luận văn
Bộ giáo dục và đào tạo trờng đại học nông nghiệp i --------------------------- Vũ thị thu Hằng Nghiên cứu tẩy sạch virus bằng kỹ thuật nuôi cấy meristem nhằm phục tráng giống khoai tây KT 2 Luận văn thạc sĩ nông nghiệp Chuyên ngành : trồng trọt Mã số : 60.62.01 Ngời hớng dẫn khoa học: GS.TS. Nguyễn Quang Thạch Hà nội - 2005 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và cha từng đợc ai công bố trong bất cứ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đợc cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã đợc chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Vũ Thị Thu Hằng i Lời cảm ơn Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp ngoài sự cố gắng của bản thân tôi đã nhận đợc rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và ngời thân. Trớc tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô giáo trong khoa Nông học những ngời đã trực tiếp giảng dạy trang bị những kiến thức bổ ích trong suốt thời gian học đại học cũng nh học cao học của mình. Tôi xin đợc gửi lời chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ sinh học và phơng pháp thí nghiệm đã chân thành đóng góp ý kiến giúp cho luận văn của tôi đợc hoàn thiện hơn. Đặc biệt tôi xin đợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo GS. TS. Nguyễn Quang Thạch ngời thầy đã tận tình hớng dẫn giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận văn này. Tôi cũng xin đợc chân thành cảm ơn tập thể cán bộ công nhân viên phòng Công Nghệ Sinh Học - Viện Sinh học Nông nghiệp - Trờng Đại học Nông nghiệp I đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập. Bên cạnh đó tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả ngời thân, bạn bè những ngời luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài. Hà Nội, ngày 10 tháng 9 năm 2005 Học viên Vũ Thị Thu Hằng ii Mục lục Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt v Danh mục các bảng vi Danh mục các hình 1. Mở đầu 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích của đề tài 3 1.3. Yêu cầu của đề tài 3 2. Tổng quan tài liệu 4 2.1. Giới thiệu chung về cây khoai tây 4 2.2. Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và Việt Nam 5 2.3. Vài nét về giống khoai tây KT 2 11 2.4. Hiện tợng thoái hoá giống khoai tây do virus 12 2.5. Cơ sở khoa học và quy trình làm sạch virus 15 2.6. Một số nghiên cứu về làm sạch virus ở khoai tây 19 3. Đối tợng, địa điểm, nội dung và phơng pháp nghiên cứu 26 3.1. Đối tợng 26 3.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu 26 3.3. Nội dung nghiên cứu 26 3.4. Phơng pháp nghiên cứu 29 3.5. Xử lý số liệu 33 4. Kết quả và thảo luận 34 4.1. Điều tra ngoài sản xuất 34 iii 4.1.1. Thí nghiệm 1: Điều tra thực tế và đánh giá tình hình sản xuất giống khoai tây KT 2 tại Bắc Ninh 34 4.1.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá độ nhiễm bệnh virus bằng phơng pháp test ELISA 37 4.2. Thí nghiệm làm sạch virus 38 4.2.1. Thí nghiệm 3: ảnh hởng của GA 3 đến khả năng bật chồi khoai tây KT 2 từ meristem 38 4.2.2. Thí nghiệm 4: ảnh hởng của liều lợng Agar đến khả năng bật chồi cây từ Meristem 41 4.2.3. Thí nghiệm 5: ảnh hởng của kích thớc Meristem đến khả năng bật chồi cây khoai tây và độ làm sạch virus 44 4.2.4. Thí nghiệm 6: ảnh hởng của nhiệt độ đến khả năng bật chồi và làm sạch virus của cây từ Meristem 48 4.3. Đánh giá sự sinh trởng của cây sạch virus trong invitro và ngoài sản xuất 57 4.3.1 Thí nghiệm 7: Đánh giá sự sinh trởng, phát triển của cây khoai tây KT 2 trong invitro 57 4.3.2. Thí nghiệm 8: Đánh giá sự hình thành năng suất khoai tây KT sạch bệnh trong invitro 2 59 4.3.3. Thí nghiệm 9: Trồng thử nghiệm ngoài sản xuất. 61 5. Kết luận và đề nghị 67 5.1 Kết luận 67 5.2 Đề nghị 68 Tài liệu tham khảo 69 Phụ lục 74 iv Danh môc c¸c ch÷ viÕt t¾t KHKT Khoa häc kü thuËt CS Céng sù §BSH §ång b»ng s«ng Hång CT C«ng thøc §KTB §−êng kÝnh trung b×nh PV Potato virus TTC T×nh tr¹ng chåi §C §èi chøng v Danh mục các bảng Bảng 2.1: Năng suất năng lợng và năng suất Pr/ha/ngày của một số cây trồng 5 Bảng 2.2. Diện tích, năng suất, sản lợng khoai tây Việt Nam từ năm 1979-2002 9 Bảng 4.1: Diện tích và năng suất khoai tây KT 2 trong các giai đoạn tại Quế Võ- Bắc Ninh 35 Bảng 4.2: Điều tra tình hình nhiễm bệnh virus của khoai tây KT 2 theo quan sát triệu chứng 36 Bảng 4.3: Kết quả kiểm tra virus trên giống KT 2 bằng phơng pháp Test ELISA 37 Bảng 4.4: ảnh hởng của GA 3 đến khả năng bật chồi của khoai tây KT 2 39 Bảng 4.5: ảnh hởng của agar đến khả năng bật chồi của cây khoai tây KT 2 42 Bảng 4.6. ảnh hởng của kích thớc Meristem đến tỷ lệ bật chồi khoai tây KT 2 45 Bảng 4.7: ảnh hởng của kích thớc meristem đến khả năng làm sạch virus của khoai tây KT 2 47 Bảng 4.8: ảnh hởng của xử lý nhiệt đến khả năng bật chồi cây từ meristem (với kích thớc meristem 0,6mm) 48 Bảng 4.9: Kết quả làm sạch virus kết hợp gia tách meristem và xử lý nhiệt độ ở kích thớc 0,6mm 50 Bảng 4.10: ảnh hởng của xử lý nhiệt đến khả năng bật chồi cây từ meristem (với kích thớc meristem 0,5mm) 51 Bảng 4.11: Kết quả làm sạch virus kết hợp gia tách meristem và xử lý nhiệt độ (ở kích thớc meristem 0,5mm) 53 vi Bảng 4.12: ảnh hởng của xử lý nhiệt đến khả năng bật chồi cây từ meristem (với kích thớc meristem 0,4mm) 54 Bảng 4.13: Kết quả làm sạch virus kết hợp gia tách meristem và xử lý nhiệt độ ở kích thớc 0,4mm 56 Bảng 4.14: Sinh trởng của cây khoai tây KT 2 in vitro sau khi test virus 57 Bảng 4.15: Tạo củ của cây khoai tây KT 2 in vitro sau khi test virus 59 Bảng 4.16: Sinh trởng của khoai tây sạch virus (sau 1 tháng trồng thử nghiệm) 61 vii Danh mục các hình Đồ thị 4.1: ảnh hởng của nồng độ GA 3 đến khả năng bật chồi của cây từ meristem 40 Đồ thị 4.2: ảnh hởng của lợng agar đến khả năng bật chồi của meristem khoai tây KT 2 43 Đồ thị 4.3: ảnh hởng của kích thớc meristem đến khả năng bật chồi của khoai tây KT 2 46 Đồ thị 4.4: ảnh hởng của xử lý nhiệt đến khả năng bật chồi của khoai tây KT 2 ở kích thớc meristem 0,6mm 49 Đồ thị 4.5: ảnh hởng của xử lý nhiệt đến khả năng bật chồi của khoai tây KT 2 ở kích thớc meristem 0,5mm 52 Đồ thị 4.6: ảnh hởng của xử lý nhiệt đến khả năng bật chồi của khoai tây KT 2 ở kích thớc meristem 0,4mm 55 viii Danh mục các hình ảnh 1: Triệu chứng của bệnh virus trên lá khoai tây 36 ảnh 2: ảnh hởng của nồng độ GA 3 đến khả năng bật chồi của cây từ meristem khoai tây KT 2 40 ảnh 3: ảnh hởng của lợng agar đến khả năng bật chồi của meristem khoai tây KT 2 43 ảnh 4: ảnh hởng của kích thớc đến khả năng bật chồi của meristem khoai tây KT 2 46 ảnh 5: ảnh hởng của xử lý nhiệt đến khả năng bật chồi của meristem khoai tây KT 2 ở kích thớc 0,5mm 52 ảnh 6: Sinh trởng của cây khoai tây bị nhiễm virus X+Y, nhiễm virus X, sạch virus X+Y (sau 15 ngày nuôi cấy) 58 ảnh 7. Cây sạch virus X+Y, Cây nhiễm virus X, Cây nhiễm virus X+Y 60 ảnh 8: Tia củ của khoai tây KT 2 bị virus X+Y và sạch virus X+Y ngoài sản xuất thử nghiệm 62 ix [...]... tráng giống khoai tây KT2 1.2 Mục đích của đề tài ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy meristem để tẩy sạch virus nhằm khắc phục hiện tợng thoái hoá giống ở khoai tây KT2 1.3 Yêu cầu của đề tài - Điều tra tình hình thoái hóa do virus trên giống KT2 ngoài sản xuất - Xác định đợc phơng pháp tẩy sạch virus bằng kỹ thuật nuôi cấy meristem (kỹ thuật tách meristem, kích thớc nuôi cấy, môi trờng nuôi cấy, thời gian... việc nghiên cứu chi tiết và đa ra quy trình tẩy sạch virus cho khoai tây một cách chính xác cụ thể hầu nh cha có công bố Liệu chúng ta có thể phục tráng lại giống bằng cách tẩy sạch virus cho củ giống để cung cấp giống sạch bệnh cho sản xuất đợc không? Xuất phát từ yêu cầu bức bách đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu tẩy sạch virus bằng kỹ thuật nuôi cấy meristem nhằm phục tráng giống. .. nghiên cứu - Thời gian nghiên cứu: từ tháng 2 năm 2004 đến tháng 8 năm 2005 - Địa điểm: đề tài đợc thực hiện tại Viện Sinh học Nông nghiệp - Trờng Đại học Nông nghiệp I Hà Nội 3.3 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu tẩy sạch virus bằng kỹ thuật nuôi cấy meristem nhằm phục tráng giống khoai tây KT2 Phần I: Điều tra ngoài sản xuất Thí nghiệm 1: Điều tra thực tế và đánh giá tình hình sản xuất giống khoai tây. .. dân tự để từ vụ này sang vụ khác nên giống KT2 bị thoái hoá rất nặng Hiện nay, 100% giống khoai tây KT2 đang trồng ngoài sản xuất bị thoái hoá do virus Ngời sản xuất tha thiết muốn có nguồn giống khoai tây KT2 với những đặc tính u việt ban đầu của nó Việc tẩy sạch virus cho nhiều cây trồng trong đó có khoai tây bằng kỹ thuật nuôi cấy meristem đã đợc nhiều nghiên cứu trên thế giới 2 thừa nhận Morel G... để tạo cây sạch virus là nuôi cấy đỉnh sinh trởng kết hợp với việc xử lý nhiệt, sau đó thông qua phơng pháp nhân nhanh in vitro để tạo ra số lợng cây lớn 2.5.2 Quy trình làm sạch virus ở khoai tây Để sản xuất giống khoai tây sạch bệnh, trớc hết phải có nguồn giống sạch bệnh ban đầu hoặc từ nguồn giống đợc làm sạch bệnh bằng nuôi cấy meristem, hoặc từ nguồn giống đợc chuẩn đoán sạch bệnh bằng các phơng... nhiễm ít virus để tiến hành nuôi cấy meristem tạo cây sạch virus 2.6.2 ảnh hởng của kích thớc meristem nuôi cấy đến kết quả làm sạch virus: Kích thớc meristem nuôi cấy có ảnh hởng rõ rệt đến kết quả tẩy sạch virus Morel G., Martin C (1952)[39]; Meyer K (1986)[38]; khi tách meristem có kích thớc 0,1 - 0,2 mm có thể loại trừ virus X, A, Y Ngoài việc quyết định tới mức độ làm sạch virus, kích thớc meristem. .. hiện đại Nuôi cấy meristem là một trong những bớc tiến hành đầu tiên trong hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh ở tất cả các nớc trồng khoai tây trên thế giới Năm 1980 Walley đề xuất quy trình làm sạch virus khoai tây (Nguyễn Thị Kim Thanh, 1998)[19] cụ thể nh sau: 17 Quy trình làm sạch virus khoai tây: Cây bị nhiễm bệnh - Xác định virus - Xử lý nhiệt độ cao Nuôi cấy mô phân sinh i h Cấy trong... (1957)[48] đã nghiên cứu tổ hợp 2 phơng pháp nuôi cấy meristem kết hợp với xử lý nhiệt độ để loại trừ virus A, X, Y trên cây khoai tây ứng dụng kỹ thuật này Mc Donall (1973) đã thu đợc cây khoai tây sạch virus X, S.; Tawantziz S M.; Southord S G (1983) cũng thu đợc kết quả tơng tự (Mai Thị Tân, 1998)[12] 21 Smith và Mellor (1967)[46] cũng thành công trong việc tẩy sạch virus X và S khi nuôi cấy Meristem. .. bố virus trong cây bị bệnh đã đa đến một kỹ thuật mới, kỹ thuật nuôi cấy meristem để tạo ra các cây sạch virus Nhiều tác giả đã phát hiện thấy có sự sai khác lớn về vùng sạch virus ở đỉnh sinh trởng phụ thuộc vào các loại virus Vì thế, cần có các phơng pháp tách Meristem khác nhau khi tẩy virus (Ten Houten et all, 1968)[47] Kỹ thật nuôi cấy mô đỉnh sinh trởng - meristem đã đợc các tác giả Buvat (1952),... hợp để nuôi cấy Sau 16 đó năm 1964 Morel và Muller đã hoàn thiện môi trờng nuôi cấy từng đoạn mầm khoai tây (Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội)[1] Từ cơ sở lý luận nêu trên nhiều tác giả đã ứng dụng thành công phơng pháp nuôi cấy meristem và trong môi trờng thích hợp đã tái sinh đợc cây khoai tây sạch virus Tuy nhiên, việc nuôi cấy và tái sinh cây từ meristem với kích thớc nhỏ nên đòi hỏi kỹ thuật . nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu tẩy sạch virus bằng kỹ thuật nuôi cấy meristem nhằm phục tráng giống khoai tây KT 2 1.2. Mục đích của đề tài ứng dụng kỹ thuật. --------------------------- Vũ thị thu Hằng Nghiên cứu tẩy sạch virus bằng kỹ thuật nuôi cấy meristem nhằm phục tráng giống khoai tây KT 2 Luận văn thạc sĩ nông nghiệp Chuyên