Nghiên cứu tẩy sạch virus bằng kỹ thuật nuôi cấy meristem nhằm phục tráng giống khoai tây KT2

Nghiên cứu tẩy sạch virus bằng kỹ thuật nuôi cấy meristem nhằm phục tráng giống khoai tây KT2

Bộ giáo dục và đào tạo

trường đại học nông nghiệp i

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Quang Thạch

Hà nội - 2005

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và ch−a từng đ−ợc ai công bố trong bất cứ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đ−ợc cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã đ−ợc chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Vũ Thị Thu Hằng

Lời cảm ơn

Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp ngoài sự cố gắng của bản thân tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và người thân

Trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô giáo trong khoa Nông học những người đã trực tiếp giảng dạy trang bị những kiến thức bổ ích trong suốt thời gian học đại học cũng như học cao học của mình Tôi xin được gửi lời chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ sinh học và phương pháp thí nghiệm đã chân thành đóng góp ý kiến giúp cho luận văn của tôi được hoàn thiện hơn Đặc biệt tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo GS TS Nguyễn Quang Thạch người thầy đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận văn này Tôi cũng xin được chân thành cảm ơn tập thể cán bộ công nhân viên phòng Công Nghệ Sinh Học - Viện Sinh học Nông nghiệp - Trường Đại học Nông nghiệp I đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập

Bên cạnh đó tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả người thân, bạn bè những người luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài

Hà Nội, ngày 10 tháng 9 năm 2005 Học viên

Vũ Thị Thu Hằng

Mục lục

Danh mục các hình

2.2 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và Việt Nam 5

2.4 Hiện tượng thoái hoá giống khoai tây do virus 122.5 Cơ sở khoa học và quy trình làm sạch virus 152.6 Một số nghiên cứu về làm sạch virus ở khoai tây 19

3 Đối tượng, địa điểm, nội dung và phương pháp nghiên cứu 26

3.1 Đối tượng 263.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 263.3 Nội dung nghiên cứu 263.4 Phương pháp nghiên cứu 293.5 Xử lý số liệu 33

4 Kết quả và thảo luận 34

4.1 Điều tra ngoài sản xuất 34

4.1.1 Thí nghiệm 1: Điều tra thực tế và đánh giá tình hình sản xuất giống

4.1.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá độ nhiễm bệnh virus bằng phương pháp test ELISA 374.2 Thí nghiệm làm sạch virus 384.2.1 Thí nghiệm 3: ảnh hưởng của GA3 đến khả năng bật chồi khoai

4.2.2 Thí nghiệm 4: ảnh hưởng của liều lượng Agar đến khả năng bật chồi cây từ Meristem 414.2.3 Thí nghiệm 5: ảnh hưởng của kích thước Meristem đến khả năng

bật chồi cây khoai tây và độ làm sạch virus 444.2.4 Thí nghiệm 6: ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng bật chồi và

làm sạch virus của cây từ Meristem 484.3 Đánh giá sự sinh trưởng của cây sạch virus trong invitro và ngoài sản

xuất 574.3.1 Thí nghiệm 7: Đánh giá sự sinh trưởng, phát triển của cây khoai tây

5 Kết luận và đề nghị 67

5.1 Kết luận 675.2 Đề nghị 68Tài liệu tham khảo 69

Danh môc c¸c ch÷ viÕt t¾t

KHKT Khoa häc kü thuËt CS Céng sù

§BSH §ång b»ng s«ng Hång CT C«ng thøc

§KTB §−êng kÝnh trung b×nh

TTC T×nh tr¹ng chåi §C §èi chøng

Bảng 4.1: Diện tích và năng suất khoai tây KT2 trong các giai đoạn tại

Quế Võ- Bắc Ninh 35Bảng 4.2: Điều tra tình hình nhiễm bệnh virus của khoai tây KT2 theo

quan sát triệu chứng 36Bảng 4.3: Kết quả kiểm tra virus trên giống KT2 bằng phương pháp Test

ELISA 37Bảng 4.4: ảnh hưởng của GA3 đến khả năng bật chồi của khoai tây KT2 39Bảng 4.5: ảnh hưởng của agar đến khả năng bật chồi của cây khoai tây

Bảng 4.6 ảnh hưởng của kích thước Meristem đến tỷ lệ bật chồi khoai

Bảng 4.7: ảnh hưởng của kích thước meristem đến khả năng làm sạch

Bảng 4.8: ảnh hưởng của xử lý nhiệt đến khả năng bật chồi cây từ

meristem (với kích thước meristem 0,6mm) 48Bảng 4.9: Kết quả làm sạch virus kết hợp giưa tách meristem và xử lý

nhiệt độ ở kích thước 0,6mm 50Bảng 4.10: ảnh hưởng của xử lý nhiệt đến khả năng bật chồi cây từ

meristem (với kích thước meristem 0,5mm) 51Bảng 4.11: Kết quả làm sạch virus kết hợp giưa tách meristem và xử lý

nhiệt độ (ở kích thước meristem 0,5mm) 53

Bảng 4.12: ảnh hưởng của xử lý nhiệt đến khả năng bật chồi cây từ

meristem (với kích thước meristem 0,4mm) 54Bảng 4.13: Kết quả làm sạch virus kết hợp giưa tách meristem và xử lý

nhiệt độ ở kích thước 0,4mm 56Bảng 4.14: Sinh trưởng của cây khoai tây KT2 in vitro sau khi test virus 57Bảng 4.15: Tạo củ của cây khoai tây KT2 in vitro sau khi test virus 59Bảng 4.16: Sinh trưởng của khoai tây sạch virus (sau 1 tháng trồng thử

nghiệm) 61

Danh mục các hình

Đồ thị 4.1: ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng bật chồi của cây

từ meristem 40Đồ thị 4.2: ảnh hưởng của lượng agar đến khả năng bật chồi của

Đồ thị 4.3: ảnh hưởng của kích thước meristem đến khả năng bật chồi

Đồ thị 4.4: ảnh hưởng của xử lý nhiệt đến khả năng bật chồi của khoai

Danh mục các hình

ảnh 1: Triệu chứng của bệnh virus trên lá khoai tây 36ảnh 2: ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng bật chồi của cây từ

ảnh 3: ảnh hưởng của lượng agar đến khả năng bật chồi của meristem

ảnh 6: Sinh trưởng của cây khoai tây bị nhiễm virus X+Y, nhiễm virus

X, sạch virus X+Y (sau 15 ngày nuôi cấy) 58ảnh 7 Cây sạch virus X+Y, Cây nhiễm virus X, Cây nhiễm virus X+Y 60ảnh 8: Tia củ của khoai tây KT2 bị virus X+Y và sạch virus X+Y ngoài

sản xuất thử nghiệm 62

1 Mở đầu

1.1 Đặt vấn đề

Cây khoai tây thuộc họ cà Solanaceae chi Solanum Trong hệ thống cây

trồng nông nghiệp của vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như ngô, lúa nước, lúa mì… thì khoai tây là cây trồng cho năng suất dinh dưỡng và năng suất protein cao nhất (Beuceman, Vander Zagg, 1979)[26] Bên cạnh vai trò là cây lương thực quan trọng của nhiều nước trên thế giới, khoai tây còn là cây thực phẩm, thức ăn gia súc và còn là nguyên liệu cho ngành công nghiệp chế biến

Cây khoai tây có những đặc tính quý như: thời gian sinh trưởng ngắn, thích hợp với nhiều vùng sinh thái, nhiều chân đất, cho năng suất cao củ giàu dinh dưỡng nên khoai tây được trồng rất phổ biến Theo trung tâm nghiên cứu khoai tây Quốc tế - CIP tính đến năm 1998 đã có 130 nước trên thế giới trồng khoai tây với tổng diện tích 18,3 triệu ha, tổng sản lượng 295,1 triệu tấn, năng suất trung bình 16 tấn/ha.(Nguyễn Quang Thạch và cs 2004)[18]

Khoai tây là cây trồng lý tưởng cho vụ Đông ở đồng bằng sông Hồng Cây khoai không đòi hỏi thời vụ nghiêm ngặt như các cây trồng vụ đông khác Thời vụ trồng khoai tây có thể kéo dài từ 25/10 đến cuối tháng 12 Khoai tây có thời gian sinh trưởng ngắn (80 - 90 ngày) nhưng lại đạt năng suất cao, có nhiều điển hình đạt năng suất 25 - 30 tấn/ha Sản phẩm thu hoạch dễ tiêu thụ và dễ thương mại hoá Mặt ưu việt khác là cây khoai tây thường được trồng trong vụ đông trên các chân đất đã trồng lúa ở vụ xuân và vụ mùa Công thức luân canh này sẽ góp phần nâng cao độ phì nhiêu của đất, hạn chế sự lan truyền của sâu bệnh Trong phong trào “cánh đồng 50 triệu đồng/ha/năm hiện nay”, sản xuất khoai tây có ý nghĩa quan trọng Một vụ khoai tây có thể cho năng suất 20 - 25 tấn/ha, với giá bán 2000 đồng/kg đã cho thu nhập 40 triệu đồng/ha

Tuy nhiên thực trạng sản xuất khoai tây ở đông bằng sông Hồng không phản ánh đúng tiềm năng đã phân tích nguyên nhân cơ bản hạn chế việc phát triển khoai tây ở nước ta là do sử dụng củ giống bị thoái hoá làm giảm năng suất nên hiệu quả sản xuất thấp

Cây khoai tây là cây nhân giống vô tính chủ yếu bằng củ, vì vậy hiện tượng thoái hóa giống do virus là rất phổ biến, lây lan rất nhanh và gây thiệt hại bình quân 13% sản lượng khoai tây hàng năm trên toàn thế giới Tác hại của bệnh không chỉ làm giảm năng suất mà còn làm giảm 16 - 17% lượng tinh bột trong củ ở Việt Nam, theo điều tra của Trương Văn Hộ và cs (1992)[7] chỉ sau một vụ trồng khoai tây sạch bệnh thì khả năng nhiễm lại của khoai tây sạch bệnh từ 1 - 33% tuỳ theo từng giống

Trong sản xuất khoai tây ở nhiều vùng của nước ta (Bắc Ninh, Bắc Giang), giống khoai tây KT2 rất được người nông dân ưa chuộng vì có nhiều đặc tính quý như thời gian sinh trưởng ngắn, có thể trồng vào vụ đông sớm, năng suất ổn định, chất lượng tốt, mắt củ nông, thời gian bảo quản lâu, dễ thương mại hoá, nếu trồng trong vụ đông sớm thì khoai tây KT2 cho năng suất hơn hẳn các giống khác trong cùng thời vụ bên cạnh đó một trong những ưu điểm nổi bật của khoai tây KT2 là có khả năng vận chuyển xa tốt nhất trong các giống hiện đang trồng ở đồng bằng sông Hồng Giống KT2 được xem là một trong những giống thích hợp nhất cho việc chuyển vào bán ở các tỉnh phía nam

Tuy nhiên, do sử dụng bằng nguồn giống được người nông dân tự để từ vụ này sang vụ khác nên giống KT2 bị thoái hoá rất nặng Hiện nay, 100% giống khoai tây KT2 đang trồng ngoài sản xuất bị thoái hoá do virus Người sản xuất tha thiết muốn có nguồn giống khoai tây KT2 với những đặc tính ưu việt ban đầu của nó Việc tẩy sạch virus cho nhiều cây trồng trong đó có khoai tây bằng kỹ thuật nuôi cấy meristem đã được nhiều nghiên cứu trên thế giới

thừa nhận Morel G và Martin C (1952) (1955)[39][40], Norris D O (1954)[43], Kasanis B (1957)[34] Tuy nhiên ở Việt Nam việc nghiên cứu chi tiết và đưa ra quy trình tẩy sạch virus cho khoai tây một cách chính xác cụ thể hầu như chưa có công bố Liệu chúng ta có thể phục tráng lại giống bằng cách tẩy sạch virus cho củ giống để cung cấp giống sạch bệnh cho sản xuất được không? Xuất phát từ yêu cầu bức bách đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề

tài: “Nghiên cứu tẩy sạch virus bằng kỹ thuật nuôi cấy meristem nhằm

1.2 Mục đích của đề tài

ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy meristem để tẩy sạch virus nhằm khắc phục hiện tượng thoái hoá giống ở khoai tây KT2

1.3 Yêu cầu của đề tài

- Điều tra tình hình thoái hóa do virus trên giống KT2 ngoài sản xuất - Xác định được phương pháp tẩy sạch virus bằng kỹ thuật nuôi cấy meristem (kỹ thuật tách meristem, kích thước nuôi cấy, môi trường nuôi cấy, thời gian xử lý nhiệt) đến quá trình tẩy sạch virus của khoai tây KT2

- Bước đầu đánh giá tính ưu việt của cây đã được tẩy sạch virus

2 Tổng quan tài liệu

2.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây

Khoai tây có nguồn gốc xuất phát từ vùng Pêru (Nam Mỹ) Petroxieda người đầu tiên (Tây Ban Nha) đã phát hiện ra cây khoai tây tại lưu vực sông Canca (Colombia), nơi thổ dân da đỏ cư trú vào năm 1538 (Lê Minh Đức, 1977) [6] Đầu thế kỷ XVI những nhà hàng hải người Tây Ban Nha đã đem giống về trồng ở nước họ Vào cuối thế kỷ XVI cây khoai tây được trồng Italia, Đức và Mỹ Năm 1586, một nhà hàng hải đem khoai tây về trồng ở Anh Năm 1785, khoai tây được mang về trồng ở Pháp Từ đó khoai tây được đem trồng ở các nước châu Âu khác Hiện nay, trên thế giới khoai tây được trồng nhiều ở Ucraina, Nga, Đức, Balan, Pháp, Hoa Kỳ, Anh, Ailen (Đường Hồng Dật, 2005)[5]

Về mặt phân loại thực vật, cây khoai tây thuộc chi Solanum Sectio

Petota gồm 160 loài có khả năng cho củ (Hawkes, 1978; Mc Collum, 1992) [32][36] Cây khoai tây thuộc nhóm cây thân thảo, họ cà (Solanaceae) Hiện

nay, theo tổng kết có khoảng 20 loại khoai tây thương phẩm Chúng đều thuộc

loài Solanum tuberosum L và ở thể tứ bội (Tetraploid) (2n=4x=48), có khả

năng sinh trưởng, phát triển tốt cho năng suất cao (Võ Văn Chi và CS, 1969 [2]; Mc Collum, 1992) [43]

Khoai tây là một trong những nguồn lương thực quan trọng của loài người, được xếp vào cây lương thực đứng hàng thứ 4 trên thế giới, sau lúa mì, lúa gạo và ngô Theo FAO (1991)[29], hàng năm sản lượng khoai tây chiếm khoảng 50% tổng sản lượng cây có củ

Khoai tây không những là cây lương thực mà còn là loài rau quý của nhiều nước Theo đánh giá tổng kết của Peter Vander Zaag (1979) so với một

số cây trồng nhiệt đới nằm trong khoảng 30o vĩ độ Bắc đến 30o vĩ Nam như lúa, ngô, đậu… khoai tây là cây trồng có thời gian sinh trưởng ngắn nhất nhưng nó lại cho năng suất năng lượng và năng suất protein là cao nhất (Đặng Thị Vân, 1997)[22]

Bảng 2.1: Năng suất năng lượng và năng suất Pr/ha/ngày của một số cây trồng

Loại cây trồng

Năng suất (T/ha)

T.gian sinh trưởng

Phần ăn được

(%)

Kcal/ 100g

N Suất Kcal.103/ngày/ha

Protein (%)

N.S protein kg/ngày/ha

Khoai tây 7,09 125 85 90,82 48,64 2,0 1,0

Sắn 9,50 330 85 185,47 45,12 0,7 0,2 Khoai lang 5,60 135 85 138,30 48,93 1,5 0,5

Củ từ 9,30 280 85 125,99 35,45 2,0 0,6 Đậu đỗ 0,44 150 100 400,24 11,72 22,2 0,6

Lúa 1,77 150 70 426,90 35,16 7,0 0,6 Ngô 1,20 135 100 438,91 38,97 9,5 0,8

Nguồn: Peter Vander Zaag 1979

2.2 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và Việt Nam 2.2.1 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới

Nhờ có giá trị về nhiều mặt như vậy mà khoai tây được trồng ở 130 nước trên thế giới từ 710 vĩ tuyến Bắc đến 400 vĩ tuyến Nam (Tạ Thu Cúc, 2001)[4] Tuy nhiên do trình độ sản xuất, trình độ khoa học công nghệ và trình độ thâm canh rất khác nhau giữa các nước trồng khoai tây nên năng suất rất chênh lệch Theo thống kê của FAO (1995)[30], tính đến năm 1990 năng

suất của các nước trồng khoai tây đạt từ 4 - 42 tấn /ha, sản lượng đạt khoảng 300 triệu tấn, chiếm khoảng 60 - 70 % sản lượng lúa hoặc lúa mì và chiếm khoảng 50% tổng sản lượng cây có củ

Về diện tích trồng khoai tây: đứng đầu là Cộng hoà Liên Bang Nga (3,5 triệu ha), tiếp đến là Trung Quốc (3,4 triệu ha), Ba Lan và Ucraina (1,5 triệu ha) ấn Độ là nước đứng thứ sáu với diện tích khoảng (1 triệu ha) Các quốc gia còn lại có diện tích trồng khoai tây dưới 1 triệu ha (FAO, 1996)[31]

Về năng suất: tuỳ theo mức độ thâm canh và trình độ sản xuất mà năng suất bình quân của các nước dao động rất lớn, từ 4 - 42 tấn/ha (FAO, 1995)[30]

Năng suất khoai tây cao thường tập trung ở các nước công nghiệp tiên tiến điển hình là các nước thuộc Tây Âu như Anh, Pháp, Bỉ, Hà Lan, Đan Mạch… Năng suất đạt từ 35 - 42 tấn Các nước như Nhật Bản, Hoa Kỳ đạt năng suất bình quân từ 31 - 36 tấn/ha ở các quốc gia đang phát triển, năng suất khoai tây bình quân chỉ dao động xung quanh 10 tấn/ha (FAO,1995)[30]

Về sản lượng: Trung Quốc có sản lượng trên 40 triệu tấn mỗi năm, là nước đứng đầu thế giới về sản lượng khoai tây, thứ hai là Ba Lan (24 triệu tấn), tiếp theo là Mỹ khoảng 20 triệu tấn và ấn Độ xung quanh 17 triệu tấn (FAO, 1996)[31]

2.2.2 Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam

ở Việt Nam, khoai tây là cây trồng mới nhập nội từ châu âu do người Pháp đưa vào năm 1890 Trước năm 1970, diện tích trồng khoai tây chỉ vào khoảng 2000 ha và được xem như là một loại rau, sau đó tăng từ 25.500 ha năm 1976 lên tới 104.600 ha năm 1979 Kết quả của việc tăng diện tích đó là nhờ cuộc cách mạng xanh về giống lúa, vụ đông ở đồng bằng sông Hồng trở thành vụ chính, cây khoai tây được coi là một cây trồng vụ đông lý tưởng cho

vùng đồng bằng sông Hồng và trở thành một cây lương thực quan trọng Năm 1987, cây khoai tây chính thức được Bộ Nông nghiệp đánh giá là cây lương thực quan trọng thứ hai sau cây lúa Chương trình khoai tây quốc gia được thành lập đã thu hút hàng loạt các cơ quan nghiên cứu và triển khai phát triển khoai tây rất mạnh (Nguyễn Quang Thạch, 1991)[15]

Hiện nay, khoai tây đang được coi là một trong những loại thực phẩm sạch, là một loại nông sản hàng hoá được lưu thông rộng rãi (Ngô Văn Hải 1977)[7]

Với điều kiện thời tiết, khí hậu vụ đông ở miền Bắc Việt Nam (đặc biệt là đồng bằng sông Hồng) cây khoai tây có các ưu thế hơn hẳn nhiều cây trồng khác cùng trong vụ

Thời vụ trồng khoai tây không khắt khe như trồng đậu tương, ngô có thể trồng từ thượng tuần tháng 10 đến hạ tuần tháng 12 vẫn cho năng suất rất khá Khung thời vụ trồng và thu hoạch khoai tây nằm trọn trong thời gian từ vụ lúa mùa sang vụ lúa xuân Việc trồng trọt và thu hoạch không gây căng thẳng tới việc thu hoạch lúa mùa và gieo cấy lúa xuân Khoai tây là cây trồng hoàn toàn phù hợp với công thức luân canh:

Lúa mùa - khoai tây - lúa xuân

Mặt khác, trồng khoai tây đông sớm thì chúng ta có thể trồng hai vụ: vụ đông và vụ xuân Việc trồng khoai tây hai vụ giúp nâng cao thu nhập của người nông dân Ngoài ra, việc luân canh lúa và khoai tây còn có tác dụng tăng độ phì cho đất cả về lý tính và hoá tính, đồng thời còn ngăn cản sự lây truyền một số bệnh

Trong các cây vụ đông không có cây nào chỉ trong thời gian dưới 3 tháng trồng trọt lại cho thu hoạch một khối lượng sản phẩm lớn, có ý nghĩa và giá trị nhiều mặt như cây khoai tây Năng suất khoai tây Việt Nam có thể đạt từ 8 - 30 tấn/ha tuỳ thuộc vào giống và điều kiện thâm canh

Diện tích: diện tích trồng khoai tây của chúng ta biến động rất lớn Diện tích tăng nhanh vào những năm 1970 và đạt cực đại vào 1979, sau đó giảm liên tục Từ năm 1991 trở lại đây diện tích dao động trong khoảng (28.000 - 30.000 ha) Một số năm gần đây diện tích có xu hướng tăng dần vào niên vụ 2002-2003 lên tới 35.000 ha (Đỗ Kim Chung, 2004)[3]

Năng suất khoai tây: bình quân trong những năm 76 - 1990 dưới 10 tấn/ha và dao động khoảng 10 tấn/ha trong những năm 1991 - 1998 và 11 - 12 tấn/ha những năm 1999 - 2002 (Đỗ Kim Chung, 2004, Nguyễn Thị Kim Thanh, 1997)[3][19]

Sản lượng: sản lượng khoai tây của cả nước dao động từ 260.100 tấn tới 361.638 tấn trong những năm1976 - 1990 và 243.348 tấn tới 382.296 tấn năm 1991 - 2000 và tăng lên tới 400.000 - 421.036 tấn những năm 2002 – 2003 (Đỗ Kim Chung, 2004, Nguyễn Thị Kim Thanh, 1998 )[3][19] (Bảng 2)

Theo kết quả của bộ môn Côn trùng học - Trường ĐHNN I cho thấy: nguyên nhân chính làm cho người nông dân thu hẹp diện tích trồng khoai tây là do việc trồng củ giống có chất lượng kém làm năng suất khoai tây quá thấp Xu hướng chung tại các địa điểm điều tra cho thấy rằng: nếu có củ giống khoai tây mới cho năng suất cao thì người nông dân sẽ trồng trở lại

Giống khoai tây người nông dân sử dụng hầu hết là do người nông dân tự mua không biết rõ nguồn gốc giống ở đâu, do trung tâm nào sản xuất và cung cấp Do mua giống ở ngoài giá thành cao cho nên người nông dân thường duy trì từ vụ này qua vụ khác do vậy mà các giống đang trồng phổ biến trong sản xuất đã bị thoái hoá

B¶ng 2.2 DiÖn tÝch, n¨ng suÊt, s¶n l−îng khoai t©y ViÖt Nam tõ n¨m 1979-2002

(1000 ha)

N¨ng suÊt (TÊn/ha)

S¶n l−îng (1000 tÊn)

Nguån: TÝnh to¸n tõ niªn gi¸m thèng kª 2004

Theo kết quả điều tra cơ cấu giống ở một số vùng thuộc châu thổ sông Hồng cho thấy: hầu hết các vườn còn duy trì các giống thuần tuý đã bị thoái hoá nghiêm trọng (tỷ lệ nhiễm virus là 54 - 65%), hao hụt trong bảo quả lớn (45 - 60%) năng suất khoai tây thấp (8 - 9 tấn/ha), hiệu quả sản xuất không cao Ngay cả nơi có trình độ thâm canh có truyền thống trồng khoai tây lâu đời như Hạ Hồi (Thường Tín) năng suất cũng chỉ đạt 12 - 13 tấn/ha

Việc nhập nội các giống khoai tây Trung Quốc tuy giá thành rẻ nhưng không kiểm soát được bệnh và phẩm chất củ không cao, thậm chí còn là khoai tây thương phẩm nên thường chỉ trồng được một vụ, muốn trồng phải nhập giống liên tục Qua số liệu điều tra cho thấy, khoai tây Trung Quốc mọc yếu, tỷ lệ không mọc và thối cao, chiếm 20 - 30%

Như vậy có thể nói rằng cây khoai tây thực sự là:

“Nguồn tiềm năng sinh học chưa được khai thác ở nước ta”

Để khắc phục được tình trạng trên, cần có sự phối hợp chặt chẽ giữa các cơ quan nghiên cứu trong nước nhằm giải quyết hai vấn đề sau:

Thứ nhất: Tìm phương pháp phục chế những giống khoai tây có chất lượng tốt năng suất cao, thích hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam cũng như phù hợp với thị hiếu người tiêu dùng Thay thế giống khoai tây đã bị thoái hoá bằng những giống khoai tây có khả năng cho năng suất và chất lượng cao

Thứ hai: Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất khoai tây giống để đảm bảo tự sản xuất củ giống có chất lượng cao, cung cấp cho người nông dân với giá thành hợp lý, kết hợp với chuyển giao kỹ thuật trồng khoai tây thương phẩm cho người nông dân

Có như vậy chúng ta mới mới khuyến khích được việc mở rộng diện tích trồng khoai tây, đưa khoai tây thực sự trở thành cây trồng lý tưởng của vụ đông và xứng đáng là cây lương thực hàng hoá quan trọng

2.3 Vài nét về giống khoai tây KT2

Giống được chọn từ tổ hợp lai giữa dòng 381064 với giống khoai tây chịu nhiệt LT - 7 tại Trung tâm cây có củ (Viện KHKT Nông nghiệp Việt Nam) từ năm 1986 Giống được công nhận là giống khoai tây mới và đặt tên là KT2 từ tháng 1/1995

Giống KT2 có thời gian sinh trưởng ngắn (75 - 80 ngày), ngắn hơn các giống đang trồng phổ biến trong sản xuất hiện nay là 10 - 15 ngày Trong điều kiện thu hoạch sớm (55 - 60 ngày sau khi trồng) giống KT2 đã có thể cho năng suất 15 - 17 tấn củ/ha (Tạ Thu Cúc và CS, 2001)[4]

Giống KT2 trồng thích hợp trong vụ đông sớm và Đông chính vụ trong vụ giữa hai vụ lúa Đặc biệt trong vụ đông sớm, giống KT2 cho năng suất hơn hẳn các giống khoai tây khác trong cùng điều kiện (Đường Hồng Dật, 2005) [5]

Củ khoai tây giống này có phẩm chất khá, dạng củ đẹp, hình tròn elip Vỏ củ màu vàng đậm, ruột củ vàng, mắt củ nông, tỷ lệ củ to cao

Tỷ lệ nhiễm bệnh mốc sương khá Thường nhiễm bệnh virus chậm Khả năng chống chịu bệnh vi khuẩn yếu Trong bảo quản tỷ lệ củ thối thấp

Giống này có thời gian ngủ nghỉ ngắn (từ 80 - 85 ngày) Củ giống nảy mầm sớm, mầm sẽ già sinh lý khi trồng Nếu sản xuất củ giống và giữ giống theo tập quán cũ, giống sẽ chóng thoái hoá làm năng suất thấp Vì vậy, cần có cách sản xuất và giữ giống riêng cho giống này

Để đảm bảo năng suất cao, phẩm chất củ tốt và hạn chế sự gây hại của sâu bệnh, nên dùng củ giống sản xuất trong vụ xuân để trồng cho vụ đông

Vì giống ngắn ngày nên cần bón phân sớm Chủ yếu là bón phân chuồng hoai mục và bón thúc

Trồng vụ xuân cần chọn chân đất cao dễ tiêu thoát nước Tốt nhất là nên trồng trên chân đất có thành phần cơ giới nhẹ, giàu dinh dưỡng

2.4 Hiện tượng thoái hoá giống khoai tây do virus

Thoái hóa giống khoai tây là một hiện tượng chung thường xảy ra ở tất cả các nước đã và đang trồng khoai tây trên thế giới Theo Vũ Triệu Mân, hiện tượng này được Parmentier phát hiện từ năm 1786 Song phải gần một thế kỷ sau, khi các nhà nghiên cứu xác định được các đặc tính của virus đã khẳng định chúng là một trong những nguyên nhân chính làm thoái hóa khoai tây Cho đến năm 1913 thì bệnh thoái hoá khoai tây đã được Quanjer - Viện bảo vệ thực vật Wageningen chính thức đề nghị (Nguyễn Quang Thạch, 1991) [15]

Từ những đầu thập kỷ 20, người ta mới chỉ phát hiện được 3 loại bệnh virus chính hại khoai tây là: bệnh cuốn lá (leafrol), bệnh khảm lá (mosaic), bệnh hoa lá (Bigarune), tiếp theo đó là hàng loạt các nghiên cứu khác của Smith K.M (1931); Murphy và Salaman R N đã phát hiện thêm nhiều loài virus khác nhau cùng chủng loại của chúng Theo Ross A.F (1964) cho biết khoai tây có thể là ký chủ của 60 loài virus gây bệnh, còn Mactin C (1968) lại thấy có 33 loại chưa kể các chủng của chúng Năm 1981, Hooker W J đã thống kê được 24 bệnh do virus gây hại trong số 112 bệnh phổ biến gây hại trên khoai tây (Đỗ Thị Thuỷ, 2004)[20]

Theo thống kê gần đây nhất của Le Hingrat Y (1989) từ những kết quả về bệnh virus hại khoai tây trên thế giới thì có 6 loài virus chủ yếu (có tính phổ biến rộng với nồng độ cao) gây hại có ý nghĩa kinh tế ở khoai tây là virus gây cuốn lá Y, X, A, S, M (Mai Thị Tân, 1998)[12]

- Virus gây cuốn lá (Potato left Roll Virus - PLRV): Virus gây cuốn lá làm giảm năng suất 40 - 90%

- Virus Y (Potato virus Y- PVY): Gây xoăn lá, khảm hoa, lá, làm giảm năng suất 50 - 90%

- Virus X (Potato virus X- PVX): Khảm hoa, lá, nhưng không biến dạng

lá, vết khảm giới hạn bởi các gân lá tạo vết bệnh bộ phận hoặc có triệu chứng đốm vòng khuyên đỏ trên lá Bệnh làm giảm năng suất 10 - 25%

- Virus A (Potato virus A- PVA): Gây khảm hoa, lá, làm giảm năng suất 50%

- Virus S (Potato virus S- PVS): Triệu chứng ẩn, có thể làm giảm diện tích lá, gây đổ cây, giảm năng suất 10 - 15%

- Virus M (Potato virus M- PVM): Gây cuấn lá nhẹ ở ngọn, khảm gân lá, làm giảm năng suất 60 - 70%

ở Việt Nam, bệnh virus hại khoai tây cũng bắt đầu được đề cập vào những năm 60 (Mai Thị Tân, 1998)[12]

Theo điều tra của Hà Minh Trung, Nguyễn Phương Đại (1972) [21] độ nhiễm bệnh virus khoai tây ở Việt Nam chiếm từ 76 - 100% số khóm điều tra Năm 1972 - 1973, Nguyễn Thơ, 1980 [14] mới phát hiện 4 loại virus ở khoai tây Việt Nam Đến năm 1984, Vũ Triệu Mân [9] đã khẳng định sự có mặt của virus Y, X, A, S, M và cuốn lá, tỷ lệ bệnh chiếm tới 90%, một số nơi đến 100% Riêng ở giống Thường tín, với 500 mẫu điều tra, thu thập ở vùng đồng bằng sông Hồng năm 1991 - 1992 có tỷ lệ virus tới 80% Thậm trí, cùng một lúc trên một cây có nhiều loại virus cùng gây bệnh, gây hại trên toàn cây, làm giảm năng suất nghiêm trọng

Các nhà nghiên cứu đã phát hiện bệnh virus có những đặc tính rất nguy hiểm:

- Là căn bệnh không chữa được: sự xâm nhiễm của virus rất khó phát hiện mặc dù nó xảy ra trong suốt quá trình sống của cây Khi xâm nhiễm vào tế bào virus làm cho hệ thống AND của cây chủ thay đổi, tế bào cây chủ liên tục sản xuất ra protein và axít nucleic của virus Vậy tế bào cây chủ đã nhân virus lên (Meyer K., 1986)[38] Do vậy, nếu có tác nhân nào đó ngăn chặn

được sự nhân lên AND của virus thì đồng thời cũng ức chế sự sinh tổng hợp AND của cây chủ Vì thế có thể nói rằng bệnh virus khoai tây là không chữa được

- Là bệnh có đặc tính lan truyền qua các thế hệ: đối với những cây nhân giống bằng con đường hữu tính, virus rất ít truyền qua hạt Song ở những cây nhân giống vô tính (bằng củ, căn hành, cành giâm, mắt ghép…) virus có mặt trong mọi tế bào đang sống, nó được nhân lên trong cây, được vận chuyển trong dòng nhựa đi đến mọi vùng của cây, cho tới tận các củ con là thế hệ nối tiếp sau này Kết quả một củ mẹ bị bệnh virus sẽ tạo nên một cây bệnh, và tiếp tục lan truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, từ năm này qua năm khác, bệnh ngày càng mở rộng (Merlet J., 1979)[37]

- Là loại bệnh rất dễ lan truyền nhờ côn trùng và tiếp xúc cơ giới: các loại côn trùng (chủ yếu là rệp) chích hút các loại khoai tây mang theo virus rồi truyền sang các cây khoẻ khác, nếu mật độ rệp cao thì chỉ sau 1 năm, từ vụ này qua vụ khác tỷ lệ bệnh đã lên tới 80% - 100% Ngoài ra, virus có thể lan truyền nhờ gió hoặc do sự vô ý của người chăm sóc Việc truyền bệnh bằng

tiếp xúc cơ giới chủ yếu với virus X, Y, S qua vết thương ở lá hay mầm

Virus khoai tây gây ra những thay đổi lớn về chức năng sinh lý của cây bệnh, ảnh hưởng nghiêm trọng đến quá trình trao đổi chất, từ đó dẫn đến hiện tượng thoái hoá, cây sinh trưởng kém, còi cọc củ nhỏ và ít, hàm lượng tinh bột, vitamin trong củ giảm thấp, có hiện tượng cây không có củ

Cây khoai tây bị bệnh đã làm giảm năng suất so với cây khỏe, trọng lượng củ/khóm giảm, tỷ lệ củ lớn thấp hoặc không có, tỷ lệ củ nhỏ tăng, nhiều củ không sử dụng được phải dùng làm thức ăn gia súc hay loại bỏ

Khoai tây bị bệnh gây ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng cây và củ khoai tây Các quá trình trao đổi C và N bị phá vỡ làm giảm hàm lượng tinh bột, đạm, protein, tăng lượng axit amin tự do, lân hoà tan và đường hoà tan trong lá

cây hàm lượng diệp lục trong lá giảm rõ rệt, khả năng bốc hơi nước tăng và hô hấp của cây tăng hơn hẳn so với các cây không bị bệnh Trong củ khoai tây bị bệnh cũng diễn biến tương tự như ở lá, lượng chất khô, tinh bột đều giảm, trong khi đó lượng axit tự do, lân hoà tan, đường hoà tan lại tăng

Thiệt hại do bệnh virus gây ra đã ảnh hưởng lớn đến quá trình bảo quản củ giống trong kho Theo số liệu điều tra của Vũ Triệu Mân (1984)[9] thì những củ khoai tây bị nhiễm bệnh virus X, Y, S, M và cuốn lá khi đưa vào bảo quản đều tăng lượng củ thối và giảm khả năng nẩy mầm

ở Việt Nam, theo kết quả điều tra của Hoàng Minh Tấn, Vũ Triệu Mân và các CS (1994) [13] ở vùng đồng bằng Bắc Bộ cho thấy các khóm bị bệnh đều cho tỷ lệ củ lớn và khối lượng củ thấp, tỷ lệ củ nhỏ cao dẫn đến năng suất cuối cùng giảm từ 40,7% - 88,1% so với khóm khoẻ

Việc lan truyền liên tục và không ngừng phát triển bệnh virus qua các thế hệ cây khoai tây làm giảm năng suất và phẩm chất nghiêm trọng chính là hiện tượng thoái hoá giống khoai tây do virus

2.5 Cơ sở khoa học và quy trình làm sạch virus 2.5.1 Cơ sở khoa học

Virus tồn tại ở mọi tế bào sống Tuy nhiên, những nghiên cứu của Morel và Martin (1952) [39] cho thấy nồng độ virus ở mô phân sinh đỉnh và lá bao thứ nhất là bằng không sau đó tăng dần ở các lá xa với mô phân sinh đỉnh ở phía dưới Từ đây các tác giả đã đề xuất kỹ thuật nuôi cấy meristem (mô phân sinh đỉnh) để tạo cây sạch virus hoàn toàn từ cây đã nhiễm bệnh

Limasset và Cornuet đã dùng phương pháp huyết thanh định lượng chứng minh được có sự tồn tại một gradien nồng độ virus từ các mô non đến mô già ở cây thuốc lá bị bệnh (Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, 2003)[17] Cụ thể là nồng độ virus bằng không ở mô đỉnh và bao lá mầm thứ

nhất, sau đó tăng dần lên cực đại ở lá mầm thứ năm rồi lại giảm ở lá phía dưới Trên cơ sở đó Morel và Martin (1952) [39] đề xuất phương pháp tẩy sạch virus bằng cách nuôi cấy meristem - mô phân sinh đỉnh (nơi hoàn toàn không chứa virus) trên môi trường vô trùng để tạo cây sạch virus

Cơ sở lý luận của việc nuôi cấy meristem tạo cây sạch virus đã được Mathews R.E.F., Wang P.J và Hu C.Y., Lizarraga R và CS, Pierik R.L.H (Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, 2003)[17] tổng kết như sau:

- Virus vận chuyển nhờ hệ thống mô dẫn, hệ thống này không có ở mô phân sinh đỉnh Như thế virus bị bao vây không vào được mô phân sinh đỉnh

- ở meristem tốc độ phân bào là rất lớn, tốc độ nhân bản của DNA cao nó không tương hợp với tốc độ nhân bản vật chất di truyền của virus do đó virus không tự tồn tại

- Dựa vào đặc điểm sinh lý ở meristem nồng độ auxin rất cao (vì đỉnh sinh trưởng là nơi sản xuất ra các hợp chất auxin) Chính vì vậy nên nó ức chế sự nhân bản virus do đó virus không tồn tại trong mô phân sinh đỉnh

- Hệ thống vô hiệu hoá virus ở vùng meristem mạnh hơn các vùng khác trong cây

Bắt nguồn từ những nghiên cứu về sự phân bố virus trong cây bị bệnh đã đưa đến một kỹ thuật mới, kỹ thuật nuôi cấy meristem để tạo ra các cây sạch virus

Nhiều tác giả đã phát hiện thấy có sự sai khác lớn về vùng sạch virus ở đỉnh sinh trưởng phụ thuộc vào các loại virus Vì thế, cần có các phương pháp tách Meristem khác nhau khi tẩy virus (Ten Houten et all, 1968)[47]

Kỹ thật nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng - meristem đã được các tác giả Buvat (1952), Norris (1954), Quak (1957) phát triển Năm 1962 Murashige và Skoog đã đưa ra thành phần môi trường dinh dưỡng thích hợp để nuôi cấy Sau

đó năm 1964 Morel và Muller đã hoàn thiện môi trường nuôi cấy từng đoạn mầm khoai tây (Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội)[1]

Từ cơ sở lý luận nêu trên nhiều tác giả đã ứng dụng thành công phương pháp nuôi cấy meristem và trong môi trường thích hợp đã tái sinh được cây khoai tây sạch virus Tuy nhiên, việc nuôi cấy và tái sinh cây từ meristem với kích thước nhỏ nên đòi hỏi kỹ thuật cao trong, công việc phức tạp và tỷ lệ tái

sinh thành công cây hoàn chỉnh thấp

Việc làm sạch virus tức là phải giải phóng các thực vật bị nhiễm virus khỏi virus, đó là công việc cần thiết đối với cây trồng nói chung nhất là các loại cây trồng nhân giống vô tính vì phương thức nhân giống vô tính này là nguyên nhân truyền bệnh từ thế hệ này sang thế hệ khác Biện pháp làm sạch virus phải luôn luôn được kết hợp với các biện pháp duy trì tính sạch bệnh của cây trồng (Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội)[1]

Phương pháp chung để tạo cây sạch virus là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng kết hợp với việc xử lý nhiệt, sau đó thông qua phương pháp nhân nhanh in vitro để tạo ra số lượng cây lớn

2.5.2 Quy trình làm sạch virus ở khoai tây

Để sản xuất giống khoai tây sạch bệnh, trước hết phải có nguồn giống sạch bệnh ban đầu hoặc từ nguồn giống được làm sạch bệnh bằng nuôi cấy meristem, hoặc từ nguồn giống được chuẩn đoán sạch bệnh bằng các phương pháp hiện đại Nuôi cấy meristem là một trong những bước tiến hành đầu tiên trong hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh ở tất cả các nước trồng khoai tây trên thế giới Năm 1980 Walley đề xuất quy trình làm sạch virus khoai tây (Nguyễn Thị Kim Thanh, 1998)[19] cụ thể như sau:

Quy trình làm sạch virus khoai tây:

- Điều kiện nuôi cấy thích hợp- Xử lý hoá chất

- Xử lý nhiệt độ tiếp- Xử lý nhiệt độ cao- Xác định virus

Nuôi cấy mô phân sinh i h

Cấy trong môi trường thích hợp Cây bị nhiễm bệnh

Tái sinh cây

2.6 Một số nghiên cứu về làm sạch virus ở khoai tây

Phương pháp nuôi cấy mô phân sinh đỉnh (meristem) tạo nguồn giống sạch bệnh và chống tái nhiễm trong nhân giống cho đến nay vẫn còn được coi là giải pháp đúng đắn, có hiệu quả được các nhà nghiên cứu về bệnh cây, sinh lý, sinh hoá thực vật các nhà chọn tạo giống và người sản xuất công nhận (Nguyễn Văn Viết, 1991; Nguyễn Quang Thạch, 1993; Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội, 1997)[23] [16] [1]

Dựa vào cơ sở kết quả đầu tiên về nuôi cấy meristem Morel G và Martin C.[39][40] đã thu được cây hoa thược dược hoàn toàn sạch virus năm 1952 Năm 1955 các tác giả cũng đã ứng dụng thành công kỹ thuật này ở cây khoai tây, làm sạch virus A, X, Y và thu được cây khoai tây hoàn toàn sạch bệnh Từ các kết quả trên cùng nhiều công trình nghiên cứu khác, đã phát hiện thấy có sự sai khác lớn về vùng sạch virus ở đỉnh sinh trưởng và việc làm sạch virus chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như chủng loại virus, số lượng virus, kích thước meristem, số lần cấy chuyển, nhiệt độ xử lý, giống v.v… Các yếu tố này ảnh hưởng khá rõ rệt tới khả năng làm sạch virus, sức sống của mẫu cấy và sự tái sinh cây hoàn chỉnh

2.6.1 ảnh hưởng của chủng loại và số lượng virus đến kết quả làm sạch virus

Khi nghiên cứu về vùng sạch virus ở đỉnh sinh trưởng Kassanis B.[34]

đã phát hiện thấy có thể có nhiều loại virus cùng tồn tại trong cây bệnh Số lượng loại virus có mặt sẽ ảnh hưởng tới kết quả loại bỏ chúng khỏi mẫu cây Phát hiện này cũng đã được Thompson A.D (1957)[48], Ten Houten và CS (1968)[47] thừa nhận Thí nghiệm của Penazio S, 1971 [44] trên hai nhóm khoai tây cho thấy: ở nhóm chỉ nhiễm virus X thì tỷ lệ làm sạch là 34/42 cây, ở nhóm nhiễm 3 virus X, M, S thì các virus khác được loại bỏ nhưng chỉ có 2 cây làm sạch được virus X Meyer K (1986)[38] cũng thu được kết quả tương

tự Đồng thời, các tác giả cũng khẳng định rằng càng nhiễm nhiều loại virus thì kết quả loại bỏ virus càng thấp, đòi hỏi phải tách meristem ở kích thước nhỏ và phải cấy chuyển nhiều lần Tốt nhất là chọn mẫu nhiễm ít virus để tiến hành nuôi cấy meristem tạo cây sạch virus

2.6.2 ảnh hưởng của kích thước meristem nuôi cấy đến kết quả làm sạch virus:

Kích thước meristem nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt đến kết quả tẩy sạch virus Morel G., Martin C (1952)[39]; Meyer K (1986)[38]; khi tách meristem có kích thước 0,1 - 0,2 mm có thể loại trừ virus X, A, Y

Ngoài việc quyết định tới mức độ làm sạch virus, kích thước meristem còn ảnh hưởng tới khả năng tái sinh cây khoai tây Meyer K (1986)[38] cho rằng nên tách meristem ít nhất có một lá bao Stace- Smith R và Mellor (1967)[52] đã thu được cây sạch virus X với tỷ lệ tái sinh 67% khi sử dụng meristem có kích thược 0,3 mm El- Fiki A.I.I và các CS (1992)[28] cũng xác nhận rằng khi nuôi cấy meristem với kích thước 0,4mm đã làm tăng tỷ lệ sống, khả năng tái sinh cây và sức sống của cây con so với kích thước nhỏ 0,2mm Tuy nhiên, tỷ lệ sạch virus X lại giảm đi tuỳ thuộc rất nhiều vào loại giống khoai tây Muzashige T., (1974)[41] và Navarro L.,(1977)[42] cũng cho biết khi tăng kích thước của meristem từ 2 lên 6 lá bao đã làm giảm tỷ lệ cây con sạch virus Exocotis từ 100% xuống 83% và virus Psorosis từ 100% xuống còn 45% Như vậy, việc chọn kích thước thích hợp cho từng loại giống, từng loại virus là cần thiết

2.6.3 ảnh hưởng của xử lý nhiệt đến kết quả làm sạch virus:

Cùng với nuôi cấy meristem để loại trừ virus, xử lý nhiệt mô nuôi cấy cũng rất có hiệu quả Tác dụng ức chế của nhiệt lên sự tổng hợp của virus đã được Kunkel L O.[35] phát hiện và được các tác giả khác tiếp tục nghiên cứu

Cơ sở lý luận của việc xử lý nhiệt mô nuôi cấy: theo Baker R [25] mỗi cơ quan cần có một nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng, phát triển Khi nhiệt độ tăng tới mức nào đó thì tốc độ sinh trưởng giảm Điểm mà nhiệt độ được coi là xử lý nhiệt là điểm bắt đầu có tác dụng làm giảm hoạt tính loại trừ tác nhân gây bệnh, tăng đến nhiệt độ nhất định nào đó sẽ có tác dụng loại trừ hoàn toàn Từ điểm nhiệt độ xử lý trở lên hiệu quả xử lý nhiệt tăng lên, nhưng đến một nhiệt độ nhất định thì cơ quan và tác nhân gây bệnh đều bị tiêu diệt gọi là điểm gây chết Như vậy, cần phải xác định một ngưỡng nhiệt độ vừa có tác dụng loại trừ bệnh vừa đảm bảo cho sự tồn tại của mô, cơ quan nuôi cấy

Thí nghiệm trên cơ sở của Baker R., Kaiser W J (1984)[33] thấy rằng

khi duy trì ở nhiệt độ 370c từ 4 - 5 tuần thì tất cả các củ khoai tây ở độ lớn 50 - 100g đều sạch virus V Virus cuốn lá được hoàn toàn làm sạch ở củ khoai tây sau 30 ngày giữ ở nhiệt độ 370c, nhưng củ không bị hại Còn ở nhiệt độ 360c (40 ngày), 370c (30 ngày), 400c (4giờ) không có hiệu lực lên bệnh khảm

rosette necrosis và pseudomanas solanacearum

Kassanis (1957)[34] khi đưa cây bị nhiễm vào nhiệt độ 35 - 39oC trong thời gian từ 2 - 5 tuần, một số loại virus không có khả năng phát triển trong

điều kiện này sẽ bị tiêu huỷ, kết quả sẽ thu được cây sạch virus đó

Tuy nhiên, theo Bhojwani và CS (1983)[27] cho biết không phải tất cả các virus đều mẫn cảm với nhiệt độ, đa số các virus X đều tương đối chịu được nhiệt độ Do vậy, nếu chỉ xử lý nhiệt độ không thôi thì cũng không đạt được kết quả mong muốn Vậy muốn đạt kết quả cao phải nuôi cấy meristem kết hợp với xử lý nhiệt độ Thompson A D (1957)[48] đã nghiên cứu tổ hợp 2 phương pháp nuôi cấy meristem kết hợp với xử lý nhiệt độ để loại trừ virus A, X, Y trên cây khoai tây ứng dụng kỹ thuật này Mc Donall (1973) đã thu được cây khoai tây sạch virus X, S.; Tawantziz S M.; Southord S G (1983) cũng thu được kết quả tương tự (Mai Thị Tân, 1998)[12]

Smith và Mellor (1967)[46] cũng thành công trong việc tẩy sạch virus X và S khi nuôi cấy Meristem ở kích thước 1mm có kết hợp với phương pháp xử lý nhiệt

2.6.4 ảnh hưởng của số lần cấy chuyển đến kết quả làm sạch virus:

Số lần cấy chuyển có tác dụng loại trừ dần nồng độ virus trong quá trình nuôi cấy (Dhingra M.K và CS, 1987) Các tác giả cho biết trong số 6 dòng khoai tây nhiễm bệnh được nuôi cấy trong môi trường có chứa NAA và kinetin thì có 2 dòng Kufri jyoti và Kufri bahar cho rất nhiều callus, những callus này hoàn toàn sạch virus sau 3 lần cấy chuyển, riêng dòng Kufri chandramukhi vẫn còn virus ở một nồng độ nhất định (Mai Thị Tân, 1997)[12]

2.6.5 ảnh hưởng của các chất bổ xung đến kết quả làm sạch virus:

Nhiều tác giả cho rằng các chất kìm hãm virus trong môi trường nuôi cấy meristem cũng có tác dụng loại trừ virus

Norris D O (1954)[43] đã bổ xung malachit xanh vào môi trường nuôi cấy meristem đã lọc sạch virus X ở khoai tây Khi bổ xung 2,4 - D vào môi trường nuôi cấy, Quak F (1961)[45] đã cải thiện việc làm làm sạch virus Một số tác giả khác cũng nhận định rằng những genotyp nào có khả năng tổng hợp được nhiều auxin thì rất có thể dễ làm sạch virus hơn El - Fiki A.I.I và CS (1992)[28] đã thấy rằng khi sử dụng thiouracil với nồng độ 30ppm đã làm sạch virus X Còn Cassells A.C và CS (1980, 1982), đã sử dụng Virazol (Vibavirin) để làm sạch virus Y, X, M, S ở thuốc lá và khoai tây Tiếp theo đó, Klein R E và CS (1982) cũng đã thành công với virus X, S (Mai Thị Tân, 1998)[12]

Tuy nhiên, nhiều tác giả khác lại khẳng định sử dụng các chất hoá học để làm sạch virus rất dễ gây nên các biến dị cho cây khi tái sinh

Việc nuôi cấy Meristem có hiệu quả làm sạch virus cao khi được bổ

xung thêm các chất kìm hãm virus vào môi trường nuôi cấy Nhiều tác giả đã đề nghị bổ xung các chất kìm hãm virus vào môi trường nuôi cấy meristem và kết hợp với phương pháp xử lý nhiệt để tẩy sạch virus

2.6.6 ảnh hưởng của giống đến khả năng làm sạch virus

Stace - Smith R và Mellor F (1967) [46] đã so sánh 18 giống khoai tây nhiễm virus X với nhau và thấy rằng khả năng làm sạch virus ở các giống có sự khác nhau từ 54 - 100%

Các tác giả trên cho rằng: nguyên nhân của sự sai khác về khả năng làm sạch virus giữa các giống là do ở một số giống không có sự nhân (sao chép) virus, ở một số giống khác lại có sự phân chia tế bào mô phân sinh với tốc độ nhanh khác nhau so với sự nhân virus trong cây Meyer K (1986)[38] còn cho biết ngoài việc ảnh hưởng tới khả năng làm sạch virus còn có sự khác nhau giữa các giống về thời gian tái sinh cây, ở dòng 5029 khó loại virus A nhưng thời gian tái sinh cây ngắn nhất (57,6 ngày), trong khi đó dòng 5256 cho tỷ lệ sạch bệnh cao nhưng thời gian tái sinh cây trung bình là 84,2 ngày hoặc dòng 4523 tái sinh thành cây sau 67,2 ngày song chỉ có 70% cây sạch bệnh

Cho đến nay kỹ thuật nuôi cấy meristem đã được nghiên cứu ứng dụng rất có hiệu quả trong việc làm sạch virus cho hàng loạt các loại cây trồng tạo ngân hàng cây giống sạch bệnh, khoẻ mạnh cho năng suất cao, phẩm chất tốt cung cấp cho sản xuất (Mai Thị Tân, 1998) [12] như:

Cây lương thực: Khoai tây, khoai lang, khoai mỡ, khoai sọ, củ từ, ngô, sắn, mạch môn đông

Cây ăn quả: Nho, mâm xôi, táo, dâu tây, chuối, chanh

Hoa cây cảnh: Cúc, loa kèn, lay ơn, thiên trúc quỳ, cẩm chướng, phong lan, hoa hồng, địa lan

Cây gia vị, cây rau: Hành ta, ớt ta, ớt đỏ, củ cải, cải bắp, cà chua Cây thuốc: Địa hoàng

Như vậy bằng kỹ thuật nuôi cấy meristem con người có thể chủ động tạo cây sạch virus cung cấp cho sản xuất, để thay thế cho giống cũ đã bị nhiễm bệnh Trong sản xuất khi sử dụng củ giống có tỷ lệ nhiễm virus khoảng 10% là bắt đầu ảnh hưởng đến năng suất, lúc này cần phải thay giống sạch bệnh

Ngoài ra, thông qua phương pháp nhân giống in vitro các meristem có thể làm trẻ hoá được cây giống, cải thiện được chất lượng cấy giống, phục hồi năng suất của chúng hoặc dùng làm vật liệu khởi đầu sạch bệnh cung cấp cho việc lai tạo giống mới Từ những cây sạch này bằng phương pháp nhân nhanh in vitro có thể sản xuất nhanh một lượng cây, củ giống cung cấp kịp thời cho sản xuất và là nguồn cung cấp cây có chất lượng cao cho sản xuất khoai tây bằng hạt

Hiện nay, các trung tâm sản xuất giống khoai tây nổi tiếng ở châu Âu như Hanvec ở Bretagre (Pháp), Bioplan ở Hamburg (Đức) là những điển hình về việc làm sạch virus khoai tây bằng nuôi cấy meristem và nhân giống in vtro để cung cấp cho sản xuất Tại Đan Mạch, từ năm 1970 bằng phương pháp nuôi cấy meristem đã tạo được cây hoàn toàn sạch virus cho 50 giống khoai tây Từ năm 1986, Đan Mạch hy vọng tất cả khoai tây ở đó sẽ được bắt nguồn từ nuôi cấy in vitro (Mai Thị Tân, 1998)[12]

ở Việt Nam, việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để làm sạch virus, nhân nhanh giống sạch cũng đã được một số cơ quan và nhiều tác giả quan tâm như: Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Minh Tấn, Mai Thị Tân, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Nhẫn, Nguyễn Thị Kim Thanh, 1991 (Đại học Nông nghiệp I), Hồ Hữu Nhị, Hoàng Xuân Yên, Mai Văn Quắc, 1992 (Viện Khoa học Nông nghiệp)

Những công đoạn cơ bản của quy trình tạo và tạo và nhân nhanh giống

3 Đối tượng, địa điểm, nội dung

và phương pháp nghiên cứu

3.1 Đối tượng

Giống khoai tây KT2 là giống được chọn từ tổ hợp lai giữa dòng 381064 với giống khoai tây chịu nhiệt LT - 7 do trung tâm cây có củ (Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp) chọn tạo Giống KT2 dùng trong thí nghiệm được thu thập từ vùng trồng ở Bắc Ninh hiện đang đươc lưu giữ tại Viện Sinh học Nông nghiệp - Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội

- Môi trường MS cơ bản, nước dừa, đường sacaroza, vitamin… - Chất điều tiết sinh trưởng kinetin, GA3…

- ống nghiệm, bình thí nghiệm…

3.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 2 năm 2004 đến tháng 8 năm 2005

- Địa điểm: đề tài được thực hiện tại Viện Sinh học Nông nghiệp - Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội

3.3 Nội dung nghiên cứu

“Nghiên cứu tẩy sạch virus bằng kỹ thuật nuôi cấy meristem nhằm phục tráng giống khoai tây KT2”

Phần I: Điều tra ngoài sản xuất

Thí nghiệm 1: Điều tra thực tế và đánh giá tình hình sản xuất giống

Điều tra: điều tra ngoài ruộng sản xuất kết hợp với thu thập số liệu tại phòng nông nghiệp huyện Quế Võ và phòng trồng trọt sở nông nghiệp tỉnh Bắc Ninh

- Điều tra tình hình sản xuất và năng suất, phẩm chất của khoai tây KT2ở Quế Võ - Bắc Ninh

- Đánh giá độ nhiễm bệnh virus của giống khoai tây KT2 bằng quan sát triệu chứng trên đồng ruộng

Thí nghiệm 2: Đánh giá độ nhiễm bệnh virus của giống KT2 bằng phương pháp Test Elisa

Phần II: Nghiên cứu làm sạch virus

Thí nghiệm 3: Xác định kích thước thích hợp cho tái sinh cây từ meristem

Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường MS + 2,5% đường sacaroza + 6,0g agar/l + 0,01ppm kinetin + 3ppm GA3 với meristem tách ở các kích thước 0,1mm, 0,2mm, 0,3mm, 0,4mm, 0,5mm, 0,6mm

Thí nghiệm 4: Xác định môi trường thích hợp cho tái sinh cây từ meristem

Công thức thí nghiệm

Đ/C: MS + 25%sacaroza+ 6,5g/l agar CT1:Đ/C + 0,01ppm kinetin + 1ppm GA3CT2:Đ/C + 0,01ppm kinetin + 2ppm GA3CT3:Đ/C + 0,01ppm kinetin + 3ppm GA3 CT4:Đ/C + 0,01ppm kinetin + 4ppm GA3

Thí nghiệm 5: ảnh hưởng của lượng Agar đến khả năng tái sinh cây từ Meristem

Công thức thí nghiệm:

Đ/C: MS + 5g agar/l + 3ppmGA3+ 25%sacaroza +0,1ppm kinetin CT1:Đ/C với 5,5g agar/l

CT2:Đ/C với 6g agar/l CT3:Đ/C với 6,5g agar/l

Thí nghiệm 6: Xác định ảnh hưởng của xử lý nhiệt kết hợp nuôi cấy meristem đến quá trình làm sạch virus (Xử lý nhiệt độ cây mẹ trước khi

Đ/C: Không xử lý nhiệt CT1: Xử lý 2 tuần CT2: Xử lý 3 tuần CT3: Xử lý 4 tuần

Chúng tôi tiến hành xử lý nhiệt cây mẫu trước khi tách meristem trong tủ định ôn có chiếu sáng Sau đó tách meristem ở các kích thước 0,6mm, 0,5mm, 0,4mm, nuôi cấy trên môi trường MS + 5,5g agar/l + 3ppm GA3+ 25%sacaroza +0,1ppm kinetin

Phần III: Đánh giá sự sinh trưởng của cây sạch virus trong in vitro

Thí nghiệm 7: Đánh giá sự sinh trưởng , phát triển của cây khoai tây

Công thức thí nghiệm:

CT1(đ/c): Cây bị bệnh virus X + Y

CT2: Cây sạch virus Y

CT3: Cây sạch virus X+Y

Thí nghiệm 8: Đánh giá tạo củ in vitro khoai tây KT2 sạch bệnh

Công thức thí nghiệm:

CT1(đ/c): Cây bị bệnh virus X + Y

CT2: Cây sạch virus Y

CT3: Cây sạch virus X+Y

Toàn bộ thí nghiệm 7 sau 3 tuần chuyển sang môi trường tạo củ

Thí nghiệm 9: Trồng thử nghiệm ngoài sản xuất

CT1: Cây bị bệnh virus X + Y CT2: Cây sạch virus X+Y

3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Các phương pháp tiến hành:

Các phương pháp điều tra ngoài sản xuất: Chúng tôi tiến hành điều

tra các thông tin về khoai tây KT2 như:

- Tình hình sản xuất trên đồng ruộng - Diện tích trồng qua các vụ

- Năng suất qua các vụ trồng

- Chất lượng củ giống trong thời gian bảo quản (trọng lượng củ, tỷ lệ nảy mầm…)

- Tình hình nhiễm bệnh của cây trên đồng ruộng: đánh giá tình hình nhiễm bệnh của cây trên đồng ruộng theo mô tả triệu chứng bệnh virus khoai tây ở các tài liệu Bệnh cây nông nghiệp (Vũ Triệu Mân)[110], ứng dụng công

nghệ cao sản xuất giống khoai tây sạch bệnh (Nguyễn Quang Thạch và CS)[21]

Kiểm tra độ sạch virus bằng test Elisa: Chúng tôi tiến hành lấy

mẫu trên đồng ruộng khoai tây ở huyện Quế Võ - Bắc Ninh theo phương pháp 5 đường chéo góc sau đó tiến hành Test Elisa tại trung tâm khảo kiểm nghiệm giống cây trồng trung ương

Quy trình test ELISA:

Bước 1: Cân 0,05 g mô lá, nghiền trong 500àl đệm cacbonat buffer bằng chày và cối sứ

Bước 2: Lấy 100àl dung dịch của các mẫu cho vào hai giếng của bản ELISA Sau đó ủ qua đêm trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 - 60C

Bước 3: Rửa bản ELISA 3 lần trong đệm PBS - T (Phosphate Buffer - Saline - Tween), mỗi lần 3 phút; hai lần bằng nước cất, mỗi lần 2 phút

Bước 4: Nghiền dịch cây khoẻ trong đệm PBS - T theo tỷ lệ 1:20 Hoà kháng huyết thanh trong dịch cây khoẻ, rồi nhỏ 100àl dịch kháng huyết thanh/ giếng ủ bản ELISA trong một giờ

Bước 5: Hoà kháng thể đặc hiệu trong đệm PBS - T theo tỷ lệ 1/10000, nhỏ 100àl dịch kháng thể đặc hiệu/giếng, ủ 2h trong hộp ẩm

Bước 6: Rửa bản như bước 2

Bước 7: Hoà chất nền NPP trong đệm (đệm Subtrate) Nhỏ 100àl dịch chất nền trên 1 giếng, ủ bản trong hộp ẩm đặt trong tối 30 - 60 phút ở nhiệt độ phòng

Bước 8: Dừng phản ứng bằng NaOH 3M

Bước 9: Kiểm tra kết quả bằng máy đọc ELISA