Luận văn : NUÔI TRỒNG VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẨN AMINO ACID CỦA MỘT SỐ LOÀI NẤM BÀO NGƯ (Pleurotus spp.) BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (High performance liquid chromatography - HPLC) part 3 pps

11 2.2.2.3. Nấm bào ngư Pleurotus pulmonarius Phần lớn đƣợc nhập từ nƣớc ngoài (Hình 2.3). Nhƣng gần đây, GS. Lê Xuân Thám và cộng sự (1999) phát hiện đƣợc một loại khác ở Daklak - Tây Nguyên, sau đó đƣa về Đà Lạt và đã hoàn thiện quy trình trồng trên mùn cƣa [7] . 2.2.2.4. Nấm bào ngƣ Pleurotus abalonus Nấm này có nguồn gốc từ Đài Loan. Là một loài nấm ƣa nóng nên rất thuận lợi để phát triển nuôi trồng trong điều kiện khí hậu của Việt Nam [1]. Nấm này có đặc điểm là quả thể rất to (Hình 2.4), đƣờng kính mũ nấm có thể đạt đến 35 cm [2]. Ngoài ra còn một loài khác cũng đang đƣợc trồng ở Việt Nam nhƣ Pleurotus eryngii, Pleurotus flabellatus. Và mới đây (2005) Thạc sĩ Cổ Đức Trọng đã trồng thành công 2 loài nấm bào ngƣ mới: Pleurotus citrinopileatus Singer Pleurotus (quả thể màu vàng) và Pleurotus djamor (quả thể có màu hồng)[7]. Hình 2.6. Pleurotus floridanus Hình 2.3. Pleurotus pulmonarius Hình 2.4. Pleurotus abalonus Hình 2.5 Pleurotus sp. 12 2.3. Phƣơng pháp sắc ký - Phân tích amino acid 2.3.1. Đặc điểm chung của phƣơng pháp sắc ký Phƣơng pháp sắc ký đƣợc phát triển vào đầu tiên bởi Mikhail Semyonovich Tsvet (1901) trong quá trình nghiên cứu về chlorophyll. Đến năm 1952, Archer John Porter Martin and Richard Laurence Millington Synge đã đoạt giải Nobel hóa học về sắc ký phân tách. Từ đó kỹ thuật sắc ký ngày vàng đƣợc phát triển cao hơn cho đến ngày nay [24]. Sắc ký là phƣơng pháp phân tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và pha tĩnh. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha tĩnh và pha động tƣơng ứng với tính chất của chúng (tính hấp phụ, tính tan). Trong các hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký. Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha tĩnh và pha động. Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tính sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tƣơng tác yếu hơn với pha này. Nhờ vậy mà ngƣời ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký [10]. 2.3.2. Cơ sở của phƣơng pháp sắc ký Phƣơng pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha động và pha tĩnh. Có nhiều nguyên nhân đƣa đến sự phân bố khác nhau giữa nhau của các chất, nhƣng chính sự lặp đi lặp lại hiện tƣợng hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký. Hầu hết các phƣơng pháp sắc lý đều đƣợc dựa theo nguyên lý trên, và hiệu quả của từng phƣơng pháp phụ vào sự chọn lựa giữa pha động pha tĩnh [8]. 2.3.3. Phân loại quá trình sắc ký Trong phƣơng pháp sắc ký pha động phải là các lƣu thể còn pha tĩnh là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn. Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, ngƣời ta chia sắc ký thành hai nhóm sắc ký khí và sắc ký lỏng. Dựa vào cơ chế trao đổi của các chất giữa pha động và pha tĩnh mà ngƣời ta lại chia các phƣơng pháp sắc ký thành nhóm nhỏ hơn. 13 Tùy theo trạng thái tập hợp của các pha, loại tƣơng tác và sự hình thành sắc ký mà ngƣời ta phân biệt các loại sắc ký nhƣ bảng 2.2. Bảng 2.2. Các dạng sắc ký cơ bản [9] Dạng sắc ký Pha động Pha tĩnh Cách bố trí pha tĩnh Cơ chế trao đổi chất Khí Khí- hấp phụ Khí -lỏng Lỏng Lỏng - rắn Lỏng - lỏng Lỏng - nhựa trao đổi Lớp mỏng Rây (sắc ký gel) Khí Khí Lỏng Lỏng Lỏng Lỏng Lỏng Rắn Lỏng Rắn Lỏng Rắn Rắn Lỏng Cột Cột Cột Cột Cột Lớp mỏng Cột Hấp phụ Phân bố Hấp phụ Phân bố Trao đổi ion Hấp phụ Theo kích thƣớc phân tử 2.4 Một số phƣơng pháp sắc ký trong phân tích amino acid Phân tích amino acid là phƣơng pháp xác định thành phần amino acid cũng nhƣ định lƣợng chúng trong mẫu protein hay peptide. Phân tích amino acid có thể sử dụng sắc ký giấy (paper chromatography), sắc ký lớp mỏng (thin layer chomatography- TLC), sắc ký khí (gas chromatography), sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography), sắc ký lỏng cao áp (high performance liquid chromatography), điện di mao quản (capillary electrophoresis) [15]. 2.4.1. Sắc ký giấy (Paper chromatograhhy) - Quá trình phân tách đƣợc thực hiện trên giấy sắc ký hoặc giấy lọc (Hình 2.7). - Dùng viết chì, vẽ một đƣờng mảnh trên gốc của giấy (1,5 - 2 cm). đánh những dấu nhỏ dọc theo đƣờng vừa kẻ. - Dùng pipett hút lƣợng mẫu với thể tích nhất định cho vào những dấu vừa mới đánh. Để khô, tiếp tục cho vào mẫu thứ 2 trên đầu tube khác nhau. Làm khô. - Đặt chúng vào bồn sắc ký (cho dung môi ngập khoảng 1cm giấy sắc ký). - Để bồn ở nơi mát tránh ánh sáng trực tiếp, khoảng 1 giờ. 14 - Lấy ra, dùng viết chì kẻ đƣờng đánh dấu nơi mà dung môi di chuyển. Làm khô. - Phun ninhydrin vào toàn bộ mặt giấy. Để khô. Tính giá trị Rf. [24] - Đối với sắc ký giấy dùng cho phân tích amino acid, các nhà phân tích còn dùng sắc ký cuộn tròn và sắc ký giấy tròn. 2.4.2. Sắc ký lớp mỏng ( Thin layer chromatography _TLC) Trong phƣơng pháp này, pha tĩnh là một lớp mỏng chất hấp phụ đƣợc gắn vào một giá mang thƣờng là bản thủy tinh và pha động đi qua lớp mỏng này bằng lực mao dẫn. Trong TLC một chiều, các thành phần trong mẫu đƣợc tách rời nhau bằng một lần chạy sắc ký với một dung môi nào đó, còn TLC hai chiều là một kỹ thuật sắc ký có khả năng tách mạnh bằng hai lần chạy sắc ký với hai chiều vuông góc nhau và với hai hệ dung môi khác nhau [7]. Quy trình phân tích amino acid trên TLC [23] - Lấy tấm TLC, dùng viết chì vẽ một đƣờng mảnh cách mép dƣới của tấm TLC khoảng 2 cm, đánh „dấu‟ trên đƣờng bút chì vừa đƣợc vẽ. Chú ý đánh dấu từng vết đều nhau và dán nhãn trƣớc để có thể không nhần lẫn khi phát hiện. - Nhỏ trên mỗi đánh dấu một giọt dung dịch amino acid mẫu, làm khô tấm TLC. - Thêm dung môi cho vào một beaker rộng điều chỉnh lƣợng dung môi để có thể phủ toàn bộ chiều ngang của tấm TLC ( chú ý phủ khoảng 1cm chiều cao của lớp mỏng). 15 - Cho tấm TLC vào beaker, mẫu đƣợc đặt phía dƣới. - Khi dung môi di chuyển đƣợc khoảng 85 % của tấm mỏng thì lấy tấm mỏng ra dùng viết chì vẽ một đƣờng mảnh ngang với đƣờng dung môi vừa di chuiyển đến. Để chúng khô hoàn toàn. - Cho bảng mỏng vào tủ hút, nhỏ ninhydrin vào để có thể thấy màu. Làm khô. .Khi đó amino acid sẽ xuất hiện màu trên bảng mỏng. Đánh dấu từng vết bằng bút chì ngay ở tâm. Tính giá trị Rf ( retardation factor). - Lƣu giá trị Rf để tính toán những amino acid chƣa biết. Ngoài ra, amino acid cò đƣợc phân tích trên sắc ký trao đổi ion thông qua phát hiện sau khi bị tách qua cột, sắc ký khí,, điện di mao quản, HPLC. Tuy nhiên, đối với phân tích amino acid, sắc ký lỏng cao áp (HPLC) thƣờng đƣợc sử dụng nhất bởi vì nó có nhiều ƣu điểm hơn nhƣ: thời gian ngắn. độ phân tách cao, dẫn xuất ổn định và có thể phát hiện thông qua UV (Ultraviolet). 2.4.3. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) HPLC đƣợc ra đời vào đầu những năm1970 là một trong những công cụ phân tích đầu tay của các nhà phân tích. HPLC dựa vào pha động (dạng lỏng) để phân tách các thành phần trộn lẫn vào nhau. Những thành phần này đầu tiên đƣợc hòa tan vào trong dung môi và sau đó dƣới tác dụng của áp suất cao , chúng sẽ bị lôi kéo di chuyển qua cột sắc ký. Trong cột, hỗn hợp sẽ đƣợc phân tách thành những cấu tử của chúng. Sự tƣơng tác giữa chất tan với pha động và pha tĩnh có thể phụ thuộc vào sự chọn lựa khác nhau cả dung môi và pha tĩnh. Kết quả HPLC sẽ thu đƣợc nhiều cấu tử khác nhau mà các kỹ thuật sắc ký khác không thực hiện đƣợc và nó dễ dàng phân tách số lƣợng lớn các chất hoá học trộn lẫn vào nhau. 2.4.3.1. Pha tĩnh Tùy theo mẫu phân tích mà ta có có mô hình pha tĩnh khác nhau. Liquid - Solid Dựa trên độ phân cực. Những cấu tử nào có độ phân cực mạnh sẽ liên kết chặ với pha tĩnh hơn những chất có độ phân cực yếu hơn. Vì thế những chất ít phân cực sẽ bị lôi cuốn ra khỏi cột nhanh hơn. 16 Size - Exclusion Dựa trên kích thuớc phân tử của thành phần đƣợc phân tích. Pha tĩnh chứa các hạt xốp bên trong có nhiều lỗ nhỏ. Những thành phần có kích thƣớc lớn hơn hạt sẽ bị loại ra ngoài và đƣợc tách rửa đầu tiên. Những cấu tử có kích thƣớc phù hợp sẽ bị hấp thu và lỗ và đƣợc tách rửa sau. Normal phase (pha bình thƣờng) Pha tĩnh phân cực cao hơn độ phân cực của dung môi pha động . Reverse Phase (ngƣợc pha) pha tĩnh có độ phân cực thấp, pha động có độ phân cực cao hơn. Ion-Exchange đƣợc tiến hành dựa trên sự thay thế những ion trong mẫu với những ion trái dấu trong pha tĩnh. Khi đó pha tĩnh sẽ giữ lại mẫu và pha động di chuyển qua cột sẽ thế chỗ cho ion mẫu và đẩy mẫu ra khỏi cột. 2.4.3.2. Pha động Tùy thuộc vào mô hình của HPLC mà pha động có thể thay đổi. Đối với pha bình thƣờng, thì dung môi thƣờng là không phân cực còn đối với mô hình ngƣợc pha thì thì thƣờng sử dụng có sự pha trộn giữa nƣớc và một vài dung môi hữu cơ phân cực nhƣ acetonitrile. Đối với mô hình size - exclusion, yêu cầu đối với pha động là ngăn cản mẫu gắn kết trên bề mặt của pha tĩnh. 17 2.4.3.3. Bộ dụng cụ HPLC Bơm: Bơm trong HPLC đuợc xem là một trong những thành phần rất quan trọng trong hệ thống sắc ký lỏng. Bởi vì hệ thống sắc ký lỏng đòi hỏi phải có tỉ lệ dòng ổn định liên tục gắn liền với injector, cột và detector. Có hai loại bơm cơ bản - Bơm áp suất liên tục. - Bơm dòng liên tục. Cột: Hiện nay có rất nhiều loại cột đang đƣợc sử dụng. Tuy nhiên tùy thuộc vào loại mẫu, tính chất của mẫu mà ta có loại cột và kích thƣớc cột khác nhau. Đối với sắc ký ngƣợc pha thì cột C-18 và Pico-Tag column, 3.9 mm x 15 cm thƣờng đƣợc sử dụng nhất. Detector: Một số detector thƣờng đƣợc sử dụng: - Detector Ultraviolet/visible: thƣờng đƣợc sử dụng để phát hiện các chất hữu cơ. - Detector chuỗi diode. - Detector huỳnh quang. Và một số detector khác nhƣ detector điện hóa học,detector dẫn điện… Hệ thống dữ liệu. Để chuyển dữ liệu phân tích, detector thƣờng đƣợc nối trực tiếp với một máy vi tính. Khi đó dữ liệu đƣợc chuyển thành những peak trên sắc ký đồ và đƣợc tính toán. 2.5. Các bƣớc phân tích amino acid Phân tích amino acid đƣợc thực hiện thông qua các bƣớc sau đây [17]. - Chuẩn bị mẫu - Thủy phân protein thành những amino acid đơn. - Tạo dẫn xuất. - Phân tách amino acid trên hệ thống sắc ký - Phân tích dữ liệu và tính toán. Trƣớc khi tiến hành phân tích amino acid, quá trình chuẩn bị mẫu cũng đóng vai trò rất quan trọng vì nếu không chuẩn bị kỹ sẽ rất dễ bị nhiễm trong quá trình phân tích. - Mẫu đƣợc đặt trong một tube sạch. - Tất cả mẫu đƣợc làm khô trƣớc khi phân tích. Trong quá trình tiến hành phải đeo găng tay , tuy nhiên tránh các bụi trên găng tay bám vào mẫu. 18 2.5.1. Quá trình thủy phân (Hydrolysis) Để phân tích amino acid trong mẫu protein, mẫu phải đƣợc thủy phân tạo thành những amino acid đơn. Thủy phân bằng acid là phƣơng pháp thông thƣờng nhất để thủy phân protein trƣớc khi tiến hành pnân tích amino acid. Phƣơng pháp thủy phân bằng acid có thể tạo ra sự phân cắt khác nhau đối với một vài amino acid- phá hủy hoàn toàn hoặc một phần. Một số khó khăn khi thủy phân bằng acid. - Trytophan bị phá hủy hoàn toàn - Serine và threonine bị phá hủy một phần - Methionine có thể bị oxy hóa - Cysteine thƣờng đƣợc phát hiện nhƣ là cystine (nhƣng cystine thƣờng đƣợc phát hiện rất kém bởi vì chúng bị phân hủy một phần). - Asparagine và glutamine tƣơng ứng bị chuyển thành acid aspartic và acid glutamic. Nhƣ vậy, nếu kỹ thuật thủy phân không tốt có thể gây ra nhiều kết quả không chính xác. Một số phƣơng pháp thủy phân thƣờng đƣợc sử dụng trong HPLC. Phƣơng pháp 1: Dùng HCl 6N và phenol (từ 0.1- 1 %) Phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng nhất là dùng HCl có chứa phenol. Thêm phenol vào để ngăn cản phản ứng halogen hóa tyrosine.Dung dịch thủy phân: HCl 6N chứa từ 0,1 đến 1 % phenol. Phƣơng pháp tiến hành: - Cho mẫu vào tube thủy phân và làm khô (mẫu đƣợc làm khô để nƣớc không pha loãng acid). Hình 2.10. Thủy phân protein bằng HCl [17] 19 - Thêm dung dịch thủy phân vào mẫu với tỷ lệ nhất định. - Làm lạnh tube chứa mẫu. - Mẫu thƣờng đƣợc thủy phân ở 110 o C, trong 24h trong chân không hoặc trong khí trơ để ngăn cản quá trình oxy hóa. Thời gian thủy phân có thể thay đổi tùy theo mục đích phân tích. - Sau khi thủy phân làm khô mẫu trong chân không để loại bỏ acid thừa. Phƣơng pháp 2: Dùng Mercaptoathanesulfonic (MESA) 2.5M. - Mẫu đƣợc làm khô trong một tube trƣớc khi thủy phân. - Tube chứa mẫu này cho vào một tube lớn hơn đã chứa dung dịch thủy phân. - Tube thủy phân này đƣợc tiến hành trong chân không để làm bay hơi dung dịch thủy phân. Tube thủy phân đƣợc gia nhiệt từ 170 o C đến 185 o C khoảng 12 phút. - Sau khi thủy phân tube đƣợc làm khô trong chân không để loại bỏ acid dung dịch thừa [17]. 2.5.2. Quá trình tạo dẫn xuất (Derivatisation) [17] Những amino acid sẽ không đƣợc phát hiện nếu chúng không đƣợc tạo dẫn xuất. Hiện nay có rất nhiều phƣơng pháp tạo dẫn xuất, sự chọn lựa bất kỳ một kỹ thuật nào phụ thuộc vào độ nhạy, thời gian phân tích và độ chính xác của phƣơng pháp. Nói chung một nữa trong số kỹ thuật phân tách amino acid là kỹ thuật sắc ký trao đổi ion kèm theo postcolumn (ninhydrin hay o – phthaladehyde). Kỹ thuật phát hiện bằng postcolumn chỉ yêu cầu với lƣợng mẫu nhỏ (khoảng 5-10 µg protein trong một lần phân tích). Kỹ thuật phân tích amino acid liên quan đến tạo dẫn xuất precolumn cũng đƣợc ứng dụng rất rộng rãi và yêu cầu là HPLC ngƣợc pha. Kỹ thuật này rất nhạy nên đòi hỏi lƣợng mẫu phân tích rất nhỏ chỉ khoảng 0.5-1 µg. Phƣơng pháp phát hiện bằng ninhydrin postcolumn Phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion với ninhydrin postcolumn là một trong những phƣơng pháp đƣợc ứng dụng nhiều nhất trong kỹ thuật định lƣợng amino acid. Sau khi amino acid đƣợc phân tách trên sắc ký sẽ đƣợc phát hiện thông qua phản ứng của chúng với ninhydrin sẽ tạo màu vàng hay màu tím. Những amino acid thƣờng cho màu tím sẽ đƣợc phát hiện ở bƣớc sóng hấp thụ là 570 nm. Những amino acid cho màu nhƣ là proline thƣờng đƣợc phát hiện ở bƣớc sóng 440 nm. Ngoài 20 ninhydrin, o – phthalaldehyde (OPA) cũng đƣợc sử dụng trong phân tích postcolumn. Bƣớc sóng phát hiện của phƣơng pháp này thƣờng vào khoảng 348 - 450 nm. Đối với phƣơng pháp precolumn thì tác nhân tạo dẫn xuất thƣờng đƣợc sử dụng là phenylisothiocyanate (PITC). PITC phản ứng với amino acid ở nhiệt độ phòng trong vòng 5-10 phút (Pierce Chemical company, 1999) tạo thành phenylisocarbamyl (PTC) và có thể đƣợc phát hiện ở bƣớc sóng 254 nm. Vì thế tạo dẫn xuất amin acid với PITC thông qua sắc ký ngƣợc pha (reversed-phase HPLC) có thể đƣợc sử dụng để phân tích định lƣợng amino acid với detector UV. Với phƣơng pháp này, giới hạn phát hiện cho phần lớn những amino acid là khoảng 1pmol. Độ tuyến tính tƣơng ứng (response linearity) thu đƣợc từ 20 đến 500 pmol. Để thu đƣợc kết quả tốt, lƣợng mẫu lớn hơn 500 ng trƣớc khi thủy phân là tốt nhất. Ngoài sử dụng các thành phần phản ứng nêu trên, các hợp chất sau đây cũng đƣợc sử dụng để phát hiện amino acid trong các mẫu sinh hóa. o - phthaladehyde (OPA).(dẫn xuất sau khi qua cột) Hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC) (dẫn xuất tiền cột) Dimethylaminoazobenzenesulfonyl chloride (DABS-Cl) (dẫn xuất tiền cột) 9-Fluornylmethyl choloformate (FMOC-Cl) (dẫn xuất tiền cột) 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole (NBD-F) (dẫn xuất tiền cột) 2.5.3. Phân tách trên HPLC [17] Đầu tiên, chuẩn amino acid đƣợc phân tách trƣớc với các nồng độ khác nhau để làm dữ liệu cho công việc tính toán sau này. Mẫu thƣờng đƣợc bơm với thể tích nhất định. Hình 2.11. Tạo dẫn xuất amino acid bằng PITC [10]. . Kh - hấp phụ Khí -lỏng Lỏng Lỏng - rắn Lỏng - lỏng Lỏng - nhựa trao đổi Lớp mỏng Rây (sắc ký gel) Khí Khí Lỏng Lỏng Lỏng Lỏng Lỏng Rắn Lỏng Rắn Lỏng Rắn Rắn Lỏng. chloride (DABS-Cl) (dẫn xuất tiền cột) 9-Fluornylmethyl choloformate (FMOC-Cl) (dẫn xuất tiền cột) 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1 , 3- diazole (NBD-F) (dẫn xuất tiền cột) 2.5 .3. Phân tách trên. amino acid có thể sử dụng sắc ký giấy (paper chromatography) , sắc ký lớp mỏng (thin layer chomatography- TLC), sắc ký khí (gas chromatography) , sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography) ,