Phương pháp nhân giống vô tính Lan Hồ Điệp

Hoa lan có ý nghĩa tinh thần vậy đó ,có giá trị kinh tế vậy đó, nhưng mà hiện nay ở Việt Nam vẫn chưa thể sản xuất Lan Hồ Điệp một cách đại trà được, vẫn còn phải nhập khẩu các giống Lan Hồ Điệp ở Thái Lan, Đài Loan với giá thành cao… có lẽ vì các kỹ thuật hiện đại sử dụng trong nhân giống chưa được nhiều người biết tới, chỉ một số ít người có thể tiếp cần những phương pháp này, vì lẽ đó hôm nay nhóm em sẽ giới thiệu một vài kỹ thuật “Nhân giống vô tính Lan Hồ Điệp”. 3. VÀI NÉT VỀ PHALAENOPSIS 3.1. Nguồn gốc và phân bố Lan Hồ Điệp được tìm thấy vào năm 1750, đầu tiên được Rumphius xác định dưới tên là Angraecum. Đến năm 1753, linné đổi lại là Epidendrum amabile. Chi Phalaenopsis do C. L Blume phát hiện vào năm 1825. Phalaenopsis hay còn gọi là lan hồ điệp. Tên Phalaenopsis xuất hiện từ tiếng Hy lạp: “Phalaina” (con bướm đêm) và “opsis” (trông giống như), nghĩa là loài hoa có hình dáng như bươm bướm. Năm 1887, loài hồ điệp lai đầu tiên được J. Veitch đăng ký với tên P. harriettiae, từ việc kết hợp giữa P. amabilis và P. violacea. Sau đó, có rất nhiều loài lan lai tạo ra làm tăng thêm sự đa dạng và huyền bí của Phalaenopsis. Giống Phalaenopsis gồm 21 loài lan phát sinh, ưa nóng sống ở bán đảo Ma Lai, Indonexia, Philipine, các tỉnh phía đông Ấn Độ, và Châu Úc. Chúng sống trên cây hoặc trên đá, nơi có khí hậu nóng ẩm, độ cao trên 2000m. Ở Việt Nam, chúng ta có thể bắt gặp 1 số loài lan hồ điệp trong các khu rừng như P. coenu (hồ điệp dẹp), P. mannii (hồ điệp ấn), P. parishii (hồ điệp trung), P. pulcherrima (hồ điệp nhài), P. chibae, P. fuscata, P. gibbo.

1 MỞ ĐẦU Đã bạn tự hỏi hoa lan nói chung hoa lan hồ điệp nói riêng tượng trưng cho ý nghĩa gì? Đó loài hoa đẹp phổ biến mà có nhiều ý nghĩa khác Không giống hầu hết loài hoa khác có cánh hoa hình tròn, hoa lan có cánh hoa theo dạng hình hình học Không có ngạc nhiên, hoa xinh đẹp sử dụng để chuyển tải thông điệp đặc biệt Hoa lan hồ điệp từ lâu phong tặng danh hiệu cao sang, quý phái số hàng trăm loài phong lan Bên cạnh đó, biểu tượng cho ngây thơ sáng Nếu bạn người yêu phong lan, bạn vui mừng biết hoa kỳ lạ biểu tượng tình yêu, vẻ đẹp thánh thiện hầu hết văn hóa giới Đây biểu tượng yếu hoa phong lan … Tình yêu: Hoa lan hồ điệp coi biểu tượng tình yêu thực tế trồng lớn lên dễ dàng, nở hoa hầu hết điều kiện Trong thời kỳ Victoria, hoa xem quà kỳ lạ để thể tình yêu tình cảm Người ta chí tin rằng, bạn chọn quà hoa bao nhiêu, tình yêu bạn sâu đậm nhiêu Trong phận châu Âu, hoa lan sử dụng thành phần quan trọng lựa chọn tình yêu Hoàn thiện sắc đẹp: Bởi đối xứng hoa, đường thẳng cánh hoa, lan hồ điệp đại diện cho vẻ đẹp đối xứng, coi hình ảnh tiêu chuẩn cho vẻ đẹp thấy Ở Anh thời Victoria, hoa đáng yêu ví người phụ nữ xinh đẹp Thật thú vị, chí trang phục người phụ nữ thời đại có tương đồng bật với hoa Những người Trung Quốc cổ đại xem cánh hoa lan hình ảnh thu nhỏ hoàn hảo người Sang trọng Sung túc: Vâng, người dân nước Anh thời đại Victoria gắn nhiều ý nghĩa cho hoa lan xinh đẹp, hoa coi biểu tượng sang trọng Đây có lẽ hoa có vùng nhiệt đới, đó, có người giàu có đủ khả thưởng lãm hoa Ở Nhật Bản cổ đại, hoa lan trân trọng hoàng gia, coi biểu tượng giàu có Từ xưa đến nay, lan biết đến loài hoa quý phái, hoa bậc vua chúa vương giả Lan Việt Nam đa dạng chủng loại chứa đựng nhiều ý nghĩa Riêng lan hồ điệp mệnh danh “ nữ hoàng loài hoa” Hồ điệp ý nghĩa cao sang, quý phái mà sứ giả truyền tải cảm xúc cách nhẹ nhàng, hoa mang đến cho vẻ đẹp tinh khiết tự nhiên, nét quyến rũ cho không gian sống Hoa có màu sắc phong phú từ trắng, hồng, đỏ, vàng, tím có loài có phối màu tự nhiên có đốm hay sọc…, cấu trúc kỳ diệu đặc tính tươi lâu sống từ đến tháng, trở thành quà tặng có giá trị cao dịp Tết đến Xuân Khả sinh sản: Hoa lan từ lâu liên kết với khả sinh sản sinh lực Trong Hy Lạp cổ đại, người ta tin việc dùng loại loại củ rễ xác định giới tính thai nhi chưa sinh Nếu cha đẻ đứa trẻ chưa sinh ăn rễ lớn lan, vợ có khả sinh cậu trai Mặt khác, người mẹ mong đợi ăn củ lan nhỏ, cô cho đời bé gái Do niềm tin phổ biến, hoa lan trở thành quà tặng phổ biến cho cặp vợ chồng mong Ở Trung Quốc cổ đại, hoa lan xem biểu tượng đàn cháu đống Ý nghĩa màu sắc khác hoa lan hồ điệp Lan hồ điệp màu xanh: biểu tượng cho cao quý, quý giá Ngoài biểu tượng cho tâm linh thiền định Hình 1: Những cánh hoa Hồ Điệp (Blue Mystique phalaenopsis orchid) có màu xanh dương Lan hồ điệp màu trắng: biểu tượng ngây thơ, xinh đẹp trang trọng Bạn dùng chậu hoa lan hồ điệp trắng làm quà để tặng cho người thân yêu Hình : Lan Hồ Điệp ( P amabilis ) với cánh hoa có màu trắng Lan hồ điệp màu hồng: tượng trưng cho niềm vui, hạnh phúc, ngây thơ Vì chậu lan hồ điệp hồng quà có ý nghĩa cho ngày kỷ niệm Hình :Những đóa hoa màu hồng rực rỡ P schilleriana Lan hồ điệp màu vàng: tượng trưng cho tình bạn khởi đầu Hình 4: Lan Hồ Điệp màu vàng (Yellow Phalaenopsis Orchids) Lan hồ điệp màu tím (lavender): biểu tượng dung thứ, sang trọng vẻ đẹp nữ tính Hình 5: Lan Hồ Điệp có hoa màu tím (Violet Phalaenopsis orchid) Lan hồ điệp màu đỏ tía: tượng trưng cho hoàng gia, ngưỡng mộ tôn trọng Hình 6: Lan Hồ Điệp mang màu đỏ tía (Purple Phalaenopsis Orchid) ĐẶT VẤN ĐỀ Hoa lan có ý nghĩa tinh thần ,có giá trị kinh tế đó, mà Việt Nam chưa thể sản xuất Lan Hồ Điệp cách đại trà được, phải nhập giống Lan Hồ Điệp Thái Lan, Đài Loan với giá thành cao… có lẽ kỹ thuật đại sử dụng nhân giống chưa nhiều người biết tới, số người tiếp cần phương pháp này, lẽ hôm nhóm em giới thiệu vài kỹ thuật “Nhân giống vô tính Lan Hồ Điệp” VÀI NÉT VỀ PHALAENOPSIS 3.1 Nguồn gốc phân bố Lan Hồ Điệp tìm thấy vào năm 1750, Rumphius xác định tên Angraecum Đến năm 1753, linné đổi lại Epidendrum amabile Chi Phalaenopsis C L Blume phát vào năm 1825 Phalaenopsis hay gọi lan hồ điệp Tên Phalaenopsis xuất từ tiếng Hy lạp: “Phalaina” (con bướm đêm) “opsis” (trông giống như), nghĩa loài hoa có hình dáng bươm bướm Năm 1887, loài hồ điệp lai J Veitch đăng ký với tên P harriettiae, từ việc kết hợp P amabilis P violacea Sau đó, có nhiều loài lan lai tạo làm tăng thêm đa dạng huyền bí Phalaenopsis Giống Phalaenopsis gồm 21 loài lan phát sinh, ưa nóng sống bán đảo Ma Lai, Indonexia, Philipine, tỉnh phía đông Ấn Độ, Châu Úc Chúng sống trên đá, nơi có khí hậu nóng ẩm, độ cao 2000m Ở Việt Nam, bắt gặp số loài lan hồ điệp khu rừng P coenu (hồ điệp dẹp), P mannii (hồ điệp ấn), P parishii (hồ điệp trung), P pulcherrima (hồ điệp nhài), P chibae, P fuscata, P gibbo 3.2 Lịch sử lai tạo Phalaenopsis Khoảng năm 1945, giới có tới 3500 loài Odontoglossum, 4300 loài Cattleya 5000 loài lan hài lai có khoảng 140 loài Phalaenopsis lai Sau 100 loài Phalaenopsis Doritaenopsis lai tạo đăng ký Các giống lai Phalaenopsis hình thành góp phần tăng thêm tính đa dạng huyền bí giới hoa Các loài lan hồ điệp phân chia thành nhóm chính: a Nhóm chuẩn “Moth orchids” có phát hoa dài phân nhánh (trên 1m) có hoa lớn (đường kính khoảng 123cm) tròn, màu trắng, hồng sọc Nhóm chủ yếu lai tạo từ P amabilis (hoa trắng) P schilleriana (hoa hồng) b Nhóm hoa nhỏ có phát hoa ngắn, hoa nhỏ (đường kính khoảng 3cm), không tròn, dạng sáp nhiều màu sắc Nhóm lai từ nhiều loài Phalaenopsis hoa nhỏ P amboinensis, P lueddemanniana, P violacea s Ban đầu, nhóm lan hồ điệp hoa nhỏ không ưa chuộng lan hồ điệp chuẩn Đầu thập niên 80, thị hiếu người chơi hoa thay đổi nên nhóm lan hồ điệp hoa nhỏ7:được chuộng đượclai sản rộng rãi(hoa lai tạo nhiều giống Hình Nhómưachuẩn chủhơn yếu,được từxuất P amabilis trắng) P schilleriana hồng) Các có màu sắc sặc sở và(hoa mang hương thơm ngát lai tạo từ P violacea hoa nhỏ mau tàn Đến cuối thập niên 80, người ta trọng đến việc nâng cao chất lượng hoa cách tuyển chọn loài có phẩm chất tốt để lai tạo, thuộc nhóm hoa nhỏ dần ngang hàng với hồ điệp chuẩn Trong đó, nhóm hồ điệp chuẩn (màu hồng trắng) lai tạo sản xuất với chất lượng tốt nhu cầu giống cao Hình : Nhóm hoa nhỏ thường lại tạo từ nhiều loài hoa P violacea (trên cùng), P amboinensis (bên trái), P lueddemanniana (bên phải) Sau đó, giống lai Phalaenopsis có kích thước hoa với hoa trắng xuất Hầu hết hoa vàng lai từ 20 năm trước đến chúng đạt chất lượng hoa tốt, lâu tàn Hiện nay, người ta tạo có hoa lớn với đường kính khoảng 10 cm cách lai tạo P deventeriana với lai màu vàng khác Lan Hồ Điệp hoa vàng tiếp tục tập trung lai tạo sau thời gian dài tạo có chất lượng cao Hình 9: P deventeriana (P amabilis x P.amboinensis) dùng để tạo lai có hoa lớn Loài P.venosa ý có hoa màu nâu nhạt hương hoa ngào ngạt Ngoài ra, số giống lai tạo từ P.venosa P.Mishima Charm P Hausermann’s Gold Cup cho hoa màu vàng ươm Những hoa nhỏ P Orchid World P Michael Croker nhiều hoa lớn lâu tàn Hình 10: P venosa có hoa màu nâu nhạt có hương thơm dùng để lai, tạo giống lan hồ điệp Một nhóm Phalaenopsis lai hình thành gọi “Hoàng Hôn” hay “Màu sa mạc” Nhóm tạo thành nhờ lai P venosa P amboinensis với P schilleriana Hoa giống (màu hồng nhạt đến hồng cam cam sẫm) có hình dạng kích thước tương tự hoa P schilleriana Một số giống đặc trưng cho nhóm P Pago Pago (venosa x Lippegiut) Nhóm hồ điệp tạo nhiều phát hoa phổ biến Trung Mỹ gồm loài P equestris P stuartiana Mặc dù kích thước hoa khoảng – cm có nhiều phát hoa, phát hoa mang số lượng lớn hoa hoa nở sớm so với loài Hồ Điệp khác nên giống ưa chuộng thị trường Hoa có màu từ trắng đến hồng sáng, sọc trắng viền trắng Nhiều giống lai sử dụng ngành công nghiệp hoa cắt cành tạo hoa quanh năm thời gian ngắn với giá thành thấp Mặc dù hoa cắt cành mau tàn hoa trồng chậu chất lượng hoa đạt tiêu chuẩn định Một số giống lai tạo lai Phalaenopsis với chi khác, đặc biệt Doritis có hoa màu sáng số lượng hoa nhiều, lai với Phalaenopsis tạo giống Doritaenopsis có hình dạng hoa tương tự Phalaenopsis Khi lai Phalaenapsis với Asconopsis Iren Dobkin ( P Doris x Ascocentrum miniatum ) Hình 11: P equestris P stuartiana giống ưa chuộng có thời điểm hoa sớm loại Lan Hồ Điệp khác 3.3 Vị trí phân loại Giới Plantae Thực vật Ngành Magnoliophyta Ngọc Lan Lớp Liliopsida Hành Phân lớp Liliidae Hành Bộ Orchidales Lan Họ Orchidaceae Lan Chi Phalaenopsis Lan Hồ Điệp 3.4 Đặc điểm thực vật Lan Hồ Điệp đa dạng di truyền chúng có đặc tính chung cấu tạo quan dinh dưỡng quan sinh sản 3.4.1 Cơ quan dinh dưỡng A Thân Cây đơn thân giả hành, tạo đỉnh sinh trưởng hoạt động liên tục Các đốt thân ngắn thường bao bọc hai hàng bẹ xếp dọc chiều dài thân B Lá Lá đơn nguyên, dày, mọng nước, không cuống có bẹ ôm lấy thân Hình dạng đơn giản (elip thuôn hình lưỡi mác) với màu xanh đơn tạp sắc 10 (100ml ND +10g đường +1g pepton +30g khoai tây + 6,5g agar) / l để gieo hạt tốt Bảng 5: Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên nảy mầm hạt lan Chỉ tiêu theo dõi Thời gian nảy mầm hạt (ngày) Tỷ lệ nảy hạt mầm (%) Chất lượng mẫu Công thức I (Đ/C ) 30 50 + I +30g KT 20 100 +++ I +30g CR 25 60 + I + 50gKT 20 100 +++ I + 50g CR 25 55 + I + 100g KT 20 100 +++ I + 100g CR 25 45 + 25 75 25 70 25 70 I + 30gKT +30g CR I+50gKT+50g CR I+100gKT+100g CR ++ ++ ++ Ghi : I :VW + 100ml ND +10g đường + 1g pepton + 6,6g agar KT : Khoai tây, CR: Cà rốt, ND: Nước dừa + : Thể Protocorm nhỏ ,có máu xanh vàng ++: Thể Protocorm nhỏ ,có máu xanh nhạt +++ : Thể Protocorm phồng to có màu xanh đậm Gieo sau 20 ngày hạt nảy mầm, sau 50-60 ngày hình thành thể tiền chồi (Protocorm) kích thước 1-2 mm Sau đó, chuyển thể tiền chồi sang môi trường : VW + (100ml ND +10g đường +1g pepton +30g khoai tây + 6,5g agar +30g cà rốt) / l để hình thành 54 non có 2-3 sau 60 ngày Tiếp tục cấy chuyền non sang chín môi trường này, khoảng 60 ngày tạo hoàn chỉnh đạt tiêu chuẩn chuyển vườn ươm Vì vậy, thời gian sau gieo khoảng tháng 8.5.3 Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm nhân giống Hồ Điệp lai 8.5.3.1 Khảo sát nhân nhanh PLBs hệ thống nuôi cấy khác Chu kỳ ngập chìm, mật độ thể tích môi trường sử dụng hệ thống TIS có tác động lớn đến chất lượng mẫu cấy Vì vậy, để đạt hiệu cao sử dụng hệ thống TIS trình nhân PLBs, cần khảo sát tối ưu hóa thông số mật độ, thể tích chu kỳ ngập chìm hệ thống TIS Sau tuần nuôi cấy tiến hành ghi nhận Bảng 6: Kết khảo sát mật độ PLBs thích hợp cho việc nhanh hệ thống TIS 55 Nghiệm Trọng lượng Số lượng PLBs/ thức tươi (g ) 1g PLBs ban đầu Số chồi Nhận xét PLBs tròn, 2g 11,25 ± 1,87 973,27 ± 30,68ab 19,58 ± 4,79 xanh tốt, cụm Một số PLBs phát triển thành chồi Không gian TIS trống PLBs 4g 23,05 ± 4,65 1020,11 ± 110,36 a xanh tốt, tròn, số PLBs 36,31 ± 6,91 phát triển thành chồi Không gian TIS trống PLBs 6g 40,15 ± 5,08 984,60 ± 116,54a b xanh tốt, tròn, số PLBs 73,21 ± 6,99 phát triển thành chồi Không gian TIS trống PLBs không 8g 53,30 6,80 ± tròn, vàng chồi 753,26 ± 151,81b 113,25 ± 8,91 nhiều, chồi bị vàng Chật kín không gian TIS Kết cho thấy nghiệm thức sử dụng 6g PLBs cho kết tạo 986,35 PLBs tính 1g PLBs ban đầu sau tuần nuôi cấy lượng PLBs tạo thành vừa đủ lấp kín không gian bình TIS, PLBs có màu xanh tốt, dạng tròn Mật độ thích hợp cho việc nhân PLBs bình TIS Khi sử dụng 6g PLBs để nuôi cấy bình Plantimia có chứa môi trường để nhân PLBs tích 200ml, nhóm nghiên cứu nhận thấy rằng: 56 Thời gian ngập chìm 10 phút với chu kỳ cho hệ số nhân PLBs tăng • nhiều (8545 PLBs) so với chu kỳ ngập lần, PLBs chủ yếu dạng trong, mọng nước khó chuyển sang dạng chồi để phát triển thành hoàn chỉnh Như tần số ngập chìm cao gây thủy tinh thể cho mẫu cấy Thời gian ngập chìm 10 phút với chu kỳ giờ, PLBs bị trương to • bình thường Thời gian ngập chìm phút với chu kỳ cho chất lượng PLBs tốt nhất, • chồi xanh tốt phát triển bình thường Bảng 7: Khảo sát ảnh hưởng tần xuất ngập chìm hệ thống lên việc nhân PLBs Nghiệm Trọng lượng Số PLBs hình thức tươi (g) thành 50,85 ± 5,31 6276,98 ± 413,26b 125,28 ± 11,65 42,27 ± 6,27 6112,30 ± 326,41b 82,96 ± 6,57 /10 phút /5 phút Số chồi Nhận xét PLBs xanh tốt PLBs xanh tốt PLBs to, số /10 phút 68,18 ± 6,96 8545,68 ± 612,45a 187,89 ± 9,60 có dạng mọng nước Tóm lại việc nhân PLBs hệ thống TIS cho kết tối ưu thời gian ngập từ 510 phút với chu kỳ giờ, thể tích nuôi cấy 200ml mật độ 6g PLBs Sau tuần nuôi cấy bình Plantima cho khoảng 6100 PLBs từ 600PLBs ban đầu, tức từ PLBs ban đầu tạo 10-11 PLBs mới, so sánh môi trường thạch, thơi gian nuôi cấy, thể tích mật độ, sau tuần thu 2200 PLBs tức PLBs ban đầu tạo 3-4 PLBs so sánh với nuôi cấy lỏng lắc bình tam giác 250ml với thể tích môi trường 40ml từ PLBs ban đầu tạo 7-8 PLBs Vậy, nuôi cấy hệ thống TIS cho tỉ lệ nhân PLBs gấp lần môi trường thạch gấp 1,3 lần môi trường lỏng 57 Bảng 8: Ảnh hưởng hệ thống nuôi cấy khác lên nhân nhanh PLBs sau tháng nuôi cấy Hệ thống nuôi cấy Số PLBs tạo / 1PLBs ban đầu Lỏng lắc 8,3 ± 0,58 TiS 10,2 ± 1,55 Thạch 3,6 ± 0,31 8.5.3.2.Khảo sát tái sinh chồi từ PLBs hệ thống TIS Nghiệm thức Tỉ lệ PLBs tái Trọng lượng tươi Số chồi /PLBs sinh chồi (%) (g) ban đầu Nhận xét Cụm chồi 20 PLBs 100 11,54 ± 2,19 4,35 ± 0,38ab xanh tốt, tròn mượt, có rễ Cụm chồi 30 PLBs 100 18,41 ± 2,67 4,66 ± 0,71ab xanh tốt, tròn mượt, có rễ Cụm chồi xanh tốt 50 PLBs 100 31,25 ± 5,10 6,30 ± 0,64a nhỏ nghiệm thức 20, 30 PLBs Đối chứng thạch (30 PLBs) Lá bị dún 100 7,24 ± 1,04 1,73 ± 0,26c lại, thân chồi kéo dài Trên hệ thống TIS, từ PLBs ban đầu nhiều tái sinh cho lượng tái sinh vượt trội so với nuôi cấy môi trường thạch Khảo sát mật độ PLBs sử dụng cho giai đoạn tái sinh chồi bình TIS ghi nhận kết bảng sau: 58 Bảng 9: Ảnh hưởng mật độ PLBs lên tái sinh chồi nhân chồi hệ thống TIS Trong bình Plantima mật độ 50 PLBs cho trung bình số tái sinh từ PLBs ban đầu 6,3 so với 1,73 PLBs môi trường thạch (gấp 3,6 lần) Thêm vào đó, sinh trưởng phát triển chồi tái sinh hệ thống TIS vượt trội bình tam giác tiêu chiều cao thân, chiều dài, chiều rộng Bảng 10:Ảnh hưởng tần xuất ngập chìm lên tái sinh chồi từ PLBs Nghiệm thức Trọng lượng tươi(g) Số chồi/ PLBs Nhận xét / phút 25,48 ± 4,84 3,17 ± 0,66c / phút 34,39 ± 6,79 6,46 ± 0,64 a Chồi xanh tốt /3 phút 28,17 ± 4,05 4,46 ± 0,60 b Chồi xanh tốt Chồi xanh tốt, có PLBs dạng cụm Kết cho thấy: Tần xuất ngập phút chu kỳ cho kết số chồi tạo thành PLBs cao nhất.Chu kỳ ngắn (4 giờ) hay dài (8 giờ) cho kết tạo chồi thấp hẳn Điều cho thấy với chu kỳ cho ngập lần mẫu cung cấp chất dinh dưỡng thường xuyên số chồi tạo PLBs 3,17 từ gốc lại tiếp tục tạo thêm PLBs mới, chu kỳ cho ngập lần cho số chồi tạo thành 4,46 so với chu kỳ (6,46 chồi) có lẽ thời gian dài lần bơm (8 giờ) làm mẫu không cung cấp dinh dưỡng thoáng khí cần thiết cho phát triển mẫu, PLBs tái sinh tiếp tục tạo thêm chồi nách chồi phát triển đồng dẫn đến trọng lượng tươi mẫu gia tăng đáng kể (34,39) Trong hệ thống TIS, môi trường không khí luôn có trao đổi bên bên bình thông qua hệ thống bơm màng lọc, chồi Hồ Điệp tái sinh hệ thống TIS phát triển tốt so với bình tam giác kín thông thường thể qua tiêu bảng 11 59 Hình 6: PLBs nhân nhanh hệ thống nuôi cấy TIS Bảng 11: Ảnh hưởng hệ thống nuôi cấy khác lên tái sinh chồi từ PLBs sau tháng nuôi cấy Chiều rộng Hệ thống nuôi Số chồi /mẫu Chiều cao thân Chiều cao cấy (mm) (mm) ± 0,36 ± 0,14 ± 0,5 ± 0,23 ± 0,24 ± 0,22 cấy (mm) Bình tam giác (môi trường 1,73 thạch ) TIS (môi trường lỏng) 6,30 Hình 7: Chồi tái sinh từ PLBs hệ thống TIS bình tam giác a1, a2, a3 :Chồi tái sinh từ PLBs hệ thống TIS 60 b: Chồi tái sinh từ PLBs bình tam giác 8.5.3.3 Khảo sát rễ chồi Hồ Điệp tái sinh từ PLBs hệ thống TIS Kết thí nghiệm từ hệ thống nuôi cấy khác lên sinh trưởng phát triển chồi Hồ Điệp cho thấy hệ thống có nhiều thông thoáng chồi Hồ Điệp sinh trưởng phát triển tốt Ở hệ thống TIS nhờ hệ thống bơm đẩy môi trường lên để tạo ngập chìm cho mẫu cấy, trình bơm môi trường khí bình trao đổi nên bình có thông thoáng nhiều so với bình tam giác Những Hồ Điệp hệ thống TIS có độ thông thoáng tốt phát triển mạnh so với bình tam giác không thoáng khí thể tiêu chiều cao, chiều dài chiều rộng lá, số rễ chiều dài rễ Bảng 12: Ảnh hưởng tần suất ngập chìm lên rễ phát triển chồi Hồ Điệp Nghiệm Trọng lượng Số chồi / số Chiều rộng Chiều dài rễ Tình thức tươi (g) chồi ban đầu (cm) (cm) trạng 47,39 ± 6,27 3,79 ± 0,65a 0,68 ± 0,06b 0,92 ± 0,16c 60,19 ± 7,78 3,39 ± 0,59a 0,97 ± 0,09a 2,62 ± 0,29a 0,77± 0,05b 1,67 ± 0,14b /3 phút /3 phút /3 phút 43,23 ± 5,39 2,59 ± , 26b Xanh mướt Xanh mướt Xanh mướt Bảng 13: Ảnh hưởng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời lên sinh trưởng phát triển chồi Hồ Điệp sau tháng nuôi cấy Hệ thống Chiều nuôi cấy Chiều dài cao Chiều rộng Chiều dài Số rễ rễ thân (mm) (mm) (mm) 15 ± 0,4 ± 0,2 11 ± 0,3 10 ± 0,1 20 ± 0,6 9,8 ± 0,4 15 ± 0,7 26 ± 0,2 (mm) Bình tam giác 500ml TIS 61 Hình 8: Sự sinh trưởng phát triển chồi Hồ Điệp hệ thống TIS bình tam giác 500 ml a : Cây Hồ Điệp hệ thống TIS b : Cây Hồ Điệp bình tam giác 500 ml Hệ thống ngập chìm tạm thời hội tụ đủ điều kiện cần thiết ngập không lâu, thoáng khí tốt giúp không bị thủy tinh thể, tăng cường khả quang hợp nên phát triển đặn, thích hợp cho trình tạo rễ khỏe mạnh trước đưa vườn ươm Tóm lại, nuôi cấy hệ thống TIS giúp phát triển nhanh mạnh nuôi cấy hệ thống kín thông thường giúp rút ngắn thời gian để đạt kích thước để đưa vườn ươm 8.5.4 Nhân nhanh phôi Protocorm – like body lan Hồ Điệp hệ thống Bioreactor 8.5.4.1 Xác định môi trường tối ưu tăng sinh phôi PLB Sau tuần nuôi cấy, tiêu trọng lượng tươi, đường kính phôi PLB P.amabilis trình bày bảng sau Bảng 14: Ảnh hưởng BA lên tăng sinh phôi PLB môi trường nuôi cấy bổ sung 0,5 mg /l NAA 20 % nước dừa sau tuần nuôi cấy Môi trường Trọng lượng tươi (mg) Nhận xét Phôi PLB tạo thành có màu vàng nhạt V1 3874a xanh thẫm, cụm lông xung quanh Đường kính từ 1-1,5 mm Phôi PLB tạo thành có màu vàng nhạt V2 3812b xanh thẫm, vài PLB có cụm lông xum quanh Đường kính từ 1-2 mm Một số PLB lớn có màu xanh thẫm xuất V3 3420c PLB có độ đồng lớn, đường kính mm V4 2597d PLB tạo thành chưa hoàn thiện, cấu trúc rõ ràng 62 Môi trường V5 V6 V7 Trọng lượng tươi (mg) Nhận xét 4312a PLB tạo thành có màu xanh thẫm, có cụm lông xum quanh, đường kính 1-1,5 mm 3812b Phôi PLB tạo thành có màu vàng nhạt xanh thẫm, vài PLB có cụm lông xum quanh Đường kính 1-2 mm 4289a PLB tạo thành có màu xanh thẫm, có cụm lông xung quanh, đường kính từ 11,5 mm Ghi chú: Những mẫu tự khác nêu cột biễu diễn khác có ý nghĩa với α =0,05 Duncan, s test Bảng 15: Ảnh hưởng NAA lên tăng sinh phôi PLB môi trường nuôi cấy bổ sung 2,0 mg / l BA 20 % nước dừa sau tuần nuôi cấy Kết thu nhận cho thấy, nghiệm thức V V2 PLB tạo thành có màu xanh đậm, cụm lông xung quanh, đường kính PLB từ 1-1,5 mm Ở nghiệm thức, khối lượng PLB tạo lớn PLB phát triển Ở nghiệm thức V3, PLB tạo thành lớn hơn, phát triển hơn, có độ đồng cao có hình dạng rõ ràng Ở nghiệm thức V V7, khối lượng PLB tạo lớn nhất, có phát triển đồng PLB, đường kính trung bình 1,5 mm Còn nghiệm thức V4 V6 phôi PLB chưa có phân hóa rõ ràng, cụm phôi PLB dính vào gây khó khăn cho trình cấy chuyền mẫu trình hình thành Ở nghiệm thức V8, PLB tạo thành có màu xanh thẫm, đường kính trung bình 1,5 63 mm, PLB đồng nhau, số PLB phát triển thành Điều giải thích tác động kích thích hình thành chồi cytokinin có nước dừa, nước dừa nồng độ cao ta thấy rõ điều so với nghiệm thức lại V9, V10và V11 Ở nghiệm thức này, phôi PLB nhỏ, cụm phôi PLB dính vào gây khó khăn cho trình cấy chuyền trình hình thành sau Còn nghiệm thức V 12, có phân hóa phôi rõ ràng sinh khối tạo Hình 9: Sự phát sinh phôi PLB môi trường ít, hiệu Tóm lại, môi trường MS bổ sung 2,0 mg /l BA, 1,0 khác mg/l NAA 20 % nước dừa môi trường tối ưu cho tăng sinh phôi PLB lan Hồ Điệp P amabilis Bảng 16: Ảnh hưởng nước dừa lên tăng sinh phôi PLB môi trường nuôi cấy bổ sung 2,0 mg /l BA 0,5 mg /l NAA sau tuần nuôi cấy Môi trường Trọng lượng tươi (mg) Nhận xét PLB tạo thành có màu xanh đậm V8 4137a Đường kính từ 1-1,5 mm Có hình thành từ PLB Phôi PLB tạo thành có màu vàng V9 3812b nhạt xanh thẫm PLB, số PLB có cụm lông xum quanh Đường kính từ 1-2 mm V10 2480c Phôi va PLB tạo thành có màu vàng 64 nhạt xanh thẫm PLB cụm lông xum quanh Đường kính từ 1- 1,5 mm Phôi tạo thành có màu vàng nhạt không V11 1197d có tạo thành PLB Đường kính phôi từ 1- mm V12 PLB có màu xanh thẫm Có hình 850e thành từ PLB 8.5.4.2 Ảnh hưởng hệ thống nuôi cấy bioreactor lên tăng sinh phôi PLB Một số ưu điểm hệ thống bioreactor là: Các thành phần môi trường nuôi cấy sử dụng tối đa nhờ có đảo trộn trình sục khí, mẫu cấy ngập môi trường cấy lỏng không bị úng không xãy tượng thủy tinh thể Kết thu sau tuần nuôi cấy hệ thống bioreactor hệ thống đối chứng trình bày bảng Bảng 17: Những kết thu hai hệ thống nuôi cấy khác sau tuần nuôi cấy Hệ thống nuôi cấy Khối lượng mẫu Trước nuôi cấy Thu hoạch Đường kính phôi Tỷ lệ sống Tỷ lệ tăng PLB (mm) sót (%) sinh (%) Trước nuôi cấy Thu hoạch Bioreactor 36,00 172,19a – 1,5a 5,5a 58,32a 4,78a Đối chứng 36,00 67,19b – 1,5a -1,5b 26,55b 1,86b PLB lan Hồ Điệp thích hợp với hệ thống nuôi cấy bioreactor có sục khí liên tục nuôi cấy môi trường thạch Với hệ thống bioreactor, không khí bên môi trường nuôi cấy thay liên tục có thành phần CO 2/ O2 gần giống với môi trường bên ngoài, điều làm cho môi trường thông thoáng nên mẫu cấy có khả trao đổi khí nhiều hơn, mẫu cấy sinh trưởng phát triển tốt so với môi trường thạch Các tiêu so sánh hai hệ thống nuôi cấy : 65 tỷ lệ sống sót, tỷ lệ tăng sinh, kích thước phôi PLB Tỷ lệ sống sót (58,32), tỷ lệ tăng sinh (4,78 lần) đường kính (5,5 mm) phôi PLB hệ thống bioreactor cao tỷ lệ sống sót (26,55), tỷ lệ tăng sinh (1,86 lần), đường kính (1,5 mm) phôi PLB hệ thống đối chứng Hình 10: a) Sự tăng nhanh Phalaenopsis PLB hệ thống bioreactor (1lít kiểu cột) sau tuần b) Sự tái sinh tăng trưởng từ PLB hệ thống bioreactor; c) Sự thích nghi nhú.s KẾT LUẬN Từ thí nghiệm thấy nhân giống Hồ Điệp nhờ hệ thống nuôi cấy ngập chìm hệ thống bioreactor tốt • Đối với nghiên cứu giống Hồ Điệp lai Dtps Taida Salu, nuôi cấy hệ thống TIS cho tỷ lệ nhân PLBs gấp lần môi trường thạch gấp 1,3 lần môi trường lỏng Đối với giai đoạn tái sinh chồi nhân chồi, hệ thống TIS cho tỷ lệ nhân chồi gấp 3,6 lần so với hệ thống nuôi cấy tên thạch Từ giúp gia tăng tỉ lệ lên 10,8 lần so với phương pháp truyền thống khác • Đối với hệ thống nuôi cấy bioreactor, môi trường tối ưu cho nhân nhanh phôi PLB môi trường MS bổ sung 2mg /l BA, 1mg /l NAA 20% nước dừa 66 Từ kết xin đưa quy trình nhân giống invitro lan Hồ Điệp sau Cây mẫu Quả Cành hoa Khử trùng kép Khử trùng MS +Knudson C (trục phát hoa) VW + 100ml + 10 g đường + 30 g KT + 1g pepton + 6,5 g agar ( gieo hạt ) Protocorm, chồi Nhân nhanh MS + 2,0 mg /l BA + 0,1 mg /l NAA +20% nước dừa (bioreactor ) MS 1/2 + nước dừa + pepton + dịch khoai tây + sucrose ( ngập chìm ) Cây giống in vitro Vườn ươm 10 TÀI LIỆU TRÍCH DẪN -Dương công kiên (2006), giáo trình Nuôi Cấy Mô tập III, nhà xuất đại học quốc gia TP.HCM -Võ Thị Bạch Mai (2004), Sự phát triển chồi rễ, nhà xuất đại học quốc gia TP.HCM -Nguyễn Cửu Thành Nhân, Nguyễn Thanh Hải cộng (2007), trích “Công nghệ sinh học thực vật công tác nhân giống chọn tạo giống hoa”, Nhà xuất Nông Nghiệp TP.HCM 67 -Cung Hoàng Phi Phượng, Nguyễn Văn Hiếu cộng (2007 ), trích “Công nghệ sinh học thực vật công tác nhân giống chọn tạo giống hoa”, Nhà xuất Nông Nghiệp TP.HCM -Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2005), “Lan Hồ Điệp kỷ thuật chọn tạo giống trồng”, Nhà xuất Nông Nghiệp Hà Nội 68