Nuôi trồng và xác định thành phần amino acid của một số loài nấm bào ngư (Pleurotus spp.) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp HPLC

Hiện nay, nấm bào ngư đang dần trở thành một trong những khẩu phần chính trong bữa ăn của người dân. Bên cạnh mùi vị thơm ngon, giàu dinh dưỡng, rất dễ chế biến, nấm còn được xem như là một loạ

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NUÔI TRỒNG VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẨN AMINO ACID

CỦA MỘT SỐ LOÀI NẤM BÀO NGƢ (Pleurotus spp.)

BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (High performance liquid chromatography - HPLC)

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NUÔI TRỒNG VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẨN AMINO ACID

CỦA MỘT SỐ LOÀI NẤM BÀO NGƯ (Pleurotus spp.)

BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (High performance liquid chromatography - HPLC)

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS LÊ ĐÌNH ĐÔN ĐOÀN BẢO QUỐC

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005

TRÂN TRỌNG BIẾT ƠN

Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận này

Thầy Bùi Cách Tuyến, Thầy Bùi Minh Trí đã tạo điều kiện cho tôi thực tập tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh

Cô Trần Thị Dung, Thầy Lưu Phúc Lợi, Thầy Nguyễn Văn Cường, Anh Mai Huy Hoàng đã giúp tôi có trang thiết bị cũng như phòng thí nghiệm để hoàn thành khóa luận

Các anh chị ở Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hòan thành khóa luận

Anh Lê Viết Ngọc Viện hạt nhân Đà Lạt, anh Hoàng trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh đã cung cấp giống nấm bào ngư cho tôi thực hiện khóa luận

Các thành viên lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập

iii

TÓM TẮT

Đoàn Bảo Quốc, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Phân tích amino

acid trên nấm bào ngư Pleurotus spp bằng sắc ký lỏng cao áp - high performance

liqud chromatography (HPLC) thời gian từ 14/2/2005 đến 18/8/2005 Hội đồng hướng dẫn:

TS Lê Đình Đôn

Khóa luận được thực hiện trên đối tượng nấm bào ngư Pleurotus spp Đây là

loại nấm rất phổ biến trên thị trường Việt Nam Vì thế, thành phần dinh dưỡng của chúng, đặc biệt là thành phần amino acid rất được quan tâm

Để thực hiện phân tích amino acid trên nấm, chúng tôi tiến hành trồng nấm tại Trung tâm Công Nghệ Sinh Học và sử dụng thiết bị là sắc ký lỏng cao áp (HPLC) của Trung tâm Hóa Lý đều thuộc Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

Những kết quả đạt được:

Nuôi trồng được 4 dòng nấm Pleurotus spp trên cơ chất là mùn cưa có

bổ sung thêm cám gạo, và một số chất khác

Phân tích và định lượng được 17 amino acid trong 2 loài nấm Pleurotus

flabellatus và Pleurotus pulmonarius

Từ đó chúng tôi tiến hành so sánh thành phần amino acid của chúng với một số rau quả khác, với một số nấm khác và so sánh giữa chúng

2.2.2 Một số loài nấm bào ngư được nuôi trồng ở VIệt Nam 9

2.2.2.1 Nấm bào ngư Pleurotus florida 10

2.2.2.2 Nấm bào ngư Pleurotus sajor-caju 10

2.2.2.3 Nấm bào ngư Pleurotus pulmonarius 11

2.2.2.4 Nấm bào ngư Pleurotus abalonus 11

2.3 Phương pháp sắc ký 12

2.3.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký 12

2.3.2 Cơ sở của phương pháp sắc ký 12

2.4 Một số phương pháp sắc ký trong phân tich amino acid 13

v

2.4.1 Sắc ký giấy (Paper chromatography) 13

2.4.2 Sắc ký lớp mỏng ( Thin layer chromatography _TLC) 14

2.4.3 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 15

2.4.3.1 Pha tĩnh 15

2.4.3.2 Pha động 16

2.4.3.3 Bộ dụng cụ HPLC 16

2.5 Các bước phân tích amino acid 17

2.5.1 Quá trình thủy phân (Hydrolysis) 17

2.5.2 Quá trình tạo dẫn xuất (Derivatisation) 19

2.5.3 Phân tách trên HPLC 20

2.5.4 Phân tích và tính toán dữ liệu 21

2.4.4.1 Định tính 21

2.4.4.2 Định lượng 21

2.6 Phân tích amino acid trên nấm bào ngư 23

3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1.Thời gian và địa điểm thực hiện 23

3.1.1 Thời gian thực hiện 23

3.3.2.3 Chuẩn bị môi trường giá môi 25

3.2.2.4 Chuẩn bị môi trường nuôi trồng 25

3.2.2.5 Tóm tắt quy trình 26

3.3.3 Phân tích amino acid 26

3.3.3.1.Thủy phân mẫu 26

vi

3.3.3.2 Tạo dẫn xuất: 27

3.3.3.3 Phân tích HPLC 28

3.3.3.4 Phân tích và tính toán kết quả 28

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

Hình 2.10 Thủy phân protein bằng HCl 18

Hình 2.11 Tạo dẫn xuất amino acid bằng PITC 20

Hình 2.12 Kết quả phân tích amino acid trên Pleurotus sp bởi sắc ký giấy tròn 22

Hình 4.1 Sinh trưởng trên môi trường hạt của Pleurotus floridanus, Pleurotus flabellatus, Pleurotus flabellatus 31

Hình 4.2 Pleurotus abalonus trên giá mô 31

Hình 4.3 Bào tử Pleurotus abalonus 31

Hình 4.4 Bào tử đảm Pleurotus floridanus 31

Hình 4 5 Bào tử đảm Pleurotus abalonus 31

Hình 4.6 Quả thể nấm Pleurotus floridanus 32

Hình 4.7 Quả thể nấm Pleurotus abalonus 32

Hình 4.8 Quả thể nấm Pleurotus flabellatus 32

Hình 4.9 Quả thể nấm Pleurotus pulmonarius 32

Phần 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay, nấm bào ngư đang dần trở thành một trong những khẩu phần chính trong bữa ăn của người dân Bên cạnh mùi vị thơm ngon, giàu dinh dưỡng, rất dễ chế biến, nấm còn được xem như là một loại “rau sạch” và có giá trị dược liệu Sản lượng nấm bào ngư tăng lên rất nhanh trong vài thập kỷ qua Theo thống kê của Chang và ctv (1999) chỉ trong vòng 36 năm trở lại đây tổng sản lượng nấm trồng tăng gấp 21 lần từ

350.000 năm 1965 tăng lên 7,5 triệu tấn, trong đó nấm bào ngư Pleurotus spp tăng từ

169000 tấn năm 1986 lên 876000 tấn năm1997

Gần đây, Việt Nam cũng đang phát triển công nghệ trồng nấm trong nước Vì thế, ngoài việc khai thác nấm hoang dại đem về trồng, nước ta còn nhập khẩu nhiều loại nấm bào ngư khác từ nước ngoài như Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản Trong số đó, có một số loài đã được biết rất rõ về thành phần dinh dưỡng, một số loài còn lại thành phần này vẫn chưa được công bố chính thức, đặc biệt là thành phần amino acid Vì thế, việc xác định thành phần amino acid trên nấm bào ngư đối với Việt Nam là điều cần thiết để có thể đánh giá giá trị sinh học, cũng như so sánh sự khác nhau giữa chúng Từ xưa đến nay, việc xác định amino acid đã được thực hiện trên rất nhiều công cụ khác nhau như: sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng Phân tích amino acid trên các công cụ phân tích truyền thống này thì đòi hỏi nhiều thời gian và rất phức tạp

Ngày nay, với sự phát triển của kỹ thuật phân tích, việc xác định thành phần amino acid trong mẫu sinh hóa đã được đơn giản hơn rất nhiều, bởi hầu hết các công cụ đã được tự động hóa và được nối trực tiếp bộ phận xử lý số liệu Hiện nay, trên thị trường đang tồn tại rất nhiều kỹ thuật phân tích amino acid như: sắc ký lỏng cao áp, HPLC (high performance liquid chromatography), sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography), điện di mao quản (capillary electrophoresis)

Trong phạm vi cho phép, chúng tôi chỉ thực hiện “Phân tích amino acid bằng

sắc ký lỏng cao áp” trên một số loài nấm đang có ở thị trường Việt Nam Từ đó, với

kết quả thu được chúng tôi sẽ tiến hành so sánh với các đối tượng khác cũng như sự khác nhau giữa chúng và dữ liệu về thành phần amino acid của từng loài nấm bào ngư sẽ được lưu lại để làm cơ sở cho những nghiên cứu sau này

1.2 Mục đích

So sánh sự thành phần amino acid giữa các loài nấm bào ngư đang có trên thị trường Việt Nam Khi đó, chúng tôi sẽ chọn ra một loài phù hợp để so sánh thành phần amino acid khi trồng trên các cơ chất khác nhau

1.3 Yêu cầu

Tạo đựợc mẫu có độ tinh sạch cao

Tránh hiện tượng làm thay đổi tính chất mẫu như oxy hóa, halogen hóa, hay làm mẫu bị hủy hoàn toàn trong quá trình thủy phân

Sử dụng thiết bị HPLC (high performance liquid chromatography) của Trung tâm Phân Tích Hóa Lý để phân tích thành phần amino acid của các loài nấm kể trên

1.4 Nội dung thực hiện

Thu thập và nhân giống các loài nấm đang có trên thị trường

Nuôi trồng các loài nấm này trên môi trường mùn cưa có bổ sung một số vi lượng Tiến hành thu quả thể

Xác định thành phần amino acid trên các loài nấm bào ngư bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nấm trồng

2.1.1 Khái niệm về nấm

Hiện nay, số loài nấm trồng được chỉ chiếm một phần rất nhỏ trong số nấm ăn thiên nhiên Ngoài đặc điểm chung là quả thể hay tai nấm có kích thước lớn (đa số dạng tán dù), chúng còn ăn ngon và rất giàu dinh dưỡng [5]

Nấm rất phong phú và đa dạng, bao gồm cả những loại ăn được và không ăn được, những loài cho quả thể lớn có thể thấy bằng mắt thường và những loài phải sử dụng kính hiển vi mới quan sát được [5]

Ban đầu nấm được xếp vào giới thực vật Tuy nhiên, quan điểm này ngày nay không còn thuyết phục nữa và nhiều nhà phân loại học đã đề nghị xếp nấm vào một giới riêng, gọi là giới nấm Sở dĩ xếp Nấm thành một giới riêng mà không xếp vào giới Thực vật vì nấm không có lục lạp, không có sắc tố quang hợp, không có đời sống tự dưỡng như thực vật, không có sự phân hóa thành rễ, thân, lá, không có hoa, phần lớn không chứa cellulose trong thành tế bào [1]

Lysosome

Bộ máy golgi Nhân

Ti thể Mạng lưới nội chất Ribosome

Hình 2.1 Cấc trúc tế bào nấm (Nguyên Lân Dũng, 2001)

Nấm ăn có cấu tạo chủ yếu là hệ sợi nấm Các sợi nấm ăn có dạng ống tròn Các ống này đều có vách ngăn Sợi nấm còn gọi là khuẩn ty (hypha), hệ sợi nấm còn gọi là khuẩn ty thể (mycelium) Khoảng cách giữa hai vách ngăn gọi là tế bào Tế bào nấm có những đặc trưng riêng, khác biệt với tế bào động vật và thực vật Trước hết là thành tế bào Dưới kính hiển vi điện tử có thể quan sát thấy thành tế bào cấu tạo bởi nhiều lớp Nếu như thành tế bào của thực vật cấu tạo chủ yếu bởi cellulose thì thành tế bào của những nhóm nấm khác nhau lại có cấu tạo bởi những thành phần khác nhau Hầu hết các loài nấm đảm đều có thành tế bào cấu tạo chủ yếu bởi kitin- glucan Thông qua các lỗ trên vách ngăn, chất nguyên sinh có thể di chuyển dễ dàng trong sợi nấm.[1]

Trong tế bào sơi nấm khi quan sát dưới kính hiển vi quang học phóng đại từ 1000 đến 1500 lần (Hình 2.1) có thể thấy

Màng tế bào Nhân tế bào Bộ máy golgi Ribosome Lysosome Ti thể

Mạng lưới nôi chất

Sợi nấm có thể phát triển từ bào tử hay tử một đoạn sợi nấm Bào tử nảy mầm theo nhiều hướng khác nhau, sợi nấm phân nhánh nhiều lần, tạo nên một hệ sợi chằng chịt và thường có màu trắng

Riêng ở nấm đảm nói chung thường có tới 3 cấp sợi nấm Sợi nấm cấp một (sơ sinh), sợi nấm cấp hai (thứ sinh) và sợi nấm cấp ba (tam sinh) Sợi nấm cấp một lúc đầu không có vách ngăn và có nhiều nhân, dần sẽ tạo thành vách ngăn và phân thành nhiều tế bào đơn nhân trong sợi nấm Sợi nấm cấp hai được tạo thành do sự phối trộn của hai sợi nấm cấp một Khi đó nguyên sinh chất trong hai sợi nấm sẽ phối trộn với nhau Hai nhân vẫn đứng riêng rẽ làm cho tế bào có hai nhân Người ta còn gọi sợi nấm loại này là sợi nấm song nhân (dycaryolic hyphae) Sợi nấm cấp ba là do sợi nấm cấp hai phát triển thành Các sợi nấm này liên kết chặt chẽ với nhau và tạo thành quả thể [1]

Người ta quen gọi hệ sợi nấm ở giai đoạn tăng trưởng (hay dinh dưỡng) là tản dinh dưỡng, phân biệt với quả thể nấm (hay cơ quan sinh bào tử hữu tính của nấm) là tản sinh sản

Hầu hết nấm trồng là nấm đảm, cơ quan sinh sản có có cấu tạo đặc biệt là tai nấm Tai nấm chủ yếu gồm mũ và cuống nấm Mũ thường có dạng nón hay phễu, với cuống đính ở giữa hay bên Mặt dưới mũ của nhóm này cấu tạo bởi các phiến mỏng xếp sát vao nhau như hình nan quạt Ở một số trường hợp, phiến nấm còn kéo dài từ

mũ xuống cuống (chân nấm), như nấm bào ngư (Pleurotus) [3]

Bào tử đảm (basidiospore) tạo ra ở bề mặt phiến, trên cấu trúc đặc biệt gọi là

đảm (basidium) Riêng nấm đậu (Coprinus), khi tai nấm trưởng thành mũ nấm sẽ chảy

thành dịch nước đen mang theo các bào tử đảm; còn các bào tử khác sẽ rụng và bay theo gió Đảm được tạo thành từ các đầu ngọn sợi nấm Tế bào này phồng to và bên trong hai nhân đứng riêng lẻ, sẽ nhập lại thành một nhân Quá trình này gọi là quá trình thụ tinh [3]

Nhân thụ tinh sẽ phân chia và cuối cùng tạo ra 4 nhân con Bình thường mỗi nhân sẽ được khối sinh chất đẩy vào một cái gai nhỏ (xuất hiện trên đảm) để tạo ra một đảm bào tử, nhưng đôi khi một đảm bào tử có thể cùng lúc hai nhân như nấm rơm (tỉ lệ

chiếm đến 1/4) hoặc đặc biệt ở nấm mỡ (Agaricus bisporus) chỉ sinh ra hai đảm tử,

mỗi bào tử chứa hai nhân

Các tế bào đảm hợp lại thành lớp trên bề mặt của phiến, được gọi là lớp thụ tầng (hymennium) và vì vậy đảm bào tử cũng thành lớp phủ trên trên bề mặt phiến Điều này thấy rõ nấm rơm, khi trưởng thành phiến nấm chuyển sang màu đỏ là do màu của bào tử

Người ta phân biệt nấm đồng đảm (homobasidiomycetidae) và nấm dị đảm (hemibasidiomycetidae) là dựa vào cấu trúc của đảm Nấm đồng đảm có đảm là một tế bào đồng nhất, còn nấm dị đảm hay tiền đảm chia làm 4 phần, mỗi phần tạo ra một đảm bào tử Đảm bào tử là bào tử hữu tính, khi rụng sẽ bay đi khắp nơi Khi gặp điều

kiện thuận lợi nẩy mầm và cho lại hệ sợi nấm Hệ sợi nấm thường chỉ có một nhân nên được gọi là sợi nấm sơ cấp (primary mycelium) Đối với nấm dị tản (heterothallic), phải có sự phối hợp giữa hai sợi nấm sơ cấp phát sinh từ hai bào tử có đặc tính di truyền khác nhau mới hoàn thành sợi nấm thứ cấp (secondary mycelium)

Trong khi đó nấm đồng tản (homothallic) chỉ cần hệ sợi sơ cấp từ bào tử nẩy mầm cũng có thể tự phối cho ra hệ sợi nấm thứ cấp Từ hệ sợi nấm thứ cấp chứa hai nhân, nấm phát triển thành mạng sợi, lan khắp nơi trên cơ chất để hút chất dinh dưỡng Trong trường hợp bị đứt khúc, các sợi nấm tự làm lành vết thương và tái lập lại hệ sợi, tương tự như cây trồng trong giâm hay chiết cành Ở những điều kiện nhất định, như ẩm độ, nhiệt độ thích hợp, hệ sợi nấm sẽ bện lại và tạo thành hạch nấm Hạch nấm sẽ tiếp tục phát triển cho quả thể trưởng thành.[3]

Giảm phân hình thành bào tử đảm

Bào tử đảm Sợi nấm sơ cấp

(đơn nhân)

Hợp tử Sợi âm

Sợi dương Quá trình dung hợp

Sợi nấm thứ cấp (song nhân) Hình thành

quả thể

Sợi nấm song nhân

Hình 2.2 Chu kỳ sống của nấm đảm ( Peter H Raven và ctv, 1992)

Ở nấm đảm, sự phối hợp nguyên sinh chất giữa hai sợi nấm cấp một xảy ra rất sớm, sợi nấm song nhân là hình thái chủ yếu của sợi nấm Quả thể là do các sợi nấm song nhân liên kết lại tạo thành Sợi nấm song nhân về mặt di truyền đuợc biểu thị là (n+n) khác với sợi nấm đơn nhân là n và hợp tử là 2n [1]

Ở một số loài còn có một dạng bào tử khác gọi là hậu bào tử hay bào tử màng dày (Chlamydospore), thí dụ như nấm rơm Hậu bào tử giống như một bào tử thu nhỏ với đầy đủ nguyên sinh chất và hai nhân nhưng cô đặc hơn và có vách tương đối dày bao bọc Có thể xem đây là một dạng sống tiềm sinh của nấm vì sau đó bào tử này có thể nẩy mầm và cho lại hệ sợi nấm thứ cấp [3]

2.1.3 Đặc điểm biến dưỡng và sinh lý

Nấm chủ yếu sống dị dưỡng, lấy thức ăn từ các nguồn hữu cơ (động vật hoặc thực vật) Ngoại trừ niêm khuẩn thay đổi hình dạng tế bào để nuốt lấy thức ăn (tương tự động vật), còn lại hầu hết các loài nấm đều nấm lấy dinh dưỡng qua màng tế bào hệ sợi (giống rễ cây thực vật) Nhiều loài nấm có hệ enzym phân giải tương đối mạnh, giúp chúng có thể sử dụng các dạng thức ăn phức tạp, bao gồm các đại phân tử như (cellulose, hemicellulose), chất đạm (protein), chất bột (amidon, polysaccharide), lignin.Với cấu trúc sợi, tơ nấm len lỏi sâu vào trong cơ chất (rơm, rạ, mạt cưa và nhiều cơ chất khác) rút lấy thức ăn đem nuôi toàn bộ cơ thể nấm (tản dinh dưỡng hay tản sinh sản) [3]

Dựa theo cách thức dinh dưỡng của nấm có thể chia thành 3 nhóm:

Hoại sinh: Đặc tính chung của hầu hết các loài nấm, trong đó có nấm trồng Thức ăn của chúng là xác bã động thực vật Nhóm nấm này có hệ enzym tiêu hoá tương đối mạnh, phân giải được nhiều loại cơ chất Chúng có khả năng biến các chất này thành những chất có thành phần đơn giản để có thể hấp thụ được Tuy nhiên, cũng có những trường hợp nấm không thể phân giải cơ chất mà phải nhờ vào các vi sinh vật khác (vi khuẩn, nâm mốc, xạ khuẩn) tiến hành trước một bước[3]

Ký sinh: Bao gồm chủ yếu các loại nấm gây bệnh Chúng sống bám vào các loài sinh vật khác (động vật, thực vật, các loài nấm khác) Thức ăn của chúng chính là các chất lấy từ cơ thể ký chủ, làm suy yếu hoặc làm tổn thương ký chủ Một số nấm ăn có thể sống trên cây còn tươi nhưng đời sống thực sự vẫn là hoại sinh, nên được xếp vào nhóm trung gian, gọi là nhóm bán ký sinh (trường hợp nấm mèo)

Cộng sinh: Đây là nhóm đặc biệt, lấy thức ăn từ cơ thể chủ nhưng không làm chết hoặc gây tổn thương ký chủ, ngược lại còn giúp chúng phát triển tốt hơn Vì vậy các loài này đối với ký chủ có mối quan hệ mật thiết với nhau Do đó, việc nuôi trồng trở nên phức tạp hơn, thường giống nấm được cấy cùng lúc với việc trồng cây

(thí dụ nấm Tuber hoặc Boletus)

2.2 Nấm bào ngư 2.2.1 Giới thiệu

Nấm bào ngư (còn gọi là nấm sò, nấm bình cô, oyster mushroom) gồm nhiều loài thuộc:

Chi Pleurotus Họ Pleurotaceae Bộ Agaricales

Lớp phụ Hymenomycetidae Lớp Hymenomycetes

Ngành phụ Basidiomycotina

Ngành nấm thật-Eumycota Giới nấm Mycota hay Fungi

Nấm bào ngư có tới 50 loài khác nhau Tuy nhiên, số loài được nuôi trồng được không nhiều, khoảng 10 loài [2]

Nấm bào ngư được nuôi trồng rộng rãi trên thế giới Ở châu Âu nấm bào ngư được trồng ở Hungary, Đức, Ý, Pháp, Hà Lan Ở Châu Á nấm bào ngư được trồng ở Trung Quốc với sản lượng rất cao (khoảng 12 nghìn tấn mỗi năm) giá khoảng 2.2 triệu đồng Việt Nam Ngoài Trung Quốc, nấm này còn được trồng ở Nhật Bản, Việt Nam, Hàn Quốc, Thái Lan Ấn Độ [2]

Nấm bào ngư không chỉ ăn ngon mà còn có giá trị dinh dưỡng cao Trong nấm chứa đầy đủ các amino acid

Ngoài giá trị dinh dưỡng, nấm bào ngư còn có giá trị dược liệu Nhiều nghiên cứu cho thấy nấm bào ngư cùng một số nấm ăn khác có tác dụng chống ung thư Bằng phương pháp khuếch tán vào thạch nhóm nghiên cứu của Trường Đại học Khoa Học

Tự Nhiên đã cho thấy nấm bào ngư Pleurotus sajor - caju ở dạng bán cầu lệch có tác dụng ức chế 2 chủng Vi khuẩn Gran dương S aureus và B subtilis và 2 chủng Gram

âm E coli và Pseudomonas aeruginosa [5] Ngoài ra, theo nghiên của nhà khoa học

Trung Quốc – Phó Liên Giang nấm bào ngư còn có khả năng làm giảm lượng cholesterol trong máu [3]

Một trong những đặc điểm quan trọng của nấm là hệ enzym Nhờ enzym cellulase và một số enzym khác, nấm bào ngư khả năng chuyển hoá cellulose thành nhưng chất cơ bản góp phần giải quyết nạn ô nhiễm môi trường do chất thải nông nghiệp tạo ra như bã mía, rơm rạ Ngoài ra, nấm còn có khả năng phân hủy thuốc trừ cỏ Antrazin nhờ vào sự gia tăng các enzym P – 450 của hệ Cytochromeoxxygenase và peroxydase (Sannia và ctv, 1990) [3]

Nấm bào ngư có đặc điểm chung là tai nấm dạng phễu lệch, phiến nấm mang bào tử kéo dài xuống chân Cuống nấm gần gốc có lông mịn Tai nấm còn non có màu sắc tối, nhưng khi trưởng thành trở nên sáng hơn Quả thể nấm bào ngư phát triển qua nhiều giai đọan, dựa theo hình thái tai nấm mà tên gọi cho từng giai đoạn khác nhau

Dạng san hô: quả thể mới tạo thành dạng sợi mãnh hình chùm Dạng dùi trống: mũ xuất hiện dưới dạng khối tròn

Dạng phễu: mũ mở rộng trong khi cuống còn ở giữa

Dạng bán cầu lệch: cuống lớn nhanh một bên so với vị trí trung bình Dạng lục bình: cuống ngừng tăng trưởng, nhưng mũ vẫn phát triển

Nấm bào ngư có chu trình phát triển cũng như các loài nấm đảm khác, bắt đầu đảm bào tử hữu tính, nẩy mầm cho hệ sợi tơ dinh dưỡng (sơ cấp và thứ cấp) và “kết thúc” bằng việc hình thành cơ quan sinh sản là tai nấm Tai nấm sinh ra đảm bào tử và chu trình lại tiếp tục [3]

2.2.2 Một số loài nấm bào ngư được nuôi trồng ở VIệt Nam

Hiện nay, nấm bào ngư được trồng rộng rãi ở Việt Nam cả miền Bắc lẫn miền Nam vì khí hậu nước ta rất thuận lợi cho việc phát triển loài nấm này Hiện nay, nấm bào ngư được trồng với nhiều chủng loại (khoảng 7 loại) tập trung nhiều ở Đà Lạt và Thành phố Hồ Chí Minh Hầu hết các dòng nấm được nuôi trồng ở nước ta là các giống được nhập từ nước ngoài Tuy nhiên vẫn có một số ít được khai thác ngay trên

địa lý của Việt Nam sau đó đêm về nuôi trồng trên điều kiện nhân tạo

Bảng 2.1 Nhiệt độ thích hợp đối với một số nấm bào ngư (Lê Duy Thắng, 1999)

Loài nấm

Nhiệt độ thích hợp cho tơ tăng

trưởng ( 0C)

Nhiệt độ thích hợp cho ra nấm ( 0C)

Pleurotus floridanus Pleurotus sajor - caju Pleurotus pulmonarius Pleurotus abalonus Pleurotus flabellatus

25-30 25-30 22-28 27-32 20-28

25 25 25 25 20-25

2.2.2.1 Nấm bào ngư Pleurotus floridanus (Hình 2.6)

Đây là loài thích nghi với nhiệt độ khá rộng từ 8 - 30oC Quả thể màu trắng sữa Có tính kháng tạp nấm, tạp khuẩn cao Sợi nấm có họat tính mạnh đối với việc phân giải cellulose Sản lượng trên đơn vị nguyên liệu tương đối cao Nấm này có thể thích nghi với nhiều loại cơ chất khác nhau: bã mía, mùn cưa, rơm, trấu Khi trồng trên trấu, năng suất có thể đạt được đợt ra quả thể đầu tiên là 114g nấm tươi trên 360 g nguyên liệu khi có bổ sung ure, KH2PO4, cám gạo [4]

2.2.2.2 Nấm bào ngư Pleurotus sajor - caju (nấm sò phượng vỹ hay nấm sò

dạng phễu)

Quả thể được hình thành ở nhiệt độ tương đối cao so với các loài nấm khác Gần đây, nấm này đang dần chiếm thị trường vì quả thể chắc, ăn ngon và rất thích hợp đối với khí hậu Việt Nam Ngoài ra, dịch chiết từ nấm này có thể ức chế một số loài vi

khuẩn: S aureus và B subtilis, E coli và Pseudomonas aeruginosa [5] Ngoài các cơ

chất thông thường, gần đây nấm này còn được trồng trên cơ chất là cây mai dương để chống sự xâm lấn của chúng góp phần giải quyết nạn môi trường Loài nấm này được nhập từ Nhật Bản và được nuôi trồng thành công trên mùn cưa đầu tiên ở Thành phố Hồ Chí Minh

2.2.2.3 Nấm bào ngư Pleurotus pulmonarius

Phần lớn được nhập từ nước ngoài (Hình 2.3) Nhưng gần đây, GS Lê Xuân Thám và cộng sự (1999) phát hiện được một loại khác ở Daklak - Tây Nguyên, sau đó

đưa về Đà Lạt và đã hoàn thiện quy trình trồng trên mùn cưa [7]

2.2.2.4 Nấm bào ngư Pleurotus abalonus

Nấm này có nguồn gốc từ Đài Loan Là một loài nấm ưa nóng nên rất thuận lợi để phát triển nuôi trồng trong điều kiện khí hậu của Việt Nam [1] Nấm này có đặc điểm là quả thể rất to (Hình 2.4), đường kính mũ nấm có thể đạt đến 35 cm [2]

Ngoài ra còn một loài khác cũng đang được trồng ở Việt Nam như Pleurotus

eryngii, Pleurotus flabellatus Và mới đây (2005) Thạc sĩ Cổ Đức Trọng đã trồng

thành công 2 loài nấm bào ngư mới: Pleurotus citrinopileatus Singer Pleurotus (quả thể màu vàng) và Pleurotus djamor (quả thể có màu hồng)[7]

Hình 2.6 Pleurotus floridanus Hình 2.3 Pleurotus pulmonarius Hình 2.4 Pleurotus abalonus

Hình 2.5 Pleurotus sp

2.3 Phương pháp sắc ký - Phân tích amino acid 2.3.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký được phát triển vào đầu tiên bởi Mikhail Semyonovich Tsvet (1901) trong quá trình nghiên cứu về chlorophyll Đến năm 1952, Archer John Porter

phân tách Từ đó kỹ thuật sắc ký ngày vàng được phát triển cao hơn cho đến ngày nay [24] Sắc ký là phương pháp phân tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và pha tĩnh

Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha tĩnh và pha động tương ứng với tính chất của chúng (tính hấp phụ, tính tan) Trong các hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha tĩnh và pha động Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tính sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn với pha này Nhờ vậy mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký [10]

2.3.2 Cơ sở của phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha động và pha tĩnh Có nhiều nguyên nhân đưa đến sự phân bố khác nhau giữa nhau của các chất, nhưng chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký Hầu hết các phương pháp sắc lý đều được dựa theo nguyên lý trên, và hiệu quả của từng phương pháp phụ vào sự chọn lựa giữa pha động pha tĩnh [8]

2.3.3 Phân loại quá trình sắc ký

Trong phương pháp sắc ký pha động phải là các lưu thể còn pha tĩnh là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành hai nhóm sắc ký khí và sắc ký lỏng Dựa vào cơ chế trao đổi của các chất giữa pha động và pha tĩnh mà người ta lại chia các phương pháp sắc ký thành nhóm nhỏ hơn

Tùy theo trạng thái tập hợp của các pha, loại tương tác và sự hình thành sắc ký mà người ta phân biệt các loại sắc ký như bảng 2.2

Bảng 2.2 Các dạng sắc ký cơ bản [9] Dạng sắc ký Pha động Pha tĩnh

Cách bố trí pha tĩnh

Cơ chế trao đổi chất

Khí

Khí- hấp phụ Khí -lỏng

Lỏng

Lỏng - rắn Lỏng - lỏng Lỏng - nhựa trao đổi Lớp mỏng

Rây (sắc ký gel)

Khí Khí

Lỏng Lỏng Lỏng Lỏng Lỏng

Rắn Lỏng

Rắn Lỏng Rắn Rắn Lỏng

Cột Cột

Cột Cột Cột

Lớp mỏng Cột

Hấp phụ Phân bố

Hấp phụ Phân bố Trao đổi ion Hấp phụ

Theo kích thước phân tử

2.4 Một số phương pháp sắc ký trong phân tích amino acid

Phân tích amino acid là phương pháp xác định thành phần amino acid cũng như định lượng chúng trong mẫu protein hay peptide Phân tích amino acid có thể sử dụng sắc ký giấy (paper chromatography), sắc ký lớp mỏng (thin layer chomatography- TLC), sắc ký khí (gas chromatography), sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography), sắc ký lỏng cao áp (high performance liquid chromatography), điện di mao quản (capillary electrophoresis) [15]

2.4.1 Sắc ký giấy (Paper chromatograhhy)

- Quá trình phân tách được thực hiện trên giấy sắc ký hoặc giấy lọc (Hình 2.7) - Dùng viết chì, vẽ một đường mảnh trên gốc của giấy (1,5 - 2 cm) đánh những dấu nhỏ dọc theo đường vừa kẻ

- Dùng pipett hút lượng mẫu với thể tích nhất định cho vào những dấu vừa mới đánh Để khô, tiếp tục cho vào mẫu thứ 2 trên đầu tube khác nhau Làm khô

- Đặt chúng vào bồn sắc ký (cho dung môi ngập khoảng 1cm giấy sắc ký) - Để bồn ở nơi mát tránh ánh sáng trực tiếp, khoảng 1 giờ

- Lấy ra, dùng viết chì kẻ đường đánh dấu nơi mà dung môi di chuyển Làm khô - Phun ninhydrin vào toàn bộ mặt giấy Để khô Tính giá trị Rf [24] - Đối với sắc ký giấy dùng cho phân tích amino acid, các nhà phân tích còn dùng sắc ký cuộn tròn và sắc ký giấy tròn

2.4.2 Sắc ký lớp mỏng ( Thin layer chromatography _TLC)

Trong phương pháp này, pha tĩnh là một lớp mỏng chất hấp phụ được gắn vào

một giá mang thường là bản thủy tinh và pha động đi qua lớp mỏng này bằng lực mao dẫn Trong TLC một chiều, các thành phần trong mẫu được tách rời nhau bằng một lần chạy sắc ký với một dung môi nào đó, còn TLC hai chiều là một kỹ thuật sắc ký có khả năng tách mạnh bằng hai lần chạy sắc ký với hai chiều vuông góc nhau và với hai hệ dung môi khác nhau [7]

Quy trình phân tích amino acid trên TLC [23]

- Lấy tấm TLC, dùng viết chì vẽ một đường mảnh cách mép dưới của tấm TLC khoảng 2 cm, đánh „dấu‟ trên đường bút chì vừa được vẽ Chú ý đánh dấu từng vết đều nhau và dán nhãn trước để có thể không nhần lẫn khi phát hiện

- Nhỏ trên mỗi đánh dấu một giọt dung dịch amino acid mẫu, làm khô tấm TLC - Thêm dung môi cho vào một beaker rộng điều chỉnh lượng dung môi để có thể phủ toàn bộ chiều ngang của tấm TLC ( chú ý phủ khoảng 1cm chiều cao của lớp mỏng)

- Cho tấm TLC vào beaker, mẫu được đặt phía dưới

- Khi dung môi di chuyển được khoảng 85 % của tấm mỏng thì lấy tấm mỏng ra dùng viết chì vẽ một đường mảnh ngang với đường dung môi vừa di chuiyển đến Để chúng khô hoàn toàn

- Cho bảng mỏng vào tủ hút, nhỏ ninhydrin vào để có thể thấy màu Làm khô .Khi đó amino acid sẽ xuất hiện màu trên bảng mỏng Đánh dấu từng vết bằng bút chì ngay ở tâm Tính giá trị Rf ( retardation factor)

- Lưu giá trị Rf để tính toán những amino acid chưa biết

Ngoài ra, amino acid cò được phân tích trên sắc ký trao đổi ion thông qua phát hiện sau khi bị tách qua cột, sắc ký khí,, điện di mao quản, HPLC Tuy nhiên, đối với phân tích amino acid, sắc ký lỏng cao áp (HPLC) thường được sử dụng nhất bởi vì nó có nhiều ưu điểm hơn như: thời gian ngắn độ phân tách cao, dẫn xuất ổn định và có thể phát hiện thông qua UV (Ultraviolet)

2.4.3 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

HPLC được ra đời vào đầu những năm1970 là một trong những công cụ phân tích đầu tay của các nhà phân tích

HPLC dựa vào pha động (dạng lỏng) để phân tách các thành phần trộn lẫn vào nhau Những thành phần này đầu tiên được hòa tan vào trong dung môi và sau đó dưới tác dụng của áp suất cao , chúng sẽ bị lôi kéo di chuyển qua cột sắc ký Trong cột, hỗn hợp sẽ được phân tách thành những cấu tử của chúng

Sự tương tác giữa chất tan với pha động và pha tĩnh có thể phụ thuộc vào sự chọn lựa khác nhau cả dung môi và pha tĩnh Kết quả HPLC sẽ thu được nhiều cấu tử khác nhau mà các kỹ thuật sắc ký khác không thực hiện được và nó dễ dàng phân tách số lượng lớn các chất hoá học trộn lẫn vào nhau

2.4.3.1 Pha tĩnh

Tùy theo mẫu phân tích mà ta có có mô hình pha tĩnh khác nhau

Liquid - Solid Dựa trên độ phân cực Những cấu tử nào có độ phân cực mạnh

sẽ liên kết chặ với pha tĩnh hơn những chất có độ phân cực yếu hơn Vì thế những chất ít phân cực sẽ bị lôi cuốn ra khỏi cột nhanh hơn