2. TỔNG QUAN
2.5.1. Quá trình thủy phân (Hydrolysis)
Để phân tích amino acid trong mẫu protein, mẫu phải đƣợc thủy phân tạo thành những amino acid đơn.
Thủy phân bằng acid là phƣơng pháp thông thƣờng nhất để thủy phân protein trƣớc khi tiến hành pnân tích amino acid. Phƣơng pháp thủy phân bằng acid có thể tạo
ra sự phân cắt khác nhau đối với một vài amino acid- phá hủy hoàn toàn hoặc một phần. Một số khó khăn khi thủy phân bằng acid.
- Trytophan bị phá hủy hoàn toàn
- Serine và threonine bị phá hủy một phần
- Methionine có thể bị oxy hóa
- Cysteine thƣờng đƣợc phát hiện nhƣ là cystine (nhƣng cystine thƣờng đƣợc phát hiện rất kém bởi vì chúng bị phân hủy một phần).
- Asparagine và glutamine tƣơng ứng bị chuyển thành acid aspartic và acid glutamic.
Nhƣ vậy, nếu kỹ thuật thủy phân không tốt có thể gây ra nhiều kết quả không chính xác. Một số phƣơng pháp thủy phân thƣờng đƣợc sử dụng trong HPLC.
Phƣơng pháp 1: Dùng HCl 6N và phenol (từ 0.1- 1 %)
Phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng nhất là dùng HCl có chứa phenol. Thêm phenol vào để ngăn cản phản ứng halogen hóa tyrosine.Dung dịch thủy phân: HCl 6N chứa từ 0,1 đến 1 % phenol.
Phƣơng pháp tiến hành:
- Cho mẫu vào tube thủy phân và làm khô (mẫu đƣợc làm khô để nƣớc không pha loãng acid).
- Thêm dung dịch thủy phân vào mẫu với tỷ lệ nhất định.
- Làm lạnh tube chứa mẫu.
- Mẫu thƣờng đƣợc thủy phân ở 110oC, trong 24h trong chân không hoặc trong khí trơ để ngăn cản quá trình oxy hóa. Thời gian thủy phân có thể thay đổi tùy theo mục đích phân tích.
- Sau khi thủy phân làm khô mẫu trong chân không để loại bỏ acid thừa. Phƣơng pháp 2: Dùng Mercaptoathanesulfonic (MESA) 2.5M.
- Mẫu đƣợc làm khô trong một tube trƣớc khi thủy phân.
- Tube chứa mẫu này cho vào một tube lớn hơn đã chứa dung dịch thủy phân.
- Tube thủy phân này đƣợc tiến hành trong chân không để làm bay hơi dung dịch thủy phân. Tube thủy phân đƣợc gia nhiệt từ 170oC đến 185o
C khoảng 12 phút.
- Sau khi thủy phân tube đƣợc làm khô trong chân không để loại bỏ acid dung dịch thừa [17].