Nghiên cứu sử dụng nano bạc trong nhân giống in vitro lan Hồ điệp vàng (Phalaenopsis sp.)

Trong nghiên cứu này, nano bạc (NS) được sử dụng làm chất khử trùng mẫu phát hoa lan Hồ điệp vàng, đồng thời NS được bổ sung vào môi trường nuôi cấy in vitro.

Công nghệ sinh học & Giống trồng NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG NANO BẠC TRONG NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN HỒ ĐIỆP VÀNG (Phalaenopsis sp.) Đồng Huy Giới1, Bùi Thị Thu Hương2 1,2 Học viện Nơng nghiệp Việt Nam TĨM TẮT Trong nghiên cứu này, nano bạc (NS) sử dụng làm chất khử trùng mẫu phát hoa lan Hồ điệp vàng, đồng thời NS bổ sung vào môi trường nuôi cấy in vitro Kết xác định được: (i) Nồng độ dung dịch nano bạc thích hợp cho việc khử trùng mẫu phát hoa lan Hồ điệp vàng 125 ppm, thời gian xử lí 45 phút, tỉ lệ mẫu sống thu 72,13%; (ii) 27,56% mẫu in vitro lan Hồ điệp vàng tạo PLB (protocorm-like body) mơi trường có bổ sung ppm NS; (iii) Bổ sung ppm NS vào môi trường tạo chồi lan Hồ điệp vàng từ PLB cho hiệu tạo chồi tốt với tỉ lệ tạo chồi đạt 92,53%, hệ số nhân chồi 2,97 lần chiều cao chồi trung bình đạt 0,87 cm; (iv) Mơi trường có bổ sung - ppm NS thích hợp để nhân nhanh chồi lan Hồ điệp vàng từ chồi in vitro với tỉ lệ mẫu tạo chồi đạt từ 60,00 - 63,33%, hệ số nhân chồi đạt từ 2,33 - 2,37 lần Từ khóa: Lan Hồ điệp, nano bạc, phát hoa, PLB ĐẶT VẤN ĐỀ Lan Hồ điệp (Phalaenopsis sp.) giống hoa lan yêu thích giới (Griesbach, R J., 2002) Với màu sắc đa dạng, kiểu dáng sang trọng tao nhã làm cho nhu cầu chơi lan Hồ điệp ngày lớn trở thành trồng đem lại hiệu kinh tế cao Tuy nhiên, lan Hồ điệp loài sinh trưởng chậm khó nhân giống, thường cho hệ số nhân giống thấp điều kiện vườn ươm môi trường tự nhiên Biện pháp nhân giống lan Hồ điệp phổ biến nuôi cấy in vitro từ mầm ngủ phát hoa, phương pháp có ưu điểm không làm tổn thương mẹ, so với việc nhân giống từ đỉnh sinh trưởng Hơn nữa, việc nhân giống in vitro từ mầm ngủ phát hoa tạo bệnh đồng di truyền, điều mà phương pháp gieo hạt truyền thống đạt (Nguyễn Thị Pha cộng sự, 2011) Tuy nhiên, tình hình sản xuất giống lan Hồ điệp nước ta chưa đáp ứng nhu cầu ngày tăng thị trường Ngun nhân phịng ni cấy mơ thường chủ yếu tập trung vào việc lưu giữ nguồn giống lan mà khơng sản xuất giống đại trà, hầu hết sở sản xuất hoa lan nước nhập từ số nước Đài Loan, Trung Quốc, Thái Lan Bên cạnh đó, vấn đề ln gặp phải q trình ni cấy mô nhiễm nấm vi khuẩn mẫu cấy, gây ảnh hưởng lớn tới hiệu nuôi cấy chất lượng con, việc sử dụng hóa chất khử trùng HgCl2, Ca(ClO)2 gây nhiễm môi trường, gây độc hại cho người sinh vật khác (Kharrazi cộng sự, 2011) Hiện nay, công nghệ nano lĩnh vực mang lại nhiều hứa hẹn với ứng dụng to lớn nhiều lĩnh vực khác Chế phẩm nano sử dụng có hiệu khử trùng mẫu ni cấy mơ tế bào thực vật, bên cạnh nano bạc cịn có tác dụng tích cực tới phát sinh hình thái in vitro (Rostami A.A Shahsavar A., 2009; Shokri cộng sự, 2015; Đồng Huy Giới Ngơ Thị Ánh, 2017) Chính vậy, nghiên cứu nhằm bước đầu sử dụng nano bạc để nâng hiệu nuôi cấy mô lan Hồ điệp PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, hóa chất Mẫu giống lan Hồ điệp vàng nhập từ Đài Loan; dung dịch nano bạc với kích thước hạt dao động 15 - 20 nm điều chế Bộ môn Sinh học, khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp khử trùng mẫu Phát hoa lan Hồ điệp vàng sau thu rửa vòi nước, sau cắt thành TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2019 19 Cơng nghệ sinh học & Giống trồng đoạn có chứa mắt ngủ Rửa lại mẫu nước cất đưa mẫu vào box cấy vô trùng, tiến hành lắc mẫu cồn 70o phút, sau lắc mẫu với dung dịch nano bạc với nồng độ khác (75 ppm, 100 ppm, 125 ppm, 150 ppm) thời gian 45 phút NaOCl 5% 15 phút (đối chứng) Rửa lại mẫu nước cất vô trùng (2 - lần), thấm khô mẫu giấy thấm vô trùng cấy vào môi trường MS + mg/l BA + g/l agar Sau tuần nuôi cấy, theo dõi tiêu tỉ lệ mẫu sống tỉ lệ mẫu sống Sử dụng nồng độ nano bạc đạt hiệu khử trùng tốt để đánh giá ảnh hưởng thời gian xử lý đến khả khử trùng mẫu 2.2.2 Phương pháp bổ sung dung dịch nano bạc vào môi trường nuôi cấy Tạo PLB từ mẫu in vitro: Mẫu in vitro lan Hồ điệp vàng nuôi cấy môi trường MS + 10% nước dừa + 2,0 mg/l BA + g/l agar (Nguyễn Thị Sơn cộng sự, 2014) có bổ sung nano bạc với nồng độ từ đến ppm Tiến hành theo dõi tiêu tỉ lệ mẫu không bị nhiễm, tỉ lệ mẫu tạo PLB sau tuần nuôi cấy Tạo chồi từ PLB: Các PLB nuôi cấy môi trường MS + 10% nước dừa + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l α-NAA + g/l agar (Nguyễn Thị Sơn cộng sự, 2014) có bổ sung nano bạc với nồng độ từ dến ppm Đánh giá khả tạo chồi từ PLB sau tuần nuôi cấy Nhân nhanh chồi từ chồi in vitro: Các chồi in vitro nuôi cấy môi trường MS + 10% nước dừa + mg/l BA (Nguyễn Thị Sơn cộng sự, 2014) có bổ sung nano bạc với nồng độ từ đến ppm Sau tuần nuôi cấy, theo dõi tiêu tỉ lệ mẫu tạo chồi, hệ số nhân chồi, số lá/chồi, chiều cao chồi 2.2.3 Phương pháp bố trí xử lý số liệu Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, công thức lần nhắc lại, lần nhắc lại 20 mẫu/công thức; môi trường nuôi cấy điều chỉnh giá trị pH từ 5,7 – 5,8 hấp khử trùng 1210C, áp suất 1,1 atm 20 phút; thí nghiệm ni cấy điều kiện ánh sáng 2000 lux, nhiệt độ 260C ± 2, thời gian chiếu sáng 16/24h Số liệu thu thí nghiệm xử lý chương trình Excel 2010 phần mềm thống kê IRRISTAT 5.0 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá khả khử trùng mẫu phát hoa lan Hồ điệp dung dịch nano bạc Theo kết nghiên cứu Nasser Mahna et al (2013) sử dụng nano bạc để khử trùng mẫu khoai tây, nồng độ 100 ppm nano bạc cho tỉ lệ mẫu sống, bệnh 100% Vì vậy, thí nghiệm chúng tơi sử dụng nồng độ nano bạc 75 ppm, 100 ppm, 125 ppm 150 ppm để khử trùng mẫu phát hoa lan Hồ điệp vàng Kết sau tuần ni cấy thể bảng hình Bảng Hiệu khử trùng mẫu phát hoa lan Hồ điệp vàng nồng độ nano bạc khác Nồng độ NS Tỉ lệ mẫu sống Tỉ lệ mẫu sống Công thức (ppm) (%) (%) b CT1 NaOCl 5% 64,44 56,11a cd CT2 75 71,53 60,56b cd CT3 100 72,22 66,67c CT4 125 74,44d 72,22d a CT5 150 61,11 60,13b LSD0.05 3,13 3,84 CV% 2,40 3,10 Ghi chú: Trong cột, giá trị mang chữ khác khác có ý nghĩa mức α = 0,05 Từ kết thu bảng cho thấy, tất công thức sử dụng nano bạc có tỉ lệ mẫu sống lớn so với công thức đối chứng (sử dụng NaOCl 5%) Trong công 20 thức sử dụng nano bạc, cơng thức xử lí 125 ppm cho tỉ lệ mẫu sống tỉ lệ mẫu sống đạt cao (tương ứng 74,44% 72,22%), cao có ý nghĩa thống kê so với cơng TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2019 Công nghệ sinh học & Giống trồng thức cịn lại; cơng thức có tỉ lệ mẫu sống mẫu sống thấp công thức 150 ppm (tương ứng 61,11% 60,13%) Sở dĩ có kết nồng độ nano bạc cao ảnh hưởng tới khả tái sinh mẫu nuôi cấy, kết phù hợp với công bố Rostami A A Shahsavar (2009) sử dụng nano bạc để khử trùng mẫu cành Ơ liu Bên cạnh đó, Nguyễn Quỳnh NaOCl 5% NS 75 ppm Trang cộng (2013) sử dụng HgCl2 0,1% NaOCl 5% để khử trùng mẫu lan Hồ điệp tím, kết thu tỉ lệ mẫu sống cao 60% sử dụng NaOCl 5% thời gian 15 phút Từ kết nghiên cứu nhận thấy, sử dụng nano bạc nồng độ 125 ppm để khử trùng mẫu phát hoa lan Hồ điệp cho hiệu khử trùng cao so với sử dụng HgCl2 NaOCl NS 100 ppm NS 125 ppm NS 150 ppm Hình Mẫu phát hoa lan Hồ điệp vàng khử trùng nồng độ nano bạc khác sau tuần nuôi cấy Từ kết thu được, lựa chọn nồng độ nano bạc 125 ppm để xử lí phát hoa Hồ điệp mốc thời gian khác (15 phút, 30 phút, 45 phút 60 phút) nhằm tìm thời gian xử lí phù hợp Kết thu bảng Bảng Hiệu khử trùng mẫu phát hoa lan Hồ điệp vàng nano bạc thời gian Thời gian xử lí Tỉ lệ mẫu sống Tỉ lệ mẫu sống Công thức (phút) (%) (%) a CT1 15 72,22 46,67a CT2 30 75,56a 51,11b a CT3 45 74,90 72,13d CT4 60 74,11a 72,56d LSD0.05 2,50 6,42 CV% 2,32 6,13 Ghi chú: Trong cột, giá trị mang chữ khác khác có ý nghĩa mức α = 0,05 Từ kết bảng cho thấy, khơng có sai khác tỉ lệ mẫu sống công thức thí nghiệm, nhiên lại có khác biệt rõ rệt tỉ lệ mẫu sống công thức Cụ thể, xử lý nano bạc 125 ppm với thời gian 15 phút thu tỉ lệ mẫu sống 46,67%, tăng thời gian xử lý lên 30 phút, tỉ lệ mẫu sống thu 51,11%, cơng thức xử lí 45 phút 60 phút cho tỉ lệ mẫu sống đạt 72,13% 72,56%, cao nhiều so với cơng thức cịn lại khơng có khác biệt tỉ lệ sống công thức độ tin cậy 95% Từ kết thu thấy, cơng thức xử lí mẫu phát hoa Hồ điệp vàng phù hợp nao bạc 125 ppm với thời gian 45 phút 3.2 Ảnh hưởng nano bạc tới trình phát sinh hình thái lan Hồ điệp vàng 3.2.1 Ảnh hưởng nano bạc tới khả tạo PLB mẫu lan Hồ điệp vàng in vitro Trong thí nghiệm này, mẫu in vitro lan Hồ điệp vàng sử dụng làm vật liệu để tạo PLB, môi trường nuôi cấy bổ sung nano bạc với nồng độ ppm, ppm, ppm ppm (dựa kết Nabeel K.Al-Ani làm thí nghiệm máu) Kết thu trình bày bảng Từ kết bảng cho thấy, nano bạc có ảnh hưởng tích cực đến TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2019 21 Công nghệ sinh học & Giống trồng hình thành PLB từ mẫu in vitro lan Hồ điệp vàng, bổ sung NS nồng độ từ - ppm làm tăng tỉ lệ mẫu tạo PLB, tiếp tục tăng nồng độ NS lên ppm ppm lại có xu hướng ức chế hình thành PLB từ mẫu in vitro Điều nồng độ cao NS tác động tiêu cực lên màng tế bào mẫu in vitro (Rostami A A Shahsava A., 2009) Ở CT3 (4 ppm) cho tỉ lệ tạo PLB cao (27,56%), khác biệt có ý nghĩa thống kê so với cơng thức cịn lại Bảng Ảnh hưởng nồng độ nano bạc tới khả tạo PLB từ mẫu lan Hồ điệp vàng Công thức Nồng độ NS (ppm) Tỉ lệ tạo PLB (%) CT1 20,00a CT2 24,44c CT3 27,56d CT4 22,22b CT5 21,92b LSD0.05 1,00 CV% 3,13 Ghi chú: Trong cột, giá trị mang chữ khác khác có ý nghĩa mức α = 0,05 3.2.2 Ảnh hưởng nano bạc đến hình thành chồi từ PLB Sau tạo PLB từ mẫu in vitro, Công thức PLB tách rời cấy vào mơi trường tạo chồi Kết trình bày bảng hình Bảng Ảnh hưởng nano bạc đến khả tạo chồi từ PLB Chiều cao TB Nồng độ Tỉ lệ tạo chồi Hệ số nhân chồi (cm) (ppm) (%) (lần) 0,53a 70,00a 1,70a 0,67b 86,35b 2,56b 0,87c 92,53c 2,97c 0,71b 86,67b 2,45b 0,68b 83,31b 2,41b CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 0,09 LSD0.05 4,7 0,13 0,7 CV% 3,00 0,11 Ghi chú: Trong cột, giá trị mang chữ khác khác có ý nghĩa mức α = 0,05 Từ kết bảng cho thấy, nano bạc có ảnh hưởng tích cực đến việc tạo chồi từ PLB lan Hồ điệp vàng Trong công thức bổ sung NS, công thức bổ sung ppm cho tỉ lệ tạo chồi thấp (83,31%), nhiên cao so với công thức đối chứng không bổ sung NS (70,00%) Công thức bổ sung ppm NS cho hiệu tạo chồi tốt nhất, tỉ lệ tạo chồi đạt 92,53%, hệ số nhân chồi 2,97 lần chiều cao chồi trung bình đạt 0,87 cm, cao có ý nghĩa thống kê so với tất cơng thức cịn lại ppm NS ppm NS ppm NS ppm NS ppm NS Hình Hình ảnh chồi lan Hồ điệp vàng hình thành từ PLB sau tuần ni cấy 22 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2019 Công nghệ sinh học & Giống trồng 3.2.3 Ảnh hưởng nano bạc đến trình nhân chồi từ chồi in vitro Từ kết thu bảng cho thấy, tiêu tỉ lệ bật chồi hệ số nhân chồi, tất công thức bổ sung NS cho kết cao mức có ý nghĩa thống kê so với công thức đối chứng không bổ sung NS Ở tiêu tỉ lệ bật chồi, công thức bổ sung ppm, ppm, ppm cho kết tương tự tốt so với cơng thức cịn lại; tiêu hệ số nhân chồi, khơng có khác biệt công thức bổ sung NS, nhiên qua quan sát nhận thấy chất lượng chồi công thức bổ sung ppm NS tốt nhất; tiêu chiều cao chồi, công thức bổ sung ppm ppm cho chiều cao chồi tốt nhất, tốt có ý nghĩa thống kê so với cơng thức cịn lại Như sơ kết luận, nồng độ NS bổ sung vào môi trường nhân nhanh chồi in vitro lan Hồ điệp vàng thích hợp từ - ppm Bảng Ảnh hưởng nano bạc đến khả nhân chồi từ chồi in vitro Nồng độ NS Tỉ lệ bật chồi Hệ số nhân Chiều cao (ppm) (%) chồi (lần) chồi (cm) CT1 51,67a 1,87a 1,23a b b CT2 60,00 2,33 1,37b CT3 63,33b 2,37b 1,39b b b CT4 61,67 2,33 1,33ab CT5 56,67ab 2,30b 1,25a LSD0.05 6,20 0,08 0,09 CV% 4,90 0,11 0,38 Ghi chú: Trong cột, giá trị mang chữ khác khác có ý nghĩa mức α = 0,05 ppm NS ppm NS ppm NS ppm NS ppm NS Hình Hình ảnh chồi lan Hồ điệp vàng hình thành từ chồi in vitro sau tuần nuôi cấy KẾT LUẬN Nồng độ NS thích hợp cho việc khử trùng mẫu phát hoa lan Hồ điệp vàng 125 ppm, thời gian xử lí 45 phút, tỉ lệ mẫu sống thu 72,13% Bổ sung ppm NS vào môi trường tạo PLB từ mẫu in vitro lan Hồ điệp vàng cho tỉ lệ tạo PLB cao (27,56%) Bổ sung ppm NS vào môi trường tạo chồi lan Hồ điệp vàng cho hiệu tạo chồi tốt với tỉ lệ tạo chồi đạt 92,53%, hệ số nhân chồi 2,97 lần chiều cao chồi trung bình đạt 0,87 cm Bổ sung - ppm NS vào môi trường nhân nhanh chồi lan Hồ điệp vàng từ chồi in vitro cho hệ số nhân chồi tốt với tỉ lệ tạo chồi đạt từ 60,00 - 63,33%, hệ số nhân chồi đạt từ 2,33 - 2,37 lần TÀI LIỆU THAM KHẢO Đồng Huy Giới, Ngô Thị Ánh (2017) Nghiên cứu sử dụng chế phẩm nano ni cấy mơ mía (Saccharum offcinarum L.) Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 6: 35-41 Griesbach, R J (2002) Development of Phalaenopsis orchids for the Mass-Market Trends in new crops and new uses: 458-463 Kharrazi M., Nemati H., Tehranifar A., Bagheri A and Sharifi A (2011) In Vitro Culture of Carnation (Dianthus caryophyllus L.) Focusing on the Problem of Vitrification J Biol Environ Sci, Vol 13:1-6 K.Al-Ani (2011) Using Silver Nano Particles to Increase Efficiency Of Sterile Solution for in vitro Techniques Iraqi Journal of Cancer and Medical Genetics, Vol 4, No 1: 48- 51 Nasser M., Z V Sepideh and K Sajjad (2013) TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2019 23 Công nghệ sinh học & Giống trồng Plant In vitro Culture goes Nano: Nanosilver-Mediated Decontamination of Ex vitro Explants Journal of Nanomedicine & Nanotechnology, Vol 4, No 2: 1-4 Nguyễn Quỳnh Trang, Vũ Thị Huệ, Khuất Thị Hải Ninh, Nguyễn Thị Thơ (2013) Nhân giống in vitro lan Hồ điệp tím (Dendrobium anosmum) Tạp chí Khoa học Công nghệ Lâm nghiệp, số 3, kỳ 1: 16- 21 Nguyễn Thị Pha, Trần Thị Xuân Mai, Lê Thị Mai Trang, Nguyễn Thị Liên (2011) Nuôi cấy mầm ngủ phát hoa lan Hồ điệp (phalaenopsis sp.) Tạp chí Khoa học, tập 20b: 12-20 Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Hoàng Thị Nga, Hồng Thị Ánh Nguyệt (2014) Nhân dịng vơ tính lan Hồ điệp Phalaenopsis sogo Yukidian Tạp chí Khoa học Phát triển, tập 12, số 8: 1283-1293 Rostami A.A and A Shahsavar (2009) NanoSilver Particles Eliminate the in vitro contaminations of Olive ‘Mission’ Explants Journal of Plant Sciences, Vol 8, No 7: 505-509 10 Shokri S., A Babaei, M Ahmadian, M.M Arab, S Hessami (2015) The effects of different concentrations of nano silver on elimination of bacterial contaminations and phenolic exudation of rose (Rosa hybrida L.) in vitro culture International Society for Horticultural Science,Vol 3, No.1: 50-54 STUDY ON USE OF SILVER NANOPARTICLES IN PHALAENOPSIS ORCHID (Phalaenopsis Sp.) TISSUE CULTURE Dong Huy Gioi1, Bui Thi Thu Huong2 1,2 Vietnam National University of Agriculture SUMMARY In this study, silver nanoparticles (NS) were not only used for sterilization of flower stalks of phalaenopsis orchid, but olso added to the in vitro culture medium The results identified that: (i) 125 ppm of silvernano solution was the best treatment in 45 minutes for sterilization the flower stalks of phalaenopsis orchid explants that made 72.13% samples clean and survival; (ii) 27.56% of in vitro leaf piece of phalaenopsis orchid explants formed protocorm-like body on the medium supplemented with ppm silvernano; (iii) The optimal medium for formation of shoots from the PLB of phalaenopsis orchid was culture medium containing ppm of silvernano, the rate of shoot formation was 92.53%, shoot of the coefficient was 2.97 times and shoot height was 0.87 cm; (iv) On the medium supplemented with - ppm silvernano, the rate of shoot formation from in vitro shoot was from 60.00 to 63.33%, shoot of the coefficient was from 233 to 237 times Keywords: Flower stalks, phalaenopsis orchid, protocorm-like body, silvernano Ngày nhận Ngày phản biện Ngày định đăng 24 : 20/12/2018 : 21/01/2019 : 28/01/2019 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2019 ... Ảnh hưởng nano bạc tới khả tạo PLB mẫu lan Hồ điệp vàng in vitro Trong thí nghiệm này, mẫu in vitro lan Hồ điệp vàng sử dụng làm vật liệu để tạo PLB, môi trường nuôi cấy bổ sung nano bạc với nồng... chồi lan Hồ điệp vàng cho hiệu tạo chồi tốt với tỉ lệ tạo chồi đạt 92,53%, hệ số nhân chồi 2,97 lần chiều cao chồi trung bình đạt 0,87 cm Bổ sung - ppm NS vào môi trường nhân nhanh chồi lan Hồ. .. khả khử trùng mẫu phát hoa lan Hồ điệp dung dịch nano bạc Theo kết nghiên cứu Nasser Mahna et al (2013) sử dụng nano bạc để khử trùng mẫu khoai tây, nồng độ 100 ppm nano bạc cho tỉ lệ mẫu sống,