MỘT số PHƯƠNG PHÁP SINH học TRONG CHẨN đoán TIỀN làm tổ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BÙI THỊ MINH PHƯỢNG MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC TRONG CHẨN ĐOÁN TIỀN LÀM TỔ CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BÙI THỊ MINH PHƯỢNG MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC TRONG CHẨN ĐOÁN TIỀN LÀM TỔ Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Huy Thịnh Cho đề tài: Chẩn đoán trước làm tổ số bệnh lý di truyền liên kết nhiễm sắc thể giới tính kỹ thuật Microsatelitte DNA Chuyên ngành: Hóa sinh Mã số: 62720112 CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2017 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Các phương pháp kỹ thuật sinh học phân tử áp dụng việc sàng lọc phôi 1.1 Kỹ thuật PCR 1.2 Fluorescence in situ hybridization (FISH) 1.2.1 Quy trình thực kỹ thuật 1.2.2 Các ứng dụng khác phép lai FISH xét nghiệm lâm sàng nghiên cứu .5 1.2.3 Ứng dụng kỹ thuật FISH Ngoài interphase FISH (FISH nhanh) sử dụng rộng rãi chẩn đoán trước sinh, để phát bất thường số lượng số nhiễm sắc thể thường gặp (13,18,21,X,Y) .5 1.2.4 Ưu nhược điểm kỹ thuật FISH 1.3 Microsatellite DNA (Fluorescent PCR) 1.3.1 Nguyên lý kỹ thuật microsattelite 1.3.2 Cơ chế hình thành microsatelie 10 1.3.3 Phương pháp xác định microsattelite 10 1.3.4 Những ứng dụng microsatelite .11 1.3.5 Ưu điểm nhược điểm microsattelite 11 1.4 Kỹ thuật micro array 12 1.4.1 Khái niệm 12 1.4.2 Chỉ định phương pháp micro array 13 1.4.3 Ưu điểm kỹ thuật PGD/Microarray .14 Các bất thường NST bệnh lý di truyền liên kết với NST giới tính sàng lọc quy trình PGD 15 2.1 - Bệnh loạn dưỡng Duchenne 16 2.2 - Bệnh Hemophillia A 19 2.3 Bất thường cấu trúc số lượng nhiễm sắc thể 20 KẾT LUẬN 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO .24 MỞ ĐẦU Năm 1990 Handyside lần áp dụng chẩn đốn bệnh lý di truyền phơi thai người Kể từ kỹ thuật PGD áp dụng rộng rãi khắp giới Kỹ thuật PGD kỹ thuật hoàn chỉnh, cho phép cặp vợ chồng có nguy truyền bệnh lý di truyền cho có hội sinh khơng mắc bệnh mà khơng phải chẩn đốn tiền sản sau mang thai bỏ thai phát bệnh lý thai Kỹ thuật PGD dựa việc phát bất thường di truyền phôi (in-vitro) cấy trở lại vào lòng tử cung phơi khơng có bất thường di truyền Có thể thấy rằng, PGD phương pháp dự phòng tốt, nhiên kỹ thuật tốn khơng thể sàng lọc hồn tồn đột biến gen bất thường NST phôi Để chẩn đoán, bệnh nhân phải thực thụ tinh ống nghiệm (IVF) để có phơi bào cung cấp cho chẩn đốn họ khơng phải bệnh nhân vơ sinh Hơn tỷ lệ có thai lâm sàng sau IVF Việt Nam khoảng 30% Việc chẩn đoán xác định đột biến gen bất thường NST từ tế bào sinh thiết rõ ràng có hạn chế định, thể tỷ lệ thành cơng, mức độ rõ ràng xác kết chẩn đốn Chính năm gần đây, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử đại FISH, Microsatellie DNA, Microarray… ứng dụng vào quy trình PGD để nâng cao tính xác hiệu chẩn đốn Cần phải nhấn mạnh rằng, việc xác định xác đột biến bệnh nhân người mang gen kỹ thuật sinh học phân tử cần thiết để định hướng khư trú tổn thương trước thực chẩn đoán PGD Cho đến PGD sử dụng phương tiện chẩn đoán lâm sàng điều trị áp dụng cách rộng rãi Hàng năm số trường hợp PGD tăng gần gấp đôi, hàng chục ngàn trẻ đời từ trung tâm IVF giới sau chẩn đoán PGD khơng có ảnh hường xấu Các phương pháp kỹ thuật sinh học phân tử áp dụng việc sàng lọc phôi 1.1 Kỹ thuật PCR PCR Multiplex-PCR kỹ thuật nhân đoạn DNA thực nghiệm sử dụng cặp mồi hay lúc nhiều cặp mồi khác Sản phẩm phản ứng khuếch đại sau kiểm tra cách điện di agarose gel để xác định có mặt hay vắng mặt đoạn DNA cần phân tích PCR kỹ thuật áp dụng vào chẩn đoán PGD Handyside cộng vào năm 1990 xác định đoạn trình tự lặp lại nhiễm sắc thể Y để xác định giới tính phơi chẩn đốn bệnh di truyền liên kết với NST giới tính chuyển phơi không mắc bệnh vào tử cung Cho đến nay, kỹ thuật PCR áp dụng rộng rãi chẩn đốn PGD với độ xác ngày cao để xác định nhiều bệnh di truyền khác , Hơn nữa, với việc phát triển kỹ thuật multiplex-PCR PGD nhà di truyền học xác định lúc nhiều đột biến có khả di truyền từ phơi Tuy nhiên, kỹ thuật PCR cịn có nhiều hạn chế Việc khuếch đại đoạn gen mong muốn từ tế bào đòi hỏi số lượng lớn chu kỳ khuếch xác định hình ảnh đoạn gen cần phân tích agarose gel Điều dẫn tới nguy nhiễm DNA ngoại lai hay DNA từ cặp vợ chồng thực PGD IVF Khi DNA bị nhiễm vào mẫu PCR cần phân tích làm sai lệch kết chẩn đốn Để khắc phục tình trạng này, nhà di truyền học thiết lập quy trình PCR sử dụng PGD với việc khuếch đại đồng thời đoạn DNA cần phân tích đoạn DNA đặc hiệu khơng có nguồn gốc từ phơi thai Như vậy, mẫu phân tích bị nhiễm DNA bị loại trừ cho kết chẩn đốn PGD cách xác Vấn đề khác việc ứng dụng PCR vào chẩn đoán PGD khoảng 80% đoạn gen cần phân tích khuếch đại thành cơng phản ứng thực với lượng DNA từ phôi bào sinh thiết Các kỹ thuật PCR khác multiplex-PCR, Fluorescent PCR làm gia tăng tỷ lệ thành cơng chẩn đốn Tuy nhiên, giá thành kỹ thuật cao so với kỹ thuật PCR tiêu chuẩn kể Kỹ thuật PCR có ưu điểm PGD : Độ nhạy cảm: Có thể phát chuỗi tế bào nhiều tế bào Các trình tự khuyếch đại từ tế bào đơn bao gồm: tế bào tinh trùng, nguyên bào sợi, bào thai… Tốc độ: Các đoạn DNA khuyếch đại vòng vài 1.2 Fluorescence in situ hybridization (FISH) Kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ (FISH) kỹ thuật di truyền tế bào – phân tử, sử dụng đầu dò DNA gắn huỳnh quang lai với trình tự DNA đặc hiệu đích nhiễm sắc thể tế bào gian kỳ nhiễm sắc thể kỳ giữa, qua phát có mặt hay vắng mặt đoạn gen kính hiển vi huỳnh quang Với kỹ thuật FISH, đưa để lựa chọn giới tính bệnh liên quan đến X, dịch chuyển nhiễm sắc thể, dị vòng tái tổ hợp lặp lại 1.2.1 Quy trình thực kỹ thuật Kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ thực đầu tận vùng cận đầu tận NST mục tiêu xác định trước NST thơng qua đoạn dị DNA đặc hiệu cho locus trình tự nucleotid định NST Những đoạn dò DNA thiết kế đánh dấu loại thuốc nhuộm huỳnh quang, tiêu đánh giá đoạn dò lai với đoạn DNA tương ứng gen theo nguyên tắc bổ sung phát tín hiệu màu huỳnh quang, tín hiệu phân tích kính hiển vi huỳnh quang (Hình 1) để đánh giá bất thường đặc hiệu NST Bên cạnh đoạn dò đặc hiệu cho locus NST, loại đoạn cdò cho phép nhuộm huỳnh quang nguyên NST phát triển để đánh giá toàn NST - Kỹ thuật FISH cho phép phát bất thường NST có kích thước < 1Mb tùy thuộc vào kích thước đoạn dò sử dụng Các đoạn dò chủ yếu DNA lấy từ nhiễm sắc thể vi khuẩn nhân tạo có kích thước 150-350 kb Hình 1: Nguyên tắc kỹ thuật FISH - Kết thí nghiệm FISH bị ảnh hưởng nguyên nhân sau : mẫu có chứa chất tự phát huỳnh quang, đầu dị thiếu tính đặc hiệu, số lượng đầu dị sử dụng q ít, số trình tự đích có cấu trúc phức tạp, hàm lượng rRNA thấp, ảnh chụp bị màu - Hiện giới FISH sử dụng việc mô tả đa dạng giới vi sinh vật, phát hệ vi sinh vật nước thải, phát vi khuẩn cộng sinh, chẩn đoán hệ vi khuẩn phức tạp, phát mầm bệnh có mơ cấy dụng cụ vô trùng, phát nấm, thuốc thú y, chẩn đoán mầm bệnh thực vật, phát mầm bệnh phương pháp lai không sử dụng chất huỳnh quang - Ở Việt Nam nghiên cứu sử dụng FISH hạn chế, chủ yếu ứng dụng chẩn đoán bệnh di truyền Do việc đẩy mạnh phát triển kỹ thuật nước ta tương lai mở bước tiến việc nghiên cứu chẩn đoán vi sinh vật so với phương pháp nuôi cấy cổ điển 1.2.2 Các ứng dụng khác phép lai FISH xét nghiệm lâm sàng nghiên cứu Các ứng dụng kỹ thuật lai FISH tiếp tục phát triển Ví dụ, nhà di truyền học tế bào ngày sử dụng phép lai ghép gen so sánh (CGH- comparative genomic hybridization) để phát sai khác số lượng, hay biến đổi số lượng gen nhiễm sắc thể Gần đây, nhà khoa học tăng độ phân giải kỹ thuật lai FISH cách sử dụng sợi chất nhiễm sắc hay microarray đối tượng đích Với cơng cụ trên, ngành di truyền học tế bào mở rộng phạm vi nghiên cứu từ quy mô nhiễm sắc thể tới đoạn DNA nằm nhiễm sắc thể 1.2.3 Ứng dụng kỹ thuật FISH Ngoài interphase FISH (FISH nhanh) sử dụng rộng rãi chẩn đoán trước sinh, để phát bất thường số lượng số nhiễm sắc thể thường gặp (13,18,21,X,Y) Kỹ thuật FISH định trường hợp sau: * Chẩn đoán trước sinh bất thường số lượng NST thai nhi * Phát đoạn nhỏ số hội chứng di truyền * Xác định đoạn nhiễm sắc thể chưa rõ nguồn gốc * Phát bất thường nhiễm sắc thể đặc hiệu ung thư + Kỹ thuật FISH chẩn đoán trước sinh: Với kỹ thuật FISH, nhà di truyền có khả phát bất thường đoạn gen nhỏ gây với độ phân giải cao mà khơng cịn bị lệ thuộc q nhiều vào kỹ thuật nhuộm băng Kỹ thuật nghiên cứu ứng dụng để chẩn đoán bất thường nhiễm sắc thể PGD từ năm 1993-1994 kỷ trước Đầu tiên để chẩn đoán nhiễm sắc thể X, Y, DNA dò tương ứng với cặp nhiễm sắc thể kiểm tra, sau phát triển lên 7, lên 12 cặp nhiễm sắc thể kiểm tra, là: 8, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, X Y Kỹ thuật FISH ứng dụng PGD có loại lai vòng (với tế bào lai lần với tất DNA dò) lai vòng (lai vòng với số DNA dò sau tẩy tín hiệu lai vịng lai tiếp vòng với số DNA dò khác) Với loại lai vịng có ưu điểm tín hiệu lai rõ ràng, nhược điểm phát bất thường nhiễm sắc thể (thường nhiễm sắc thể) Lai vòng ưu điểm phát nhiều bất thường nhiễm sắc thể (thường 9), nhược điểm tín hiệu lai vịng khơng đẹp vòng Hiện ứng dụng rộng rãi kỹ thuật FISH PGD loại DNA dò (13, 18, 21, X, Y) lai vòng DNA dò 13, 15, 16, 17, 18, 21, 22, X Y lai vòng Kỹ thuật interphase FISH (FISH nhanh) sử dụng để sàng lọc số hội chứng di truyền thường gặp: hội chứng Down (trisomy 21), hội chứng Patau (trisomy 13), hội chứng Edward (trisomy 18), hội chứng Turner (monosomy X), hội chứng Kleinerfelter (XXY)… với ưu điểm: * Nhanh: Thời gian xét nghiệm vòng 48h kể từ nhận mẫu dịch ối Hoàn thành thủ tục quản lý chất lượng xét nghiệm sau ngày * Độ xác cao * Yêu cầu 10-20ml dịch ối * Có thể thực mẫu bệnh phẩm gai rau 13 thiết tế bào từ phôi thu từ thụ tinh ống nghiệm, phôi khoảng 3- ngày tuổi Tế bào mang xét nghiệm để phát sớm bất thường di truyền loại bỏ phôi lỗi Điều bảo đảm cho đứa trẻ sinh sau không bị mắc bệnh lý di truyền 1.4.2 Chỉ định phương pháp micro array PGD giúp xác định loại trừ phôi gặp bất thường cặp nhiễm sắc thể số 13,18,21… có liên quan đến dị tật bẩm sinh thai nhi dẫn đến tử vong thai nhi cao thai ngừng phát triển hay chủ động chấm dứt thai kỳ Ngoài trẻ có bất thường số lượng nhiễm sắc thể sinh mắc hội Phương pháp Micro Array chứng minh ưu vượt trội so với phương pháp PGD Về chuẩn đoán, PGD khảo sát cặp NST Micro Array giúp xác định loại trừ phôi gặp bất thường tất 23 cặp NST Việc rà soát phát lỗi gen giúp phát sớm gần 2000 dị tật bẩm sinh, đảm bảo cho tương lai phôi thai khỏe mạnh Ngồi việc chẩn đốn bất thường gen, Micro Array phát gen đột biến gây ung thư biết đến ung thư đại tràng di truyền gia đình dạng ung thư mắt gặp Ngoài ra, phương pháp PGD/ Micro Array định cho trường hợp đây: – Những cặp vợ chồng mắc bệnh di truyền gia đình có người mắc bệnh di truyền – Những cặp vợ chồng lớn tuổi , có nguy dị tật thai cao Mặc dù thể lợi ích vượt trội thời điểm này, nước ta chưa triển khai phương pháp yếu tố khách quan sở vật chất, công nghệ kĩ thuật hay rào cản pháp lý Thấu hiểu nhằm đáp ứng mong muốn cặp vợ chồng đó, Bệnh viện Hồng Ngọc triển khai chương trình hợp tác với bệnh viện Thái Lan để 14 thực phương pháp thụ tinh ống nghiệm, sử dụng công nghệ tối tân, đại PGD Micro Array Theo đó, nửa q trình bao gồm khám sức khỏe, tiêm thuốc kích trứng diễn Bệnh viện Hồng Ngọc, lại bước tạo phôi, nuôi phôi, kiểm tra chuyển phôi diễn Thái Lan Với đối tác uy tín Bệnh viện BNH (Bangkok IVF Center), Bệnh viện Samitivej, Bệnh viện Phyathai2, , Hồng Ngọc mang tới niềm hạnh phúc làm cha, làm mẹ cho nhiều cặp vợ chồng sau nhiều năm chờ đón Phương pháp thụ tinh ống nghiệm đại Micro Array, kiểm tra tới 23 cặp nhiễm sắc thể, giúp lựa loại bỏ tới 200 bệnh, di tật di truyền, phương pháp điều trị thành công cho hàng trăm trường hợp Tỷ lệ thành công phương pháp lên đến 90%, cao gấp 3-4 lần so với kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm thơng thường Có kết thành công cao trước chuyển, bác sỹ kiểm tra tất cặp nhiễm sắc thể (23 cặp) loại bỏ phôi thai chất lượng kém, dị tật có nhiễm thể bất thường Hiện nay, bệnh viện Phyathai2 bệnh viện Thái Lan có đủ điều kiện kỹ thuật, vật chất để triển khai công nghệ 1.4.3 Ưu điểm kỹ thuật PGD/Microarray Nếu PGD giúp đánh giá cặp nhiễm sắc thể 13,18,21,22 23 kỹ thuật Microarray cho phép rà sốt xác định bất thường tất 23 cặp nhiễm sắc thể tế bào nhất, bao gồm nhiễm sắc thể giới tính X, Y Các nghiên cứu khoa học ứng dụng thực tiễn chứng minh, kỹ thuật PGD/Microarray có khả kiểm tra số lượng lớn rối loạn gen như: Hội chứng Down, bệnh Huntington, bệnh teo Duchenne, hội chứng Fragie X, máu khó đơng, xơ nang, thiếu máu hồng cầu hình liềm, thần kinh chậm phát triển… 15 Ngoài ra, PGD/Microarray cho phép hạn chế nguy sẩy thai, giúp tăng tỷ lệ thành công cho kỹ thuật hỗ trợ sinh sản PGD/Microarray giải pháp giúp loại trừ tới 2000 dị tật bật sinh Các bất thường NST bệnh lý di truyền liên kết với NST giới tính sàng lọc quy trình PGD Cùng với phát triển kỹ thuật chọc hút phôi ứng dụng tiến sinh học phân tử vào chẩn đoán, nhiều bệnh lý di truyền hầu hết bất thường nhiễm sắc thể, chí đột biến số gen quan trọng gây ung thư, sàng lọc thơng qua quy trình PGD , Trong nhóm bệnh lý di truyền liên kết với NST giới tính có tỷ lệ mắc cao với bệnh cảnh lâm sàng nặng nề, gây sang chấn lớn tâm lý cho gia đình cho người bệnh (thuyết minh chi tiết phần sau) Chính nhóm bệnh lý ưu tiên giải triệt để kỹ thuật di truyền đại PGD Trên giới, có ba bệnh lý di truyền liên kết với NST giới tính phổ biến sàng lọc quy trình PGD hội chứng Fragile-X, bệnh loạn dưỡng Duchenne Hemophilia A Tuy nhiên chế bệnh sinh biểu lâm sàng phức tạp, dễ nhầm lẫn với tình trạng rối loạn tinh thần khác trẻ nên hội chứng Fragile-X quan tâm, nghiên cứu Việt Nam Cho đến chưa có sở liệu toàn diện đột biến gen gây hội chứng Fragile-X trẻ số liệu người mang gen Trái lại, hai bệnh lý loạn dưỡng Duchenne Hemophilia A, có nghiên cứu xác định đột biến gen gây bệnh, sàng lọc người mang gen chẩn đoán trước sinh Việt Nam Việc quản lý tốt sở liệu đột biến gen, bệnh nhân người mang gen hai loại bệnh lý tiền đề vững để triển khai thành cơng quy trình PGD sàng lọc phơi Chính vậy, nghiên cứu này, chúng tơi thực quy trình PGD để sàng lọc phơi hai 16 bệnh lý di truyền liên kết với NST giới tính bất thường nhiễm sắc thể thường gặp nước ta bao gồm bệnh loạn dưỡng Duchenne Hemophilia A Sản phẩm nghiên cứu này giúp giảm bến chứng di chứng cho người mẹ mang thai bệnh lý, giảm chấm dứt thai kỳ phát bệnh thai nhi chẩn đoán tiền sản, mang lại hạnh phúc cho cặp vợ chồng mang gen bệnh, đồng thời giảm tỷ lệ mắc bệnh cộng đồng 2.1 - Bệnh loạn dưỡng Duchenne Bệnh loạn dưỡng Duchenne (Duchenne Muscular Dystrophy-DMD) bệnh lý di truyền thường gặp nhất, phát tất chủng tộc khác giới Tần suất bệnh vào khoảng 1/3500 trẻ trai Hầu hết trẻ trai mắc bệnh có dấu hiệu lâm sàng với triệu chứng yếu tiến triển dấu hiệu Gower điển hình, biểu khó lại, khó đứng lên ngồi xuống khó khăn leo cầu thang Trong giai đoạn nặng, bệnh nhân trở nên tàn phế, khả lại vào lứa tuổi 12 tử vong 20 tuổi tổn thương tim rối loạn hơ hấp Chẩn đốn bệnh chủ yếu dựa vào đặc điểm lâm sàng phương pháp định lượng hoạt độ creatine kinase (CK) toàn phần miễn dịch huỳnh quang bên cạnh phương pháp khác thăm dò điện sinh lý cơ, sinh thiết Ở bệnh nhân DMD, hoạt độ CK huyết thường tăng cao trước có dấu hiệu lâm sàng, chí tăng từ thời kỳ sơ sinh, khoảng từ 10000 đến 35000 UI/L (bình thường G Trong mẹ người mang gen, phơi bào bình thường phơi bào mang đột biến Trong số dạng đột biến gen Dystrophin, đột biến xóa đoạn gen dạng thường gặp bệnh nhân DMD, chiếm khoảng 60-65% dạng đột biến gây bệnh DMD Những đột biến xóa đoạn làm lệch khung dịch mã mRNA chiếm tỷ lệ đến 90% tạo protein dystrophin khơng có chức gây nên bệnh cảnh lâm sàng nặng DMD (69) Đột biến xóa đoạn gen dystrophin tập trung chủ yếu hai vùng “hotspot” - vùng trung tâm đầu tận 5’ gen dystrophin Đột biến điểm đứng thứ hai mức độ thường gặp, chiếm 25-30% Hầu hết đột biến điểm DMD tạo mã kết thúc sớm gây thể bệnh nặng Đột biến điểm nằm rải rác khắp chiều dài gen tạo trở 18 ngại lớn việc xác định đột biến Theo thống kê có khoảng 200 đột biến điểm gen Dystrophin xác định Đột biến lặp đoạn, thêm đoạn nguyên nhân gây nên bệnh DMD hầu hết trường hợp lại Prior (2005) cho 80% đột biến lặp đoạn xảy đầu tận 5’ 20% vùng trung tâm Việc áp dụng kỹ thuật PGD vào sàng lọc bệnh Duchenne thực lần vào năm 1999 Mathew cộng Các tác giả sử dụng kỹ thuật multiplex-PCR để xác định vị trí đột biến gen Dystrophin đoạn trình tự DNA đặc hiệu nhiễm sắc thể Y để xác định giới tính phơi Kể từ có nhiều phương pháp khác áp dụng vào chẩn đoán sàng lọc Duchenne Microsatellite DNA (Hình 6), kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ, FISH (Hình 7) nhiều báo cáo lâm sàng tỷ lệ thành công phương pháp Cho đến việc sàng lọc Duchenne trở thành thường quy trung tâm IVF chẩn đốn PGD tồn giới Nguồn: Malmgren et al Mol Hum Reprod, 2006, 12 (5), 353-356 Hình 4: Chẩn đốn sàng lọc Duchenne trước chuyển phôi kỹ thuật FISH 19 Đây trường hợp chẩn đốn đột biến xóa đoạn gen Dystrophin Các đoạn DNA có trình tự đặc hiệu với vùng trung tâm NST (màu cam) để xác định số lượng NST exon 45 (màu xanh cây) để xác định đột biến sử dụng Hình ảnh cho thấy có đột biến xóa đoạn exon 45 gen Dystrophin 2.2 - Bệnh Hemophillia A Bệnh Hemophilia (còn gọi bệnh ưa chảy máu) bệnh di truyền thiếu hụt bất thường chức yếu tố đông máu: yếu tố VIII gây nên bệnh Hemophilia A, yếu tố IX gây nên bệnh Hemophilia B, yếu tố XI gây nên bệnh Hemophilia C Hemophilia A bệnh rối loạn đông máu di truyền hay gặp Theo thống kê tổ chức Hemophilia A giới, có khoảng 250.000 bệnh nhân mắc bệnh Hemophilia A có khoảng 50.000 điều trị đặc hiệu Triệu chứng đặc trưng bệnh Hemophilia A bệnh nhân bị chảy máu nơi thể chảy máu kéo dài bao gồm: chảy máu khớp, chảy máu cơ, chảy máu não, chảy máu cổ ngực… Mức độ biểu bệnh lâm sàng liên quan trực tiếp đến nồng độ yếu tố VIII huyết tương Hemophilia A thể nhẹ nồng độ yếu tố VIII huyết tương khoảng từ 6-30% so với người bình thường, thể chảy máu thường xảy sau chấn thương sau phẫu thuật Thể trung bình nồng độ yếu tố VIII huyết tương từ 1-5% Và thể bệnh nặng nồng độ yếu tố VIII huyết tương 1% Việc điều trị Hemophilia A bao gồm nguyên tắc sau: điều trị chảy máu, điều trị dự phòng phục hồi chức năng, việc sử dụng chế phẩm thay đóng vai trị chủ chốt Hemophilia A bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể giới tính X, gây nên đột biến gen FVIII Cấu trúc gen gen F8 chế bệnh học phân tử nghiên cứu đầy đủ rõ ràng Gen FVIII gen lớn thể, có kích thước 186 kb gồm 20 26 exon 24 exon có kích thước từ 62 - 262 bp exon lớn exon 14 (3106 bp) exon 26 (1958 bp) Gen FVIII mã hóa cho protein yếu tố VIII gồm 2332 acid amin có trọng lượng phân tử khoảng 300 kD Gồm chuỗi nặng có kích thước 200 kD phức hợp ion kim loại với chuỗi nhẹ có kích thước 80 kD Khi gen FVIII bị đột biến, tế bào giảm khả tổng hợp yếu tố VIII gây nên bệnh Hemophilia A Có nhiều dạng đột biến gen gây bệnh Hemophilia A phổ biến đột biến điểm đảo đoạn tùy thuộc vào kiểu vị trí đột biến gen F8 mà gây thể bệnh nặng nhẹ khác Ứng dụng chẩn đoán PGD việc sàng lọc Hemophillia thường định cho thể bệnh hay gặp Hemophillia A Sự kết hợp xác định đột biến gen F8 xác định giới tính phôi thực từ phôi bào sinh thiết Các kỹ thuật sử dụng cho chẩn đoán PGD sàng lọc Hemophillia A bao gồm: multiplex-PCR, Flourescent-PCR kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ, FISH Ứng dụng lâm sàng trung tâm IVF chẩn đoán PGD góp phần khơng nhỏ việc giảm tỷ lệ mắc bệnh Hemophillia A cộng đồng, 2.3 Bất thường cấu trúc số lượng nhiễm sắc thể Xác định bất thường nhiễm sắc thể định phổ biến PGD trung tâm IVF giới nhằm tăng tỷ lệ thành công phương pháp Một báo cáo tổng quan phân tích di truyền sẩy thai tự nhiên cho thấy từ 50-90% thai sẩy bất thường nhiễm sắc thể Trong bất thường số lượng nhiễm sắc thể, bất thường nhiễm sắc thể 13, 14, 15, 16, 21 22 nguyên nhân thường gặp sẩy thai Vấn đề đặt loại phơi lệch bội hay có bất thường nhiễm sắc thể trước cấy vào buồng tử cung Tầm sốt phơi bất thường số lượng nhiễm sắc thể PGD trước chuyển vào buồng tử cung giúp làm tăng tỷ lệ làm tổ 21 phôi, giảm số phôi chuyển vào buồng tử cung, giảm tình trạng đa thai, giảm sẩy thai giảm tỷ lệ bỏ thai phát bất thường thai chẩn đốn tiền sản thơng thường Một tỷ lệ lớn phơi IVF có bất thường số lượng nhiễm sắc thể Khơng có tương quan hình thái học phơi bất thường di truyền phơi Phơi có hình dạng bình thường vẫ có bất thường di truyền ngừng phát triển giai đoạn phát triển phơi, thai Do nhiều tác giả cho việc dựa vào tiêu chuẩn hình thái để chọn lựa phơi cấy vào buồng tử cung không hiệu cần phải thay đổi Chỉ định tầm soát bất thường số lượng nhiễm sắc thể phôi IVF trước cấy vào buồng tử cung gọi tầm soát di truyền tiền làm tổ (PGSPreinplantation Genetic Screening) Dựa chứng cho thấy bệnh nhân muộn có tỷ lệ phôi bất thường nhiễm sắc thể cao, PGS áp dụng nhiều trung tâm IVF giới Hiện nay, PGS mở rộng định thường quy cho số trường hợp làm IVF có tiên lượng như: phụ nữ lớn tuổi (tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể cao) tiền sẩy thai liên tiếp, thất bại làm IVF nhiều lần PGD sử dụng kỹ thuật FISH dùng để chẩn đoán chuyển đoạn nhiễm sắc thể Các trường hợp sẩy thai liên tiếp có chuyển đoạn nhiễm sắc thể định PGD (Hình 8) Thống kê cho thấy có đến 4,7% trường hợp sẩy thai liên tiếp bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể Theo thống kê chuyển đoạn nhiễm sắc thể tương hỗ xảy với tần suất cao vào khoảng 500 trẻ sinh sống Bất thường di truyền từ cha mẹ hay xảy độc lập trình hình thành phát triển phơi thai Chuyển đoạn nhiễm sắc thể chẩn đốn cặp vợ chồng thực thụ tinh ống nghiệm có bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể hay phát có chuyển đoạn nhiễm sắc thể Một gợi 22 ý cho việc phát chuyển đoạn nhiễm sắc thể cặp vợ chồng bị xảy thay nhiều lần trước mà khơng rõ nguyên nhân Việc áp dụng kỹ thuật PGD vào sàng lọc bất thường nhiễm sắc thể trước chuyển phôi giúp cặp vợ chồng sinh đứa khỏe mạnh gia tăng tỷ lệ thụ thai Nguồn: Geraedts et al Clin Genet, 2009, 76, 315–325 Hình 5: Chẩn đốn sàng lọc bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể trước chuyển phôi kỹ thuật FISH Đây trường hợp bệnh nhân nữ có chuyển đoạn NST NST số 10 14 đoạn q26.3 q32.1 (46,XX,t(10;14)(q26.3;q32.1) Hình ảnh nhuộm (e) metaphase (f) interphase 23 KẾT LUẬN Quy trình chẩn đốn PGD phức tạp, cần phối hợp đội ngũ chuyên gia IVF chuyên gia chuyên sâu lĩnh vực chẩn đoán bệnh lý di truyền sử dụng kỹ thuật Y sinh học phân tử Tuy nhiên, việc sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để chẩn đoán lại tùy thuộc vào đặc điểm tổn thương gen/nhiễm sắc thể bệnh nhân trường hợp bệnh lý di truyền cụ thể Thêm vào việc triển khai kỹ thuật PGD cần quan tâm tuân thủ chặt chẽ quy định đạo đức nghiên cứu y sinh pháp luật để tránh lạm dụng chẩn đoán sàng lọc giới Hiện tỷ lệ vô sinh Việt Nam nước giới gia tăng với phát triển kinh tế xã hội Sự gia tăng độ tuổi sinh lần đầu phụ nữ, gia tăng tiếp xúc với hóa chất độc hại nạn nhiễm mơi trường việc sử dụng tràn lan chất bảo quản thực phẩm dẫn đến nguy cao trứng thụ tinh mang bất thường di truyền làm ảnh hưởng đến trình mang thai, sinh sống phát triển đứa trẻ sau Đối tượng có nguy cao có định làm PGD ngày gia tăng Những đứa trẻ khỏe mạnh đời không mong muốn cặp vợ chồng mà mong muốn toàn thể bác sỹ nhân viên làm việc ngành Y tế 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO W N Zheng Ying-ming, Li Lei, Jin Fan (2011) Whole genome amplification in preimplantation genetic diagnosis Zheng et al J Zhejiang Univ-Sci B (Biomed & Biotechnol), 12 , 1-11, K S Thornhil A R (2002,) Molecular diagnostics in Preimplantation Genetic diagnosis, Journal of molecular Diagnostics,, 4, (1), 11-29, F F Mullis K, Scharf S (1986) Speccific enzymatic amplification of DNA in vitro: thepolymerase chain reaction Cold spring Harb Symp Quant Biol, 51, 263-273 H A Hardy K (1992) Biopsy of cleavage stage human embryos and diagnosis of single gene defects by DNA amplification Arch Pathol Lab Med, 116, 388-392 G L Australian Genome Research Facility, University of Queensland, Queensland, Australia (2000) Pre-implantation genetic diagnosis British Medical Bulletin, 56 (3), 672-690 K T L Scriven Paul N, Ogilvie Caroline Mackie (2011,) FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis, Journal of Visualized Experiments,, 48,, 1-5, J H J Song Lee -Hyoung, Choi Hye Won , et al (2007 ) Preimplantation Genetic Diagnosis for Ornithine Transcarbamylase Deficiency by Simultaneous Analysis of Duplex-nested PCR and Fluorescence In Situ Hybridization J Korean Med Sci, 22, 572-576 W a D Munne Santiago, and Cohen Jacques (2010) Technology requirements for preimplantation genetic diagnosis to improve assisted reproduction outcomes Fertility and Sterilit,94 (2), 408-430 25 G D.K (1992) Dual fluorescent in situ hybridisation for simultaneous detection of X and Y chromosome-specific probes for the sexing of human preimplantation embryonic nuclei Human Genetic,89, 18–22 10 E T Colls P, Cekleniak N et al (2007) Increased efficiency of preimplantation genetic diagnosis for infertility using ‘‘no result rescue", Fertility and Sterility,88, 53–61 11 R M Y Miah Gous, Ismail Mohd R, et.al (2013) A Review of Microsatellite Markers and Their Applications in Rice Breeding Programs to Improve Blast Disease Resistance Int J Mol Sci 2013, 14, 22499-22528 12 N K D Ngô Thị Dung, Nguyễn Hoàng Thêm Phương pháp SSR 13 S R Pinkel D, Sudar D, Clark S, Poole I, Kowbel D, Collins C, Kuo W.L, Chen C, Zhai Y, Dairkee S.H, Ljung B.M Gray J.W (1998) High resolution analysis of DNA copy number variation using comparative genomic hybridization to microarrays Nat Genet, 20, 207-211 14 G W.W ((2003) Ethical Issues Raised by Genetic Testing with Oligonucleotide Microarrays Molecular Biotechnology, 23, 127-138 15 S C Lu X, Patel A, et al (2007) Clinical implementation of chromosomal microarray analysis: summary of 2513 postnatal cases PLoS One, 2, 16 A M Miller DT, Aradhya S (2010) Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies Am J Hum Genet, 86, 749–764 17 M B J Dreesen, C de Die-Smulders et al (1998) Preimplantation genetic diagnosis of spinal muscular atrophy Mol Hum Reprod, 4, 881– 885 26 18 Z S K Xu, L Veeck, M Hughes, Z Rosenwaks (1999) First unaffected pregnancy using preimplantation genetic diagnosis for sickle cell anemia JAMA, 281, 1701–1706 19 M M (2002) “Duchenne and Becker muscular dystrophy, from molecular diagnosis to gene therapy” IUBMB Life, 53, 147-152 20 S T (2002) Human Molecular Genetics Garland Science Publishing, 4th Edition., 21 C C Martin J.J., Lübke U., Van B.C (1993) “Duchenne muscular dystrophy immunohistochemistry of foetal muscles” Acta Neurol Belg, 93(3), 130-138 22 Y D (2002) “The Duchenne muscular dystrophy gene, Structure, evolution, expression and function of products” Mol Cell Bio, 324-326 23 Y M Takeshima Y, Okizuka Y, Awano H, Zhang Z, Yamauchi Y, Nishio H, Matsuo M (2010) Mutation spectrum of the dystrophin gene in 442 Duchenne/Becker muscular dystrophy cases from one Japanese referral center J Hum Genet, 55 (6), 379-388 24 D H Hussey ND, Froiland DA, Hussey DJ, Haan EA, Matthews CD, Craig JE (1999 ) Analysis of five Duchenne muscular dystrophy exons and gender determination using conventional duplex polymerase chain reaction on single cells Mol Hum Reprod, (11), 1089-1094 25 W I Malmgren H, Johansson S, Levkov L, Iwarsson E, Fridström M, Blennow E (2006) PGD for dystrophin gene deletions using fluorescence in situ hybridization Mol Hum Reprod, 12 (5), 353-356 26 K A van Essen AJ, van der Hout AH, Scheffer H, Ginjaar IB, ten Kate LP, van Ommen GJ, Buys CH, Bakker E (1997) The clinical and molecular genetic approach to Duchenne and Becker muscular dystrophy: an updated protocol J Med Genet, 34 (10), 805-812 27 27 J Oldenburg, Ananyeva, N M & Saenko, E L (2004) “Molecular basis of haemophilia A” Haemophilia, 10, 133–139 28 P I Goodeve AC (2003) “The molecular basis of hemophilia A: genotype-phenotype relationships and inhibitor development” Semin Thromb Hemost, 29, 23-30 29 B H Graw J, Oldenburg J, Schneppenheim R, Spannagl M, Schwaab R (2005) “Haemophilia A: from mutation analysis to new therapies” Nat Rev Genet, (6), 488-501 30 P T Kuliev A, Verlinsky O, Rechitsky S ( 2011) Preimplantation genetic diagnosis for hemoglobinopathies Hemoglobin, 35, 547-555 31 L S (2004) Preimplantation genetic diagnosis, new reproductive options for carriers of haemophilia Haemophilia,, 10, 126-132 32 J C S Evsikov, Y Verlinsky (2000) Effect of chromosomal translocations on the development of preimplantation human embryos in vitro Fertil Steril,, 74, 672–677 33 S Munne, Marquez, C., Magli, C., Morton, P & Morrison, L (1998) Scoring criteria for preimplantation genetic diagnosis of numerical abnormalities for chromosomes X, Y, 13, 16, 18 and 21 Mol Hum Reprod., 4, 863–870 34 M S (2001) Preimplantation genetic diagnosis of structural abnormalities Mol Cell Endocrinol, 183, 55–58 ... TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BÙI THỊ MINH PHƯỢNG MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC TRONG CHẨN ĐOÁN TIỀN LÀM TỔ Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Huy Thịnh Cho đề tài: Chẩn đoán trước làm tổ số bệnh lý di... thai, tăng tỷ lệ thai làm tổ tỷ lệ sinh sống chuyển phôi sàng lọc phương pháp * Nhược điểm - Đầu dò FISH đắt chi phí làm tốn - Mặc dù phương pháp FISH cải tiến góp phần làm tăng hiệu điều trị... nhiễm sắc số 1, thêm đoạn nhánh dài nhiễm sắc thể số có giá trị có giá trị phân loại tiên lượng điều trị 8 + FISH ứng dụng chẩn đoán tiền làm tổ PGD sử dụng kỹ thuật FISH dùng để chẩn đoán chuyển