Nghiên Cứu Khả Năng Kháng Khuẩn Và Xác Định Thành Phần Hóa Học Của Một Số Loại Cao Chiết Hoa Sứ

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ LOẠI CAO CHIẾT HOA SỨ TRẮNG PLUMERIA RUBRA L.. Kết quả định tính một số thành phần hóa học c

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT

SỐ LOẠI CAO CHIẾT HOA SỨ TRẮNG

(PLUMERIA RUBRA L ACUTIFOLIA)

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Giảng viên hướng dẫn : ThS Phạm Minh Nhựt

TP Hồ Chí Minh, 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên cơ

sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS Phạm Minh Nhựt Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này

TP.Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 07 năm 2017

Sinh viên

TRẦN PHƯƠNG THÙY

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua

Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt, người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng các anh chị, bạn bè

đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài của mình

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như trong cuộc sống

Tp Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 07 năm 2017

Sinh viên

TRẦN PHƯƠNG THÙY

i

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 3

4 Phạm vi nghiên cứu 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Giới thiệu về cây Sứ trắng 4

1.1.1 Phân loại 4

1.1.2 Đặc điểm hình thái 4

1.1.3 Phân bố 5

1.1.4 Công dụng của cây Sứ Trắng 6

1.1.5 Thành phần hóa học của Hoa Sứ trắng 8

1.1.6 Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ ở Việt Nam và trên thế giới 8

1.2 Đại cương về một số hợp chất hữu cơ hiện diện ở thực vật 9

ii

1.2.2 Alkaloid 10

1.2.3 Flavonoid 11

1.2.4 Saponin 12

1.2.5 Tannin 13

1.2.6 Hợp chất glycoside 14

1.2.7 Hợp chất phenolic 15

1.3 Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật 16

1.3.1 Khái niệm 16

1.3.2 Cơ chế kháng khuẩn 17

1.4 Tổng quan về vi khuẩn đường ruột 17

1.4.1 Định nghĩa 17

1.4.2 Đặc điểm hình thái 17

1.4.3 Tính chất nuôi cấy 17

1.4.4 Đặc điểm sinh hóa 18

1.4.5 Sức đề kháng 18

1.4.6 Độc tố 19

1.4.7 Cấu trúc kháng nguyên 19

1.4.8 Khả năng gây bệnh 20

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

iii

2.1.1 Địa điểm 22

2.1.2 Thời gian 22

2.2 Vật liệu 22

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.2.2 Địa điểm thu mẫu 22

2.2.3 Vật liệu nghiên cứu 22

2.2.4 Thiết bị và dụng cụ 24

2.2.5 Hóa chất, dung môi 24

2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3.1 Phương pháp xử lý nguyên liệu 25

2.3.2 Phương pháp tách chiết cao từ thực vật 25

2.3.3 Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 26

2.3.4 Phương pháp tăng sinh vi sinh vật 27

2.3.5 Phương pháp pha loãng mẫu 27

2.3.6 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết 28

2.3.7 Phương pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết 28

2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 31

2.4 Bố trí thí nghiệm 32

iv

thu hồi cao từ Hoa Sứ trắng 32 2.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết khác nhau từ Hoa Sứ trắng 34 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hàm lượng thu hồi cao

từ Hoa Sứ trắng 38

3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng 39

3.2.1 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm

vi khuẩn Escherichia coli 39

3.2.2 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm

3.3 Kết quả định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết Hoa Sứ trắng

từ dung môi ethanol 70% 57

Phụ lục C: Cách pha các loại thuốc thử 38

Phụ lục D Kết quả hình ảnh định tính một số thành phần hóa học của cao chiết EtOH 70% từ Hoa Sứ trắng 40

vi

TSB: Trypton Soya Broth

TSA: Trypticase Soya Agar

DMSO: Dimethyl Sulfoxide

NA: Non activity

DNA: Deoxyribonucleic acid

RNA: Ribonucleic acid

PrAEE: Cao chiết ethanol từ Hoa Sứ trắng

vii

Bảng 3.1 Kết quả đường kính vòng ức chế (mm) của cao chiết Hoa Sứ trắng từ các loại dung môi khác nhau trên 10 chủng vi khuẩn gây bệnh 54Bảng 3.2 Kết quả đường kính vòng ức chế (mm) của cao chiết Hoa Sứ trắng từ các loại dung môi khác nhau trên 10 chủng vi khuẩn gây bệnh 55Bảng 3.3 Kết quả định tính thành phần hóa học của cao chiết ethanol 70% từ mẫu Hoa

Sứ trắng 58

viii

Hình 1.1 Cây Hoa Sứ trắng 4

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí nghiệm tổng quát 32

Hình 2.2 Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ Hoa Sứ trắng 33

Hình 2.3 Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao PrAEE 34

Hình 2.4 Định tính một số thành phần hóa học của cao chiết ethanol 70% từ Hoa Sứ trắng 36

Hình 3.1 Hàm lượng thu hồi cao chiết từ Hoa Sứ trắng với các dung môi khác nhau 38 Hình 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli 40

Hình 3.3 A Vòng ức chế E.coli (EtOH 70%) B Vòng ức chế E0208 (EtOH 96%) 40

Hình 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp 42

Hình 3.5 A Vòng ức chế của L.innocua (EtOH 70%) B Vòng ức chế của L.monocytogenes (EtOH 70%) 42

Hình 3.6 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn salmonella spp 44

Hình 3.7 Vòng ức chế S.dublin của cao chiết EtOH 70% (A) và 96% (B) 44

Hình 3.8 Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp 46

Hình 3.9 Vòng ức chế của S.boydii của cao chiết EtOH 96% (A) và cao chiết EtOH 50% (B) 47

Hình 3.10 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp 49

Hình 3.11 A Vòng ức chế V.cholerae của cao chiết EtOH 96% và B Vòng ức chế V.harveyi của cao chiết EtOH 70% 49

Hình 3.12 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng đối với nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da 51

Hình 3.13 Vòng ức chế S.aureus (A) và P.aeruginosa ở cao chiết EtOH 70% (B) 51

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Lãnh thổ Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, có tới 3/4 diện tích cả nước là rừng núi Với đặc điểm khí hậu và địa hình như vậy nên nước ta được đánh giá

là nước có nguồn tài nguyên sinh vật đa dạng và phong phú, được xếp thứ 16 trong số

25 quốc gia có mức độ đa dạng sinh vật cao nhất thế giới Nguồn thực vật phong phú này đã cung cấp cho con người nhiều sản phẩm thiên nhiên có giá trị Các sản phẩm thiên nhiên có hoạt tính sinh học được ứng dụng rất lớn trong nhiều lĩnh vực khác nhau của cuộc sống, đặc biệt là dùng làm thuốc chữa bệnh Theo các nhà phân loại thực vật, nước ta có khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao, trong đó khoảng 3.948 loài được dùng làm dược liệu (Viện dược liệu, 2007) Nếu so với khoảng 20.000 loài cây làm thuốc đã biết trên thế giới (IUCN, 1992) thì số loài cây thuốc ở Việt Nam chiếm khoảng 19% Tuy có nguồn thực vật đa dạng và phong phú nhưng do chúng phân bố rải rác ở nhiều nơi, cùng với sự khai thác nhưng không có kế hoạch bảo tồn nên dẫn đến tình trạng trữ lượng các loài cây ngày càng ít đi Thế nên, hiện nay chúng ta cần khai thác có hiệu quả về hoạt tính sinh học của các loài cây và duy trì trồng lại các giống đã khai thác, để tạo ra các loại thuốc trị bệnh mới đem lại lợi ích cho con người nhưng không làm cạn kiệt nguồn tài nguyên nước nhà

Nguồn dược liệu của nước ta vô cùng phong phú, trong đó có nhiều cây thuốc kháng sinh được Y học dân tộc dùng làm thuốc từ lâu Chúng thường là những cây cỏ rất quen thuộc, mọc hoang dại hoặc được trồng ngay trong vườn như: Hành, Tỏi, Hẹ, Kim ngân, Sâm đại hành, lá Móng tay… được nhân dân ta dùng làm thuốc tiêu độc, tiêu viêm, sát khuẩn, chữa các bệnh nhiễm khuẩn ngoài da, mụn nhọt, chốc lở, viêm họng, viêm phế quản và nhiều bệnh nhiễm khuẩn khác Nhiều cây thuốc được nhân dân

ta dùng chữa vết thương có kết quả tốt như Mỏ quạ, Nọc sởi, lá Vối, lá Bòng bong, Sắn thuyền, Lô hội, lá Trầu không, Sài đất…Trong điều trị các vết thương phần mềm,

nhiều tác giả trong và ngoài nước cũng đã công nhận dùng chất kháng khuẩn thực vật chữa vết thương chóng sạch, các đám hoại tử dễ bong, tổ chức hạt non phát triển mạnh, vết thương mau lành hơn chữa bằng kháng sinh tân dược vì trong nước sắc cây thuốc không phải chỉ có kháng sinh mà còn có những chất kích thích giúp vết thương chóng đầy miệng, có các loại men, vitamin và các nguyên tố vi lượng tạo điều kiện cho vết thương chóng khỏi Hiện nay trên thế giới, phong trào quay về với thiên nhiên đang diễn ra mạnh mẽ và Việt Nam chúng ta cũng đang rất tích cực nghiên cứu về vấn đề này Ở Việt Nam, các nghị định,các chương trình của nhà nước đã thúc đẩy việc phát hiện, nghiên cứu và sử dụng các nguồn cây thuốc trong kho tàng cây thuốc Việt Nam

Trong các cuốn sách nói về cây thuốc hầu hết đều có nhắc tới công dụng chữa bệnh của cây sứ trong đó có hoa sứ điển hình như trong cuốn sách Từ điển cây thuốc Việt Nam của tác Võ Văn Chi Theo y học cổ truyền, các bộ phận sau của cây sứ có thể dùng làm thuốc: vỏ thân, vỏ rễ, hoa, nụ hoa, lá tươi và nhựa cây, nhưng sử dụng nhiều nhất là hoa Toàn cây có chứa một loại kháng sinh thực vật là fulvo plumierin, có tác dụng ức chế sự tăng sinh và phát triển của một số vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis Thời xa xưa, dân gian thường dùng hoa đại phơi khô để làm thuốc chữa chứng ho, kiết lỵ và tiêu chảy

Với nghiên cứu khoa học và thực tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và xác định thành phần hóa học của cao chiết Hoa Sứ trắng (Plumeria rubra L var acutifolia)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ trắng khi tách chiết bằng các dung môi khác nhau

- Bước đầu định tính một số thành phần hóa học hiện diện trong cao chiết Hoa

Sứ trắng

3 Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá hàm lượng thu hồi cao chiết Hoa Sứ trắng từ 4 loại dung môi nước, ethanol 50%, ethanol 70%, ethanol 96%

- Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với các vi khuẩn chỉ thị

- Bước đầu định tính một số thành phần hóa học hiện diện trong cao chiết Hoa

Sứ trắng

4 Phạm vi nghiên cứu

- Chỉ thực hiện tách chiết trên những loại dung môi là cồn và nước

- Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN1.1 Giới thiệu về cây Sứ trắng

Tên khoa học: Plumeria rubra L var acutifolia (Poir.) Bailey

Tên thường gọi: Sứ cùi, cây Đại, bông Sứ, Chăm pa…

Hình 1.1 Cây Hoa Sứ trắng

1.1.2 Đặc điểm hình thái

Cây cao khoảng 2 – 3 m, có khi cao đến 7 m.Thân tròn mập, phân cành nhiều nhánh, dài, khẳng khiu, cong queo, xù xì Vỏ cây có màu trắng xám với những sẹo lá

để lại, cây có nhựa mủ

Lá cây Hoa Sứ trắng thuôn dài có hình bầu dục, rộng ở giữ và hẹp ở cả 2 đầu

Lá có màu xanh bóng, nhẵn ở mặt trên, lớp lông mịn cùng với gân chính màu trắng và

các gân viền ở mép nổi rõ ở mặt dưới lá Lá xếp sát nhau thành vòng ở ngọn cành, khi rụng để lại sẹo lớn ở cành

Hoa Sứ trắng ra những cụm hoa trên cuống chung dài khoảng 30 – 50 cm, phân nhánh ở vòng đỉnh, có nhiều sẹo do hoa rụng Các bông có cánh dày, mập, khi còn nụ thì xếp vặn, nở bung thì khoe sắc trắng của cánh hoa và tâm màu vàng cùng nhị đính trên ống tràng Hoa nở quanh năm và mang mùi thơm thoang thoảng Cây Hoa Sứ trắng có quả mọc choãi thẳng hàng, dài từ 10 – 15 cm Quả chứa các hạt có cánh nhưng

ít gặp vì Hoa Sứ trắng khó đậu trái

Cây Hoa Sứ trắng có tốc độ sinh trưởng nhanh Đây là cây ưa sáng, phát triển tốt trên đất giàu dinh dưỡng, thoát nước tốt Cây còn có thể trồng trên đất cát, đất sỏi vì

Sứ Trắng có khả năng chịu hạn cao Cây được nhân giống từ giâm cành là chính Vào mùa mưa, những cành Sứ trắng giâm rất nhanh ra rễ và mọc khỏe

1.1.3 Phân bố

Hoa Sứ trắng là một trong số nhiều loài thuộc chi Plumeria Chi này có nguồn

gốc ở vùng Trung Mỹ Do có hoa đẹp và đặc biệt có hương thơm, dần dần đã được con người trồng nhiều nơi trên thế giới để làm cảnh và lấy hương từ hoa Ở nhiều nước Nam Á như Ấn Độ, Thái Lan, Campuchia, Lào và Việt Nam, Sứ trắng thường được trồng ở các đền đài, và dùng hoa của nó để thờ cúng Nicaragua và Lào là hai nước lấy cây Sứ Trắng làm quốc hoa, ở đó nó được gọi với cái tên là Sacuajoche (Nicaragua) và Champa (Lào) Sứ Trắng có tên tiếng Anh là frangipani, xuất phát từ tên dòng họ Frangipani của một gia đình hầu tước đã nghĩ ra cách tạo một loại nước hoa có mùi của hoa Sứ Trắng

Ở Việt Nam, Cây Sứ trắng được trồng nhiều tại công viên, dọc đường phố, khu

đô thị, khu công nghiệp, trồng dọc lối đi, dải phân cách, cảnh quan nhà máy, bệnh viện hay trồng sân vườn biệt thự… Những đình, chùa, lăng miếu hay nghĩa trang cũng sử dụng loại cây này rất nhiều

1.1.4 Công dụng của cây Sứ Trắng

1.1.4.1 Công dụng làm cảnh

Sứ có nhiều loại và màu sắc khác nhau, từ những cây nhỏ được trồng trong chậu đặt ở những vị trí nhỏ hẹp như sân thượng, ban công nhà,… đến những cây Sứ to

được trồng trong sân vườn đem lại hương hoa và bóng mát cho ngôi nhà

1.1.4.2 Công dụng dân gian của cây Sứ trắng

Tính vị, tác dụng: Hoa Sứ trắng có vị ngọt, tính bình, thơm, có tác dụng thanh nhiệt lợi tiểu, hòa vị, nhuận tràng, bổ phổi, có tác dụng hạ huyết áp rất rõ Vỏ cây có vị đắng tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, tả hạ, tiêu thủng, sát trùng Lá có tác dụng hành huyết, tiêu viêm Nhựa có tác dụng tiêu viêm và làm mềm những tổ chức rắn chai chân

Theo y học cổ truyền, các bộ phận sau của cây Sứ trắng có thể dùng làm thuốc:

vỏ thân, vỏ rễ, hoa, nụ hoa, lá tươi và nhựa cây, nhưng sử dụng nhiều nhất là hoa Toàn cây có chứa một loại kháng sinh thực vật là fulvo plumierin, có tác dụng ức chế sự tăng

sinh và phát triển của một số vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis Từng bộ phận

khác nhau của cây có những công dụng khác nhau:

a) Công dụng của hoa

Năm 1962, khoa Dược lý trường sĩ quan quân y Việt Nam đã nghiên cứu tác dụng của Hoa Sứ và kết luận rằng “Hoa Sứ có tác dụng hạ huyết áp Hoa khô có tác dụng mạnh hơn hoa tươi” Hoa Sứ hạ huyết áp nhưng không làm giãn tĩnh mạch, không tác dụng đối với tuần hoàn ngoại biên mà tác dụng vào trung tâm Tác dụng huyết áp xuất hiện nhanh và tương đối bền vững

Ngoài ra Hoa Sứ còn có một số công dụng sau:

Dự phòng say nắng

Viêm ruột, lỵ

Khó tiêu, kém hấp thu và kém dinh dưỡng ở trẻ em

Nhiễm khuẩn, viêm gan

Viêm khí quản, ho

b) Công dụng của vỏ thân, vỏ rễ

Trong vỏ thân có gluside là agoniadin và một chất đắng là plumierite Vỏ thân

và rễ có hơi độc, vị đắng, tính mát Dân gian thường sử dụng để chữa thủy thủng, làm thuốc tẩy xổ (dùng 8 – 15 g), táo bón lâu ngày (thay thế cho đại hoàng), nhuận tràng (dùng 3 – 5 g), viêm chân răng Ở Ấn Độ, người ta còn dùng vỏ trị tiêu chảy và dùng

vỏ rễ để trị bệnh lậu và loét đường sinh dục

c) Công dụng của nhựa mủ

Nhựa mũ thành phần chủ yếu là acid plumeric Cũng có thể dùng nhựa mủ để

tẩy xổ, nhưng liều thấp hơn nhiều so với vỏ thân , 0.5 – 0.8g/ngày dưới dạng nhũ dịch Nhựa mủ còn được dùng để chữa chai chân, sưng tấy, mụn nhọt Ở Ấn Độ, người ta dùng như chất gây sung huyết để trị thấp khớp và còn dùng xổ

d) Công dụng của lá

Lá tươi chứa plumier và một số chất khác đã được sử dụng để điều trị loét,

viêm (Bobbarala và ctv, 2000, Zaheer và ctv, 2010) Chiết xuất lá đã cho thấy dấu hiệu

của hoạt động kháng khuẩn

Kinh nghiệm dân gian dùng lá cây Sứ trắng chữa bong gân, sai khớp, mụn nhọt

Một số bài thuốc dân gian từ Hoa Sứ:

Chữa cao huyết áp, bằng cách dùng như sau: Hằng ngày sử dụng 12 - 20g hoa

sứ (loại khô), đem sắc (nấu) lấy nước, uống thay trà trong ngày

Bong gân: Dùng một lá tươi rửa sạch, giã nhuyễn, trộn với một ít muối ăn đắp lên chỗ sưng Lại dùng một ít lá tươi khác, hơ lên lửa cho héo và đắp phía ngoài rồi cố định bằng băng hoặc vải sạch Ngày đắp 1 – 3 lần liên tục như vậy 1 – 2 ngày

Đau nhức hay mụn nhọt: Cũng dùng lá tươi giã nhuyễn đắp vào

Chân răng sưng đau: Vỏ rễ ngâm rượu, dùng ngậm rất hiệu quả (chú ý không được nuốt)

Ho: Sử dụng 4 – 12g hoa sứ khô, sắc lấy nước, uống thay trà trong ngày.

1.1.5 Thành phần hóa học của Hoa Sứ trắng

- Hoa chứa tinh dầu dễ bốc hơi (chừng 0,05 %) trong có citronellol, farnesol, geraniol, bornesitol, linalol, phenyl-ethyl alcohol, 2-methylbutan-1-ol Các flavonoid như kaempferol, kaempferol-glycoside, quercetin, quercetin-glycoside , quercitrin, rutin

- Vỏ thân có beta-sitosterol, các iridoids như fulvoplumierin (0,25%), al lamcin

và allamandin , plumieride (6%), p-benzoquinone, lignan loại liriodendrin

- Rễ chứa beta-dihydroplumericic acid, beta-dihydroplumericine, isoplume ricine, plumericine

- Nhựa chứa acetyl-luoeol, alpha và beta-amyrin, cerotic acid, lupeol, lupe acetate, oxymethyl-dioxycinnamic acid, plumieric acid

ol Lá chứa khoảng 5,6 % pectin

1.1.6 Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ ở Việt Nam và trên thế giới

1.1.6.1 Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ ở Việt Nam

Hiện nay ở Việt Nam chưa có bài viết cụ thể nào nghiên cứu về loài Hoa Sứ

1.1.6.2 Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ trên thế giới

Năm 2010, Ajay Singh Baghel và ctv đã nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn

của chiết xuất từ hoa Plumeria rubra L bằng các loại dung môi nước, ethanol, etyl

acetate, chloroform

Năm 2015, Lawal và ctv đã khảo sát thành phần hóa học của chiết xuất tinh

dầu từ lá Plumeria rubra L trồng ở Nigeria

Năm 2014, Muruganantham và ctv đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và

kháng nấm của chiết xuất ethanol từ Plumeria rubra

Năm 2008, Laila Jarin đã nghiên cứu hoạt động kháng nấm và kháng khuẩn

của chiết xuất tinh dầu từ Plumeria rubra.

Năm 2012, Ravi Kumar Goyal và ctv đã khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của

vỏ cây Plumeria alba

Năm 2010, Subur Khan và ctv đã nghiên cứu đánh giá thành phần hóa học của

Plumeria rubra và Plumeria alba

1.2 Đại cương về một số hợp chất hữu cơ hiện diện ở thực vật

1.2.1 Carbohydrate

1.2.1.1 Khái niệm

Carbohydrate là một nhóm chất hữu cơ phổ biến khá rộng rãi trong cơ thể sinh vật Được cấu tạo từ các nguyên tố: C, H, O với công thức cấu tạo chung Cm(H2O)n, thường m = n (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013).Nhìn chung hàm lượng carbohydrate ở thực vật cao hơn động vật Ở thực vật carbohydrate thay đổi tùy theo loài, giai đoạn sinh trưởng và phát triển

Thực vật: chiếm khoảng 75% trong các bộ phận như củ, quả, lá, thân, cành Động vật: chiếm khoảng 2% trong gan, cơ máu, (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013)

1.2.1.2 2. Phân loại

Dựa vào cấu tạo, tính chất carbohydrate được chia làm ba nhóm chính sau: Monosaccharide còn được gọi là đường đơn vì chúng là thành phần đơn giản nhất của carbohydrate và không bị thủy phân Monosaccharide được xem là sản phẩm oxy hóa không hoàn toàn của các polyalcol, công thức có chứa chức aldehyde và cetone

Oligosaccharide là hợp chất trung gian giữa monosaccharide và polysaccharide Phân tử oligosaccharide và polysaccharide đều do các monosaccharide kết hợp với nhau bằng liên kết O-glycoside do nhóm hydroxyl hemiacetal của một gốc với một hydroxyl bất kì của một gốc khác

Thông thường người ta gọi oligosaccharide là những gluside chứa từ 2 - 10 gốc monosaccharide Tùy theo số lượng monosaccharide mà người ta gọi disaccharide, trisaccharide, tetrasaccharide…

Hầu hết các oligosaccharide dễ kết tinh, dễ hòa tan, có vị ngọt và có phân tử lượng xác định

Polysaccharide là những hợp chất bao gồm hàng trăm đến hàng nghìn monosaccharide kết hợp với nhau bằng liên kết glycoside Polysaccharide mang nhiều tính khác với mono và disaccharide như: không có phản ứng khử, không có vị ngọt, thường không tan trong nước, khi hòa tan dễ hình thành dung dịch keo

Phân tử polysaccharide có thể gồm một hoặc vài loại monome khác nhau, do

đó người ta chia ra polysaccharide đồng thể và polysaccharide dị thể

1.2.1.3 Vai trò

Trong cơ thể sống carbohydrate giữ nhiều vai trò quan trọng:

Đảm bảo cung cấp khoảng 60% năng lượng cho các quá trình sống

Có vai trò cấu trúc, tạo hình (ví dụ: cellulose, peptidoglican )

Có vai trò bảo vệ (mucopolysaccharide)

Chống tạo thể cetone (mang tính acid gây độc cho cơ thể) (Nguyễn Phương

1.2.2.2 Phân loại

Do cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ bản không thể đáp ứng được cho

số lượng alkaloid rất nhiều và đa dạng, nên để tiện lợi, các alkaloid được chia làm 3 loại: alkaloid thật, protoalkaloid và giả - alkaloid (Pseudoalkaloid)

Alkaloid thật là những hợp chất có hoạt tính sinh học, luôn có tính base, thường có chứa nguyên tử nitơ trong vòng dị hoàn, thường được sinh tổng hợp từ amino acid, phân bố giới hạn trong thực vật và hiện diện trong cây dưới dạng muối của một acid hữu cơ, ngoại trừ colchicin, acid aristolochic, alkaloid tứ cấp Các alkaloid loại này thường được chia thành nhóm theo nguồn gốc sinh tổng hợp của chúng (ornithin Lysin, phenylalanin, tryptophan, histidin, acid antranilic…) hơn là theo vòng

dị hoàn

Các protoalkaloid được xem là những amin có hoạt tính sinh học kể cả mescalin và N, N - dimetyltryptamin Chúng là những amin đơn giản, được tổng hợp

từ các amino acid, trong đó nguyên tử nitơ không ở vòng dị hoàn

Các giả - alkaloid, là những hợp chất không bắt nguồn từ những amino aicd, bao gồm hai nhóm hợp chất lớn là alkaloid steroid và alkaloid terpenoid (thí dụ conessin) và purin (cafein)

Hầu hết các alkaloid hiện diện trong cây có hoa, loại 2 lá mầm, nhưng người ta cũng thấy alkaloid trong động vật, côn trùng, sinh vật biển, vi sinh vật… (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

1.2.3 Flavonoid

1.2.3.1 Khái niệm

Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa… Phần lớn có màu vàng ( do từ flavus là màu vàng ); tuy vậy, một sắc tố

có màu xanh, tím, đỏ, không màu cũng được xếp vào nhóm này vì về mặt hóa học chúng có cùng khung sườn cơ bản

Các flavonoid có thể ở dạng tự do hoặc dạng glycoside Các đường thường gặp nhất là D-glucose; kế đó là D-galactose; L-Rhammose; L-Arabinose…

Chalcone hiện diện ít trong tự nhiên; flavanol và flavanonol cũng hiếm gặp; flavone và flavonol phân bố rộng rãi trong tự nhiên Các glyside flavonol như: rutin, quercitrin, daempherol Kaempherol rất thường xuyên hiện diện Antocyanidine dạng glycoside thí dụ như: pelargonidin; cyanidin; delphinidin… tạo màu xanh, đỏ, tím cho những cánh hoa và trái

Các flavonoid thường dễ kết tinh và thường có màu Flavone có màu vàng nhạt hoặc màu cam; flavonol màu vàng nhạt đến màu vàng; chalcone màu vàng đến cam –

đỏ Các isoflavone; flavanone; flavanonol; leucoantocyanidine; catechin kết tinh không màu Antocyanidine có màu đỏ, tím, xanh dương tạo màu cho nhiều loại hoa và trái

1.2.3.2 Vai trò

Quercetin ở môi trường kiềm thì có tác dụng kháng khuẩn kém nhưng ở môi trường acid thì có tác dụng rất rõ với vi khuẩn tụ cầu vàng, vi khuẩn tụ cầu trắng samonella oranienbur có tác dụng kháng nấm thực vật

Một số hợp chất thuộc loại isoflavonoid như rotenon ( trích từ cây thuốc cá

Derris elliptica Benth, họ Đậu ) có tính độc đối với cá và côn trùng nhưng không độc

với các động vật hữu nhũ Cũng có những hợp chất có tính diệt côn trùng như hợp chất

pyrethrin ( trích thừ cây trừ trùng Chrysanthemum cinerariaefolium, họ Cúc )

1.2.4 Saponin

1.2.4.1 Khái niệm

Saponin còn gọi là saponosid do chữ la tinh Sapo = xà phòng (vì nó tạo bọt như xà phòng), là một nhóm glycosid phân bố khá rộng rộng trong thực vật, có một số tính chất đặc trưng: khi hòa tan vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt; làm vỡ hồng cầu còn gọi là tính phá huyết Saponin thường

ở dạng vô định hình, có vị đắng Saponin rất khó tinh chế, có điểm nóng chảy thường cao từ 200oC trở lên và có thể trên 300oC Saponin có thể bị tủa bởi acetat chì, hydroxit barium, sulfat amonium nên có thể lợi dụng tính chất này để cô lập saponin

1.2.4.2 Vai trò

Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho Một số dược liệu chứa saponin có tác dụng thông tiểu như rau má, tỳ giải, thiên môn, mạch môn, Saponin làm tăng sự thấm của tế bào; sự có mặt của saponin sẽ làm cho các hoạt chất khác dễ hoà tan và hấp thu

Nhiều saponin steroid là nguyên liệu đầu để tổng hợp các chất hormon steroid

có hoạt tính cao Nhiều loại saponin có tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn Một số có tác dụng chống ung thư trên thực nghiệm Nhiều saponin có tác dụng diệt các loài thân mềm (nhuyễn thể) Sapogenin steroid dùng làm nguyên liệu để bán tổng hợp các thuốc steroid

1.2.5 Tannin

1.2.5.1 Khái niệm

Tannin là nhóm hợp chất polyphenol phân bố rộng rãi trong thực vật Người ta gặp tannin hằng ngày trong cuộc sống ( trà, rượu vang đỏ, trong nhiều loại trái cây, đặc biệt là trong vỏ trái măng cục…) Các tannin có trọng lượng phân tử khoảng 500 –

3000 Các tannin do mang nhiều nhóm –OH nên ít nhiều (tùy theo trọng lượng phân tử của chúng) hòa tan trong nước tạo nên dung dịch nhớt (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Tannin thủy giải được có cấu trúc hóa học là ester của glcose với acid galic Người ta cũng chia tannin loại này ra là tannin galic và tannin ellagic

1.2.5.3 Vai trò

Ở trong cây, tannin tham gia vào quá trình trao đổi chất, các quá trình oxy hoá khử Là những chất đa phenol, tannin có tính kháng khuẩn nên có vai trò bảo vệ cho cây

Dung dịch tannin kết hợp với protein, tạo thành màng trên niêm mạc nên ứng dụng làm thuốc săn da Tannin còn có tác dụng kháng khuẩn nên dùng làm thuốc súc miệng khi niêm mạc miệng, họng bị viêm loét, hoặc chỗ loét khi nằm lâu Tannin có thể dùng trong để chữa viêm ruột, chữa tiêu chảy

Tannin kết tủa với kim loại nặng và với alcaloid nên dùng chữa ngộ độc đường tiêu hoá Tannin có tác dụng làm đông máu nên dùng đắp lên vết thương để cầm máu, chữa trĩ, rò hậu môn

Phần đường của glycosid : phần đường phổ biến là D-glucose, D-galactose, arabinose, L-rhamnose, D-xylose, acid glucuronic, acid galacturonic và một số đường khác

L-Phần aglycon của glycosid : phần aglycon rất đa dạng và gồm tất cả các loại hợp chất tự nhiên như : monoterpen, sesquiterpen, diterpen, triterpen, steroid, iriđoi, flavonoid, alcaloid, quinonoid, polyphenol…

1.2.7 Hợp chất phenolic

1.2.7.1 Khái niệm

Đây là nhóm hợp chất lớn trong các nhóm hợp chất thứ cấp ở thực vật, Các nhà khoa học đã phát hiện ra hơn 8,000 hợp chất phenol tự nhiên, Đặc biệt trong cấu trúc của nhóm này trong phân tử có vòng 6C (vòng benzen) gắn trực tiếp một hay nhiều nhóm hydroxyl (OH) Vì vậy, chúng là những alcol bậc 4 và được đặc trưng bởi tính acid yếu

(naphthoquinone), C6-C1-C6 (xanthone), C6-C2- C6 (stilbene, anthraquinone), C6-C3-C6

(flavonoid, isoflavonoid), (C6-C1)2 (tannin thủy phân), (C6-C3)2(lignan, neolignan), (C

6-C3-C6)2 (biflavonoid), (C6-C3)n (lignin), (C6)n (catechol melanin), (C6-C3-C6)n (tannin ngưng tụ)

Nhóm hợp chất polyphenol là nhóm đa dạng nhất trong các hợp chất phenol, có cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc sự trung hợp của các đơn phân Ngoài gốc phenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng

1.2.7.3 Vai trò

Thực vật tổng hợp rất nhiều các chất thứ sinh so với động vật vì chúng không thể lẫn trốn được kẻ thù mà phải dựa vào hệ thống phòng thủ hóa học này Nhìn chung vai trò bảo vệ của các hợp chất phenol dựa trên đặc tính kháng khuẩn, kháng dinh dưỡng của chúng

Các phenol còn có vai trò then chốt trong hình thành các sắc tố của hoa như

đỏ, xanh, tím…Đặc tính chống oxyl hóa (antioxidant) hay tạo phức với kim loại; tạo ra các tín hiệu thông tin giữ phần ở trên cũng như dưới mặt đất, giữa các cây khác với sinh vật khác; phenol còn là các tác nhân che chắn tia tử ngoại (UV) từ mặt trời Khả năng che chắn tia UV giúp cho thực vật có thể chuyển từ sống dưới nước lên cạn hoàn toàn

Các nghiên cứu còn cho thấy trao đổi hợp chất phenol không chỉ là bảo vệ chống lại các yếu tố sinh học, vô sinh mà còn có tham gia quá trình điều hòa ở cấp độ phân tử giúp cây sinh trưởng và phát triển bình thường

Các flavonoid như flavonol và anthoxyane có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh sự phân bố năng lượng ánh sáng ở lá cây, làm tăng hiệu quả quang hợp, Một

số hợp chất polyphenol tham gia tạo màu sắc tự nhiên của hoa, quả, hấp dẫn côn trùng thụ phấn cho hoa

1.3 Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật

1.3.1 Khái niệm

Kháng khuẩn thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật, có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật Các chất kháng khuẩn thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở một nồng độ thường rất nhỏ (Silva và Fernandes, 2010)

1.3.2 Cơ chế kháng khuẩn

Cao chiết từ các loại thực vật có thể biểu hiện hoạt tính kháng lại các chủng vi khuẩn ở các mức độ khác nhau như sự can thiệp vào các lớp đôi phospholipid của màng tế bào gây hậu quả làm gia tăng độ thấm, tổn hại các thành phần tế bào, phá hủy các enzyme tham gia vào việc hình thành năng lượng tế bào, tổng hợp các thành phần cấu trúc, và đồng thời phá hủy hoặc làm bất hoạt các vật liệu di truyền Nói chung, cơ chế tác động của hợp chất kháng khuẩn tự nhiên có liên quan đến sự rối loạn, phá vỡ màng tế bào chất, làm gián đoạn mất ổn định lực chuyển động của proton (PMF), dòng điện tử, sự

vận chuyển tích cực, và đông tụ các thành phần của tế bào (Kotzekidou và ctv, 2008)

1.4 Tổng quan về vi khuẩn đường ruột

1.4.1 Định nghĩa

Họ vi khuẩn đường ruột (Enterbacteriaceae) bao gồm các trực khuẩn Gram

âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, không có men oxidase, lên men đường glucose có kèm theo sinh hơi hoặc không, khử nitrat thành nitrit, có thể di động hoặc không nhưng nếu di động thì sẽ có tiên mao, không sinh bào tử

1.4.2 Đặc điểm hình thái

Tất cả các vi khuẩn thuộc học này đều là vi khuẩn Gram âm Kích thước trung bình từ 2 – 4 µm x 0,4 – 0,6 µm Một số loài hình dạng không ổn định, có thể xuất hiện dạng sợi Những vi khuẩn di động thì có tiên mao phân bố khắp xung quanh tế bào Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột không sinh bào tử Một số có vỏ, có thể quan sát được bằng kính hiển vi thông thường

1.4.3 Tính chất nuôi cấy

Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột có thể mọc trên môi trường nuôi cấy thông thường Trong môi trường lỏng, vi khuẩn làm đục đều môi trường sau 12 -18h nuôi cấy, một số có thể phát triển thành váng trên mặt và lắng cặn dưới đáy ống,

nhưng cũng có thể vừa làm đục môi trường vừa có cặn ở dưới đáy Trên môi trường đặc có ba dạng khuẩn lạc:

Dạng S: Khuẩn lạc tròn, bờ đều, nhẵn bóng

Dạng R: Mặt khuẩn lạc khô, xù xì Thường gặp khi nuôi cấy giữ chủng

Dạng M: Hình thức này thường gặp ở những vi khuẩn có khả năng hình thành

vỏ Khuẩn lạc nhầy, kích thước lớn hơn khuẩn lạc dạng S và các khuẩn lạc có xu hướng hòa vào nhau

1.4.4 Đặc điểm sinh hóa

Những đặc tính sau đây thường được xác định khi nghiên cứu vi khuẩn đường ruột:

Di động hoặc không di động

Lên men hoặc không lên men một số loại đường Hai loại đường thường được xác định nhất là glucose và lactose

Sinh hơi hay không sinh hơi khi lên men đường

Có hay không có một số enzyme Hai enzyme thường được xác định nhất là urease và tryptophanase

Khả năng sinh ra sunfua hydro (H2S) khi dị hóa protein, acid amin hoặc các dẫn chất có lưu huỳnh

Phát triển được hay không phát triển được trên một số môi trường tổng hợp Ví dụ: khả năng sử dụng citrat như nguồn cacbon duy nhất có trong môi trường Simmons

1.4.5 Sức đề kháng

Vì không có khả năng hình thành bào tử nên các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột không có sức đề kháng cao với những điều kiện hóa lý đặc biệt của môi trường Chúng dễ dàng bị tiêu diệt ở nhiệt độ sôi 100OC và bởi các hóa chất sát khuẩn kháng nguyên K, hiện tượng ngưng kết O có thể bị cho lấp bởi kháng nguyên này Kháng nguyên O có tính đặc hiệu cao, nó thường được dùng để phân loại vi khuẩn Dựa thông thường Tuy nhiên nhiều loài vi khuẩn đường ruột có khả năng sống nhiều

ngày đến nhiều tuần, thậm chí một vài tháng ngoài môi trường Đây là điều kiện thuận lợi để các vi khuẩn gây bệnh lan truyền

1.4.6 Độc tố

Hầu hết các vi khuẩn đường ruột đều có độc tố bản chất hóa học của nội độc

tố là lipoposaccharid (LPS) của vách tế bào Nội độc tố chỉ được giải phóng khi tế bào

bị ly giải Nội độc tố có khối lượng phân tử từ 100 đến 500 KDa Nội độc tố có tính rất độc chỉ cần 0,005 mg nội độc tố đủ giết chết chuột nhắt sau 24 giờ Nội độc tố có thể gây ra tình trạng sốc, nếu không được điều trị kịp thời có thể dẫn đến đến tử vong Nội độc tố không bị mất tính độc ở 100OC trong 30 phút Nội độc tố là chất có khả năng gây sốc

Một số thành viên của họ vi khuẩn đường ruột có khả năng sinh ngoại độc tố

như Shigella, E.Coli loại enterotoxigenic e.coli (ETEC ) Ngoại độc tố của Shigella làm

cho bệnh lỵ nặng hơn rất nhiều, ngoại độc tố LT (Labile Toxin) của ETEC là yếu tố quyết định độc lực của vi khuẩn này

1.4.7 Cấu trúc kháng nguyên

Họ vi khuẩn đường ruột có ba nhóm kháng nguyên cơ bản: kháng nguyên O, kháng nguyên H và kháng nguyên K

Kháng nguyên O: Là kháng nguyên than của vi khuẩn Đây là thành phần

kháng nguyên của vách tế bào Là một phức hợp protein, poliozid và lipid, trong dó protein làm cho phức hợp có tính kháng nguyên, poliozid quyết định tính đặc hiệu kháng nguyên còn lipid quyết định tính độc Không bị phá hủy ở 100OC trong hai giờ hoặc trong cồn 50% nhưng bị mất tính kháng nguyên khi bị xử lý bằng formol 0,5% Ở những vi khuẩn không có vỏ hoặc màng bọc (không có kháng nguyên K) thì kháng nguyên O nằm ở lớp ngoài cùng Khi kháng nguyên O gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy

ra phản ứng ngưng kết, gọi là “hiện tượng ngưng kết O” với các hạt ngưng kết nhỏ, lắc

khó tan Ở những vi khuẩn có vào kháng nguyên O người ta có thể chia một vài loài vi khuẩn thành type huyết thanh

Kháng nguyên H: là kháng nguyên lông của tế bào vi khuẩn, chỉ có ở những vi

khuẩn có lông Có bản chất là protein, dễ bị phá hủy ở 100OC hoặc trong cồn 50% nhưng không bị phân hủy trong formol 0,5% Kháng nguyên H khi gặp kháng thể

tương ưngsẽ xảy ra “hiện tượng ngưng kết H” với các hạt to hơn trong hiện tượng

ngưng kết O và rất dễ tan khi lắc Những vi khuẩn có khả năng di động khi tiếp xúc với kháng thể H tương ứng sẽ trở thành không di động Kháng nguyên O và kháng nguyên

H có thể được sản xuất riêng để phát hiện riêng biệt các kháng thể tương ứng Để có kháng nguyên O, người ta cho vi khuẩn này vào cồn 50%, kháng nguyên H sẽ bị phá hủy, kháng nguyên O vẫn tồn tại Để có kháng nguyên H người ta cho vi khuẩn bào formol 0,5% thì kháng nguyên O bị phá hủy, kháng nguyên H vẫn còn nguyên vẹn

Kháng nguyên K: là kháng nguyên vỏ hoặc bề mặt, kháng nguyên K nằm bên

ngoài kháng nguyên thân Nó có thể dưới dạng một lớp vỏ dày, quan sát được bằng

kính hiển vi quang học thông thường (như ở Klebsiella) hoặc dưới dạng một lớp rất mỏng chỉ có thể quan sát bằng kính hiển vi điện tử (như ở S.Typhii) Kháng nguyên K

nếu chi phủ hoàn toàn kháng nguyên O sẽ ngăn cách không cho kháng thể O gắn với kháng nguyên O làm cho phản ứng ngưng kết không xảy ra Trong trường hợp này cần phải phá hủy kháng nguyên K hoặc vi khuẩn phải được nuối cấy trong điều kiện không sinh ra được kháng nguyên này

1.4.8 Khả năng gây bệnh

Nói về khả năng gây bệnh của họ vi khuẩn đường ruột, trước hết phải đề cập đến các nhiễm khuẩn đường tiêu hóa Họ vi khuẩn đường ruột đứng đầu trong các căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy Cơ chế gây bệnh, vị trí gây tổn thương ở bộ máy tiêu hóa rất khác nhau tùy theo từng giống, từng loài

Ngoài đường tiêu hóa, các vi khuẩn đường ruột còn có khả năng gây bệnh ở nhiều cơ quan khác như tiết niệu, thần kinh, hô hấp…Các thành viên của họ này đứng đầu trong các vi khuẩn gây viêm đường tiết niệu, bỏ xa các vi khuẩn khác Chúng cũng

đứng đầu trong các vi khuẩn gây nhiễm trùng máu Có thể nói khái quát ở bất kỳ bệnh phẩm nào cũng có thể gặp thành viên của họ vi khuẩn đường ruột

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Địa điểm

Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Vi sinh thuộc Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

2.1.2 Thời gian

Từ tháng 03/2017 đến tháng 07/2017

2.2 Vật liệu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Hoa Sứ trắng (Plumeria rubra L var acutifolia (Poir.) Bailey)

2.2.2 Địa điểm thu mẫu

Mẫu được thu tại nghĩa trang phường 8, quận Gò Vấp

2.2.3 Vật liệu nghiên cứu

Các chủng vi sinh vật sử dụng trong quá trình nghiên cứu được cung cấp bởi ThS Phạm Minh Nhựt giảng viên trường Đại học Công Nghệ TP Hồ Chí Minh bao gồm các chủng:

Nhóm vi khuẩn Escherichia Coli gồm: E coli, ETEC, E coli 0208, E Coli O157:H7

Nhóm vi khuẩn Salmonella spp gồm: S enteritidis, S typhii, S typhimurium, S

dublin

Nhóm vi khuẩn Shigella spp gồm: S sonnei, S boydii, S flexneri

Nhóm vi khuẩn Vibrio spp gồm: V parahaemolyticus, V alginolyticus, V

harveyi, V.cholerae

Nhóm vi khuẩn Listeria spp gồm: L monocytogenes, L innocua

Các vi khuẩn gây bệnh khác bao gồm: E feacalis, S aureus,P aeruginosa

Tủ hấp autoclave Máy lắc

Eppendoff Que trang Dao cấy Ống trụ kim loại rỗng (d = 6 mm) Đèn cồn

Bông không thấm Bông thấm

Parafilm

2.2.5 Hóa chất, dung môi

Môi trường nuôi cấy và tăng sinh

Môi trường TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Độ)

Môi trường TSA (Trypton Soya Agar) (HiMedia - Ấn Độ)

Dung môi: ethanol 96%, ethanol 70%, ethanol 50%, Dimethylsulfoxid (DMSO), nước cất (Việt Nam)

Hóa chất

Ciprofloxacin 500 mg (Thái Lan)

H2SO4 đậm đặc, H2SO4 loãng, HCl đậm đặc, chloroform, NaCl

Na nitro prusside, pyridine, ninhydrin, ammonia, gelatin 1%, glycerol

Acid acetic glacial, acetic anhydride, benzene, bột Magnesium

NaOH 10%, Ferric chloride (FeCl3) 10%, lead acetate (Pb(C2H3O2) 10% Thuốc thử: Molisch, Fehling A, Fehling B, Barfoed, Mayer, Dragendorff,

Hager, Wagner

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp xử lý nguyên liệu

Tiến hành thu những mẫu Hoa Sứ trắng nở hoàn toàn, không héo Sau đó, rửa sạch, để ráo rồi sấy khô đến trọng lượng không đổi và xay mẫu Mẫu sau khi được xay thành bột được bảo quản trong các túi nhựa ở nhiệt độ 4oC để tiến hành tách chiết cao

2.3.2 Phương pháp tách chiết cao từ thực vật

Tách chiết là dùng dung môi thích hợp có khả năng hòa tan các hợp chất trong cây bằng phương pháp chiết ngâm và lắc để phá vỡ mẫu ở nhiệt độ thường Sau đó thu nhận cao chiết bằng cách cho bay hơi, loại bỏ lượng dung môi của dịch chiết bằng các thiết bị cô thích hợp

Nguyên tắc: Sử dụng các loại dung môi theo thể tích nhất định để tách chiết

các hợp chất có trong cây nhờ lực liên kết hóa học từ đó ta có thể lôi kéo các chất cần thiết ra khỏi mẫu cây.

Cách tiến hành: Mẫu hoa Sứ được ngâm trong dung môi theo tỷ lệ 1:20 để ở

nhiệt độ phòng Mẫu được lắc ở 150 vòng/phút trong khoảng 18 – 24 giờ Sau đó đem

đi lọc để thu dịch chiết Tiếp tục lặp lại 3 lần cho đến khi dịch lọc trong suốt Tiến hành

cô cách thủy ở 70oC để loại bỏ dung môi và thu cao Cao chiết thu được sẽ được bảo quản ở - 4oC để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo

2.3.3 Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật

2.3.3.1 Phương pháp cấy chuyển vi sinh vật

Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật

được cấy trên môi trường thạch nghiêng và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển Sau đó các chủng này được chuyển vào tủ mát (3 – 5oC) để bảo quản Quá trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết Tùy từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyển khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyển một lần

Cách tiến hành: Giống vi sinh vật thuần khiết, được bảo quản trong ống thạch

nghiêng và giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC Sau 1 - 3 tháng phải cấy truyền vi sinh vật qua ống thạch nghiêng mới bằng cách dùng que cấy vòng lấy sinh khối vi sinh vật trong ống thạch nghiêng cũ ria vào ống thạch nghiêng mới, sau đó đem ống thạch nghiêng mới đi ủ, tùy từng loại vi sinh vật mà quyết định nhiệt độ ủ, nhiệt độ ủ dao động từ 48 – 72 giờ Ống thạch nghiêng chứa vi sinh vật sau khi ủ xong được bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007)

2.3.3.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu

Nguyên tắc: Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, có

thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào

Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol

Cách tiến hành: Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích

hợp rồi hút 1ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu cặn có chứa sinh khối vi khuẩn Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -15oC (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007)

2.3.4 Phương pháp tăng sinh vi sinh vật

Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh

dưỡng thích hợp Môi trường dinh dưỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hoá lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trường

Cách tiến hành: Môi trường TSB được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút ở

1 atm Tiến hành hút 100µl dịch vi khuẩn khảo sát vào 20ml môi trường TSB trong đều kiện vô trùng Sau đó tiến hành lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng Sinh khối vi khuẩn tăng lên sẽ làm đục môi trường

Mật độ tế bào vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang OD

ở bước sóng 600nm

Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (công thức McFahrland):

Mật độ = OD600nmx 1,02 x 109(cfu/ml)

2.3.5 Phương pháp pha loãng mẫu

Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng có

vai trò rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lượng cũng như phân tích vi sinh vật Phương pháp pha loãng mẫu chỉ được sử dụng trong trường hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu

Cách tiến hành: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9

ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1 Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2 Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi được nồng độ cần thiết (Phạm Minh Nhựt, 2013)

2.3.6 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết

Nguyên tắc: Các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết sẽ khuếch tán vào

trong môi trường thạch và tác động lên các vi sinh vật chỉ thị Nếu cao chiết có khả năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch

Từ đó, xác định được hoạt tính kháng khuẩn của cao thuốc bằng đường kính vòng

ức chế (mm)

Cách thực hiện: Hút 100 µl dịch vi khuẩn đã được hoạt hóa ở mật độ 10-6 vào đĩa chứa môi trường TSA và tiến hành trang đều vi khuẩn lên đĩa cho đến khi khô hoàn toàn Sau đó đục lỗ thạch để tạo giếng với đường kính 6 mm

Chuẩn bị dịch cao chiết bằng cách hòa tan lượng cao chiết trong Dimethyl Sulfoxide (DMSO)1% theo nồng độ khảo sát Bổ sung 100 µl dịch cao chiết vào các giếng thạch trên đĩa petri và giữ các đĩa ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ để dịch cao được khuyếch tán đều vào môi trường thạch và dùng paraflim quấn xung quanh đĩa Sau đó,

ủ các đĩa vào tủ ấm 37oC trong 24 giờ và tiến hành đọc kết bằng cách đo giá trị đường kính vòng ức chế (mm) trên đĩa thạch (Ramakrishnan, 2011)

2.3.7 Phương pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết

Nguyên tắc: Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết từ

cây Sứ trắng bằng các phản ứng với thuốc thử đặc trưng dựa trên tính chất hóa học của

chúng theo các phương pháp thông dụng trong phòng thí nghiệm đã được chuẩn hoá để

sơ bộ hóa thành phần hoạt chất

Cách tiến hành: Cao chiết được đem ngâm trong dung môi thích hợp, tiến

hành lọc và thu dịch lọc Sau đó dùng dịch cao chiết này tiến hành định tính các thành phần hóa học với các loại hóa chất, thuốc thử đặc trưng

2.3.7.1 Định tính carbohydrate

Thử nghiệm Molisch: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho

5 - 6 giọt thuốc thử Molisch vào, tiếp tục nhỏ từ từ 2 ml dung dịch H2SO4đậm đặc vào

và đọc kết quả Kết quả được xem là dương tính khi có hình thành phức hợp màu đỏ - tím

Thử nghiệm Fehling: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, cho lần lượt

1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B vào Đun cách thủy 5 phút và đọc kết quả Kết quả dương tính khi có xuất hiện tủa màu đỏ của Cu2O

Thử nghiệm Barfoed: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Barfoed Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, sau đó làm lạnh ngay và đọc

kết quả Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu đỏ gạch

2.3.7.2 Định tính alkaloid

Thử nghiệm Mayer: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer và đọc kết quả Kết quả dương tính là khi quan sát được kết tủa màu trắng đục tạo thành

Thử nghiệm Dragendorff: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff và đọc kết quả Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu vàng cam

Thử nghiệm Hager: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml thuốc thử Hager và đọc kết quả Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu vàng

Thử nghiệm Wagner: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và bổ sung

2 ml thuốc thử Wagner vào và đọc kết quả Kết quả dương tính là khi hình thành kết

tủa màu nâu đỏ

2.3.7.3 Định tính saponin

Thử nghiệm tạo bọt: Hút 5 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó lắc

mạnh và đọc kết quả Kết quả dương tính khi ống nghiệm có xuất hiện bọt và ổn định

2.3.7.4 Định tính cardiac glycoside

Thử nghiệm Legal: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml pyridine và 1 ml Na nitro prusside, sau đó bổ sung 5 - 6 giọt NaOH 10% vào và đọc kết quả Kết quả dương tính khi xuất hiện màu đỏ đậm