4. Kết quả và thảo luận
4.2.4. Thí nghiệm 6: ảnh h−ởng của nhiệt độ đến khả năng bật chồi và làm sạch virus của cây từ Meristem
làm sạch virus của cây từ Meristem
Sau khi tiến hành tách meristem ở các kích th−ớc khác nhau ta thấy kích th−ớc meristem ở 0,4mm chỉ làm sạch đ−ợc virus PVY vậy còn virus PVX thì sao.
Bảng 4.8: ảnh h−ởng của xử lý nhiệt đến khả năng bật chồi cây từ meristem (với kích th−ớc meristem 0,6mm)
Chỉ tiêu ĐC CT1 CT2 CT3 CT4
Tỷ lệ bật chồi (%) 43,3 40,0 35 23,3 16,6
Chiều cao cây (sau 60 ngày) 1,3 1,1 0,9 0,6 0,5
Số lá (sau 60 ngày) 2 1,8 1,5 1 1
Chiều cao cây (sau 90 ngày) 5,4 4,7 4,0 2,8 2,4
Số lá (sau 90 ngày) 4,8 4,6 3,5 2,6 2,3
Ghi chú: ĐC: không xử lý nhiệt cây mẹ CT1: Xử lý nhiệt 1 tuần cây mẹ
CT2: Xử lý nhiệt 2 tuần cây mẹ CT3: Xử lý nhiệt 3 tuần cây mẹ CT4: Xử lý nhiệt 4 tuần cây mẹ
để loại trừ virus, việc xử lý nhiệt mô nuôi cấy cũng rất có hiệu quả. ở nhiệt độ cao từ 360c - 370c thì một số loài virus không có khả năng nhân lên.
Kế thừa những nghiên cứu trên chúng tôi đã kết hợp xử lý nhiệt cây mẹ (ở 370c) tr−ớc khi tách meristem. Kết quả đ−ợc thể hiện ở bảng 4.8 và đồ thị 4.4. (%) Tỷ lệ bật chồi 0 1 2 3 4 Tuần 50 40 30 20 10 0 Tỷ lệ bật chồi (%)
Đồ thị 4.4: ảnh h−ởng của xử lý nhiệt đến khả năng bật chồi của khoai tây KT2 ở kích th−ớc meristem 0,6mm
Qua đồ thị trên ta thấy:
Với kích th−ớc meristem 0,6mm xử lý nhiệt có ảnh h−ởng tới tỷ lệ bật chồi của meristem. Việc xử lý nhiệt độ cao 37oc đã làm giảm khả năng bật chồi của cây từ meristem. Thời gian xử lý nhiệt càng dài thì khả năng bật chồi của cây càng thấp.
Với cây không xử lý nhiệt độ tỷ lệ bật chồi là 43,3%, sau đó tỷ lệ bật chồi giảm dần theo thời gian xử lý nhiệt độ tăng dần. Với 1 tuần xử lý nhiệt tỷ lệ bật chồi là 40% sau đó giảm dần và tỷ lệ bật chồi chỉ còn 16,6% ở thời gian 4 tuần xử lý nhiệt.
xử lý nhiệt độ khác nhau.
ở công thức đối chứng không xử lý nhiệt độ sau 2 tháng nuôi cấy chiều cao cây đã lên tới 1,2cm và số lá đạt 2 lá, sau 3 tháng nuôi cây chiều cao cây đã lên tới 5,4cm với số lá là 4,8 lá. Sau đó tình hình sinh tr−ởng của cây giảm dần theo thời gian xử lý nhiệt độ tăng dần. Với công thức 1 tuần xử lý nhiệt độ sau 2 tháng nuôi cấy chiều cao của cây đạt 1,1cm và số lá đạt 1,8 lá, sau 3 tháng nuôi cấy chiều cao cây lên tới 4,7cm và số lá là 4,6 lá. Trong khi đó, ở công thức xử lý nhiệt 4 tuần sau 2 tháng nuôi cấy chiều cao cây chỉ đạt 0,5cm với 1 lá, sau 3 tháng nuôi cấy chiều cao cây chỉ đạt 2,4cm với 2,3 lá.
Vậy việc xử lý nhiệt có ảnh h−ởng đến khả năng bật chồi cũng nh− tình hình sinh tr−ởng của meristem khoai tây KT2. Thời gian xử lý nhiệt càng ngắn thì khả năng bật chồi và sự sinh tr−ởng của meristem càng mạnh.
Việc xử lý nhiệt ở kích th−ớc 0,6mm có ảnh h−ởng thế nào đến việc làm sạch virus ở khoai tây KT2. Sau khi meristem bật chồi thành cây chúng tôi tiến hành test ELISA kết quả thu đ−ợc nh− sau:
Bảng 4.9: Kết quả làm sạch virus kết hợp gi−a tách meristem và xử lý nhiệt độ ở kích th−ớc 0,6mm
Chỉ tiêu ĐC CT1 CT2 CT3 CT4
Nhiễm (%) 100 100 52,4 35,7 27,3
Sạch Y(%) 0 0 47,6 64,3 72,7
Sạch XY(%) 0 0 0 0 0
Qua bảng trên chúng ta nhận thấy:
Xử lý nhiệt có ảnh h−ởng đến khả năng tẩy sạch virus của khoai tây KT2 ở kích th−ớc 0,6mm. ở công thức đối chứng không xử lý nhiệt và công thức 1 xử lý nhiệt 1 tuần không có khả năng tẩy sạch virus. Bắt đầu từ công
thức xử lý nhiệt 2 tuần trở lên đã có khả năng tẩy sạch virus PVY nh−ng ch−a có khả năng tẩy sạch virus PVX.
Tỷ lệ sạch virus tăng dần theo thời gian xử lý nhiệt tăng dần. Thời gian xử lý nhiệt càng dài thì tỷ lệ sạch virus càng cao. ở công thức xử lý nhiệt 2 tuần tỷ lệ sạch virus PVY là 47,6% sau đó tỷ lệ sạch virus tăng dần theo thời gian xử lý nhiệt tăng dần và đạt tới 72,7% ở công thức xử lý nhiệt 4 tuần.
Vậy việc xử lý nhiệt độ 37oc từ 2 tuần trở lên ở kích th−ớc meristem 0,6mm có khả năng tẩy sạch virus PVY.
Vậy còn với kích th−ớc 0,5mm thì sao? Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh h−ởng của xử lý nhiệt cây mẹ (370c) đến khả năng tái sinh và là sạch virus của khoai tây KT2 ở kích th−ớc 0,5mm kết quả đ−ợc trình bày ở bảng 4.10
Bảng 4.10: ảnh h−ởng của xử lý nhiệt đến khả năng bật chồi cây từ meristem (với kích th−ớc meristem 0,5mm)
Chỉ tiêu ĐC CT1 CT2 CT3 CT4
Tỷ lệ bật chồi (%) 36,6 33,3 26,6 18,3 8,3
Chiều cao cây (sau 60 ngày) 0,9 0,8 0,65 0,4 0,3
Số lá (sau 60 ngày) 1,7 1,5 1,3 1 0,7
Chiều cao cây (sau 90 ngày) 3,8 3,6 3 1,6 1,1
Số lá (sau 90 ngày) 4,0 3,5 3,2 1,7 1,5
Ghi chú: ĐC: không xử lý nhiệt cây mẹ CT1: Xử lý nhiệt 1 tuần cây mẹ
CT2: Xử lý nhiệt 2 tuần cây mẹ CT3: Xử lý nhiệt 3 tuần cây mẹ CT4: Xử lý nhiệt 4 tuần cây mẹ
Tỷ lệ bật chồi (%) 4 Tuần 3 0 1 2 40 30 20 10 0 (%) Tỷ lệ bật chồi
Đồ thị 4.5: ảnh h−ởng của xử lý nhiệt đến khả năng bật chồi của khoai tây KT2 ở kích th−ớc meristem 0,5mm
1 tuần 2 tuần 3 tuần 4 tuần
ảnh 5: ảnh h−ởng của xử lý nhiệt đến khả năng bật chồi của meristem khoai tây KT2 ở kích th−ớc 0,5mm
Qua bảng trên ta thấy:
Với kích th−ớc meristem 0,5 mm tỷ lệ bật chồi thành cây cũng giảm dần theo thời gian xử lý nhiệt tăng dần. Với công thức đối chứng không xử lý nhiệt tỷ lệ bật chồi đạt 36,6% sau đó tỷ lệ tái sinh giản dần. Tới công thức xử lý nhiệt 4 tuần tỷ lệ bật chồi chỉ còn 8,3%.
Khả năng sinh tr−ởng của cây tái sinh từ meristem cũng giảm dần từ công thức đối chứng không xử lý nhiệt đến công thức xử lý nhiệt 4 tuần. Với công thức đối chứng sau 2 tháng nuôi cấy chiều cao cây đã đạt 0,9cm và số lá là 1,7 lá, sau 3 tháng nuôi cấy chiều cao cây đạt 3,8cm và số lá là 4 lá.
Khả năng tăng tr−ởng của cây tái sinh giảm dần qua thời gian xử lý nhiệt tăng dần đến công thức xử lý nhiệt 4 tuần chiều cao cây chỉ còn 0,3cm và số lá là 0,7 lá sau 2 tháng nuôi cấy và chỉ đạt 1,1cm chiều cao 1,5 lá sau 3 tháng nuôi cây.
Sau khi hình thành cấy chúng tối tiến hành Test ELISA để kiểm tra độ sạch virus kết quả thu đ−ợc ở bảng 4.11:
Bảng 4.11: Kết quả làm sạch virus kết hợp gi−a tách meristem và xử lý nhiệt độ (ở kích th−ớc meristem 0,5mm)
Chỉ tiêu ĐC CT1 CT2 CT3 CT4
Nhiễm (%) 100 50 31,3 0 0
Sạch Y(%) 0 50 68,7 100 100
Sạch XY(%) 0 0 0 9 40
Qua bảng trên chúng tôi nhận thấy:
Nuôi cấy meristem ở kích th−ớc 0,5mm không có khả năng tẩy sạch đ−ợc virus. Nh−ng chỉ xử lý nhiệt 1 tuần cho cây mẹ đã có khả năng tẩy sạch virus PVY với tỷ lệ lên tới 50%. Tỷ lệ tẩy sạch virus PVY tăng dần lên tới
68,7% khi xử lý nhiệt 2 tuần.
Xử lý nhiệt 3 tuần đã có khả năng làm sạch cả 2 loại virus PVX, PVY và không còn mẫu nhiễm với tỷ lệ 100% sạch virus PVY và 9% sạch virus PVX. Xử lý nhiệt 4 tuần tỷ lệ sạch cả 2 loại virus lên tới 40%.
Vậy việc xử lý nhiệt ở kích th−ớc 0,5mm với 3 tuần xử lý nhiệt đã có khả năng tẩy sạch virus nh−ng với tỷ lệ rất thấp.
Còn với kích th−ớc 0,4mm kết hợp với xử lý nhiệt cây mẹ (370c) thì khả năng tái sinh cũng nh− làm sạch virus nh− thế nào? chúng tôi tiếp tục tiến hành nghiên cứu ảnh h−ởng của nhiệt độ đến khả năng tái sinh và bật chồi của meristem khoai tây KT2 ở kích th−ớc 0,4mm kết quả thu đ−ợc ở bảng 4.12.
Bảng 4.12: ảnh h−ởng của xử lý nhiệt đến khả năng bật chồi cây từ meristem (với kích th−ớc meristem 0,4mm)
Chỉ tiêu ĐC CT1 CT2 CT3 CT4
Tỷ lệ bật chồi (%) 25 23,3 18,3 8,3 3,3
Chiều cao cây (sau 60 ngày) 0,5 0,42 0,35 0,25 0,2
Số lá (sau 60 ngày) 1 1 1 0,7 0,5
Chiều cao cây (sau 90 ngày) 1,2 1,1 0,9 0,7 0,6
Số lá (sau 90 ngày) 2,6 2,3 1,9 1,4 1
Ghi chú: ĐC: không xử lý nhiệt cây mẹ CT1: Xử lý nhiệt 1 tuần cây mẹ
CT2: Xử lý nhiệt 2 tuần cây mẹ CT3: Xử lý nhiệt 3 tuần cây mẹ CT4: Xử lý nhiệt 4 tuần cây mẹ Qua bảng 4.12 ta thấy:
Cũng nh− ở kích th−ớc 0,5 và 0,6mm ở kích th−ớc 0,4mm thời gian xử lý nhiệt có ảnh h−ởng đến tỷ lệ bật chồi và mức độ tăng tr−ởng của cây khoai tây tái sinh từ meristem.
30 20 10 0 Tỷ lệ bật chồi (%) Tỷ lệ bật chồi Tuần 0 1 2 3 4
Đồ thị 4.6: ảnh h−ởng của xử lý nhiệt đến khả năng bật chồi của khoai tây KT2 ở kích th−ớc meristem 0,4mm
Với công thức đối chứng không xử lý nhiệt tỷ lệ bật chồi của cây đạt 25% và giảm dần tới công thức xử lý nhiệt 2 tuần là 18,3% đến công thức xử lý nhiệt 4 tuần tỷ lệ bật chồi chỉ còn 3,3%.
Khả năng tăng tr−ởng của cây hình thành từ meristem ở kích th−ớc 0,4mm cũng giảm dần theo thời gian xử lý nhiệt tăng dần.
ở công thức đối chứng không xử lý nhiệt sau 2 tháng nuôi cấy chiều cao cây đạt 0,5cm và số lá đạt 1 lá sau 3 tháng nuôi cấy chiều cao cây đạt 1,2 cm với 2,6 lá, ở công thức xử lý nhiệt 2 tuần chiều cao cây đạt 0,35cm số lá đ−ợc 1 lá sau 2 tháng nuôi cấy và sau 3 tháng nuôi cấy chiều cao cây đạt 0,9 cm số lá đạt 1,9 lá. Sinh tr−ởng chậm nhất là ở công thức 4 xử lý nhiệt 4 tuần với chiều cao cây chỉ đạt 0,2cm với 0,5 lá sau 2 tháng nuôi cấy và sau 3 tháng nuôi cấy chiều cao cây đạt 0,6cm với 1 lá.
Vậy xử lý nhiệt ở 3 đến 4 tuần làm giảm khả năng tăng tr−ởng của cây rất mạnh.
ở kích th−ớc 0,4mm khả năng làm sạch virus nh− thế nào? Sau khi tái sinh thành cây chúng tôi tiến hành test virus đã thu đ−ợc kết quả thể hiện ở bảng 4.13.
Bảng 4.13: Kết quả làm sạch virus kết hợp gi−a tách meristem và xử lý nhiệt độ ở kích th−ớc 0,4mm
Chỉ tiêu ĐC CT1 CT2 CT3 CT4
Nhiễm (%) 60 7 0 0 0
Sạch Y(%) 40 93 100 100 100
Sạch XY(%) 0 0 18,2 60 100
Qua bảng trên chúng tôi nhận thấy:
Xử lý nhiệt cây mẹ tr−ớc khi đ−a vào tách meristem có ảnh h−ởng lớn đến khả năng làm sạch virus (ở kích th−ớc 0,4mm).
Với công thức đối chứng không xử lý nhiệt đã có khả năng tẩy sạch virus PVY nh−ng với tỷ lệ còn thấp. Khi có xử lý nhiệt độ thì khả năng tẩy sạch virus PVY tăng lên đáng kể từ 40% ở công thức đối chứng không xử lý nhiệt độ lên tới 93% khi xử lý nhiệt 1 tuần và 100% ở 3, 4 tuần xử lý nhiệt cây mẹ.
Với thời gian xử lý nhiệt 2 tuần đã có khả năng tẩy sạch đ−ợc cả 2 loại virus X và Y nh−ng với tỷ lệ thấp chỉ đạt 18,2%. Tỷ lệ tẩy sạch cả hai loại virus ở 3 tuần xử lý nhiệt độ lên tới 60% và đạt 100% ở 4 tuần xử lý nhiệt.
Việc xử lý nhiệt kết hợp với tách meristem ở kích th−ớc 0,4mm có khả năng tẩy sạch đ−ợc cả 2 loại virus. Thời gian xử lý nhiệt càng cao thì tỷ lệ sạch virus càng cao. Xử lý nhiệt 4 tuần tỷ sạch virus đạt 100%.
Vậy khi nghiên cứu kết hợp hai ph−ơng pháp nuôi cấy meristem với xử lý nhiệt đã có khả năng tẩy sạch đ−ợc hai loại virus PVX, PVY.