Các phương pháp nhân giống in vitro lan hồ điệp

Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Phần I: Mở Đầu Cuộc sống ngày càng phát triển, nhu cầu tạo một gốc vườn nhỏ mang màu xanh cây lá thiên nhiên vào trong nhà của người dân ngày càng cao.Vốn nhiều họ, nhiều chủng loại, màu sắc phong phú lại tốn ít diện tích nên việc chọn trồng và tạo một vườn lan nhỏ trong khuôn viên nhà là sự lựa chọn của nhiều cá nhân, nhiều hộ gia đình.Trong số những loại phong lan được nuôi trồng ở nước ta hiện nay, bên cạnh những loài tương đối dễ trồng như Mokaro, Dendro, lan Vũ Nữ…thì vẫn có những loài lan thích hợp với một số khu vực địa lý nhất định, cụ thể là Địa Lan – loài hoa chỉ có thể nuôi trồng trong điều kiện lí tưởng của Đà Lạt .[4] Không quá kén chọn và hạn chế nơi trồng như Địa Lan song Hồ Điệp cũng là một trong những giống lan quý lại khó trồng. Do đó, đòi hỏi người trồng phải có đôi chút am hiểu về loài hoa này.Thích hợp với điều kiện trong nhà lại là một trong những giống lan được yêu thích không chỉ về màu sắc, kiểu dáng mà còn mang một nét đẹp rất sang trọng, trang nhã. Chính vì vậy, Hồ Điệp đã nhanh chống trở thành sản phẩm trồng trọt được nhiều người ưa chuộng và mang lại hiệu quả kinh tế cao không chỉ ở Việt Nam mà còn ở nhiều nước trên thế giới như:Đài Loan, Hàn Quốc, Nhật Bản, Mỹ…Bên cạnh đó, hoa Hồ Điệp rất lâu tàn, độ bền bông cao, giàu sức quyến rũ nên nó đã được lựa chọn làm vật trang trí, tạo cảnh quan trong các ngày lễ, tết.Vốn là một loài rất khó nhân giống bởi Hồ Điệp thường cho hệ số nhân rất thấp trong điều kiện vườn ươm. Để có được số lượng lớn cây giống đồng đều và sạch bệnh đáp ứng nhu cầu thị trường là một vấn đề thật nan giãi. Do đó, việc nhân giống bằng kỷ thuật nuôi cấy mô ra đời tạo ra hàng loạt cây con ổn định về mặt di truyền, sạch bệnh, giá cả lại phải chăng là rất hữu ích. Xuất phát từ thực tiễn này cộng với sự đam mê của chính bản thân mình, tôi đã tiến hành tìm kiếm sưu tập từ đó đưa ra đề tài: “Các phương pháp nhân giống in vitro lan Hồ Điệp”. SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 1 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Phần II: Nội Dung II.1. Tổng quan tài liệu 1.1. Lịch sử và thành tựu của ni cấy mơ [5] 1.1.1. Trên thế giới • Năm 1902, nhà thơng thái Haberlant lần đầu tiên đưa ra ý tưởng cấy mơ của sinh vật ra ngồi cơ thể nhưng ơng đã dùng tế bào q chun biệt nên khơng thành cơng. Mơ động vật được cấy trước tiên do A.Carrel(1919), đến năm 1934 mơ thực vật mới được ni cấy. • Năm 1934 White đã thành cơng trong việc phát hiện ra sự sống vơ hạn của việc ni cấy tế bào rễ cà chua. • Năm 1964 Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ ni cấy chồi ngọn. Ơng đã thành cơng trơng việc chuyển cây con của cây sen cạn và cây White Lupin từ mơi trường ni cấy tối thiểu, tuy nhiên việc nhân giống vẫn chưa hồn chỉnh. Sau đó, nhiều nhà nghiên cứu đã khám phá những thành phần dinh dưỡng qua trọng cần thiết cho sự phát triển của tế bào được ni cấy (White (1951),Gauthere (1939),Van Overbeck (1941), Steward và Caplin (1951)). • Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự nảy chồi. • Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến mơi trường ni cấy đánh dấu một bước tiến trong kỷ thuật ni cấy mơ. Mơi trường của họ dùng làm cơ sở cho việc ni cấy nhiều loại cây và vẫn còn sử dụng rộng rải cho đến ngày nay. • Năm 1960-1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vơ tính lan bằng ni cấy đỉnh sinh trưởng.Từ kết quả đó, lan được xem là cây ni cấy mơ đầu tiên được thương mại hố. Từ đó đến nay, cơng nghệ ni cấy mơ tế bào thực vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác (Haramaki(1971), Murashige(1972), Miller và Murashige (1976)) và được ứng dụng thương mại hóa. 1.1.2. Ở Việt Nam Ni cấy mơ tế bào thực vật đã được phát triển ở Việt Nam sau chiến tranh thế giới kết thúc (1975). Phòng thí nghiệm ni cấy mơ và tế bào đầu tiên được xây dựng đầu tiên ở viện sinh học, viện khoa học Việt Nam(KHVN) do tiến sĩ Lê Thị Muội đứng đầu. Bước đầu tập trung nghiên cứu những vấn đề cơ bản như ni cấy bao phấn, ni cấy mơ sẹo và protoplast. Các kết quả đầu tiên về ni cấy thành cơng bao phấn lúa và thuốc lá được cơng bố năm 1978 (Lê Thò Muội và cs,, 1978; Lê Thò Xuân và cs,, 1978). Tiếp đó là thành cơng về protoplast ở thuốc lá và khoai tây (Lê Thị Muội và Nguyễn Đức Thành(1978),Nguyễn Đức Thành và Lê Thị Muội 1980,1981).Trong cùng thời gian tại phân viện KHVN tại Tp.HCM, muội hơn nửa là tại Đại học Nơng SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 2 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Nghiệp I (ĐHNNI) Hà Nội và Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Việt Nam (KHKTNNVN) và các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào cũng được thành lập chủ yếu tập trung vào vi nhân giống khoai tây . Hiện nay, chúng ta có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô không những ở các trường đại học các viện nghiên cứu (viện Di Truyền Nông Nghiệp(DTNN), viện Rau Quả Trung ương(RQTƯ)) mà ở cả một số tỉnh và cơ sở sản xuất(Yên Bái ,Hưng Yên, Thanh Hóa….). Giữa những năm 1980 trở lại đây, các hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô và tế bào thực vật phát triển mạnh. Những kết quả khích lệ đã đạt được trong lĩnh vực vi nhân giống khoai tây(viện Công Nghệ Sinh Học (CNSH), ĐHNNI, viện KHKTNNVN), dứa, chuối, mía (viện CNSH, ĐHNNI, viện KHKTNNVN, viện RQTƯ) một số cây hoa phong lan (phân viện CNSH thành phố Hồ Chí Minh), Hồng, Cúc, Cẩm Chướng(viện CNSH, viện DTNN) và cây công nghiệp như bạch đàn (viện DTNN, viện Lâm Nghiệp). Một số kết quả bước đầu đã ghi nhận trong lỉnh vực chọn dòng tế bào như chọn dòng tế bào kháng bệnh (Lê Bích Thủy và cs,, 1994), chọn dòng chịu muối ,chịu mất nước (Nghuyễn Tường Vân và cs ,,1994; Đinh Thị Phòng và cs,, 1994). Các kết quả về dung hợp cây lai tế bào chất và chuyển gen lục lạp củng thu được kết quả lý thú (Nguyễn Đức Thành và cs,, 1988; Nguyễn Đức Thành và cs,, 1993, 1997) nuôi cấy bao phấn để tạo dòng thuần đã được ứng dụng nhiều ở viện CNSH và DTNN. Nuôi cấy các dược liệu quý để bảo tồn nguồn gen và tạo các tế bào có hàm lượng các chất sinh học quan trọng cao cũng đã và đang phát triển. 1.2. Các giai đoạn nhân giống invitro [5] Cho tới nay việc nhân giống invitro đã áp dụng cho nhiều loại cây (350 loài, Murashige (1974) chia quy trình nhân giống ra làm 4 giai đoạn : • Nuôi cấy khởi đầu, tái sinh chồi, cụm chồi. • Nhân nhanh chồi, cụm chồi trong điều kiện invitro. • Tạo cây con hoàn chỉnh, huấn luyện cây con. • Phục hồi, chuyển cây ra trồng trong điều kiện tự nhiên. 1.3. Các phương pháp nhân giống invitro [5] 1.3.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Một phương thức dễ dàng nhất đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và nuôi cấy chồi bên). Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp. Từ một đỉnh sinh trưởng, sau một thời gian nuôi cấy nhất định mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Chồi tiếp tục phát triển thân, ra lá và rể để thành một cây hoàn chỉnh. Cây con được chuyển dần ra đất và thích nghi bình thường. SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 3 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp 1.3.2. Nuôi cấy mô sẹo Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phân hóa của các tế bào đã được phân hóa. Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện diện của auxin. Khối mô sẹo có khả năng phát triển thành cây con hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo. Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với các loại thực vật không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ. Từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma lại cao hơn. 1.3.3. Nuôi cấy tế bào đơn Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đạt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẽ gọi là tế bào đơn.Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tăng sinh khối. Với các chất thích hợp được bổ sung vào môi trường, tế bào có khả năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học. Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được tách ra và trải trên môi trường thạch. + Khi môi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành từng cụm có mô sẹo. + Khi môi trường thạch có tỷ lệ cytokinine/auxin thích hợp, tế bào đơn có khả năng tái sinh thành cây con hoàn chỉnh. 1.3.4. Nuôi cấy protoplast-chuyển gen Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn được tách bởi vỏ cellullose, có sức sống và duy trì đầy đủ các chức năng sẵn có. Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh cây hoàn chỉnh (tính toàn thể ở thực vật). Khi tế bào chất mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung hợp với nhau tạo tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng. Quá trình dung hợp protoplast có thể thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài. 1.3.5. Nuôi cấy hạt phấn đơn bội Hạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp tạo mô sẹo. Mô sẹo này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội. II.2. Tìm hiểu về nhân giống lan Hồ Điệp 2.1. Nguồn gốc và đặc điểm của lan Hồ Điệp [4] 2.1.1. Nguồn gốc SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 4 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Lan Hồ Điệp là giống lan có tên gọi Phalaenopsis, thuộc họ phụ Vandeae. Tên gọi Phalaenopsis bắt nguồn từ tiếng Hi Lạp trong đó Phalaina có nghĩa là “con bướm” và Opsis có nghĩa là “giống như”. Lan Hồ Điệp được khám phá năm 1750, đầu tiên được ông Rumphius đặt tên là Angraecum album, năm 1753 Linne đổi tên thành Epidendrum, 1825 nhà thực vật Hà Lan định danh lại là Phalaenopsis. Loài hoa này có xuất xứ ở miền Bắc Australia, Ấn Độ và các nước Đông Nam Á như Philippine, Inđônêsia, bán đảo Đông Dương. Quê hương của lan Hồ Điệp là các nước của vùng Đông Nam Á, rừng Việt Nam không có loài Phalaenopsis amabilis, chỉ có 5 loài tương tự được biết là Phaenopsis mannii, Phalaeopsis gibbosa, Phalaenopsis lobbi, Phalaenopsis fuscata và Phalaenopsis cornu-cervi. Lan Hồ Điệp được trồng ở mọi nơi trên thế giới, hầu hết là ở Đức, Nhật bản, Phần Lan, Đài Loan, Thái Lan và Mỹ. Cây con được nuôi cấy mô nhiều ở các nước Phần Lan, Thái Lan, Đài Loan… Hiện nay giống Hồ Điệp có trên 70 loài và càng ngày càng lai tạo ra rất nhiều. 2.1.2. Đặc điểm  Lan Hồ Điệp là cây đơn thân, ngắn, lá to, dày, mọc sát vào nhau. Hoa nở luân phiên hết cái này đến cái khác, thời kì nở hoa thay đổi theo loài và thường nở trong vài tháng. Phát hoa mọc từ nách lá, dài, chùm hoa nở từng cái, 3 đài to tròn, hai cánh xoè rộng kín, sắc đẹp. Môi hoa cong dẹp có hai râu dài nên cả đóa hoa trong giống như con bươm bướm. Hai hàng hoa xếp đều đặn 2 bên cành, khẽ đong đưa như đàn bướm xinh xắn đang bay lượn chập chờn. Trụ có hình bán nguyệt với hai phân khối u lên, chứa đầy phấn hoa. Số hoa trên cành biểu thị sức sống của cây. Số lượng càng nhiều thì cây càng sung sức. Riêng đặc tính phân nhành hoa lại tùy thuộc nhiều vào từng loại giống.  Lan Hồ Điệp có màu sắc phong phú, không thua kém bất cứ giống lan nào khác từ trắng, hồng, đỏ, vàng, tím đến các loại Hồ Điệp có sọc nằm ngang hoặc thẳng đứng, hoặc có đốm to hay nhỏ…Lan Hồ Điệp sinh trưởng chậm, khoảng 40 ngày với điều kiện chăm sóc tốt mới mọc thêm một lá hoàn chỉnh. Khi cây có trên 4 lá mới có thể phân hoá mầm hoa. Loài lan này có độ bền bông cao trong điều kiện thích hợp, rất thích hợp để trồng trong nhà, dễ ra hoa. Nhưng nó vốn vẫn là loài hoa khó tính. 2.2. Điều kiện sinh thái [5] 2. 2.1. Nhiệt độ [3] Lan Hồ Điệp có nguồn gốc từ miền nhiệt đới, do đó nhiệt độ thích hợp để trồng Lan Hồ Điệp tương đối cao, nhiệt độ thích hợp để trồng ban ngày là từ 25-28 0C , ban đêm là 18-20 0C giai đoạn ươm cây non thì cần nhiệt độ ban đêm khoảng 23 0C . Nếu nhiệt độ nhà trông nhỏ hơn 15 0C rễ cây ngừng hút chất dinh dưỡng, quá trình sinh trưởng ngừng lại, thậm chí bị lạnh hại làm rụng hoa hoặc làm cho cánh hoa xuất hiện các đốm nhỏ ảnh hưởng đến vẽ đẹp của hoa, giai đoạn phấn hoa đòi hỏi phải có sự SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 5 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp cách biệt khá cao về độ lêch nhiệt độ ngày /đêm, nhiệt độ ban ngày thích hợp nhất là 25 0C , ban đêm 10-20 0C , kéo dài 3-6 tuần rất có lợi cho sự phân hóa hoa. 2. 2.2. Nước tưới Hồ Điệp là loài đơn thân, không có giả hành nên không dự trữ nước, hơn nữa diện tích bốc hơi của bản lá khá lớn và chúng không có mùa nghỉ vì thế phải cung cấp cho không một lượng nước đầy đủ và thường xuyên trong suốt năm. Trong mùa mưa mỗi ngày phải tưới cho chúng 2 lần, trừ những ngày có mưa, một lần vào 9 giờ sáng, một lần vào 3 giờ chiều. Tưới như vậy sẽ đảm bảo cây khô ráo khi trời tối vì đọng nước ở nách lá suốt đêm có thể gây ra sự thối rữa. Vào mùa nắng, nên tưới cho chúng 1 ngày 3 lần. Điều kiện thoát nước là tương đối quan trọng, Hồ Điệp không thể chịu được một độ ẩm lắng đọng (nhất là ban đêm), vì rất đễ tạo điều kiện cho bệnh thối rữa phát triển. Tốt nhất cứ ba ngày ta nên pha Dithane M45, Maneb, Captan vào trong nước tưới với nồng độ 1/400 để ngừa chứng bệnh nói trên. Nên nhớ, Hồ Điệp là loài lan thích hợp với giá thể và nước tưới có pH khá thấp (pH=5,2) vì thế phải dùng axít phôtphoric để giảm pH của nước. Ở nước ta, vào mùa mưa Hồ Điệp tăng trưởng mạnh hơn, nhưng những giọt mưa nặng hạt cũng không kém phần nguy hiểm vì thế đa số các loại Hồ Điệp bị chết do những cơn mưa đầu mùa. Đây cũng là một hình thức tưới của thiên nhiên mà ta không kiểm soát được. Do đó để ngừa tình trạng trên, mái giàn che Hồ Điệp nên dùng những tấm tôn nhựa xanh, như vậy sẽ loại trừ những trận mưa không cần thiết và tạo được những tia sáng khuếch tán rất lý tưởng. Vào mùa khô, ta vẫn duy trì mức độ tưới đều đặn như trong mùa mưa, vì lúc này ẩm độ trong không khí giảm xuống rõ rệt. Do đó, sự tăng số lần tưới nhằm mục đích tạo cho cây tăng trưởng liên tục. Nếu cây có trạng thái thiếu nước, ủ rũ bạn nên chuyển cây sang vị trí khác hoặc tăng số lần tưới lên. Một lần tưới bổ sung vào giữa trưa trong mùa khô rất thích hợp cho sự phát triển của Hồ Điệp. 2. 2.3. Ánh sáng [3] Lan Hồ Điệp rất kỵ ánh sáng chiếu thẳng trực tiếp, do đó phải có biện pháp che sáng đồng thời tùy thuộc vào cây lớn nhỏ mà có biện pháp điều chỉnh ánh sáng cho thích hợp. Thời kỳ ươm cây non nhu cầu về ánh sáng có cường độ 10.000-12.000 lux, giai đoạn cây bánh tẻ là 12.000-20.000 lux, giai đoạn thúc ra hoa 20.000-30.000 lux. Trong điều kiện trồng trong nhà lưới, mùa hè và mùa thu phải che đi 75-85% ánh sáng, cần phải có hai lớp che sáng đặt chồng lên nhau, mùa đông xuân thì ánh sáng yếu hơn chỉ cần che 40-50% là đủ. SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 6 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp 2. 2.4. Độ thông thoáng Rất cần thiết vì Hồ Điệp hay bị bệnh thối nhũn lá (phõng lá), sự thông thoáng giúp lá cây mau khô sau khi tưới và bộ rễ không bị úng nước nên hạn chế bệnh rất nhiều. Ở nước ta vào mùa mưa Hồ Điệp tăng trưởng mạnh những giọt mưa nặng hạt có thể làm thối đọt. Do đó để ngăn ngừa tình trạng trên nên dùng những tấm tôn nhựa xanh để che. Có một số trường hợp trồng Hồ Điệp trên cao (sân thượng) có hiệu quả hơn. Tuy nhiên gió nhiều và mạnh dễ làm cây mất nước nhanh nếu ta không cung cấp đủ lá cây sẽ héo rũ, nhăn. 2. 2.5. Dinh dưỡng Hồ Điệp cần dinh dưỡng thường xuyên, quanh năm vì không có mùa nghỉ . Khi tưới phân không nên tưới với nồng độ cao càng đừng tưới lên đọt, nhất là lúc lá non mới nhú ra từ đỉnh sinh trưởng. Hồ Điệp cần phân bón tưới với nồng độ loãng và có thể tưới nhiều lần trong tuần. Có thể tưới thêm phân hữu cơ như: bánh dầu 15 ngày/lần, vitamin B1, kích thích ra rễ… Cách tưới phân + Thời kỳ cây dưới 12 tháng tuổi cần dùng N, P, K với tỷ lệ cao 30-10-10, sau đó dùng phân N, P, K với tỉ lệ 20-20-20 hoặc 18-18-18 cho đến lúc ra hoa. Tuy nhiên vào mùa mưa nếu tưới phân 30-10-10 thấy cây yếu mềm quá có thể tăng cường lượng lân và kali bằng cách xen kẽ phân 20-20-20 hoặc 18-18-18 (dù là cây con), để cây được cứng cáp, tăng cường sức đề kháng sâu bệnh. + Lúc cây trưởng thành (18-24 tháng tuổi) vào thời điểm cuối năm, thời tiết lạnh có thể kích thích cây ra hoa bằng cách tưới phân 10-30-30, đến khi cây bắt đầu nhú cành hoa rồi ta trở lại tưới phân 20-20-20 cho đến lúc hoa nở và tàn. Không nên để cành hoa lâu quá trên cây, khi nụ hoa cuối cùng đã nở và có 1, 2 hoa bắt đầu héo, thì ta nên cắt cành hoa bỏ đi để dưỡng sức cho cây. Khi cắt cành hoa càng sớm thì lá mới ra mau và cây sinh trưởng tốt hơn để lần ra hoa sau sẽ mạnh hơn. 2.2.6. Sâu bệnh Đối với phong lan, việc phòng bệnh hết sức quan trọng, vì khi cây đã bị bệnh rất khó trị và có thể làm chết cây. Ngoài việc chăm sóc lan kỹ lưỡng đều đặn, tưới nưới và dinh dưỡng cần phải tưới thêm thuốc trừ nấm bệnh nhằm tăng sức đề đề kháng cho cây. Lan Hồ Điệp hay bị con bọ trĩ chích tạo vết thương trên lá từ đó vi khuẩn xâm nhập gây bệnh thối nhũn trên lá. Có thể dùng một số loại thuốc để phòng trị như Malathion, lannat… để phòng trị. 2.2.7. Chậu, giá thể, cách trồng Cách trồng chung nhất cho các loại Hồ Điệp là chậu thật thoáng, có nhiều lỗ có thể sử dụng chậu đất nung có nhiều lỗ hay chậu nhựa cũng được. Chậu phải thật sạch không có rêu bám trên thành chậu. Thông thường các nhà vườn trồng lan với số lượng SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 7 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp lớn (vài ngàn cây) thường dùng than, dớ, xơ dừa, mút… làm giá thể để trồng lan Hồ Điệp. Có rất nhiều cách trồng lan Hồ Điệp tuỳ theo từng vùng. Nhưng có điểm chung là than, mút nằm dưới đáy chậu, còn xơ dừa hay dớn sẽ nằm trên miệng chậu cách trồng này giúp cây thoát nước tốt vào mùa mưa, không bị thối rễ và phát triển tốt. Trong thời gian khoảng 2 năm ta thay chậu một lần, nếu cây lớn quá mau có thể thay chậu sớm hơn. 2.3. Tình hình sản xuất lan Hồ Điệp ở Việt Nam [5] Hiện nay, tại TP.HCM cây lan Hồ Điệp được xem là cây trồng chiến lượt trong việc chuyển đổi cơ cấu cây trồng và vật nuôi. Đây là cây trồng đem lại hiệu quả cao gấp 2-3 lần so với việc trồng lúa, hoa màu v.v Trong xu thế đất trồng ngày càng hẹp thì cây lan không chiếm diện tích đất nhiều nên là giải pháp rất hiệu quả. Không chỉ đẹp về màu sắc, hình dáng, hoa lâu tàn… giá thành rẻ nên ngày càng được ưa chuộng và nuôi trồng. Tại TP.HCM và các tỉnh lân cận có rất nhiều vườn trồng Hồ Điệp với qui mô từ vài trăm đến vài nghìn cây. Điển hình là công ty Lâm Thăng của Đài Loan đầu tư và công ty Kim Ngân chuyên trồng về lan Hồ Điệp, hàng năm có thể cung ứng cho thị trường từ vài ngàn đếm vài chục ngàn cây, nhất là vào dịp Tết Nguyên Đán. Tuy nhiên do không có sự liên kết giữa các nhà vườn nên sản phẩm làm ra không tìm được thị trường tiêu thụ, giữa cung và cầu không hợp lý. Về nguồn cây giống thì ở nước ta do không đầu tư nên cây giống không đạt chất lượng tốt, giống mới không nhiều nên các nhà vườn thường nhập giống từ các nước như Thái Lan, Đài Loan…Ngoài ra hàng năm việc nhập khẩu hoa từ các nước này ước tính tiêu tốn hàng triệu USD. So với các nước có ngành trồng lan phát triển như Đài Loan hay Thái Lan thì ngành trồng ở nước ta cần phải học hỏi nhiều và cần phải có chính sách phát triển hợp lý nhằm đem lại hiệu quả kinh tế cao hơn. 2.4. Nhân giống invitro lan Hồ Điệp 2.4.1. Nhân giống Hồ Điệp lai từ trục phát hoa [14] 2.4.1.1. Vật liệu và phương pháp nuôi cấy Trục phát hoa Hồ Điệp lai được cắt khi các hoa gần tàn. Các mắt được làm sạch và tẩy trùng bằng phương thức của Scuully, có 4 loại chồi khác nhau trên các khúc mắt được dùng trong thí nghiệm. • Chồi nguyên vẹn được dùng để kiểm chứng . • Chồi bị làm chấn thương bằng cách cắt bỏ 2/3 chồi theo mặt cắt song song với trục phát hoa và như thế mặt cắt sẽ nghiêng với hướng mọc một gốc α. • Chồi bị làm chấn thương bằng cách cắt chồi làm hai mặt cắt theo trục. • Đâm dọc chồi bằng một kim nhọn từ đỉnh xuống gốc. 2.4.1.2 Điều kiện nuôi cấy SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 8 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp • Môi trường Murashige và Skoog( M+S). • Môi trường Knudson C. • pH:5.8. • Ánh sáng: 5000 1m/m 2 . • Quang kỳ : 14 giờ. • Nhiệt độ: 210 0C . • Dụng cụ chứa đựng môi trường là lọ thuốc nhỏ chứa 10ml. 2.4.2. Gieo hạt lan Hồ Điệp nảy mầm trong điều kiện invitrro [3] Trong tự nhiên hạt lan ít nảy mầm (chỉ nảy mầm 1-2%) do hạt lan không có chứa anbunin và một phôi chưa phân hóa, có kích thước nhỏ nên khó chứa chất dự trữ .Vì vậy, trong tự nhiên hạt lan Hồ Điệp nảy mầm được nó phải cộng sinh với nấm Rhizoctonia mucoroides. Nấm sẽ cung cấp đường để nuôi cây, phân giải các chất hữu cơ khó hấp thu. Bù lại cây sẽ cung cấp nước cho nấm, chỗ ở và các khoáng chất mà nó thu được từ sương. Dựa trên nguyên tắc này, các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô đã tạo môi trường gieo hạt lan Hồ Điệp trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo với tỉ lệ rất cao. 2.4.2.1.Tiến hành • Chọn quả lan: Chọn các quả 4 tháng tuổi, quả căng đều, không bị nứt vở, không bị sâu bệnh làm nguyên liệu để gieo hạt. • Khử trùng : Dùng cồn 75 0 rửa sạch quả, khử trùng bằng dung dịch HgCl 2 0,1% trong 10 phút. Rửa lại quả bằng nước vô trùng 5 lần, thấm khô bằng giấy thấm vô trùng. Dùng dao tách vỏ quả để lấy các hạt nhỏ li ti bên trong và gieo trong môi trường đã chuẩn bị sẵn. • Để gieo hạy lan có thể sử dụng các loại môi trường nền: Knudson, Vacine- Went (VW), Murashige –Skoog ( MS) có bổ sung thêm đường và các chất hữu như: Dịch nghiền của khoai tây, chuối , cà rốt, nước dừa, pepton… 2.4.3. Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm trong nhân giống Hồ Điệp lai [2] 2.4.3.1. Hệ thống nuôi cấy Hệ thống ngập chìm tạm thời được sử dụng trong nghiên cứu này là hệ thống bình nuôi cấy Plantima do công ty A-tech Bioscientific của Đài Loan sản xuất . Hệ thống này gồm những bộ phận chủ yếu sau: Bơm hay máy nén khí tạo áp lực để đẩy môi trường từ ngăn chứa lên ngăn chứa mẫu cấy và ngược lại, timer dùng để điều khiển chu kỳ ngập, hệ thống ống dẫn và van điều khiển, các màng lọc thoáng khí vô trùng, các bình Platima bằng nhựa polycarbonate gồm có 2 ngăn, ngăn dưới chứa môi trường lỏng và ngăn trên chứa mẫu thực vật. SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 9 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Bằng cách điều chỉnh tự động áp lực không khí thông qua một máy bơm, môi trường lỏng từ ngăn dưới sẽ được bơm lên ngăn chứa mẫu cấy và khi đạt đến thời gian ngập chìm tạm thời dung dịch sẽ quay trở lại ngăn dưới . Trong giai đoạn dung dịch ngập mẫu có sự trao đổi không khí, mẫu được xoay chuyển nhẹ và làm mới không khí bên trong bình nuôi cấy, dòng khí đi vào và thoát ra được khử trùng nhờ cách lọc vô trùng 0,45µm . Thời gian ngập chìm và tần suất ngập chìm được điều khiển bằng timer. Hình 1: Hệ thống Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ ngập[11] 2.4.3.2. Mẫu cấy lan Hồ Điệp Đối tượng thí nghiệm là một loài lan Hồ Điệp lai có tên gọi Doritaenopsis Taida Salu. Mẫu cấy gồm có : • Protocorm – like bodies –PLBs của giống Dtps Taida Salu. • Mẫu cấy chồi được lấy trong thí nghiệm tái sinh chồi từ PLBs trong các hệ thống khác nhau trên môi trường tái sinh chồi. 2.4.3.3. Phương pháp thí nghiệm A.Khảo sát sự nhân nhanh PLBs trong các hệ thống nuôi cấy khác nhau Thí nghiệm khảo sát sự nhân nhanh PLBs trong các hệ thống nuôi cấy khác nhau được tiến hành trong nhằm so sánh hiệu quả trong việc nâng cao hệ quả nhân và chất lượng của PLBs trong hệ thống TIS so với các hệ thống nhân giống trên môi trường thạch và trong hệ thống nuôi cấy lỏng lắc. Đồng thời khảo sát các thông số tối ưu cho việc nhân PLBs trên hệ thống TIS . Mật độ mẫu cấy và tần xuất ngập chìm. SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 10 [...]... Nhi Lớp 07S1 15 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp 2.5.2 Gieo hạt lan Hồ Điệp nảy mầm trong điều kiện invitrro [3] Các nhà khoa học đã tiến hành thí nghiệm trên một số giống lan Hồ Điệp nhằm tìm được tuổi quả thích hợp và loại môi trường nuôi cấy tối ưu cho việc nhân giống bằng gieo hạt Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 4 và bảng 5 dưới đây: Bảng 4: Ảnh hưởng của các tuổi khác nhau... được lai tạo gần đây nhất là Harlequin, có màu trắng hay vàng với các mép cánh bông được điểm xuyết bởi các chấm tròn ngẫu nhiên có giá rất cao trên thị trường hiện nay SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 28 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Hình11: Mô hình sản xuất lan Hồ Điệp. [10] Phần III: Kết Luận Từ những thí nghiệm trên tôi thấy rằng nhân giống Hồ Điệp nhờ hệ thống nuôi cấy ngập chìm... Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp cấy (mm) cấy Bình tam giác (môi trường thạch ) TIS (môi trường lỏng) (mm) 1,73 7 ± 0,36 9 ± 0,23 7 ± 0,24 (mm) 6 ± 0,14 6,30 lá 3 ± 0,5 5 ± 0,22 Hình 7: Chồi tái sinh từ PLBs trong hệ thống TIS và bình tam giác.[7] a1, a2, a3 :Chồi tái sinh từ PLBs trong hệ thống TIS b: Chồi tái sinh từ PLBs trong bình tam giác 2.5.3.3 Khảo sát sự ra rễ của chồi Hồ Điệp. .. 8: Sự sinh trưởng và phát triển của chồi Hồ Điệp trong hệ thống TIS và bình tam giác 500 ml [7] a : Cây con Hồ Điệp trong hệ thống TIS b : Cây con Hồ Điệp trong bình tam giác 500 ml SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 23 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Hệ thống ngập chìm tạm thời đã hội tụ đủ những điều kiện cần thiết như ngập không quá lâu, thoáng khí tốt giúp cây không bị thủy tinh thể,... 22 100 +++ phấn 90 ngày sau thụ phấn Các kết quả ở bảng 4 cho thấy: Chỉ sau khi thụ phấn >100 ngày thì hạt lan Hồ Điệp mới đủ độ chín và có khả năng nảy mầm cao nhất Hình 5: Hạt lan nảy mầm trong điều kiện in vitro [12] SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 16 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Kết quả ở bảng 5 chứng tỏ rằng : Tất cả các công thức bổ sung các chất hữu cơ tự nhiên ở dạng riêng... cho nhân nhanh phôi và PLB là môi trường MS cơ bản bổ sung 2mg /l BA, 1mg /l NAA và 20% nước dừa Từ kết quả trên tôi xin đưa ra quy trình nhân giống invitro lan Hồ Điệp như sau Cây mẫu Cành hoa Khử trùng kép Quả Khử trùng MS +Knudson C (trục phát hoa) + 30 g KT 29 SVTH: Bùi ThịVW + 100ml + 10 g đườngLớp 07S1 + 1g pepton + 6,5 g agar ( gieo hạt ) Thu Nhi Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp. .. Thêm vào SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 20 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp đó, sự sinh trưởng và phát triển của chồi tái sinh trong hệ thống TIS đều vượt trội hơn trong bình tam giác về các chỉ tiêu chiều cao thân, chiều dài, chiều rộng lá Bảng 10:Ảnh hưởng của tần xuất ngập chìm lên tái sinh chồi từ PLBs Nghiệm thức Trọng lượng tươi(g) Số chồi/ PLBs 4 giờ / 3 phút 25,48 ± 4,84 3,17... cường độ chiếu sáng 2500 lux 2.4.4 Nhân nhanh phôi và Protocorm – like body cây lan Hồ Điệp bằng hệ thống Bioreactor [1] 2.4.4.1 Vật liệu và phương pháp SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 11 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Đối tượng nghiên cứu Giống lan Hồ Điệp có màu trắng (phalaenopsis amabilis ) Mẫu thí nghiệm Nguồn mẫu lá phôi và PLB ( có màu xanh, đường kính từ 1-1,5 mm) thu nhận sau 2-... tăng sinh (1,86 lần), và đường kính (1,5 mm) của phôi và PLB trong hệ thống đối chứng [9] Hình 10: a) Sự tăng nhanh Phalaenopsis PLB trong hệ thống bioreactor (1lít kiểu cột) sau 6 tuần SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 27 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp b) Sự tái sinh và tăng trưởng từ PLB trong hệ thống bioreactor; c) Sự thích nghi của những cây mới nhú 2.6 Hiệu quả kinh tế của lan Hồ Điệp. .. Phương pháp thí nghiệm Các bước thiết lập và vận hành hệ thống nuôi cấy bioreactor được thực hiện như sau: SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 12 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Bước 1: Chuẩn bị các bộ phận của hệ thống bioreactor :bình cầu, nắp silicone, các ống dẫn silicone, máy lọc khí, máy sục khí Chuẩn bị môi trường nuôi Chuẩn bị môi trường nuôi cấy và mẫu nuôi cấy Bước 2 : Gói các . kiếm sưu tập từ đó đưa ra đề tài: Các phương pháp nhân giống in vitro lan Hồ Điệp . SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 1 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Phần II: Nội Dung II.1. Tổng. 07S1 15 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp 2.5.2. Gieo hạt lan Hồ Điệp nảy mầm trong điều kiện invitrro [3] Các nhà khoa học đã tiến hành thí nghiệm trên một số giống lan Hồ Điệp nhằm tìm. Nhân nhanh phôi và Protocorm – like body cây lan Hồ Điệp bằng hệ thống Bioreactor [1] 2.4.4.1. Vật liệu và phương pháp SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 11 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan