Lịch sử và thành tựu của nuôi cấy mô, các phương pháp nhân giống invitro, tìm hiểu về nhân giống lan Hồ Điệp, nhân giống invitro lan Hồ Điệp,... là những nội dung chính của đề tài Các phương pháp nhân giống in vitro lan Hồ Điệp. Mời các bạn cùng tham khảo.
Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Phần I: Mở Đầu Cuộc sống ngày càng phát triển, nhu cầu tạo một gốc vườn nhỏ mang màu xanh cây lá thiên nhiên vào trong nhà của người dân ngày càng cao.Vốn nhiều họ, nhiều chủng loại, màu sắc phong phú lại tốn ít diện tích nên việc chọn trồng và tạo một vườn lan nhỏ trong khn viên nhà là sự lựa chọn của nhiều cá nhân, nhiều hộ gia đình.Trong số những loại phong lan được ni trồng nước ta hiện nay, bên cạnh những lồi tương đối dễ trồng như Mokaro, Dendro, lan Vũ Nữ…thì vẫn có những lồi lan thích hợp với một số khu vực địa lý nhất định, cụ thể là Địa Lan – lồi hoa chỉ có thể ni trồng trong điều kiện lí tưởng của Đà Lạt .[4] Khơng q kén chọn và hạn chế nơi trồng như Địa Lan song Hồ Điệp cũng là một trong những giống lan q lại khó trồng. Do đó, đòi hỏi người trồng phải có đơi chút am hiểu về lồi hoa này.Thích hợp với điều kiện trong nhà lại là một trong những giống lan được u thích khơng chỉ về màu sắc, kiểu dáng mà còn mang một nét đẹp rất sang trọng, trang nhã. Chính vì vậy, Hồ Điệp đã nhanh chống trở thành sản phẩm trồng trọt được nhiều người ưa chuộng và mang lại hiệu quả kinh tế cao khơng chỉ ở Việt Nam mà còn ở nhiều nước trên thế giới như:Đài Loan, Hàn Quốc, Nhật Bản, Mỹ…Bên cạnh đó, hoa Hồ Điệp rất lâu tàn, độ bền bơng cao, giàu sức quyến rũ nên nó đã được lựa chọn làm vật trang trí, tạo cảnh quan trong các ngày lễ, tết.Vốn là một lồi rất khó nhân giống bởi Hồ Điệp thường cho hệ số nhân rất thấp trong điều kiện vườn ươm. Để có được số lượng lớn cây giống đồng đều và sạch bệnh đáp ứng nhu cầu thị trường là một vấn đề thật nan giãi. Do đó, việc nhân giống bằng kỷ thuật ni cấy mơ ra đời tạo ra hàng loạt cây con ổn định về mặt di truyền, sạch bệnh, giá cả lại phải chăng là rất hữu ích. Xuất phát từ thực tiễn này cộng với sự đam mê của chính bản thân mình, tơi đã tiến hành tìm kiếm sưu tập từ đó đưa ra đề tài: “Các phương pháp nhân giống in vitro lan Hồ Điệp”. SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Phần II: Nội Dung II.1 Tổng quan tài liệu 1.1 Lịch sử và thành tựu của nuôi cấy mô [5] 1.1.1 Trên thế giới Năm 1902, nhà thơng thái Haberlant lần đầu tiên đưa ra ý tưởng cấy mơ của sinh vật ra ngồi cơ thể nhưng ơng đã dùng tế bào q chun biệt nên khơng thành cơng. Mơ động vật được cấy trước tiên do A.Carrel(1919), đến năm 1934 mơ thực vật mới được ni cấy Năm 1934 White đã thành cơng trong việc phát hiện ra sự sống vơ hạn của việc ni cấy tế bào rễ cà chua Năm 1964 Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ ni cấy chồi ngọn. Ơng đã thành cơng trơng việc chuyển cây con của cây sen cạn và cây White Lupin từ mơi trường ni cấy tối thiểu, tuy nhiên việc nhân giống vẫn chưa hồn chỉnh. Sau đó, nhiều nhà nghiên cứu đã khám phá những thành phần dinh dưỡng qua trọng cần thiết cho sự phát triển của tế bào được ni cấy (White (1951),Gauthere (1939),Van Overbeck (1941), Steward và Caplin (1951)) Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự nảy chồi Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến mơi trường ni cấy đánh dấu một bước tiến trong kỷ thuật ni cấy mơ. Mơi trường của họ dùng làm cơ sở cho việc ni cấy nhiều loại cây và vẫn còn sử dụng rộng rải cho đến ngày nay Năm 19601964, Morel cho rằng có thể nhân giống vơ tính lan bằng ni cấy đỉnh sinh trưởng.Từ kết quả đó, lan được xem là cây ni cấy mơ đầu tiên được thương mại hố. Từ đó đến nay, cơng nghệ ni cấy mơ tế bào thực vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác (Haramaki(1971), Murashige(1972), Miller và Murashige (1976)) và được ứng dụng thương mại hóa 1.1.2 Ở Việt Nam Ni cấy mơ tế bào thực vật đã được phát triển Việt Nam sau chiến tranh thế giới kết thúc (1975). Phòng thí nghiệm ni cấy mơ và tế bào đầu tiên được xây dựng đầu tiên viện sinh học, viện khoa học Việt Nam(KHVN) do tiến sĩ Lê Thị Muội đứng đầu. Bước đầu tập trung nghiên cứu những vấn đề cơ bản như ni cấy bao phấn, ni cấy mơ sẹo và protoplast. Các kết quả đầu tiên về ni cấy thành cơng bao phấn lúa và thuốc lá được cơng bố năm 1978 (Lê Thò Muội và cs,, SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp 1978; Lê Thò Xuân và cs,, 1978). Tiếp đó là thành cơng về protoplast ở thuốc lá và khoai tây (Lê Thị Muội và Nguyễn Đức Thành(1978),Nguyễn Đức Thành và Lê Thị Muội 1980,1981).Trong cùng thời gian tại phân viện KHVN tại Tp.HCM, muội hơn nửa là tại Đại học Nơng Nghiệp I (ĐHNNI) Hà Nội và Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nơng Nghiệp Việt Nam (KHKTNNVN) và các phòng thí nghiệm ni cấy mơ và tế bào cũng được thành lập chủ yếu tập trung vào vi nhân giống khoai tây . Hiện nay, chúng ta có rất nhiều phòng thí nghiệm ni cấy mơ khơng những ở các trường đại học các viện nghiên cứu (viện Di Truyền Nơng Nghiệp(DTNN), viện Rau Quả Trung ương(RQTƯ)) mà cả một số tỉnh và cơ sở sản xuất(n Bái ,Hưng n, Thanh Hóa….). Giữa những năm 1980 trở lại đây, các hướng nghiên cứu ứng dụng ni cấy mơ và tế bào thực vật phát triển mạnh. Những kết quả khích lệ đã đạt được trong lĩnh vực vi nhân giống khoai tây(viện Công Nghệ Sinh Học (CNSH), ĐHNNI, viện KHKTNNVN), dứa, chuối, mía (viện CNSH, ĐHNNI, viện KHKTNNVN, viện RQTƯ) một số cây hoa phong lan (phân viện CNSH thành phố Hồ Chí Minh), Hồng, Cúc, Cẩm Chướng(viện CNSH, viện DTNN) và cây cơng nghiệp như bạch đàn (viện DTNN, viện Lâm Nghiệp). Một số kết quả bước đầu đã ghi nhận trong lỉnh vực chọn dòng tế bào như chọn dòng tế bào kháng bệnh (Lê Bích Thủy và cs,, 1994), chọn dòng chịu muối ,chịu mất nước (Nghuyễn Tường Vân và cs ,,1994; Đinh Thị Phòng và cs,, 1994). Các kết quả về dung hợp cây lai tế bào chất và chuyển gen lục lạp củng thu được kết quả lý thú (Nguyễn Đức Thành và cs,, 1988; Nguyễn Đức Thành và cs,, 1993, 1997) ni cấy bao phấn để tạo dòng thuần đã được ứng dụng nhiều ở viện CNSH và DTNN. Ni cấy các dược liệu q để bảo tồn nguồn gen và tạo các tế bào có hàm lượng các chất sinh học quan trọng cao cũng đã và đang phát triển 1.2 Các giai đoạn nhân giống invitro [5] Cho tới việc nhân giống invitro áp dụng cho nhiều loại (350 lồi, Murashige (1974) chia quy trình nhân giống ra làm 4 giai đoạn : Ni cấy khởi đầu, tái sinh chồi, cụm chồi Nhân nhanh chồi, cụm chồi trong điều kiện invitro Tạo cây con hồn chỉnh, huấn luyện cây con Phục hồi, chuyển cây ra trồng trong điều kiện tự nhiên 1.3 Các phương pháp nhân giống invitro [5] 1.3.1 Ni cấy đỉnh sinh trưởng SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Một phương thức dễ dàng nhất đạt được mục tiêu trong ni cấy mơ tế bào thực vật là ni cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm ni cấy chồi đỉnh và ni cấy chồi bên). Sau khi vơ trùng, mẫu sẽ được ni cấy trên mơi trường thích hợp chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng khống vơ cơ và hữu cơ hoặc mơi trường khống có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp. Từ một đỉnh sinh trưởng, sau một thời gian ni cấy nhất định mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Chồi tiếp tục phát triển thân, ra lá và rể để thành một cây hồn chỉnh. Cây con được chuyển dần ra đất và thích nghi bình thường 1.3.2 Ni cấy mơ sẹo Mơ sẹo là một khối tế bào phát triển vơ tổ chức, hình thành do sự phân hóa của các tế bào đã được phân hóa. Mơ sẹo sẽ phát triển nhanh khi mơi trường có sự hiện diện của auxin. Khối mơ sẹo có khả năng phát triển thành cây con hồn chỉnh trong điều kiện mơi trường khơng có chất kích thích tạo mơ sẹo. Ni cấy mơ sẹo được thực hiện đối với các loại thực vật khơng có khả năng nhân giống thơng qua ni cấy đỉnh sinh trưởng. Cây tái sinh từ mơ sẹo có đặc tính giống như cây mẹ. Từ một cụm tế bào mơ sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là ni cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma lại cao hơn 1.3.3 Ni cấy tế bào đơn Khối mơ sẹo được ni cấy trong mơi trường lỏng và được đạt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẽ gọi là tế bào đơn.Tế bào đơn được lọc và ni cấy trên mơi trường đặc biệt để tăng sinh khối Với các chất thích hợp được bổ sung vào mơi trường, tế bào có khả năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học. Sau một thời gian ni cấy kéo dài trong mơi trường lỏng tế bào đơn được tách ra và trải trên mơi trường thạch + Khi mơi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành từng cụm có mơ sẹo + Khi mơi trường thạch có tỷ lệ cytokinine/auxin thích hợp, tế bào đơn có khả năng tái sinh thành cây con hồn chỉnh 1.3.4 Ni cấy protoplastchuyển gen Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn được tách bởi vỏ cellullose, có sức sống và duy trì đầy đủ các chức năng sẵn có Trong điều kiện ni cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh cây hồn chỉnh (tính tồn thể ở thực vật). Khi tế bào chất mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung hợp với SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp nhau tạo tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng. Q trình dung hợp protoplast có thể thực hiện trên hai đối tượng cùng lồi hay khác lồi 1.3.5 Ni cấy hạt phấn đơn bội Hạt phấn ở thực vật được ni cấy trên những mơi trường thích hợp tạo mơ sẹo. Mơ sẹo này được tái sinh thành cây hồn chỉnh là cây đơn bội. II.2 Tìm hiểu về nhân giống lan Hồ Điệp 2.1 Nguồn gốc và đặc điểm của lan Hồ Điệp [4] 2.1.1 Nguồn gốc Lan Hồ Điệp là giống lan có tên gọi Phalaenopsis, thuộc họ phụ Vandeae Tên gọi Phalaenopsis bắt nguồn từ tiếng Hi Lạp trong đó Phalaina có nghĩa là “con bướm” và Opsis có nghĩa là “giống như” Lan Hồ Điệp được khám phá năm 1750, đầu tiên được ơng Rumphius đặt tên là Angraecum album, năm 1753 Linne đổi tên thành Epidendrum, 1825 nhà thực vật Hà Lan định danh lại là Phalaenopsis. Lồi hoa này có xuất xứ miền Bắc Australia, Ấn Độ và các nước Đơng Nam Á như Philippine, Inđơnêsia, bán đảo Đơng Dương. Q hương của lan Hờ Điệp là các nước của vùng Đơng Nam Á, rừng Việt Nam khơng có lồi Phalaenopsis amabilis, chỉ có 5 lồi tương tự được biết là Phaenopsis mannii, Phalaeopsis gibbosa, Phalaenopsis lobbi, Phalaenopsis fuscata và Phalaenopsis cornucervi. Lan Hồ Điệp được trồng mọi nơi trên thế giới, hầu hết là Đức, Nhật bản, Phần Lan, Đài Loan, Thái Lan và Mỹ. Cây con được ni cấy mơ nhiều ở các nước Phần Lan, Thái Lan, Đài Loan…Hiện nay giống Hồ Điệp có trên 70 lồi và càng ngày càng lai tạo ra rất nhiều 2.1.2 Đặc điểm Lan Hồ Điệp là cây đơn thân, ngắn, lá to, dày, mọc sát vào nhau. Hoa nở ln phiên hết cái này đến cái khác, thời kì nở hoa thay đổi theo lồi và thường nở trong vài tháng. Phát hoa mọc từ nách lá, dài, chùm hoa nở từng cái, 3 đài to tròn, hai cánh x rộng kín, sắc đẹp. Mơi hoa cong dẹp có hai râu dài nên cả đóa hoa trong giống như con bươm bướm. Hai hàng hoa xếp đều đặn 2 bên cành, khẽ đong đưa như đàn bướm xinh xắn đang bay lượn chập chờn. Trụ có hình bán nguyệt với hai phân khối u lên, chứa đầy phấn hoa. Số hoa trên cành biểu thị sức sống của cây. Số lượng SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp càng nhiều thì cây càng sung sức. Riêng đặc tính phân nhành hoa lại tùy thuộc nhiều vào từng loại giống Lan Hồ Điệp có màu sắc phong phú, khơng thua kém bất cứ giống lan nào khác từ trắng, hồng, đỏ, vàng, tím đến các loại Hồ Điệp có sọc nằm ngang hoặc thẳng đứng, hoặc có đốm to hay nhỏ…Lan Hồ Điệp sinh trưởng chậm, khoảng 40 ngày với điều kiện chăm sóc tốt mới mọc thêm một lá hồn chỉnh. Khi cây có trên 4 lá mới có thể phân hố mầm hoa. Lồi lan này có độ bền bơng cao trong điều kiện thích hợp, rất thích hợp để trồng trong nhà, dễ ra hoa. Nhưng nó vốn vẫn là lồi hoa khó tính 2.2 Điều kiện sinh thái [5] 2. 2.1 Nhiệt độ [3] Lan Hồ Điệp có nguồn gốc từ miền nhiệt đới, do đó nhiệt độ thích hợp để trồng Lan Hồ Điệp tương đối cao, nhiệt độ thích hợp để trồng ban ngày là từ 25 280C, ban đêm là 18200Cgiai đoạn ươm cây non thì cần nhiệt độ ban đêm khoảng 230C . Nếu nhiệt độ nhà trơng nhỏ hơn 150C rễ cây ngừng hút chất dinh dưỡng, q trình sinh trưởng ngừng lại, thậm chí bị lạnh hại làm rụng hoa hoặc làm cho cánh hoa xuất hiện các đốm nhỏ ảnh hưởng đến vẽ đẹp của hoa, giai đoạn phấn hoa đòi hỏi phải có sự cách biệt khá cao về độ lêch nhiệt độ ngày /đêm, nhiệt độ ban ngày thích hợp nhất là 25 0C, ban đêm 10200C, kéo dài 36 tuần rất có lợi cho sự phân hóa hoa. 2. 2.2 Nước tưới Hồ Điệp là lồi đơn thân, khơng có giả hành nên khơng dự trữ nước, hơn nữa diện tích bốc hơi của bản lá khá lớn và chúng khơng có mùa nghỉ vì thế phải cung cấp cho khơng một lượng nước đầy đủ và thường xun trong suốt năm. Trong mùa mưa mỗi ngày phải tưới cho chúng 2 lần, trừ những ngày có mưa, một lần vào 9 giờ sáng, một lần vào 3 giờ chiều. Tưới như vậy sẽ đảm bảo cây khơ ráo khi trời tối vì đọng nước ở nách lá suốt đêm có thể gây ra sự thối rữa. Vào mùa nắng, nên tưới cho chúng 1 ngày 3 lần. Điều kiện thốt nước là tương đối quan trọng, Hồ Điệp khơng thể chịu được một độ ẩm lắng đọng (nhất là ban đêm), vì rất đễ tạo điều kiện cho bệnh thối rữa phát triển. Tốt nhất cứ ba ngày ta nên pha Dithane M45, Maneb, Captan vào trong nước tưới với nồng độ 1/400 để ngừa chứng bệnh nói trên. Nên nhớ, Hồ Điệp là lồi lan thích hợp với giá thể và nước tưới có pH khá thấp (pH=5,2) vì thế phải dùng axít phơtphoric để giảm pH của nước. SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Ở nước ta, vào mùa mưa Hồ Điệp tăng trưởng mạnh hơn, nhưng những giọt mưa nặng hạt cũng khơng kém phần nguy hiểm vì thế đa số các loại Hồ Điệp bị chết do những cơn mưa đầu mùa. Đây cũng là một hình thức tưới của thiên nhiên mà ta khơng kiểm sốt được. Do đó để ngừa tình trạng trên, mái giàn che Hồ Điệp nên dùng những tấm tơn nhựa xanh, như vậy sẽ loại trừ những trận mưa khơng cần thiết và tạo được những tia sáng khuếch tán rất lý tưởng Vào mùa khơ, ta vẫn duy trì mức độ tưới đều đặn như trong mùa mưa, vì lúc này ẩm độ trong khơng khí giảm xuống rõ rệt. Do đó, sự tăng số lần tưới nhằm mục đích tạo cho cây tăng trưởng liên tục. Nếu cây có trạng thái thiếu nước, ủ rũ bạn nên chuyển cây sang vị trí khác hoặc tăng số lần tưới lên. Một lần tưới bổ sung vào giữa trưa trong mùa khơ rất thích hợp cho sự phát triển của Hồ Điệp 2. 2.3 Ánh sáng [3] Lan Hồ Điệp rất kỵ ánh sáng chiếu thẳng trực tiếp, do đó phải có biện pháp che sáng đồng thời tùy thuộc vào cây lớn nhỏ mà có biện pháp điều chỉnh ánh sáng cho thích hợp. Thời kỳ ươm cây non nhu cầu về ánh sáng có cường độ 10.000 12.000 lux, giai đoạn cây bánh tẻ là 12.00020.000 lux, giai đoạn thúc ra hoa 20.000 30.000 lux. Trong điều kiện trồng trong nhà lưới, mùa hè và mùa thu phải che đi 75 85% ánh sáng, cần phải có hai lớp che sáng đặt chồng lên nhau, mùa đơng xn thì ánh sáng yếu hơn chỉ cần che 4050% là đủ. 2. 2.4 Độ thơng thống Rất cần thiết vì Hồ Điệp hay bị bệnh thối nhũn lá (phõng lá), sự thơng thống giúp lá cây mau khơ sau khi tưới và bộ rễ khơng bị úng nước nên hạn chế bệnh rất nhiều. Ở nước ta vào mùa mưa Hồ Điệp tăng trưởng mạnh những giọt mưa nặng hạt có thể làm thối đọt. Do đó để ngăn ngừa tình trạng trên nên dùng những tấm tơn nhựa xanh để che. Có một số trường hợp trồng Hồ Điệp trên cao (sân thượng) có hiệu quả hơn. Tuy nhiên gió nhiều và mạnh dễ làm cây mất nước nhanh nếu ta khơng cung cấp đủ lá cây sẽ héo rũ, nhăn. 2. 2.5 Dinh dưỡng Hồ Điệp cần dinh dưỡng thường xun, quanh năm vì khơng có mùa nghỉ . Khi tưới phân khơng nên tưới với nồng độ cao càng đừng tưới lên đọt, nhất là lúc lá non mới nhú ra từ đỉnh sinh trưởng. Hồ Điệp cần phân bón tưới với nồng độ lỗng và có thể tưới nhiều lần trong tuần. Có thể tưới thêm phân hữu cơ như: bánh dầu 15 ngày/lần, vitamin B1, kích thích ra rễ… SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Cách tưới phân + Thời kỳ cây dưới 12 tháng tuổi cần dùng N, P, K với tỷ lệ cao 3010 10, sau đó dùng phân N, P, K với tỉ lệ 202020 hoặc 181818 cho đến lúc ra hoa. Tuy nhiên vào mùa mưa nếu tưới phân 301010 thấy cây yếu mềm quá có thể tăng cường lượng lân và kali bằng cách xen kẽ phân 202020 hoặc 181818 (dù là cây con), để cây được cứng cáp, tăng cường sức đề kháng sâu bệnh + Lúc cây trưởng thành (1824 tháng tuổi) vào thời điểm cuối năm, thời tiết lạnh có thể kích thích cây ra hoa bằng cách tưới phân 103030, đến khi cây bắt đầu nhú cành hoa rồi ta trở lại tưới phân 202020 cho đến lúc hoa nở và tàn. Khơng nên để cành hoa lâu q trên cây, khi nụ hoa cuối cùng đã nở và có 1, 2 hoa bắt đầu héo, thì ta nên cắt cành hoa bỏ đi để dưỡng sức cho cây. Khi cắt cành hoa càng sớm thì lá mới ra mau và cây sinh trưởng tốt hơn để lần ra hoa sau sẽ mạnh hơn. 2.2.6 Sâu bệnh Đối với phong lan, việc phòng bệnh hết sức quan trọng, vì khi cây đã bị bệnh rất khó trị và có thể làm chết cây. Ngồi việc chăm sóc lan kỹ lưỡng đều đặn, tưới nưới và dinh dưỡng cần phải tưới thêm thuốc trừ nấm bệnh nhằm tăng sức đề đề kháng cho cây. Lan Hồ Điệp hay bị con bọ trĩ chích tạo vết thương trên lá từ đó vi khuẩn xâm nhập gây bệnh thối nhũn trên lá. Có thể dùng một số loại thuốc để phòng trị như Malathion, lannat… để phòng trị 2.2.7 Chậu, giá thể, cách trồng Cách trồng chung nhất cho các loại Hồ Điệp là chậu thật thống, có nhiều lỗ có thể sử dụng chậu đất nung có nhiều lỗ hay chậu nhựa cũng được. Chậu phải thật sạch khơng có rêu bám trên thành chậu. Thơng thường các nhà vườn trồng lan với số lượng lớn (vài ngàn cây) thường dùng than, dớ, xơ dừa, mút… làm giá thể để trồng lan Hồ Điệp. Có rất nhiều cách trồng lan Hồ Điệp tuỳ theo từng vùng. Nhưng có điểm chung là than, mút nằm dưới đáy chậu, còn xơ dừa hay dớn sẽ nằm trên miệng chậu cách trồng này giúp cây thốt nước tốt vào mùa mưa, khơng bị thối rễ và phát triển tốt. Trong thời gian khoảng 2 năm ta thay chậu một lần, nếu cây lớn q mau có thể thay chậu sớm hơn. 2.3 Tình hình sản xuất lan Hồ Điệp ở Việt Nam [5] Hiện nay, tại TP.HCM cây lan Hồ Điệp được xem là cây trồng chiến lượt trong việc chuyển đổi cơ cấu cây trồng và vật ni. Đây là cây trồng đem lại hiệu cao gấp 23 lần so với việc trồng lúa, hoa màu v.v Trong xu thế đất trồng ngày càng hẹp thì cây lan khơng chiếm diện tích đất nhiều nên là giải pháp rất hiệu SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp quả. Khơng chỉ đẹp về màu sắc, hình dáng, hoa lâu tàn… giá thành rẻ nên ngày càng được ưa chuộng và ni trồng. Tại TP.HCM và các tỉnh lân cận có rất nhiều vườn trồng Hồ Điệp với qui mơ từ vài trăm đến vài nghìn cây. Điển hình là cơng ty Lâm Thăng của Đài Loan đầu tư và cơng ty Kim Ngân chun trồng về lan Hồ Điệp, hàng năm có thể cung ứng cho thị trường từ vài ngàn đếm vài chục ngàn cây, nhất là vào dịp Tết Ngun Đán. Tuy nhiên do khơng có sự liên kết giữa các nhà vườn nên sản phẩm làm ra khơng tìm được thị trường tiêu thụ, giữa cung và cầu khơng hợp lý Về nguồn cây giống thì nước ta do khơng đầu tư nên cây giống khơng đạt chất lượng tốt, giống mới khơng nhiều nên các nhà vườn thường nhập giống từ các nước như Thái Lan, Đài Loan…Ngồi ra hàng năm việc nhập khẩu hoa từ các nước này ước tính tiêu tốn hàng triệu USD. So với các nước có ngành trồng lan phát triển Đài Loan hay Thái Lan thì ngành trồng nước ta cần phải học hỏi nhiều và cần phải có chính sách phát triển hợp lý nhằm đem lại hiệu quả kinh tế cao hơn 2.4. Nhân giống invitro lan Hồ Điệp 2.4.1 Nhân giống Hồ Điệp lai từ trục phát hoa [14] 2.4.1.1. Vật liệu và phương pháp ni cấy Trục phát hoa Hồ Điệp lai được cắt khi các hoa gần tàn. Các mắt được làm sạch và tẩy trùng bằng phương thức của Scuully, có 4 loại chồi khác nhau trên các khúc mắt được dùng trong thí nghiệm Chồi ngun vẹn được dùng để kiểm chứng Chồi bị làm chấn thương bằng cách cắt bỏ 2/3 chồi theo mặt cắt song song với trục phát hoa và như thế mặt cắt sẽ nghiêng với hướng mọc một gốc α Chồi bị làm chấn thương bằng cách cắt chồi làm hai mặt cắt theo trục Đâm dọc chồi bằng một kim nhọn từ đỉnh xuống gốc 2.4.1.2 Điều kiện ni cấy Mơi trường Murashige và Skoog( M+S) Mơi trường Knudson C pH:5.8 Ánh sáng: 5000 1m/m2 Quang kỳ : 14 giờ Nhiệt độ: 2100C SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Dụng cụ chứa đựng môi trường là lọ thuốc nhỏ chứa 10ml 2.4.2 Gieo hạt lan Hồ Điệp nảy mầm trong điều kiện invitrro [3] Trong tự nhiên hạt lan ít nảy mầm (chỉ nảy mầm 12%) do hạt lan khơng có chứa anbunin và một phơi chưa phân hóa, có kích thước nhỏ nên khó chứa chất dự trữ .Vì vậy, trong tự nhiên hạt lan Hồ Điệp nảy mầm được nó phải cộng sinh với nấm Rhizoctonia mucoroides. Nấm sẽ cung cấp đường để ni cây, phân giải các chất hữu cơ khó hấp thu. Bù lại cây sẽ cung cấp nước cho nấm, chỗ và các khống chất mà nó thu được từ sương. Dựa trên ngun tắc này, các phòng thí nghiệm ni cấy mơ đã tạo mơi trường gieo hạt lan Hồ Điệp trên mơi trường dinh dưỡng nhân tạo với tỉ lệ rất cao 2.4.2.1.Tiến hành Chọn quả lan: Chọn các quả 4 tháng tuổi, quả căng đều, không bị nứt vở, không bị sâu bệnh làm nguyên liệu để gieo hạt Khử trùng : Dùng cồn 750 rửa sạch quả, khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 10 phút. Rửa lại quả bằng nước vơ trùng 5 lần, thấm khơ bằng giấy thấm vơ trùng. Dùng dao tách vỏ quả để lấy các hạt nhỏ li ti bên trong và gieo trong mơi trường đã chuẩn bị sẵn Để gieo hạy lan có thể sử dụng các loại mơi trường nền: Knudson, Vacine Went (VW), Murashige –Skoog ( MS) có bổ sung thêm đường và các chất hữu như: Dịch nghiền của khoai tây, chuối , cà rốt, nước dừa, pepton… 2.4.3. Ứng dụng hệ thống ni cấy ngập chìm trong nhân giống Hồ Điệp lai [2] 2.4.3.1. Hệ thống ni cấy Hệ thống ngập chìm tạm thời được sử dụng trong nghiên cứu này là hệ thống bình ni cấy Plantima do cơng ty Atech Bioscientific của Đài Loan sản xuất . Hệ thống này gồm những bộ phận chủ yếu sau: Bơm hay máy nén khí tạo áp lực để đẩy mơi trường từ ngăn chứa lên ngăn chứa mẫu cấy và ngược lại, timer dùng để điều khiển chu kỳ ngập, hệ thống ống dẫn và van điều khiển, các màng lọc thống khí vơ trùng, các bình Platima bằng nhựa polycarbonate gồm có 2 ngăn, ngăn dưới chứa mơi trường lỏng và ngăn trên chứa mẫu thực vật Bằng cách điều chỉnh tự động áp lực khơng khí thơng qua một máy bơm, mơi trường lỏng từ ngăn dưới sẽ được bơm lên ngăn chứa mẫu cấy và khi đạt đến thời gian ngập chìm tạm thời dung dịch sẽ quay trở lại ngăn dưới . Trong giai đoạn dung SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 10 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Nghiệm thức 2g 4g 6g 8g Trọng lượng Số lượng PLBs/ Số chồi tươi (g ) 1g PLBs ban đầu Nhận xét 11,25 1,87 19,58 ± 4,79 PLBs xanh tốt, tròn, cụm. Một số PLBs phát triển thành chồi. Khơng gian TIS còn trống 36,31 ± 6,91 PLBs xanh tốt, tròn, một số PLBs phát triển thành chồi Khơng gian TIS còn trống 73,21 ± 6,99 PLBs xanh tốt, tròn, một số PLBs phát triển thành chồi Khơng gian TIS còn trống 23,05 4,65 40,15 5,08 53,30 6,80 ± 973,27 ± 30,68ab ± 1020,11 ± 110,36 a ± 984,60 ± 116,54a b ± 753,26 ± 151,81b PLBs khơng được tròn, hơi vàng chồi 113,25 ± 8,91 nhiều, chồi bị vàng Chật kín khơng gian TIS Kết quả cho thấy nghiệm thức sử dụng 6g PLBs cho kết quả tạo 986,35 PLBs tính trên 1g PLBs ban đầu và sau 6 tuần ni cấy lượng PLBs tạo thành vừa đủ lấp kín khơng gian bình TIS, PLBs có màu xanh tốt, dạng tròn . Mật độ này là thích hợp nhất cho việc nhân PLBs trong bình TIS Khi sử dụng 6g PLBs để ni cấy trong bình Plantimia có chứa mơi trường để nhân PLBs có thể tích là 200ml, nhóm nghiên cứu đã nhận thấy rằng: Thời gian ngập chìm 10 phút với chu kỳ 1 giờ cho hệ số nhân PLBs tăng nhiều (8545 PLBs) so với chu kỳ 2 giờ ngập một lần, nhưng PLBs ch ủ yếu dạng trong, mọng nước rất khó chuyển sang dạng chồi để phát triển thành cây hồn chỉnh. Như vậy tần số ngập chìm cao đã gây ra hiện thủy tinh thể cho mẫu cấy Thời gian ngập chìm 10 phút với chu kỳ 2 giờ, các PLBs bị trương to hơn bình thường. SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 20 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Thời gian ngập chìm 5 phút với chu kỳ 2 giờ cho chất lượng PLBs tốt nhất, chồi xanh tốt phát triển bình thường. Bảng 7: Khảo sát ảnh hưởng của tần xuất ngập chìm của hệ thống lên việc nhân PLBs Nghiệm thức Trọng lượng Số PLBs hình Số chồi tươi (g) thành Nhận xét /10 50,85 ± 5,31 phút 6276,98 ± 413,26 b 125,28 ± 11,65 PLBs rất xanh tốt /5 42,27 ± 6,27 phút 6112,30 ± 326,41 b 82,96 ± 6,57 PLBs xanh tốt /10 68,18 ± 6,96 phút 8545,68 ± 612,45a 187,89 ± 9,60 PLBs rất to, một số có dạng trong mọng nước Tóm lại việc nhân PLBs trên hệ thống TIS cho kết quả tối ưu khi thời gian ngập từ 510 phút với chu kỳ 2 giờ, thể tích ni cấy 200ml và mật độ 6g PLBs Sau 6 tuần ni cấy mỗi bình Plantima cho khoảng 6100 PLBs từ 600PLBs ban đầu, tức là từ 1 PLBs ban đầu tạo ra 1011 PLBs mới, nếu so sánh trên mơi trường thạch, cùng thơi gian ni cấy, cùng thể tích và mật độ, sau 6 tuần thu được 2200 PLBs tức là 1 PLBs ban đầu tạo ra 34 PLBs mới và so sánh với ni cấy lỏng lắc trong bình tam giác 250ml với thể tích mơi trường 40ml thì từ 1 PLBs ban đầu tạo ra 78 PLBs . Vậy, ni cấy trên hệ thống TIS cho tỉ lệ nhân PLBs gấp 3 lần trên mơi trường thạch và gấp 1,3 lần trên mơi trường lỏng Bảng 8: Ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy khác nhau lên sự nhân nhanh PLBs sau 2 tháng nuôi cấy Hệ thống nuôi cấy Số PLBs tạo / 1PLBs ban đầu Lỏng lắc 8,3 ± 0,58 TiS 10,2 ± 1,55 Thạch 3,6 ± 0,31 SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 21 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp 2.5.3.2.Khảo sát sự tái sinh chồi từ PLBs trong hệ thống TIS Trên hệ thống TIS, từ một PLBs ban đầu rất nhiều cây được tái sinh cho lượng cây tái sinh vượt trội so với nuôi cấy trên môi trường thạch. Khảo sát mật độ PLBs sử dụng cho giai đoạn tái sinh chồi trong bình TIS ghi nhận kết quả trong bảng sau: Bảng 9: Ảnh hưởng của mật độ PLBs lên sự tái sinh chồi và nhân chồi trong hệ thống TIS Nghiệm thức 20 PLBs 30 PLBs 50 PLBs Đối chứng thạch (30 PLBs) Tỉ lệ PLBs tái Trọng lượng Số chồi Nhận xét sinh chồi (%) tươi (g) /PLBs ban đầu 100 100 100 100 11,54 ± 2,19 18,41 ± 2,67 31,25 ± 5,10 7,24 ± 1,04 4,35 ± 0,38ab Cụm chồi xanh tốt, lá tròn mượt, có rễ 4,66 ± 0,71ab Cụm chồi xanh tốt, lá tròn mượt, có rễ 6,30 ± 0,64a Cụm chồi xanh tốt nhưng lá nhỏ nghiệm thức 20, 30 PLBs 1,73 ± 0,26c Lá hơi bị dún lại, thân chồi kéo dài Trong bình Plantima mật độ 50 PLBs cho trung bình số cây tái sinh từ một PLBs ban đầu là 6,3 so với 1,73 PLBs trên mơi trường thạch (gấp 3,6 lần). Thêm vào đó, sự sinh trưởng và phát triển của chồi tái sinh trong hệ thống TIS đều vượt trội hơn trong bình tam giác về các chỉ tiêu chiều cao thân, chiều dài, chiều rộng lá Bảng 10:Ảnh hưởng của tần xuất ngập chìm lên tái sinh chồi từ PLBs SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 22 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Nghiệm thức Trọng tươi(g) lượng Số chồi/ PLBs Nhận xét 4 giờ / 3 phút 25,48 ± 4,84 3,17 ± 0,66c Chồi xanh tốt, có PLBs dạng cụm 6 giờ / 3 phút 34,39 ± 6,79 6,46 ± 0,64 a Chồi xanh tốt 8 giờ /3 phút 28,17 ± 4,05 4,46 ± 0,60 b Chồi xanh tốt Kết quả cho thấy: Tần xuất ngập 3 phút trong chu kỳ 6 giờ cho kết quả số chồi tạo thành trên một PLBs là cao nhất.Chu kỳ ngắn (4 giờ) hay dài (8 giờ) cho kết quả tạo chồi thấp hơn hẳn. Điều này cho thấy với chu kỳ 4 giờ cho ngập một lần mẫu được cung cấp chất dinh dưỡng thường xun hơn nhưng số chồi tạo ra trên 1 PLBs chỉ là 3,17 và từ gốc lại tiếp tục tạo thêm PLBs mới, còn ở chu kỳ 8 giờ cho ngập một lần cho số chồi tạo thành là 4,46 ít hơn so với chu kỳ 6 giờ (6,46 chồi) có lẽ thời gian q dài giữa các lần bơm (8 giờ) làm mẫu khơng được cung cấp dinh dưỡng cũng như sự thống khí cần thiết cho sự phát triển của mẫu, vì vậy PLBs tái sinh và tiếp tục tạo thêm chồi nách và các chồi này phát triển rất đồng đều dẫn đến trọng lượng tươi của mẫu cũng gia tăng đáng kể (34,39) Trong hệ thống TIS, mơi trường khơng khí ln ln có sự trao đổi giữa bên trong và bên ngồi bình thơng qua hệ thống bơm và các màng lọc, do đó chồi Hồ Điệp tái sinh trong hệ thống TIS phát triển rất tốt so với trong bình tam giác kín thơng thường thể hiện qua các chỉ têu trong bảng 11 Hình 6: PLBs nhân nhanh trong hệ thống ni cấy TIS.[7] Bảng11: Ảnh hưởng của các hệ thống nuôi cấy khác nhau lên sự tái sinh chồi từ PLBs sau 2 tháng nuôi cấy Hệ thống nuôi Số chồi /mẫu Chiều cao thân cấy cấy Chiều cao lá Chiều rộng SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 23 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp (mm) (mm) Bình tam giác (mơi trường thạch ) 1,73 7 ± 0,36 6 ± 0,14 TIS (môi trường lỏng) 6,30 9 ± 0,23 7 ± 0,24 (mm) 3 ± 0,5 ± 0,22 Hình 7: Chồi tái sinh từ PLBs trong hệ thống TIS và bình tam giác.[7] a1, a2, a3 :Chồi tái sinh từ PLBs trong hệ thống TIS b: Chồi tái sinh từ PLBs trong bình tam giác 2.5.3.3. Khảo sát sự ra rễ của chồi Hồ Điệp tái sinh từ PLBs trong hệ thống TIS Kết quả thí nghiệm từ các hệ thống ni cấy khác lên sự sinh trưởng và phát triển của chồi Hồ Điệp đã cho thấy hệ thống càng có nhiều sự thơng thống thì chồi Hồ Điệp càng sinh trưởng và phát triển tốt hơn. Ở hệ thống TIS nhờ hệ thống bơm đẩy mơi trường lên để tạo sự ngập chìm cho mẫu cấy, trong q trình bơm mơi trường khí trong bình được trao đổi nên trong bình có sự thơng thống nhiều hơn so với trong bình tam giác. Những cây Hồ Điệp trong hệ thống TIS có độ thơng thống tốt hơn phát triển mạnh hơn so với cây trong bình tam giác khơng thống khí thể hiện ở các chỉ tiêu chiều cao, chiều dài và chiều rộng lá, số rễ và chiều dài rễ Bảng 12: Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự ra rễ và phát triển chồi của Hồ Điệp SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 24 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Nghiệm thức Trọng Số chồi / số Chiều rộng Chiều dài rễ Tình lượng tươi chồi ban lá (cm) (cm) trạng cây. (g) đầu /3 47,39 ± 6,27 phút 3,79 ± 0,65a 0,68 ± 0,06b 0,92 ± 0,16c Xanh mướt /3 60,19 ± 7,78 phút 3,39 ± 0,59a 0,97 ± 0,09a 2,62 ± 0,29a Xanh mướt /3 43,23 ± 5,39 phút 2,59 ± , 0,77± 0,05b 26b 1,67 ± 0,14b Xanh mướt Bảng 13: Ảnh hưởng của hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời lên sự sinh trưởng và phát triển của chồi Hồ Điệp sau 2 tháng ni cấy Chiều cao Chiều rộng Chiều dài lá Số rễ Hệ thống thân (mm) lá (mm) (mm) ni cấy Chiều dài rễ (mm) Bình tam giác 15 ± 0,4 500ml 6 ± 0,2 11 ± 0,3 10 ± 0,1 TIS 9,8 ± 0,4 15 ± 0,7 26 ± 0,2 20 ± 0,6 Hình 8: Sự sinh trưởng và phát triển của chồi Hồ Điệp trong hệ thống TIS và bình tam giác 500 ml .[7] a : Cây con Hồ Điệp trong hệ thống TIS b : Cây con Hồ Điệp trong bình tam giác 500 ml SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 25 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Hệ thống ngập chìm tạm thời đã hội tụ đủ những điều kiện cần thiết như ngập khơng q lâu, thống khí tốt giúp cây khơng bị thủy tinh thể, cây tăng cường khả năng quang hợp nên cây phát triển khá đều đặn, thích hợp cho q trình tạo bộ rễ khỏe mạnh trước khi đưa ra vườn ươm. Tóm lại, khi ni cấy trong hệ thống TIS giúp cây phát triển nhanh và mạnh hơn những cây được ni cấy trong hệ thống kín thơng thường giúp rút ngắn thời gian để cây đạt được kích thước để đưa ra vườn ươm 2.5.4 Nhân nhanh phơi và Protocorm – like body cây lan Hồ Điệp bằng hệ thống Bioreactor [1] 2.5.4.1. Xác định mơi trường tối ưu tăng sinh phơi và PLB Sau 8 tuần ni cấy, các chỉ tiêu về trọng lượng tươi, đường kính phơi và PLB của P.amabilis được trình bày ở các bảng sau Bảng 14: Ảnh hưởng của BA lên sự tăng sinh của phôi và PLB trong môi trường nuôi cấy bổ sung 0,5 mg /l NAA và 20 % nước dừa sau 8 tuần nuôi cấy Môi trường Trọng lượng tươi (mg) Nhận xét 3874a Phơi và PLB tạo thành có màu vàng nhạt và xanh thẫm, khơng có những cụm lơng xum quanh. Đường kính từ 11,5 mm 3812b Phơi và PLB tạo thành có màu vàng nhạt và xanh thẫm, một vài PLB có cụm lơng xum quanh. Đường kính từ 12 mm V3 3420c Một số PLB lớn có màu xanh thẫm xuất PLB có độ đồng lớn, đường kính 2 mm. V4 2597d PLB tạo thành chưa hồn thiện, khơng có cấu trúc rõ ràng V1 V2 Ghi chú: Những mẫu tự khác nhau được nêu trong các cột trên biễu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với α =0,05 trong Duncan, s test SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 26 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Bảng 15: Ảnh hưởng của NAA lên sự tăng sinh của phôi và PLB trong môi trường nuôi cấy bổ sung 2,0 mg / l BA và 20 % nước dừa sau 8 tuần nuôi cấy Môi trường V5 V6 V7 Trọng lượng tươi (mg) Nhận xét 4312a PLB tạo thành có màu xanh thẫm, có cụm lơng xum quanh, đường kính 11,5 mm 3812b Phơi và PLB tạo thành có màu vàng nhạt và xanh thẫm, một vài PLB có những cụm lơng xum quanh Đường kính 12 mm 4289a PLB tạo thành có màu xanh thẫm, có cụm lơng xung quanh, đường kính từ 1 1,5 mm Hình 9: Sự phát sinh phơi và PLB trong các mơi trường khác nhau.[8] SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 27 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Kết quả thu nhận được cho thấy, ở nghiệm thức V1 và V2 PLB tạo thành có màu xanh đậm, khơng có những cụm lơng xung quanh, đường kính PLB từ 11,5 mm. Ở các nghiệm thức, tuy khối lượng PLB tạo ra lớn nhưng PLB kém phát triển Ở nghiệm thức V3, PLB tạo thành lớn hơn, phát triển hơn, có độ đồng đều cao hơn và có hình dạng rõ ràng hơn. Ở các nghiệm thức V 5 và V7, khối lượng PLB tạo ra là lớn nhất, có phát triển đồng đều giữa các PLB, đường kính trung bình 1,5 mm. Còn các nghiệm thức V4 và V6 phơi và PLB chưa có sự phân hóa rõ ràng, các cụm phơi và PLB dính vào nhau gây khó khăn cho q trình cấy chuyền mẫu và q trình hình thành cây con. Ở nghiệm thức V8, PLB được tạo thành có màu xanh thẫm, đường kính trung bình 1,5 mm, các PLB khá đồng đều nhau, một số PLB phát triển thành cây con. Điều này được giải thích là do tác động kích thích sự hình thành chồi của cytokinin có trong nước dừa, và khi nước dừa ở nồng độ cao thì ta thấy rõ điều này so với các nghiệm thức còn lại là V9, V10và V11. Ở các nghiệm thức này, phơi và PLB nhỏ, các cụm phơi và PLB dính vào nhau gây khó khăn cho q trình cấy chuyền và q trình hình thành cây con sau này. Còn các nghiệm thức V 12, có sự phân hóa phơi rõ ràng nhưng sinh khối tạo ra ít, khơng có hiệu quả. Tóm lại, mơi trường MS cơ bản bổ sung 2,0 mg /l BA, 1,0 mg/l NAA và 20 % nước dừa là mơi trường tối ưu cho tăng sinh phơi và PLB của lan Hồ Điệp P. amabilis Bảng 16: Ảnh hưởng của nước dừa lên sự tăng sinh của phơi và PLB trong mơi trường ni cấy bổ sung 2,0 mg /l BA và 0,5 mg /l NAA sau 8 tuần ni cấy SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 28 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Môi trường Trọng lượng tươi (mg) Nhận xét 4137a PLB tạo thành có màu xanh đậm Đường kính từ 11,5 mm. Có sự hình thành cây từ PLB 3812b Phơi PLB tạo thành có màu vàng nhạt và xanh thẫm PLB, một số PLB có những cụm lơng xum quanh. Đường kính từ 12 mm 2480c Phơi va PLB tạo thành có màu vàng nhạt xanh thẫm PLB cụm lơng xum quanh. Đường kính từ 1 1,5 mm V11 1197d Phơi tạo thành có màu vàng nhạt khơng có sự tạo thành PLB. Đường kính phơi từ 1 2 mm V12 850e PLB có màu xanh thẫm Có hình thành cây từ PLB V8 V9 V10 2.5.4.2. Ảnh hưởng của hệ thống ni cấy bioreactor lên sự tăng sinh phơi và PLB Một số ưu điểm chính của hệ thống bioreactor là: Các thành phần trong mơi trường ni cấy được sử dụng tối đa nhờ có sự đảo trộn của q trình sục khí, mẫu cấy ngập trong mơi trường cấy lỏng vẫn khơng bị úng và khơng xãy ra hiện tượng thủy tinh thể. Kết quả thu được sau 6 tuần ni cấy trong hệ thống bioreactor và hệ thống đối chứng được trình bày ở bảng dưới Bảng 17: Những kết quả thu được trên hai hệ thống ni cấy khác nhau sau 6 tuần ni cấy. Hệ thống ni cấy Trước ni cấy Thu hoạch Đường kính phôi và Tỷ lệ Tỷ lệ PLB (mm) sống sót tăng sinh Trước Thu (%) (%) nuôi cấy hoạch Bioreactor 36,00 172,19a 1 – 1,5a 5,5a 58,32a 4,78a Đối 67,19b 1 – 1,5a 1 1,5b 26,55b 1,86b Khối lượng mẫu 36,00 SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 29 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp chứng PLB của lan Hồ Điệp thích hợp với hệ thống ni cấy bioreactor có sục khí liên tục hơn là ni cấy trên mơi trường thạch. Với hệ thống bioreactor, khơng khí bên trong mơi trường ni cấy được thay mới liên tục và có thành phần CO2/ O2 gần giống với mơi trường bên ngồi, điều này làm cho mơi trường được thơng thống hơn nên mẫu cấy có khả năng trao đổi khí nhiều hơn, do vậy mẫu cấy sinh trưởng và phát triển tốt hơn so với trên mơi trường thạch. Các chỉ tiêu so sánh giữa hai hệ thống ni cấy là : tỷ lệ sống sót, tỷ lệ tăng sinh, kích thước của phơi và PLB. Tỷ lệ sống sót (58,32), tỷ lệ tăng sinh (4,78 lần) và đường kính (5,5 mm) của phơi và PLB trong hệ thống bioreactor cao hơn tỷ lệ sống sót (26,55), tỷ lệ tăng sinh (1,86 lần), và đường kính (1,5 mm) của phơi và PLB trong hệ thống đối chứng. SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 30 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp [9] Hình 10: a) Sự tăng nhanh Phalaenopsis PLB trong hệ thống bioreactor (1lít kiểu cột) sau 6 tuần b) Sự tái sinh và tăng trưởng từ PLB trong hệ thống bioreactor; c) Sự thích nghi của những cây mới nhú 2.6. Hiệu quả kinh tế của lan Hồ Điệp [4] Hồ Điệp khơng chỉ phổ biến ở Nam Mĩ, trong những năm gần đây, Hồ Điệp trở thành loại hoa trồng chậu có giá trị nhất trong ngành cơng nghiệp trồng hoa ở Hà Lan. Chúng còn là những món q xa xỉ ở các nước Châu Á đặc biệt là Nhật Bản. Ngồi ra các lồi hoa đẹp này cũng được nhập vào Mỹ để trang trí chậu hoặc dưới dạng q tặng cao cấp. Ngày nay, hoa lan cắm chậu đã trở nên khá phổ biến ở hầu hết các nước trên thế giới. Người ta có thể thấy Hồ Điệp ở mọi nơi, trên truyền hình, trong nhà, trong vườn, tạp chí thậm chí nơi bạn làm việc. Chứng tỏ, càng ngày con người càng nhận thức được tầm quan trọng của những chậu hoa trong cuộc sống thường nhật của mình. Lan Hồ Điệp, là một lồi lan có độ bền bơng cao trong điều kiện thích hợp, cũng là một lồi cây rất thích hợp để trồng trong nhà, dễ ra hoa. Hơn nữa, trong vài thập kỉ gần đây nền cơng nghệ trồng lan phát tiển giúp người trồng đã giảm giá thành đáng kể đối với loại lan này nên giá cả phù hợp với những người mê hoa hay người mới tập trồng, Hồ Điệp rất được ưa chuộng và được trồng nhiều nơi. Trước đây, Hồ Điệp có giá khá cao, nên được xem là một loại hàng hố cao cấp trên thị trường. Trong 20 năm trở lại đây, cơng nghệ hiện đại và các nghiên cứu đã giúp cho loại sản phẩm này trở nên phổ biến với người tiêu dùng, đặc biệt là trong các ngày lễ. Thêm vào đó, cơng nghệ lai giống và gieo hạt ngày càng tạo nên nhiều chủng loại giống mới, nổi bật màu hoa, kích thước hoa… Điều này làm cho người tiêu dùng rất thích thú với thú chơi lan và tạo nên những cơn sốt hoa lan trên thị trường thế giới. Hồ Điệp được trồng mọi nơi trên thế giới, hầu hết là Đức, Nhật bản, Phần Lan, Đài Loan, Thái Lan và Mỹ. Cây con được ni cấy mơ ở các nước Phần Lan, Thái Lan, Đài Loan sau đó cây con lại được xuất khầu cho các nước khác với cả Mỹ để trồng ra hoa. Hàng ngàn các giống được lai và tạo dòng rất có giá trị trên thị trường. Các nhà nhân giống đã gieo hạt được rất nhiều giống Hồ Điệp có chất lượng hoa và cây giống rất có giá trị như các tính trạng qui định màu sắc hoa, và cấu trúc hoa, nhiều nhánh, nhiều vòi hoa, và gần đây là các giống có hương thơm Cuộc chạy đua diễn ra hầu hết tại Đài Loan, điều này dẫn đến một hệ quả là các SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 31 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp giống có giá trị hiện nay có thể khơng còn giá trị chỉ trong vài năm nữa. Màu sắc hoa tập trung các màu chủ đạo như : trắng, vàng, xanh, màu mơ chín, hồng, đỏ tươi hay nâu sẫm. Hoa có thể chỉ có một màu hay sự pha trộn giữa các màu này với nhau, chủ yếu là khác nhau ở vùng giữa, hay mép cánh hoa với nhiều cấu trúc khác nhau như chấm hay sọc trên từng cánh bơng. Loại hoa mới được lai tạo gần đây nhất là Harlequin, có màu trắng hay vàng với các mép cánh bơng được điểm xuyết bởi các chấm tròn ngẫu nhiên có giá rất cao trên thị trường hiện nay. Hình11: Mơ hình sản xuất lan Hồ Điệp.[10] Phần III: Kết Luận Từ những thí nghiệm trên tơi thấy rằng nhân giống Hồ Điệp nhờ hệ thống ni cấy ngập chìm và hệ thống bioreactor là tơt nhất Đối với nghiên cứu giống Hồ Điệp lai Dtps .Taida Salu, ni cấy trên hệ thống TIS cho tỷ lệ nhân PLBs gấp 3 lần trên mơi trường thạch và gấp 1,3 lần trên mơi trường lỏng. Đối với giai đoạn tái sinh chồi và nhân chồi, hệ thống TIS cho tỷ lệ nhân chồi gấp 3,6 lần so với hệ thống ni cấy tên thạch. Từ đó giúp gia tăng tỉ lệ cây con lên 10,8 lần so với các phương pháp truyền thống khác Đối với hệ thống nuôi cấy bioreactor, môi trường tối ưu cho nhân nhanh phôi và PLB là môi trường MS cơ bản bổ sung 2mg /l BA, 1mg /l NAA và 20% nước dừa SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 32 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Từ kết quả trên tơi xin đưa ra quy trình nhân giống invitro lan Hồ Điệp như sau Cây mẫu Quả Cành hoa Khử trùng kép Khử trùng MS +Knudson C (trục phát hoa) VW + 100ml + 10 g đường + 30 g KT + 1g pepton + 6,5 g agar ( gieo hạt ) Protocorm, chồi Nhân nhanh MS + 2,0 mg /l BA + 0,1 mg /l NAA +20% nước dừa (bioreactor ) MS 1/2 + nước dừa + pepton + dịch khoai tây + sucrose ( ngập chìm ) Cây giống in vitro Vườn ươm Tài Liệu Tham Khảo Tài liệu sách giáo khoa [1]. Nguyễn Cửu Thành Nhân, Nguyễn Thanh Hải và cộng sự (2007), trích “Cơng nghệ sinh học thực vật trong cơng tác nhân giống và chọn tạo giống hoa”, Nhà xuất bản Nơng Nghiệp TP.HCM [2]. Cung Hồng Phi Phượng, Nguyễn Văn Hiếu và cộng sự (2007 ), trích “ Cơng nghệ sinh học thực vật trong cơng tác nhân giống và chọn tạo giống hoa”, Nhà xuất bản Nơng Nghiệp TP.HCM SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 33 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp [3]. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2005), “Lan Hồ Điệp kỷ thuật chọn tạo giống cây trồng”, Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội Tài liệu internet [4]. www.longdinh.com [5]. http://giaoan.violet.vn/present/show/entry_id/240388 [6]. http://www.hcmbiotech.com.vn/news_detail.php?cateid=17&id=518 [7]. http://www.hcmbiotech.com.vn/research_detail.php?id=4 [8]. http://www.ecaa.ntu.edu.tw/weifang/lab551/flower/phal/2002 RAPID%20PROPAGATION%20OF%20PHALAENOPSIS%20FROM%20FLORAL %20STALKDERIVED%20LEAVES.pdf [9]. http://ecaaser5.ecaa.ntu.edu.tw/weifang/lab551/flower/phal/2005 Application%20of%20bioreactor%20systems%20for%20large%20scale %20production%20of%20horticultural%20and%20medicinal%20plants.pdf [10]. http://www.hort.purdue.edu/newcrop/ncnu02/pdf/griesbach.pdf [11]. www.hcmbiotech.com.vn/technology_detail.php?c [12]. http://www.hoalanvietnam.org/Article.asp?ID=507 [13]. http://www.cesti.gov.vn/left/stinfo/sukien/tpkhac/2007/11/TTSKLV16110703 [14]. http://www.caycanhvietnam.com/?trungdu=view&id=1067 Các Từ Viết Tắt NAA : α – Naphalen axetic axit BA : 6 – Benzylaminpurin IBA : Indole 3 butyric axit MỤC LỤC SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 34 ... SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 12 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp 2.4.4.1. Vật liệu và phương pháp Đối tượng nghiên cứu Giống lan Hồ Điệp có màu trắng (phalaenopsis amabilis )... SVTH: Bùi Thị Thu Nhi Lớp 07S1 16 Các Phương Pháp Nhân Giống In Vitro Lan Hồ Điệp Hình 4: Sự hình thành chồi sinh dưỡng từ phát hoa.[6] 2.5.2. Gieo hạt lan Hồ Điệp nảy mầm trong điều kiện invitrro [3]... sẹo. Mơ sẹo này được tái sinh thành cây hồn chỉnh là cây đơn bội. II.2 Tìm hiểu về nhân giống lan Hồ Điệp 2.1 Nguồn gốc và đặc điểm của lan Hồ Điệp [4] 2.1.1 Nguồn gốc Lan Hồ Điệp là giống lan có tên gọi Phalaenopsis, thuộc họ