 62 17 Don J.B., James T.S., 2005 Bergey’s Mannual of Systematic Bacterology Springer Second Edition (2) : 657- 661 18 Donald G G., Jr., Christopher J.F and Amy S.G., 2000 The Dot Blot ELISA: A Rapid & Simple Experiment to Demonstrate Antibody-Antigen Interactions The American Biology Teacher 62 (8): 583-587 19 Eijiro K., Yutaka F., Riichi K., 1998 Serological Differences among Photobacterium damsel subsp piscicida Isolate Fish Pathology 33 (4), 281285 20 Elza F.B., Calil K.F., 2010 Comparion of Dot-Elisa for detcetion of Neisseria menigtidis outer membrane complex-specific antibodies Brazilian journal of infectious diseases 14: 1413-8670 21 Eric P., Puttharat B., Jeffery T., Peng X., Samiran N., Huseyin K., Ping L., Shaolin W., Benjaporn S., Rex D., Zhanjiang L., 2007 Expression analysis of the acute phase response in channel catfish (Ictalurus punctalus) after infection with a Gram – negative bacterium Developmental and Comparative Immunology 31(11): 1183-1196 22 Ferguson H.W., Turnbull J.F., Shin A., Thompson K., Dung TT., and Crumlish M., 2001 Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage) from the Mekong Delta, Vietnam.J Fish Dis 24: 509 -513 23 Hawke J.P , Durborow R.M., Thune R.L., Camus A.C., 1998 ESC – Enteric Septicemia of Catfish SRAC Publication 477 24 Heberling R.L., Kalter S.S., 1986 Rapid dot-immunobinding assay on nitrocellulose for viral antibody Journal of clinical microbiology 23(1): 109113 63 25 Hisashi Y., Kunioki A., Ken K., 2003 Evaluation of Dot-Elisa for serological diagnosis of Amebiasis Journal of Infection and chemotherapy 9(1): 25-29 26 Hoben H.J., P.Somasegaran, 1994 Polyclonal antisera production by immunization with mixed cell antigens of different Rhizobial species World journal of microbiolgy & biotechnology 10: 538-542 27 Ildiko K.P, 2007 Characterization of a virulence related hypothetical protein in Edwardsiella ictaluri Master of Science, Clark University, The Interdepartmental Program in Veterinary Medical Sciences through the Department of Pathobiological Sciences 28 James M.B., Rocco C., Pyle S.W., and John J.A.,1990 Serological investigation of the fish pathogen Edwardsiella ictaluri, cause of enteric septicemia of catfish, Journal of Wildlife Diseases 28(2): 248-252 29 Jayakumar R., Nachimuthu K., and Padmanaban V.D., 1995 A dot enzyme linked immunosorbent assay (dot ELISA): Comparison with standard fluorescent antibody test (FAT) for the diagnosis of rabies in animals Parasitology 107: 79-85 30 Jesus A.A.A, 2006 Locus NMB0035 codes for a 47-kDa surface accessible conserved antigen in Neisseria International microbiology 9: 273 – 280 31 John A.P., Craig S., 1995, Effects of temperature and salt concentration on latent Edwardsiella ictaluri infections in channel catfish Diseases of Aquatic Organism (21): 171 – 175 32 John A.P., Dean E., W A R., 1996 Isolation of Edwardsiella ictaluri from channel catfish by tissue homogenization, filtration and enzyme linked immunosorbent assay Diseases of Aquatic Organism (27): 19– 24 64 33 John R.C, 2002 The ELISA Guidebook Methods in Molecular Biology, The International Atomic Energy Agency, Vienna, Austria 34 Karen L Camp, William R.W., and Charles D R, 2000 Survivability and immune responses after challenge with Edwardsiella ictaluri in susceptible and resistant families of channel catfish, Ictalurus punctatus Fish & Shellfish Immunology 10 (6):475–487 35 Khadelmul I., 2007 Analysis of immune responses against H.pylori World J Gastroenterol 13 (14): 600-606 36 Lazarovits G., Zutra D., Bar-Joshep M., 1987 Enzyme-linked immunosorbent assay on nitrocellulose (dot-Elisa) in the serodiagnosis of plant pathogenic bacteria Can.J.Microbiol 33(2): 98-103 37 Lelania B., and Geoffrey C.W., Jeffery S.T., and David J.W., William R.W., 2003 A Real-Time Polymerase Chain Reaction Assay of the Bacterium Edwardsiella ictaluri in Channel Catfish Journal of Aquatic Animal Health 15 : 80-86 38 Majahao Li., 1997 Rapid detection of motile Aeromonas species in fish by Dot-Elisa Journal of Dalian Fisheries university 39 Mark D.L., Heather L.H., Sandra L.B., Steven F.H., Kathleen A.W, and Christine J.M., 2007 Production and Evaluation of reagents for detection of Histoplasma capsulatum Antigenuria by Enzyme Immunoassay Clinical and Vaccine immunology 14(6): 700-709 40 Mark L.L., Michelle M.B., Parastoo A., and Brenda Y.R,, 2003 The Edwardsiella ictaluri O polysaccharide biosynthesis gene cluster and the role of O polysaccharide in resistance to normal catfish serum anh catfish neutrophil Microbiology 149: 1409–1421 65 41 Martin H., 2006 Basic Methods for the Biochemical Lab, First English Edition, Springer 42 Michelle M.M., Denise L.F., Ronald L.T, 2002 Cloning and characterization of Edwardsiella ictaluri proteins expressed and recognized by the channel catfish Ictalurus punctatus immune response during Diseases of Aquatic Organism 52 : 93 – 107 43 Neelam S., Rajesh K.A., R.K.Agarwal., 2008 A simple enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of Aeromonas spp Fao/Who Collaborating Centre for Research and Training in Veterinary Public Health Indian Veterinary Research Institute Indian 44 N.H.Thinh, T.Y.Kuo., 2009 Combined immersion and oral vaccination of Vietnamese catfish (Pangasasianodon hypophalmus) confers protection agaisnt mortality caused by Edwardsiella ictaluri Fish & Selfish immunology 27: 773-776 45 Nourollahi F., 2004 Standardization and Comparision of Dot-Elisa with IFA test for diagnosis of human toxoplasmisis Iranian journal of Veterinary Research (2): ISSN 10 1383 46 Oie, 2009 Chapter2.1.12 Enteric Septicaemia of Catfish Manual of DiagnosticTests for Aquatic animals 47 Oktay K., Selỗuk S., Mỹjgan I., Sỹheyla , Rajhab S.M., 2008 Edwardsiella ictaluri infection in Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) Turk J Vet Anim Sci 28 : 649- 653 48 Padmanaban V.P., Jayakumar R., Nachimuthu K , 1999 A dot enzyme linked immunosorbent assay (dot ELISA): Comparison with standard fluorescent antibody test (FAT) for the diagnosis of rabies in animals 66 Comparative Immunology, Microbiology and Infectiuos Diseases 18(4): 269273 49 Panangala VS, Shoemaker CA, McNulty ST, Arias CR, Klesius PH, 2006 Intra- and interspecific phenotypic characteristics of fish-pathogenic Edwardsiella ictaluri and E tarda Aquaculture Reseach 37:49–60 50 Pappas M.G., 1998 Recent applications of the Dot-ELISA in immunoparasitology Vet Parasitol 29 (2-3): 105-29 51 Rajasulochana P., Dhamotharan R., and Srinivasulu P., 2008 Comparison Of Dac-Elisa And Dot-Blot-Elisa For The Detection Of Cucumber Mosaic And Banana The Journal of American Science 4(3): ISSN 1545-1003 52 Roxanna S., Krystal D.B, Hemant M C., Roxanna S., and Kevin R.U., 2003 Detection of Edwardsiella Infections in Opsanus tau by Polymerase Chain Reaction Biol Bull 205: 235–236 53 Shelley R.H., BarnaranR., Ruth C.M and Soad T., 1986 Immunobloting to demonstrate antigenic and immunogenic Differences among Nine Standard Strains of Clositridium difficile Journal of Clinical Microbiology 24(3): 384387 54 Siwaporn L., Kriengkrai P., Vithaya M., Sirirat R., Sombat R., Weerawan S., Parin C., Paisa, 2007 Identification of Aeromonas hydrophilla infection with specific monoclonal antibodies, Mj Int J Sci Tech., 01(02), 107-119: Shigetoshi E., John P.B., W.R Waters., Yasuyuki M., Robert H W., M.Cathy S.,1 and C A Speer1., 2006 A hightly Sensitive and SubspeciesSpecific Surface Antigen Enzyme Linked Immunosorbent Assay for Diagnosis of Johne’sDisease Clinical and vaccine immunology 13(8): 837844 67 55 Somsak V., John A.P., 1993 Protection of channel catfish Ictalurus punctatus following natural exposure to Edwardsiella ictaluri and effects of feeding antigen on antibody titer Diseases of aquatic organisms 15: 31 – 34 56 Swain P., Mukherjee S.C., Sahoo P.K., Das B.K., Pattnaik P., Murjani G and Nayak S.K, 2001 Dot-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (DotElisa) for the Diagnosis of Edwardsiella tarda infection in fish Short Communication Asian Fisheries Science 14: 89-93 57 Victor S.P., Richard A S., Craig A S., Phillip H K.,.Amitava M., Edward E., 2006a Immunofluorescent test for simultaneous detection of Edwardsiella ictaluri and Flavobacterium columnare Diseases of aquatic organisms 68: 197-207 58 Victor S.P., Craig A.S., Shawn T.M., Phillip H.K, 2006b Intra and interspecific phenotypic characteristics of fish-pathogenic Edwardsiella ictaluri and E tarda Aquaculture Research 37(1): 49-60 59 Victor S.P., Craig A.S., Shawn T.M., Phillip H.K, Amitava M., Riccardo R., 2009 Cross-protection elicited in channel catfish (Ictalurus punctatus Rafinesque) immunized with a low dose of virulent Edwardsiella ictaluri strains Aquaculture Research 40(8): 915-926 60 Waltman W.D., Shotts E.B., 1986 Biochemical characteristics of Edwardsiella ictaluri Applied and Environmental Microbiology American Society for Microbiology 51(1) 101 – 104 61 Wallace H., Andrews., 2002 Food and Drug Administration AOAC International OMA Program manual 62 Zang H.M., Fan J.F, Wang B., 2006 Detection of Vibrio parahaemolyticus by Dot-Elisa Journal of Dalian Fisheries University 01 68 63 Zhu Z.C., Chen yang., Hao D.S., Jiang G.J., Xing Z.B, Wu P., Bai C.Z., Li J.L., Shi-l., Shi X.G., 2010 Rapid detection of Pathogenic Bacteria of Ascites in Japanese Flounder (Paralichthys olivaceus) by Dot-Elisa Fisheries Science 03 69 PHỤ LỤC Phosphate buffer (PBS) 50X (pH 7,6-8,0): + Dung dịch A: + Dung dịch B : Na2HPO4.2H2O 89g NaH2PO4 Hoặc Na2HPO4 71g dH2O dH2O 100ml 900 ml PBS 50X: Cho B vào A để đạt pH yêu cầu Dung dịch PBS pH 7,2 (KN) Phosphate buffer pH 7,6-8 1l NaCl 14,61g Dung dịch TBST (Tris-buffered saline + Tween 20): 10mM Tris-HCl, pH 7,8; 150mM NaCl ; 0,05% Tween 20 Dung dịch đệm bao vây (Bloking solution): % BSA dung dịch TBST Đệm phosphate kiềm 100 mM Tris-HCl, pH 9,5; 100mM NaCl; mM MgCl 70 7,8g ... catfish MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG MỤC LỤC i DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH SÁCH CÁC BẢNG v DANH SÁCH CÁC HÌNH vi Chương GIỚI THI U ... sản xuất để đạt mục tiêu trên, nhiều năm qua, người nuôi cá bị thi t hại lớn nhiều dịch bệnh xảy Trong đó, bệnh gan thận mủ gây thi t hại nghiêm trọng cho nghề nuôi cá Năm 2002, qua nghiên cứu... ctv, 2001; Nguyễn Hữu Thịnh Trương Thị Thanh Loan, 2007),…nhưng hầu hết phương pháp đòi hỏi trang thi t bị đắt tiền, kỹ thuật viên huấn luyện thục hay thời gian phân lập – phát kéo dài kéo theo