Đề tài Các phương pháp nhân giống in vitro lan Hồ Điệp

Phần I: Mở Đầu Cuộc sống ngày càng phát triển, nhu cầu tạo một gốc vườn nhỏ mang màu xanh cây lá thiên nhiên vào trong nhà của người dân ngày càng cao.Vốn nhiều họ, nhiều chủng loại, màu

Phần I: Mở Đầu

Cuộc sống ngày càng phát triển, nhu cầu tạo một gốc vườn nhỏ mang màu xanh

cây lá thiên nhiên vào trong nhà của người dân ngày càng cao.Vốn nhiều họ, nhiều

chủng loại, màu sắc phong phú lại tốn ít diện tích nên việc chọn trồng và tạo một vườn

lan nhỏ trong khuôn viên nhà là sự lựa chọn của nhiều cá nhân, nhiều hộ gia

đình.Trong số những loại phong lan được nuôi trồng ở nước ta hiện nay, bên cạnh

những loài tương đối dễ trồng như Mokaro, Dendro, lan Vũ Nữ…thì vẫn có những loài

lan thích hợp với một số khu vực địa lý nhất định, cụ thể là Địa Lan – loài hoa chỉ có

thể nuôi trồng trong điều kiện lí tưởng của Đà Lạt [4]

Không quá kén chọn và hạn chế nơi trồng như Địa Lan song Hồ Điệp cũng là

một trong những giống lan quý lại khó trồng Do đó, đòi hỏi người trồng phải có đôi

chút am hiểu về loài hoa này.Thích hợp với điều kiện trong nhà lại là một trong những

giống lan được yêu thích không chỉ về màu sắc, kiểu dáng mà còn mang một nét đẹp

rất sang trọng, trang nhã Chính vì vậy, Hồ Điệp đã nhanh chống trở thành sản phẩm

trồng trọt được nhiều người ưa chuộng và mang lại hiệu quả kinh tế cao không chỉ ở

Việt Nam mà còn ở nhiều nước trên thế giới như:Đài Loan, Hàn Quốc, Nhật Bản,

Mỹ…Bên cạnh đó, hoa Hồ Điệp rất lâu tàn, độ bền bông cao, giàu sức quyến rũ nên

nó đã được lựa chọn làm vật trang trí, tạo cảnh quan trong các ngày lễ, tết.Vốn là một

loài rất khó nhân giống bởi Hồ Điệp thường cho hệ số nhân rất thấp trong điều kiện

vườn ươm Để có được số lượng lớn cây giống đồng đều và sạch bệnh đáp ứng nhu

cầu thị trường là một vấn đề thật nan giãi Do đó, việc nhân giống bằng kỷ thuật nuôi

cấy mô ra đời tạo ra hàng loạt cây con ổn định về mặt di truyền, sạch bệnh, giá cả lại

phải chăng là rất hữu ích

Xuất phát từ thực tiễn này cộng với sự đam mê của chính bản thân mình, tôi đã

tiến hành tìm kiếm sưu tập từ đó đưa ra đề tài: “Các phương pháp nhân giống in vitro

lan Hồ Điệp”

Phần II: Nội Dung

II.1 Tổng quan tài liệu

1.1 Lịch sử và thành tựu của nuơi cấy mơ [5]

1.1.1 Trên thế giới

 Năm 1902, nhà thơng thái Haberlant lần đầu tiên đưa ra ý tưởng cấy mơ của

sinh vật ra ngồi cơ thể nhưng ơng đã dùng tế bào quá chuyên biệt nên khơng thành

cơng Mơ động vật được cấy trước tiên do A.Carrel(1919), đến năm 1934 mơ thực vật

mới được nuơi cấy

 Năm 1934 White đã thành cơng trong việc phát hiện ra sự sống vơ hạn của việc

nuơi cấy tế bào rễ cà chua

 Năm 1964 Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ nuơi cấy chồi ngọn Ơng đã

thành cơng trơng việc chuyển cây con của cây sen cạn và cây White Lupin từ mơi

trường nuơi cấy tối thiểu, tuy nhiên việc nhân giống vẫn chưa hồn chỉnh Sau đĩ,

nhiều nhà nghiên cứu đã khám phá những thành phần dinh dưỡng qua trọng cần thiết

cho sự phát triển của tế bào được nuơi cấy (White (1951),Gauthere (1939),Van

Overbeck (1941), Steward và Caplin (1951))

 Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất cĩ thể điều khiển sự

nảy chồi

 Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến mơi trường nuơi cấy đánh dấu một

bước tiến trong kỷ thuật nuơi cấy mơ Mơi trường của họ dùng làm cơ sở cho việc

nuơi cấy nhiều loại cây và vẫn cịn sử dụng rộng rải cho đến ngày nay

 Năm 1960-1964, Morel cho rằng cĩ thể nhân giống vơ tính lan bằng nuơi cấy

đỉnh sinh trưởng.Từ kết quả đĩ, lan được xem là cây nuơi cấy mơ đầu tiên được

thương mại hố Từ đĩ đến nay, cơng nghệ nuơi cấy mơ tế bào thực vật đã được phát

triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác (Haramaki(1971), Murashige(1972), Miller

và Murashige (1976)) và được ứng dụng thương mại hĩa

1.1.2 Ở Việt Nam

Nuơi cấy mơ tế bào thực vật đã được phát triển ở Việt Nam sau chiến tranh thế

giới kết thúc (1975) Phịng thí nghiệm nuơi cấy mơ và tế bào đầu tiên được xây dựng

đầu tiên ở viện sinh học, viện khoa học Việt Nam(KHVN) do tiến sĩ Lê Thị Muội

đứng đầu Bước đầu tập trung nghiên cứu những vấn đề cơ bản như nuơi cấy bao phấn,

nuơi cấy mơ sẹo và protoplast Các kết quả đầu tiên về nuơi cấy thành cơng bao phấn

lúa và thuốc lá được cơng bố năm 1978 (Lê Thị Muội và cs,, 1978; Lê Thị Xuân

và cs,, 1978) Tiếp đĩ là thành cơng về protoplast ở thuốc lá và khoai tây (Lê Thị Muội

và Nguyễn Đức Thành(1978),Nguyễn Đức Thành và Lê Thị Muội 1980,1981).Trong

cùng thời gian tại phân viện KHVN tại Tp.HCM, muội hơn nửa là tại Đại học Nơng

Nghiệp I (ĐHNNI) Hà Nội và Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Việt Nam

(KHKTNNVN) và các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào cũng được thành lập

chủ yếu tập trung vào vi nhân giống khoai tây Hiện nay, chúng ta có rất nhiều phòng

thí nghiệm nuôi cấy mô không những ở các trường đại học các viện nghiên cứu (viện

Di Truyền Nông Nghiệp(DTNN), viện Rau Quả Trung ương(RQTƯ)) mà ở cả một số

tỉnh và cơ sở sản xuất(Yên Bái ,Hưng Yên, Thanh Hóa….) Giữa những năm 1980 trở

lại đây, các hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô và tế bào thực vật phát triển

mạnh Những kết quả khích lệ đã đạt được trong lĩnh vực vi nhân giống khoai tây(viện

Công Nghệ Sinh Học (CNSH), ĐHNNI, viện KHKTNNVN), dứa, chuối, mía (viện

CNSH, ĐHNNI, viện KHKTNNVN, viện RQTƯ) một số cây hoa phong lan (phân

viện CNSH thành phố Hồ Chí Minh), Hồng, Cúc, Cẩm Chướng(viện CNSH, viện

DTNN) và cây công nghiệp như bạch đàn (viện DTNN, viện Lâm Nghiệp) Một số kết

quả bước đầu đã ghi nhận trong lỉnh vực chọn dòng tế bào như chọn dòng tế bào

kháng bệnh (Lê Bích Thủy và cs,, 1994), chọn dòng chịu muối ,chịu mất nước

(Nghuyễn Tường Vân và cs ,,1994; Đinh Thị Phòng và cs,, 1994) Các kết quả về dung

hợp cây lai tế bào chất và chuyển gen lục lạp củng thu được kết quả lý thú (Nguyễn

Đức Thành và cs,, 1988; Nguyễn Đức Thành và cs,, 1993, 1997) nuôi cấy bao phấn để

tạo dòng thuần đã được ứng dụng nhiều ở viện CNSH và DTNN Nuôi cấy các dược

liệu quý để bảo tồn nguồn gen và tạo các tế bào có hàm lượng các chất sinh học quan

trọng cao cũng đã và đang phát triển

1.2 Các giai đoạn nhân giống invitro [5]

Cho tới nay việc nhân giống invitro đã áp dụng cho nhiều loại cây (350 loài,

Murashige (1974) chia quy trình nhân giống ra làm 4 giai đoạn :

 Nuôi cấy khởi đầu, tái sinh chồi, cụm chồi

 Nhân nhanh chồi, cụm chồi trong điều kiện invitro

 Tạo cây con hoàn chỉnh, huấn luyện cây con

 Phục hồi, chuyển cây ra trồng trong điều kiện tự nhiên

1.3 Các phương pháp nhân giống invitro [5]

1.3.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Một phương thức dễ dàng nhất đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào thực

vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và nuôi cấy chồi bên)

Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ các

chất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chất

kích thích sinh trưởng thích hợp Từ một đỉnh sinh trưởng, sau một thời gian nuôi cấy

nhất định mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi Chồi tiếp tục phát triển

thân, ra lá và rể để thành một cây hoàn chỉnh Cây con được chuyển dần ra đất và thích

nghi bình thường

1.3.2 Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phân hóa của

các tế bào đã được phân hóa Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện

diện của auxin Khối mô sẹo có khả năng phát triển thành cây con hoàn chỉnh trong

điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo Nuôi cấy mô sẹo được thực

hiện đối với các loại thực vật không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh

sinh trưởng Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ Từ một cụm tế bào

mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy

nhiên mức độ biến dị tế bào soma lại cao hơn

1.3.3 Nuôi cấy tế bào đơn

Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đạt trên máy lắc có

tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẽ gọi là tế bào đơn.Tế

bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tăng sinh khối Với các chất

thích hợp được bổ sung vào môi trường, tế bào có khả năng sản xuất các chất có hoạt

tính sinh học Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn

được tách ra và trải trên môi trường thạch

+ Khi môi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành từng

cụm có mô sẹo

+ Khi môi trường thạch có tỷ lệ cytokinine/auxin thích hợp, tế bào đơn có khả

năng tái sinh thành cây con hoàn chỉnh

1.3.4 Nuôi cấy protoplast-chuyển gen

Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn được tách bởi vỏ cellullose, có sức sống và

duy trì đầy đủ các chức năng sẵn có

Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào,

tiếp tục phân chia và tái sinh cây hoàn chỉnh (tính toàn thể ở thực vật) Khi tế bào chất

mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung hợp với nhau tạo tế

bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng Quá trình dung hợp protoplast

có thể thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài

1.3.5 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội

Hạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp tạo mô sẹo

Mô sẹo này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội

II.2 Tìm hiểu về nhân giống lan Hồ Điệp

2.1 Nguồn gốc và đặc điểm của lan Hồ Điệp [4]

2.1.1 Nguồn gốc

Lan Hồ Điệp là giống lan có tên gọi Phalaenopsis, thuộc họ phụ Vandeae

Tên gọi Phalaenopsis bắt nguồn từ tiếng Hi Lạp trong đó Phalaina có nghĩa là “con

bướm” và Opsis có nghĩa là “giống như”

Lan Hồ Điệp được khám phá năm 1750, đầu tiên được ông Rumphius đặt tên

là Angraecum album, năm 1753 Linne đổi tên thành Epidendrum, 1825 nhà thực vật

Hà Lan định danh lại là Phalaenopsis

Loài hoa này có xuất xứ ở miền Bắc Australia, Ấn Độ và các nước Đông Nam

Á như Philippine, Inđônêsia, bán đảo Đông Dương Quê hương của lan Hồ Điệp là các

nước của vùng Đông Nam Á, rừng Việt Nam không có loài Phalaenopsis amabilis, chỉ

có 5 loài tương tự được biết là Phaenopsis mannii, Phalaeopsis gibbosa, Phalaenopsis

lobbi, Phalaenopsis fuscata và Phalaenopsis cornu-cervi Lan Hồ Điệp được trồng ở

mọi nơi trên thế giới, hầu hết là ở Đức, Nhật bản, Phần Lan, Đài Loan, Thái Lan và

Mỹ Cây con được nuôi cấy mô nhiều ở các nước Phần Lan, Thái Lan, Đài

Loan…Hiện nay giống Hồ Điệp có trên 70 loài và càng ngày càng lai tạo ra rất nhiều

2.1.2 Đặc điểm

 Lan Hồ Điệp là cây đơn thân, ngắn, lá to, dày, mọc sát vào nhau Hoa nở luân

phiên hết cái này đến cái khác, thời kì nở hoa thay đổi theo loài và thường nở trong vài

tháng Phát hoa mọc từ nách lá, dài, chùm hoa nở từng cái, 3 đài to tròn, hai cánh xoè

rộng kín, sắc đẹp Môi hoa cong dẹp có hai râu dài nên cả đóa hoa trong giống như con

bươm bướm Hai hàng hoa xếp đều đặn 2 bên cành, khẽ đong đưa như đàn bướm xinh

xắn đang bay lượn chập chờn Trụ có hình bán nguyệt với hai phân khối u lên, chứa

đầy phấn hoa Số hoa trên cành biểu thị sức sống của cây Số lượng càng nhiều thì cây

càng sung sức Riêng đặc tính phân nhành hoa lại tùy thuộc nhiều vào từng loại giống

 Lan Hồ Điệp có màu sắc phong phú, không thua kém bất cứ giống lan nào khác

từ trắng, hồng, đỏ, vàng, tím đến các loại Hồ Điệp có sọc nằm ngang hoặc thẳng đứng,

hoặc có đốm to hay nhỏ…Lan Hồ Điệp sinh trưởng chậm, khoảng 40 ngày với điều

kiện chăm sóc tốt mới mọc thêm một lá hoàn chỉnh Khi cây có trên 4 lá mới có thể

phân hoá mầm hoa Loài lan này có độ bền bông cao trong điều kiện thích hợp, rất

thích hợp để trồng trong nhà, dễ ra hoa Nhưng nó vốn vẫn là loài hoa khó tính

2.2 Điều kiện sinh thái [5]

2 2.1 Nhiệt độ [3]

Lan Hồ Điệp có nguồn gốc từ miền nhiệt đới, do đó nhiệt độ thích hợp để trồng

Lan Hồ Điệp tương đối cao, nhiệt độ thích hợp để trồng ban ngày là từ 25-280C, ban

đêm là 18-200Cgiai đoạn ươm cây non thì cần nhiệt độ ban đêm khoảng 230C Nếu

nhiệt độ nhà trông nhỏ hơn 150C rễ cây ngừng hút chất dinh dưỡng, quá trình sinh

trưởng ngừng lại, thậm chí bị lạnh hại làm rụng hoa hoặc làm cho cánh hoa xuất hiện

các đốm nhỏ ảnh hưởng đến vẽ đẹp của hoa, giai đoạn phấn hoa đòi hỏi phải có sự

cách biệt khá cao về độ lêch nhiệt độ ngày /đêm, nhiệt độ ban ngày thích hợp nhất là

25 0C, ban đêm 10-200C, kéo dài 3-6 tuần rất có lợi cho sự phân hóa hoa

2 2.2 Nước tưới

Hồ Điệp là loài đơn thân, không có giả hành nên không dự trữ nước, hơn nữa

diện tích bốc hơi của bản lá khá lớn và chúng không có mùa nghỉ vì thế phải cung cấp

cho không một lượng nước đầy đủ và thường xuyên trong suốt năm Trong mùa mưa

mỗi ngày phải tưới cho chúng 2 lần, trừ những ngày có mưa, một lần vào 9 giờ sáng,

một lần vào 3 giờ chiều Tưới như vậy sẽ đảm bảo cây khô ráo khi trời tối vì đọng

nước ở nách lá suốt đêm có thể gây ra sự thối rữa Vào mùa nắng, nên tưới cho chúng

1 ngày 3 lần

Điều kiện thoát nước là tương đối quan trọng, Hồ Điệp không thể chịu được một

độ ẩm lắng đọng (nhất là ban đêm), vì rất đễ tạo điều kiện cho bệnh thối rữa phát triển

Tốt nhất cứ ba ngày ta nên pha Dithane M45, Maneb, Captan vào trong nước tưới với

nồng độ 1/400 để ngừa chứng bệnh nói trên Nên nhớ, Hồ Điệp là loài lan thích hợp

với giá thể và nước tưới có pH khá thấp (pH=5,2) vì thế phải dùng axít phôtphoric để

giảm pH của nước

Ở nước ta, vào mùa mưa Hồ Điệp tăng trưởng mạnh hơn, nhưng những giọt mưa

nặng hạt cũng không kém phần nguy hiểm vì thế đa số các loại Hồ Điệp bị chết do

những cơn mưa đầu mùa Đây cũng là một hình thức tưới của thiên nhiên mà ta không

kiểm soát được Do đó để ngừa tình trạng trên, mái giàn che Hồ Điệp nên dùng những

tấm tôn nhựa xanh, như vậy sẽ loại trừ những trận mưa không cần thiết và tạo được

những tia sáng khuếch tán rất lý tưởng

Vào mùa khô, ta vẫn duy trì mức độ tưới đều đặn như trong mùa mưa, vì lúc này

ẩm độ trong không khí giảm xuống rõ rệt Do đó, sự tăng số lần tưới nhằm mục đích

tạo cho

cây tăng trưởng liên tục Nếu cây có trạng thái thiếu nước, ủ rũ bạn nên chuyển cây

sang vị trí khác hoặc tăng số lần tưới lên Một lần tưới bổ sung vào giữa trưa trong

mùa khô rất thích hợp cho sự phát triển của Hồ Điệp

2 2.3 Ánh sáng [3]

Lan Hồ Điệp rất kỵ ánh sáng chiếu thẳng trực tiếp, do đó phải có biện pháp che

sáng đồng thời tùy thuộc vào cây lớn nhỏ mà có biện pháp điều chỉnh ánh sáng cho

thích hợp Thời kỳ ươm cây non nhu cầu về ánh sáng có cường độ 10.000-12.000 lux,

giai đoạn cây bánh tẻ là 12.000-20.000 lux, giai đoạn thúc ra hoa 20.000-30.000 lux

Trong điều kiện trồng trong nhà lưới, mùa hè và mùa thu phải che đi 75-85% ánh sáng,

cần phải có hai lớp che sáng đặt chồng lên nhau, mùa đông xuân thì ánh sáng yếu hơn

chỉ cần che 40-50% là đủ

2 2.4 Độ thông thoáng

Rất cần thiết vì Hồ Điệp hay bị bệnh thối nhũn lá (phõng lá), sự thông thoáng

giúp lá cây mau khô sau khi tưới và bộ rễ không bị úng nước nên hạn chế bệnh rất

nhiều Ở nước ta vào mùa mưa Hồ Điệp tăng trưởng mạnh những giọt mưa nặng hạt

có thể làm thối đọt Do đó để ngăn ngừa tình trạng trên nên dùng những tấm tôn nhựa

xanh để che Có một số trường hợp trồng Hồ Điệp trên cao (sân thượng) có hiệu quả

hơn Tuy nhiên gió nhiều và mạnh dễ làm cây mất nước nhanh nếu ta không cung cấp

đủ lá cây sẽ héo rũ, nhăn

2 2.5 Dinh dưỡng

Hồ Điệp cần dinh dưỡng thường xuyên, quanh năm vì không có mùa nghỉ Khi

tưới phân không nên tưới với nồng độ cao càng đừng tưới lên đọt, nhất là lúc lá non

mới nhú ra từ đỉnh sinh trưởng Hồ Điệp cần phân bón tưới với nồng độ loãng và có

thể tưới nhiều lần trong tuần Có thể tưới thêm phân hữu cơ như: bánh dầu 15

ngày/lần, vitamin B1, kích thích ra rễ…

Cách tưới phân

+ Thời kỳ cây dưới 12 tháng tuổi cần dùng N, P, K với tỷ lệ cao 30-10-10,

sau đó dùng phân N, P, K với tỉ lệ 20-20-20 hoặc 18-18-18 cho đến lúc ra hoa Tuy

nhiên vào mùa mưa nếu tưới phân 30-10-10 thấy cây yếu mềm quá có thể tăng cường

lượng lân và kali bằng cách xen kẽ phân 20-20-20 hoặc 18-18-18 (dù là cây con), để

cây được cứng cáp, tăng cường sức đề kháng sâu bệnh

+ Lúc cây trưởng thành (18-24 tháng tuổi) vào thời điểm cuối năm, thời

tiết lạnh có thể kích thích cây ra hoa bằng cách tưới phân 10-30-30, đến khi cây bắt

đầu nhú cành hoa rồi ta trở lại tưới phân 20-20-20 cho đến lúc hoa nở và tàn Không

nên để cành hoa lâu quá trên cây, khi nụ hoa cuối cùng đã nở và có 1, 2 hoa bắt đầu

héo, thì ta nên cắt cành hoa bỏ đi để dưỡng sức cho cây Khi cắt cành hoa càng sớm thì

lá mới ra mau và cây sinh trưởng tốt hơn để lần ra hoa sau sẽ mạnh hơn

2.2.6 Sâu bệnh

Đối với phong lan, việc phòng bệnh hết sức quan trọng, vì khi cây đã bị bệnh rất

khó trị và có thể làm chết cây Ngoài việc chăm sóc lan kỹ lưỡng đều đặn, tưới nưới và

dinh dưỡng cần phải tưới thêm thuốc trừ nấm bệnh nhằm tăng sức đề đề kháng cho

cây Lan Hồ Điệp hay bị con bọ trĩ chích tạo vết thương trên lá từ đó vi khuẩn xâm

nhập gây bệnh thối nhũn trên lá Có thể dùng một số loại thuốc để phòng trị như

Malathion, lannat… để phòng trị

2.2.7 Chậu, giá thể, cách trồng

Cách trồng chung nhất cho các loại Hồ Điệp là chậu thật thoáng, có nhiều lỗ có

thể sử dụng chậu đất nung có nhiều lỗ hay chậu nhựa cũng được Chậu phải thật sạch

không có rêu bám trên thành chậu Thông thường các nhà vườn trồng lan với số lượng

lớn (vài ngàn cây) thường dùng than, dớ, xơ dừa, mút… làm giá thể để trồng lan Hồ

Điệp Có rất nhiều cách trồng lan Hồ Điệp tuỳ theo từng vùng Nhưng có điểm chung

là than, mút nằm dưới đáy chậu, còn xơ dừa hay dớn sẽ nằm trên miệng chậu cách

trồng này giúp cây thoát nước tốt vào mùa mưa, không bị thối rễ và phát triển tốt

Trong thời gian khoảng 2 năm ta thay chậu một lần, nếu cây lớn quá mau có thể thay

chậu sớm hơn

2.3 Tình hình sản xuất lan Hồ Điệp ở Việt Nam [5]

Hiện nay, tại TP.HCM cây lan Hồ Điệp được xem là cây trồng chiến lượt trong

việc chuyển đổi cơ cấu cây trồng và vật nuôi Đây là cây trồng đem lại hiệu quả cao

gấp 2-3 lần so với việc trồng lúa, hoa màu v.v Trong xu thế đất trồng ngày càng hẹp

thì cây lan không chiếm diện tích đất nhiều nên là giải pháp rất hiệu quả Không chỉ

đẹp về màu sắc, hình dáng, hoa lâu tàn… giá thành rẻ nên ngày càng được ưa chuộng

và nuôi trồng Tại TP.HCM và các tỉnh lân cận có rất nhiều vườn trồng Hồ Điệp với

qui mô từ vài trăm đến vài nghìn cây Điển hình là công ty Lâm Thăng của Đài Loan

đầu tư và công ty Kim Ngân chuyên trồng về lan Hồ Điệp, hàng năm có thể cung ứng

cho thị trường từ vài ngàn đếm vài chục ngàn cây, nhất là vào dịp Tết Nguyên Đán

Tuy nhiên do không có sự liên kết giữa các nhà vườn nên sản phẩm làm ra không tìm

được thị trường tiêu thụ, giữa cung và cầu không hợp lý

Về nguồn cây giống thì ở nước ta do không đầu tư nên cây giống không đạt chất

lượng tốt, giống mới không nhiều nên các nhà vườn thường nhập giống từ các nước

như Thái Lan, Đài Loan…Ngoài ra hàng năm việc nhập khẩu hoa từ các nước này ước

tính tiêu tốn hàng triệu USD So với các nước có ngành trồng lan phát triển như Đài

Loan hay Thái Lan thì ngành trồng ở nước ta cần phải học hỏi nhiều và cần phải có

chính sách phát triển hợp lý nhằm đem lại hiệu quả kinh tế cao hơn

2.4 Nhân giống invitro lan Hồ Điệp

2.4.1 Nhân giống Hồ Điệp lai từ trục phát hoa [14]

2.4.1.1 Vật liệu và phương pháp nuôi cấy

Trục phát hoa Hồ Điệp lai được cắt khi các hoa gần tàn Các mắt được làm sạch

và tẩy trùng bằng phương thức của Scuully, có 4 loại chồi khác nhau trên các khúc

mắt được dùng trong thí nghiệm

 Chồi nguyên vẹn được dùng để kiểm chứng

 Chồi bị làm chấn thương bằng cách cắt bỏ 2/3 chồi theo mặt cắt song song với

trục phát hoa và như thế mặt cắt sẽ nghiêng với hướng mọc một gốc α

 Chồi bị làm chấn thương bằng cách cắt chồi làm hai mặt cắt theo trục

 Đâm dọc chồi bằng một kim nhọn từ đỉnh xuống gốc

2.4.1.2 Điều kiện nuôi cấy

 Môi trường Murashige và Skoog( M+S)

 Môi trường Knudson C

 pH:5.8

 Ánh sáng: 5000 1m/m2

 Quang kỳ : 14 giờ

 Nhiệt độ: 2100C

 Dụng cụ chứa đựng môi trường là lọ thuốc nhỏ chứa 10ml

2.4.2 Gieo hạt lan Hồ Điệp nảy mầm trong điều kiện invitrro [3]

Trong tự nhiên hạt lan ít nảy mầm (chỉ nảy mầm 1-2%) do hạt lan không có chứa

anbunin và một phôi chưa phân hóa, có kích thước nhỏ nên khó chứa chất dự trữ Vì

vậy, trong tự nhiên hạt lan Hồ Điệp nảy mầm được nó phải cộng sinh với nấm

Rhizoctonia mucoroides Nấm sẽ cung cấp đường để nuôi cây, phân giải các chất hữu

cơ khó hấp thu Bù lại cây sẽ cung cấp nước cho nấm, chỗ ở và các khoáng chất mà nó

thu được từ sương Dựa trên nguyên tắc này, các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô đã tạo

môi trường gieo hạt lan Hồ Điệp trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo với tỉ lệ rất cao

2.4.2.1.Tiến hành

 Chọn quả lan: Chọn các quả 4 tháng tuổi, quả căng đều, không bị nứt vở,

không bị sâu bệnh làm nguyên liệu để gieo hạt

 Khử trùng : Dùng cồn 750 rửa sạch quả, khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1%

trong 10 phút Rửa lại quả bằng nước vô trùng 5 lần, thấm khô bằng giấy thấm vô

trùng Dùng dao tách vỏ quả để lấy các hạt nhỏ li ti bên trong và gieo trong môi trường

đã chuẩn bị sẵn

 Để gieo hạy lan có thể sử dụng các loại môi trường nền: Knudson,

Vacine-Went (VW), Murashige –Skoog ( MS) có bổ sung thêm đường và các chất hữu như:

Dịch nghiền của khoai tây, chuối , cà rốt, nước dừa, pepton…

2.4.3 Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm trong nhân giống Hồ Điệp lai [2]

2.4.3.1 Hệ thống nuôi cấy

Hệ thống ngập chìm tạm thời được sử dụng trong nghiên cứu này là hệ thống

bình nuôi cấy Plantima do công ty A-tech Bioscientific của Đài Loan sản xuất Hệ

thống này gồm những bộ phận chủ yếu sau: Bơm hay máy nén khí tạo áp lực để đẩy

môi trường từ ngăn chứa lên ngăn chứa mẫu cấy và ngược lại, timer dùng để điều

khiển chu kỳ ngập, hệ thống ống dẫn và van điều khiển, các màng lọc thoáng khí vô

trùng, các bình Platima bằng nhựa polycarbonate gồm có 2 ngăn, ngăn dưới chứa môi

trường lỏng và ngăn trên chứa mẫu thực vật

Bằng cách điều chỉnh tự động áp lực không khí thông qua một máy bơm, môi

trường lỏng từ ngăn dưới sẽ được bơm lên ngăn chứa mẫu cấy và khi đạt đến thời gian

ngập chìm tạm thời dung dịch sẽ quay trở lại ngăn dưới Trong giai đoạn dung dịch

ngập mẫu có sự trao đổi không khí, mẫu được xoay chuyển nhẹ và làm mới không khí

bên trong bình nuôi cấy, dòng khí đi vào và thoát ra được khử trùng nhờ cách lọc vô

trùng 0,45µm Thời gian ngập chìm và tần suất ngập chìm được điều khiển bằng

timer

Hình 1: Hệ thống Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ ngập[11]

2.4.3.2 Mẫu cấy lan Hồ Điệp

Đối tượng thí nghiệm là một loài lan Hồ Điệp lai có tên gọi Doritaenopsis Taida

Salu Mẫu cấy gồm có :

 Protocorm – like bodies –PLBs của giống Dtps Taida Salu

 Mẫu cấy chồi được lấy trong thí nghiệm tái sinh chồi từ PLBs trong các hệ

thống khác nhau trên môi trường tái sinh chồi

2.4.3.3 Phương pháp thí nghiệm

A Khảo sát sự nhân nhanh PLBs trong các hệ thống nuôi cấy khác nhau

Thí nghiệm khảo sát sự nhân nhanh PLBs trong các hệ thống nuôi cấy khác nhau

được tiến hành trong nhằm so sánh hiệu quả trong việc nâng cao hệ quả nhân và chất

lượng của PLBs trong hệ thống TIS so với các hệ thống nhân giống trên môi trường

thạch và trong hệ thống nuôi cấy lỏng lắc Đồng thời khảo sát các thông số tối ưu cho

việc nhân PLBs trên hệ thống TIS Mật độ mẫu cấy và tần xuất ngập chìm

Môi trường nuôi cấy : Môi trường MS bổ sung BA và NAA, sucrose, glucose,

nước dừa Môi trường đối chứng trên thạch có sử dụng than hoạt tính và agar

B Khảo sát sự tái sinh chồi từ PLBs trong hệ thống TIS

Mẫu cấy là những PLBs thu được từ quá trình nhân PLBs Môi trường nuôi cấy

là môi trường MS 1/2 có bổ sung nước dừa, pepton, dịch chiết khoai tây, sucrose Đối

chứng là các mẫu được cấy trên môi trường đặc

Khảo sát các thông số tối ưu cho việc tái sinh chồi và nhân chồi trên hệ thống

TIS Mật độ mẫu cấy và tần suất ngập chìm

C Khảo sát sự ra rễ của chồi Hồ Điệp tái sinh từ PLBs trong hệ thống TIS

Mẫu cấy là những chồi được tách ra từ quá trình tái sinh chồi, chồi lúc cấy vào có

chiều dài là khoảng 8-9 mm, chiều rộng là khoảng 3-4 mm, chiều cao thân là khoảng

10mm, không có rễ Môi trường nuôi cấy là môi trường MS 1/2 có bổ sung nước dừa,

pepton, dịch chiết khoai tây, sucrose, IBA Đối chứng là mẫu nuôi cấy trên môi trường

đặc

Hình 2: Cây sinh trưởng trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm [13]

2.4.4.4 Điều kiện thí nghiệm

Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công Nghệ Tế Bào Thực Vật (Trung

tâm Công Nghệ Sinh Học TP HCM) trong điều kiện nhiệt độ khoảng 25 ± 20C, độ ẩm

80- 85 %, thời gian chiếu sáng 10 giờ / ngày, cường độ chiếu sáng 2500 lux

2.4.4 Nhân nhanh phôi và Protocorm – like body cây lan Hồ Điệp bằng hệ thống

Bioreactor [1]

2.4.4.1 Vật liệu và phương pháp

Đối tượng nghiên cứu

Giống lan Hồ Điệp có màu trắng (phalaenopsis amabilis )

Mẫu thí nghiệm

Nguồn mẫu lá phôi và PLB ( có màu xanh, đường kính từ 1-1,5 mm) thu nhận

sau 2- 3 tháng cấy chuyền trên môi trường MS có bổ sung 2,0 mg/l BA, 0,5 mg/l

NAA, 20%

nước dừa và 30 g/l đường Nguồn mẫu này được dùng làm nguồn vật liệu để làm thí

nghiệm

Môi trường nuôi cấy

Môi trường MS cơ bản có bổ sung kết hợp các thành phần BA, NAA, và nước

dừa, sau đó bổ sung 9g/l agar, 1g/l than hoạt tính, pH môi trường được điều chỉnh về

5,8 trước khi hấp khử trùng

 Đối tượng thí nghiệm tối ưu hóa môi trường nuôi cấy tăng sinh phôi và PLB

Dùng các bình thủy tinh có thể tích 250 ml, thể tích môi trường đỏ vào là 40 ml Bình

thủy tinh có độ truyền suốt ánh sáng cao để mẫu cấy có khả năng quang hợp tốt

 Đối với hệ thống bioreactor

Bioreactor sử dụng trong nghiên cứu có dạng hình cầu, thể tích 3 lít (sản xuất tại

Hàn Quốc) Phần đáy có dạng hình trụ (đường kính ngoài 45 mm, cao 100 mm) Phần

trên có dạng hình cầu (đường kính ngoài 170 mm) Đáy được nối với máy sục khí,

bên dưới là một miếng ceramic (đường kính 20 mm, dày 2mm) có tác dụng tạo bọt khí

mịn Nắp đậy làm bằng vật liệu silicone, hình nón cụt, đường kính trung bình là 100

mm và có khả năng chịu nhiệt tốt (không biến dạng khi hấp vô trùng ở 1210C, 1atm,

trong 30 phút) Trên nắp có ống nối với màng lọc khí Màng lọc khí sử dụng là loại

chịu nhiệt, đường kính lỗ màng lọc là 0,2 Mm Hệ thống nuôi cấy này sử dụng 2 màng

lọc, một để lọc khí vào và một để lọc khí ra Các ống dẫn khí được làm từ silicone chịu

nhiệt, chia làm 2 loại: Loại đường kính 7 mm và loại đường kính 13 mm Sử dụng một

máy bơm để cung cấp khí cho bioreactor với lượng khí khoảng 20 lít/ phút

Điều kiện nuôi cấy

Thực hiện các quá trình nuôi cấy ở nhiệt độ 25 ± 20C, cường độ ánh sáng khoảng

2000lux, sử dụng ánh sáng trắng từ đèn neon, thời gian chiếu sáng là 10 giờ /ngày, độ

ẩm trung bình là 75- 80%

Phương pháp thí nghiệm

Các bước thiết lập và vận hành hệ thống nuôi cấy bioreactor được thực hiện như

sau:

Bước 1: Chuẩn bị các bộ phận của hệ thống bioreactor :bình cầu, nắp silicone,

các ống dẫn silicone, máy lọc khí, máy sục khí Chuẩn bị môi trường nuôi Chuẩn bị

môi trường nuôi cấy và mẫu nuôi cấy

Bước 2 : Gói các bộ phận của hệ thống bioreactor vào trong túi nilon chịu nhiệt

và đem hấp khử trùng ở 121 0C, 1 atm trong 40 phút Đồng thời hấp vô trùng môi

trường cùng một lúc

Bước 3 : Tiến hành lần lượt, đổ môi trường nuôi cấy vào bình cầu với thể tích

nuôi cấy là 1lít, cấy mẫu phôi và PLB vào, đậy nắp lại và sau đó gắn các màng lọc khí

Nắp đậy được dán bằng keo dán ống nước Sau cùng gắn máy sục khí vào hệ thống để

thực hiện quá trình nuôi cấy

Hình 3: Các thiết lập và vận hành hệ thống bioreactor.[1]

Thiết kế thí nghiệm

 Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy tăng sinh phôi và PLB

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực

vật (BA, NAA) và nước dừa phát sinh phôi vô tính và PLB của lan Hồ Điệp Các thí

nghiệm được bố trí theo các bảng như sau

Sau 8 tuần nuôi cấy, thu nhận phôi và PLB, tiến hành lấy kết quả với các chỉ

tiêu sau: Trọng lượng tươi, đường kính phôi, PLB và đánh giá thông qua quan sát thực

tế

Bảng 1: Ảnh hưởng của BA lên sự tăng sinh của phôi và PLB trong môi trường nuôi

cấy bổ sung 0,5 mg /l NAA và 20 % nước dừa

Bảng 2:Ảnh hưởng của NAA lên sự tăng sinh của phôi và PLB trong môi trường nuôi

cấy bổ sung 2,0 mg /l BA và 20% nước dừa

Bảng 3: Ảnh hưởng của nước dừa lên sự tăng sinh của phôi và PLB trong môi trường

nuôi cấy bổ sung 2,0 mg /l BA và 0,5 mg /l NAA

 Khảo sát sự tăng sinh của phôi và PLB trong hệ thống nuôi cấy bioreactor

Từ kết quả đạt được ở thí nghiệm tối ưu môi trường tăng sinh phôi nhóm nghiên

cứu xác định được các thành phần tối ưu cho môi trường nuôi cấy trong bioreactor là:

Môi trường MS cơ bản, thể tích nuôi cấy 1lít bổ sung 2,0 mg / l BA , 1,0 mg /l NAA

và 20 % nước dừa, chỉnh pH về 5,8 trước khi đem đi hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm

trong 40 phút Các bước tiến hành nuôi cấy trong hệ thống bioreactor đã được trình

Môi trường nuôi cấy BA (mg/ l)

bình và môi trường tượng tự như trong hệ thống bioreactor là 3 lít (thể tích bình)và 1

lít (thể tích môi trường) để làm mẫu đối chứng Tất cả các thí nghiệm đều được theo

dõi và tiến hành lấy số liệu sau 6 tuần nuôi cấy Kết quả thu nhận phôi và PLB thông

qua các chỉ số sau: Trọng lượng tươi, hệ số tăng sinh, tỉ lệ sống, số lượng, đường kính

của phôi và PLB được hình thành

Xử lý số liệu

Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, kết quả thí nghiệm được phân tích bằng

Duncan, s test ( Ducan, 1995) với α = 0,05

2.5 Kết quả các thí nghiệm

2.5.1 Nhân giống Hồ Điệp lai từ trục phát hoa [4]

Hai tuần sau, các chồi nguyên vẹn phồng lên và phát triển thành tước, trong khi

các chồi bị chấn thương đã phát triển thành mô sẹo Từ 6-8 tuần người ta có thể quan

sát thấy các chồi bất định nhỏ màu xanh, trên mô sẹo Kết quả thấy rằng mặt cắt

nghiêng 2/3 chồi và đâm dọc chồi được coi là phương pháp tốt nhất Mặc dù phần lớn

chồi phát sinh bất định từ mô sẹo, vẫn có một ít phát sinh không bất định từ các chồi

bên còn lại trên mặt chấn thương

Sau 10 tuần lễ các chồi bất định vừa đủ lớn thì không lấy ra được, biểu hiện lúc

các lá hình thành chồi đạt được chiều dài 5-10 mm và rễ bắt đầu xuất hiện Cây con

được lấy ra trong điều kiện vô trùng, được trồng trên môi trường Knudson C và xử lý

như cây con trồng hạt Khi cây con được lấy ra, các chồi khác vẫn được hình thành và

phát triển.Tuy nhiên, nếu để một số lượng quá nhiều trên một mắt thì các chồi lớn cản

trở sự phát triển các chồi nhỏ Để đảm bảo các chồi phát triển liên tục ta cấy chuyền

các khúc mắt lúc đầu sang môi trường mới khi các chồi đựơc lấy ra hoặc khi môi

trường khô và cạn chất dinh dưỡng

Hình 4: Sự hình thành chồi sinh dưỡng từ phát hoa.[6]

2.5.2 Gieo hạt lan Hồ Điệp nảy mầm trong điều kiện invitrro [3]

Các nhà khoa học đã tiến hành thí nghiệm trên một số giống lan Hồ Điệp nhằm

tìm được tuổi quả thích hợp và loại môi trường nuôi cấy tối ưu cho việc nhân giống

bằng gieo hạt Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 4 và bảng 5 dưới đây:

Bảng 4: Ảnh hưởng của các tuổi khác nhau tới quá trình nảy mầm

Chỉ tiêu theo dõi

Công thức

Thời gian nảy mầm (ngày)

Tỷ lệ nảy mầm (%)

Chất lượng mẫu

Các kết quả ở bảng 4 cho thấy: Chỉ sau khi thụ phấn >100 ngày thì hạt lan Hồ

Điệp mới đủ độ chín và có khả năng nảy mầm cao nhất

Hình 5: Hạt lan nảy mầm trong điều kiện in vitro [12]