Nuôi cấy mô gấc
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
TRƯƠNG THỊ KIM CHUNG
HIỆU QUẢ CỦA BENZYL ADENINE,
NAPHTHALENEACETIC ACID, INDOLE-3-BUTYRIC ACID VÀ THAN HOẠT TÍNH TRÊN SỰ NHÂN CHỒI VÀ TẠO RỄ
CÂY GẤC (Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng.)
IN VITRO
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ TRỒNG TRỌT
Cần Thơ-02/2007
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
TRƯƠNG THỊ KIM CHUNG
HIỆU QUẢ CỦA BENZYL ADENINE,
NAPHTHALENEACETIC ACID, INDOLE-3-BUTYRIC ACID VÀ THAN HOẠT TÍNH TRÊN SỰ NHÂN CHỒI VÀ TẠO RỄ
CÂY GẤC (Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng.)
IN VITRO
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ TRỒNG TRỌT
Cần Thơ-02/2007
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS LÊ VĂN HOÀ ThS NGUYỄN QUỐC HỘI CN NGUYỄN VĂN ÂY
Trang 3LỜI CẢM TẠ
Kính dâng
Cha mẹ suốt đời tận tuỵ vì tương lai của con
Chân thành biết ơn:
Thầy Lê Văn Hoà đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành tốt bài luận văn này
Thầy Nguyễn Quốc Hội đã thường xuyên góp ý, tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt đề tài này
Quí thầy cô đã tận tâm dìu dắt tôi trong suốt quá trình tôi theo học tại trường
Anh Nguyễn Văn Ây đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài này
Các thầy cô cùng các anh chị, các bạn trong Bộ Môn Sinh Lý- Sinh Hoá đã giúp đỡ tôi thực hiện tốt luận văn
Các bạn sinh viên lớp Trồng Trọt K28 đã giúp đỡ tôi, động viên tôi trong những năm tháng trên giảng đường Đại Học
Thân ái gởi về:
Các bạn sinh viên khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, lời chúc thành công và sức khoẻ
Cần Thơ, ngày….tháng 02 năm 2007
Trương Thị Kim Chung
Trang 4TIỂU SỬ CÁ NHÂN
Họ và tên: Trương Thị Kim chung Sinh ngày: 09/04/1981
Nơi sinh: Thới Hoà-Trà Ôn-Vĩnh Long
Con ông Trương Văn Que và bà Nguyễn Thị Phiến
Năm 2001 tốt nghiệp trường Trung Học Phổ Thông Hựu Thành - Trà Ôn - Vĩnh Long
Năm 2002- 2007 sinh viên Lớp Trồng Trọt khoá 28, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ
Năm 2007 tốt nghiệp chuyên ngành Trồng Trọt, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ
Trang 5LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây
Tác giả luận văn Trương Thị Kim Chung
Trang 6TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN SINH LÝ-SINH HÓA
Chứng nhận luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Trồng Trọt với đề tài:
HIỆU QUẢ CỦA BENZYL ADENINE, NAPHTHALENEACETIC ACID, INDOLE-3-BUTYRIC ACID VÀ THAN HOẠT TÍNH
TRÊN SỰ NHÂN CHỒI VÀ TẠO RỄ CÂY GẤC (Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng.) IN VITRO
Do sinh viên TRƯƠNG THỊ KIM CHUNG thực hiện Kính trình lên hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp
TP Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2007 Cán bộ hướng dẫn
Lê Văn Hoà
Trang 7TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN SINH LÝ-SINH HÓA
Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp nhận luận văn đính kèm với đề tài: HIỆU QUẢ CỦA BENZYL ADENINE, NAPHTHALENEACETIC ACID, INDOLE-3-BUTYRIC ACID VÀ THAN HOẠT TÍNH
TRÊN SỰ NHÂN CHỒI VÀ TẠO RỄ CÂY GẤC (Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng.) IN VITRO
Do sinh viên: TRƯƠNG THỊ KIM CHUNG thực hiện và bảo vệ trước hội đồng
Luận văn tốt nghiệp đã được hội đồng đánh giá ở mức:
CHỦ NHIỆM KHOA CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
Trang 8MỤC LỤC
Trang phụ bìa Lời cảm tạ
Tiểu sử cá nhân i
Lời cam đoan ii
Chứng nhận luận văn tốt nghiệp iii
Chấp nhận luận văn của Hội Đồng iv
Chương I: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
1.1 NGUỒN GỐC, PHÂN LOẠI, ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ SINH THÁI 3
1.1.1 Nguồn gốc và phân loại 3
1.1.2 Đặc điểm hình thái 3
1.1.3 Đặc điểm sinh thái 4
1.2 PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG CỔ TRUYỀN 4
1.3 THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG, CÔNG DỤNG VÀ GIÁ TRỊ KINH TẾ 5
1.4.2 Quá trình vi nhân giống 8
1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy 12
Chương II: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 21
Trang 92.2.2.2 Thí nghiệm 2: Hiệu quả của Naphthaleneacetic acid (NAA) và than hoạt tính trên sự tạo rễ chồi gấc in vitro 23
2.2.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng thích ứng ban đầu của cây gấc khi chuyển từ ống nghiệm ra vườn ươm trên 3 nền giá thể khác nhau: tro trấu, xơ dừa, tro trấu + xơ dừa (1:1) 24
Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26
3.1 Thí nghiệm 1: Hiệu quả của BA và IBA đến sự sinh trưởng của chồi gấc in vitro 26
3.1.1 Chiều cao chồi gia tăng (cm) 26
3.1.2 Trọng lượng cụm chồi gia tăng (g) 28
Trang 103.2.1 Trọng lượng cụm chồi gia tăng (g) 37
3.2.2 Chiều cao gia tăng (cm) 39
QUI TRÌNH NHÂN GIỐNG GẤC IN VITRO 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO 57
PHỤ CHƯƠNG 59
Trang 11DANH SÁCH BẢNG STT
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Tựa bảng
Hiệu quả của BA và IBA lên sự gia tăng chiều cao cụm chồi của
mẫu chồi gấc in vitro theo thời gian (tuần sau khi cấy)
Hiệu quả của BA và IBA lên sự gia tăng trọng lượng cụm chồi của
mẫu chồi gấc in vitro theo thời gian (tuần sau khi cấy)
Hiệu quả của BA và IBA lên sự hình thành số lượng chồi lớn của
mẫu chồi gấc in vitro theo thời gian (tuần sau khi cấy)
Hiệu quả của BA và IBA lên sự hình thành số lượng chồi nhỏ của
mẫu chồi gấc in vitro theo thời gian (tuần sau khi cấy)
Hiệu quả của NAA và than hoạt tính trong sự gia tăng trọng lượng
cụm chồi gấc in vitro vào thời điểm 5 tuần sai khi cấy
Hiệu quả của NAA và than hoạt tính lên sự gia tăng chiều cao của
cụm chồi gấc in vitro vào thời điểm 5 tuần sau khi cấy
Hiệu quả của NAA và than hoạt tính lên sự gia tăng số lá của mẫu
chồi gấc in vitro vào thời điểm 5 tuần sau khi cấy
Hiệu quả của NAA và than hoạt tính lên sự hình thành số rễ của
mẫu chồi gấc in vitro vào thời điểm 5 tuần sau khi cấy
Hiệu quả của NAA và than hoạt tính lên chiều dài rễ của mẫu chồi
gấc in vitro vào thời điểm 5 tuần sau khi cấy
Hiệu quả của 3 loại giá thể và nylon lên tỷ lệ cây sống của cây
gấc in vitro sau 4 tuần giâm
Hiệu quả của 3 loại giá thể và nylon lên chiều cao cây gia tăng của
cây gấc in vitro sau 4 tuần giâm
Hiệu quả của 3 loại giá thể và nylon lên sự gia tăng số lá của cây
gấc in vitro sau 4 tuần giâm
Trang
27 29 31 32 38 40 42 44 45 50 51 52
Trang 12DANH SÁCH HÌNH STT
1 2 3 4 5 6 7
Sự sinh trưởng của chồi gấc in vitro ở các nghiệm thức có nồng độ
BA khác nhau vào thời điểm 6 TSKC
Sự sinh trưởng của chồi gấc in vitro ở các nghiệm thức có nồng độ
BA và IBA khác nhau vào thời điểm 6 TSKC
Hiệu quả của NAA và than hoạt tính lên sự tạo rễ của mẫu chồi
gấc in vitro vào thời điểm 5 tuần sau khi cấy
Hiệu quả của NAA lên sự tạo rễ của mẫu chồi gấc in vitro vào thời
điểm 5 tuần sau khi cấy
Sự sinh trưởng của gấc in vitro sau 4 tuần giâm
Trang
18 20 35 36 47 48 54
Trang 13Trương Thị Kim Chung, 2007 Hiệu quả của Benzyl Adenine, Naphthaleneacetic acid, Indole-3-butyric acid và than hoạt tính trên sự nhân chồi và tạo rễ cây gấc
(Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng.) in vitro Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư
Trồng Trọt, Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ Cán bộ hướng dẫn PGS.TS Lê Văn Hoà, ThS Nguyễn Quốc Hội và CN Nguyễn Văn Ây
TÓM LƯỢC
Đề tài “Hiệu quả của Benzyl Adenine, Naphthaleneacetic acid,
Indole-3-butyric acid và than hoạt tính trên sự nhân chồi và tạo rễ cây gấc (Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng.) in vitro” được thực hiện tại phòng nuôi cấy mô
thực vật thuộc Bộ môn Sinh Lý - Sinh Hoá, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng
Dụng, trường Đại học Cần Thơ, từ tháng 08/2006 đến tháng 02/2007 Các thí
nghiệm được tiến hành nhằm mục đích tìm ra môi trường có nồng độ chất điều hoà sinh trưởng thích hợp để nhân chồi và tạo rễ cây gấc Sử dụng môi trường cơ bản MS có bổ sung BA, IBA trong thí nghiệm tạo chồi; có bổ sung NAA và than hoạt
tính trong thí nghiệm tạo rễ in vitro và sử dụng ba loại giá thể xơ dừa, tro trấu, xơ
dừa + tro trấu (1:1) kết hợp với nylon giữ ẩm trong thí nghiệm thuần dưỡng cây gấc
ex vitro Kết quả ghi nhận cho thấy:
- Môi trường có 0,2 ppm BA + 0,02 ppm IBA cho số chồi nhiều nhất
- Môi trường có 0,2 ppm NAA + than hoạt tính 2 g/l thích hợp cho tạo rễ in vitro cây gấc
- Chất nền tro trấu kết hợp với nylon giữ ẩm tỏ ra thích hợp cho bước đầu
thuần dưỡng cây gấc in vitro
Trang 14ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, khi khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển, con người càng lạm dụng quá mức các chế phẩm hoá học độc hại Từ phẩm màu trong thức ăn, hàn the, formol, các chất bảo quản nông sản, thực phẩm, thuốc trừ sâu chưa phân huỷ hết trong rau quả, các sản phẩm hoá dược, hoá mỹ phẩm, đã gây nhiễm độc tiềm tàng và nhiều bệnh nguy hiểm Đặc biệt là hiện tượng rụng tóc, bệnh ung thư, sần da và rất nhiều chứng bệnh khác
Với phương châm “phòng bệnh hơn chữa bệnh” của ngành y tế, việc tìm về với thiên nhiên để nghiên cứu, khai thác và phát triển các loại thuốc bổ, các chế phẩm dùng trong thực phẩm nhằm tăng cường sức khoẻ cho cộng đồng, ngăn ngừa bệnh tật, đang là vấn đề cấp bách và ngày càng được đẩy mạnh trên thế giới cũng như ở Việt Nam
Việt Nam là một trong số ít quốc gia có đặc điểm địa lý và khí hậu đa dạng, có một hệ thống y học cổ truyền phát triển từ lâu đời với nhiều loại cây thuốc là nguồn
nguyên liệu chủ yếu Trong đó, gấc (Momordica cochinchinesis (Lour.) Spreng.) là
loại cây có giá trị dược liệu vô cùng quí giá, được ghi vào Dược điển Việt Nam (1983) và Dược điển Trung Quốc (1963), (1997) Theo y học cổ truyền, tất cả các bộ phận của gấc đều là vị thuốc Đặc biệt là hàm lượng ß-carotene (tiền chất vitamin A) rất cao Đây là nguồn vitamin A thiên nhiên vô cùng quí giá, có tác dụng phòng và chữa bệnh thiếu vitamin A là nguyên nhân gây khô giác mạc mắt, bệnh quáng gà, suy dinh dưỡng và chậm lớn ở trẻ em (Đỗ Tất Lợi, 2003)
Gấc được tìm thấy ở nhiều nơi trên thế giới như Philipin, Thái Lan, miền nam Trung Quốc, Miến Điện, Lào và Campuchia (Le Thuy Vuong, 2002) Ở Việt Nam gấc mọc hoang hay được trồng khắp nơi nhiều nhất là các vùng phía Bắc Gấc là loại dây leo dễ trồng, không tốn đất, chi phí đầu tư thấp Gấc có thể trồng bằng hạt hay giâm cành, nhưng hệ số nhân giống không cao (Đỗ Tất Lợi, 2003) Thêm vào đó gấc là loại cây đơn tính biệt chu (cây đực và cây cái riêng), nếu trồng bằng hạt thì sau một thời gian mới xác định được là cây đực hay cây cái mà cây đực thì không cho quả Điều này vừa mất công chăm sóc, vừa tốn thời gian và chi phí Vì
Trang 15vậy, phương pháp nhân giống cổ truyền không thể cung cấp đủ lượng cây giống cho qui mô sản xuất lớn, đáp ứng nhu cầu thị trường Để giải quyết các trở ngại trên thì
nhân giống bằng phương pháp in vitro đã và đang chứng tỏ là một phương pháp có
ý nghĩa quan trọng cho công tác giống cây trồng, mang lại hiệu quả kinh tế cao Đây là phương pháp giúp tạo ra một số lượng lớn giống cây trồng đồng nhất trong một thời gian ngắn, giúp duy trì được các tính trạng tốt từ thế hệ trước sang thế hệ sau, cải tiến các giống cây trồng và tạo cây sạch bệnh
Do vậy, đề tài nghiên cứu “Hiệu quả của Benzyl adenine, Naphthaleneacetic acid, Indole-3-butyric acid và than hoạt tính trên sự tạo chồi và rễ cây gấc (Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng.) in vitro” được tiến hành nhằm tìm
ra hàm lượng cytokinin và auxin thích hợp cho sự tạo chồi và rễ cây gấc in vitro
Trang 16CHƯƠNG I
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1 NGUỒN GỐC, PHÂN LOẠI, ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ SINH THÁI 1.1.1 Nguồn gốc và phân loại
Gấc có tên khoa học là Momordica cochinchinesis (Lour.) Spreng., thuộc bộ Vioales, họ Bầu bí (Cucurbitaceae), chi Momordica L, loài Cochinchinensis
Tên nước ngoài: Mộc Miết (Trung Quốc), Muricic (Pháp), Cochinchina Momordica (Anh) (Phạm Hoàng Hộ, 1999)
Gấc có khoảng 45 loài trên thế giới, tập trung chủ yếu ở vùng nhiệt đới Châu Phi, Châu Mỹ và Châu Á có 5-7 loài, trong đó Việt Nam có 4 loài (M Karaudren, 1975 và Nguyễn Hữu Tiến, 1994, trích dẫn bởi Phạm Hoàng Hộ, 1999)
1.1.2 Đặc điểm hình thái
Gấc là loại dây leo bám trên giàn, bờ tường hay các cây có tán lá rộng, phân bố ở độ cao 0-15 m Gấc sống lâu năm nhờ rễ củ, mỗi năm tàn một lần, nhưng lại đâm chồi từ gốc cũ vào mùa xuân năm sau (Đỗ Tất Lợi, 2003)
Mỗi gốc có nhiều cây, mỗi cây có nhiều đốt, mỗi đốt có lá Lá cây gấc mọc so le, có từ 3-5 thuỳ khía sâu tới ½ phiến lá, mặt trên lá màu xanh lục sẫm, mặt dưới lá có lông nhám, lúc đầu lá có lông ở mặt trên, sau đó nhẵn Gân lá có hình chân vịt Cuống lá dài từ 2-3 cm Tua cuốn to, đơn nằm giáp với gốc lá (Đỗ Tất Lợi, 2003)
Gấc là loại cây đơn tính biệt chu, hoa đực và hoa cái riêng Hoa đực mọc ở kẽ lá, lá bắc hình thận to và rộng; đài có ống ngắn, các thuỳ hình tam giác nhọn, màu lam sẫm; tràng có 5 cánh, màu trắng hoặc ngã vàng, hình trứng thuôn, có lông ở mặt trong, 5 nhị Hoa cái có lá bắc nhỏ, bầu xù xì (Đỗ Tất Lợi, 2003)
Quả hình bầu dục hoặc hình trứng dài từ 15-20 cm, có cuống mập, đáy nhọn, ngoài có nhiều gai, khi chín màu vàng đỏ Trong quả có nhiều hạt sếp thành hàng dọc, quanh hạt có màu đỏ máu được gọi là thịt gấc Hạt gấc dẹt, có hình dạng gần giống con ba ba nhỏ, màu đen hoặc hơi xám, vỏ ngoài rất cứng, mép có răng cưa, dày từ 5-6 mm, trong hạt có nhân trắng chứa nhiều dầu (Phạm Hoàng Hộ, 1999)
Trang 17Gấc có giống quả chín màu đỏ và giống quả màu vàng Giống quả vàng hiện thấy trồng ở một số vùng miền núi thuộc tỉnh Lai Châu và Sơn La Giống quả đỏ có hai loại: quả to và quả nhỏ, đều được trồng nhiều ở vùng trung du và đồng bằng Bắc Bộ Theo kinh nghiệm của nhân dân ở một số vùng thuộc tỉnh Hải Hưng, gấc có loại tẻ và loại nếp: gấc tẻ có tên khác là gấc giun (Hưng Yên), ruột màu đỏ, ăn không ngấy (béo) (màu này nhạt đi khi nấu chín), quả to, rất sai, gai quả dày, nhiều hạt; gấc nếp (gấc gạch), ruột màu vàng, ăn rất ngấy (béo), quả nhỏ, cây ít quả, gai quả thưa, ít hạt
1.1.3 Đặc điểm sinh thái
Gấc là loại cây ưa sáng và ẩm, sinh trưởng và phát triển nhanh trong điều kiện chăm sóc tốt và có đủ giá thể leo Hàng năm, sau khi quả được thu hoạch, cây có hiện tượng rụng lá Muốn cây ra nhiều chồi khoẻ, người ta chặt bỏ toàn bộ phần thân leo, chỉ chừa lại phần gốc, từ gốc sẽ tạo ra thế hệ cây mới có sức sống mạnh mẽ hơn (Đỗ Tất Lợi, 2003)
1.2 PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG CỔ TRUYỀN
Gấc được trồng phân tán khắp nơi như gốc sân, cạnh bờ ao, đầu ngõ,…Theo cách truyền thống gấc có thể nhân giống bằng hạt hay giâm cành, nhưng trong thực tế ít trồng bằng hạt vì cây lâu cho quả, năng suất thấp và phẩm chất kém, trồng bằng cách giâm cành thì có hiệu quả hơn
Cách làm: sau khi thu hoạch quả và cuối năm, chọn cành bánh tẻ của cây
có 2-3 năm tuổi, cắt thành những đoạn dài 40-50 cm, khoanh tròn lại rồi cho vào hốc sâu 50-60 cm với mỗi bề rộng 50 cm được chuẩn bị sẵn với phân chuồng, mùn rác mục trộn lẫn với đất tốt đã lấp đầy gần miệng hố, sau khi đặt hom lấp đất lại dày khoảng 3-5 cm bằng rơm hay rác và tưới ẩm Tuy nhiên không được tưới quá ẩm vì hom giống sẽ bị thối Khi mầm cao 40-50 cm cần tiến hành làm giàn hay lợi dụng những cây cao xung quanh cho cây leo Theo Đỗ Tất Lợi (2003), ánh sáng đầy đủ thì quả sẽ nhiều và ít bị thối rụng Năm đầu cây đã có quả nhưng rất ít, càng về sau
Trang 18quả càng nhiều Nếu gấc được trồng trên đất tốt, ít sâu bệnh và được chăm sóc chu đáo có thể sống và cho quả từ 10-15 năm
1.3 THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG, CÔNG DỤNG VÀ GIÁ TRỊ KINH TẾ 1.3.1 Thành phần dinh dưỡng
Theo Stephen và ctv (2002) (trích dẫn bởi Trang Ngọc Diệp, 2006), thành phần dinh dưỡng chính trong quả gấc gồm: ß-carotene (175 µg/g thịt quả), lycopene (802 µg/g thịt quả), tổng carotenoids (977 µg/g thịt quả), lipid (102 µg/g thịt quả), hàm lượng nước của thịt quả (78 % khối lượng)
Theo Le Thuy Vuong (2003) (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Phương Dung, 2006), gấc có hàm lượng ß-carotene cao nhất trong tất cả các loại trái cây với nồng độ 35,5 mg/100 g thịt quả
Thịt quả gấc chứa nhiều acid béo (đa số là các acid béo chưa no) như: oleic acid, palmitic acid, linoleic acid Ngoài ra, phần thịt quả còn chứa nhiều dưỡng chất khác như: lycopene, zeaxanthin, ß-cryptoxanthin Trong đó, hàm lượng lycopene đạt đến 380 µg/g thịt quả, cao gấp 76 lần khoai tây (Ishida và ctv., 2004) (trích dẫn bởi Trang Ngọc Diệp, 2006)
Trong quả gấc có dầu gấc Màng đỏ bao quanh hạt (áo hạt) của quả gấc chứa đựng một lượng dầu gấc màu đỏ sẫm, chất sánh có mùi vị thơm đặc biệt, 100 g dầu gấc có 150-175 mg β-carotene, 4 g lycopene và 12 g α-tocopherol (vitamin E thiên nhiên), 33,4% palmitic acid, 7,9% stearic acid Đặc biệt là 44% oleic acid và 14,7% linoleic acid là hai loại acid béo rất cần thiết cho cơ thể Dầu gấc còn chứa các nguyên tố vi lượng cần thiết cho cơ thể như: Sắt, Đồng, Colbalt, Kali, và Kẽm,… Hàm lượng vitamin A trong dầu gấc cao gấp 1,8 lần so với dầu gan cá thu, gấp 15 lần so với củ cà rốt và gấp 68 lần so với quả cà chua (Trần Công Khánh, 2004) (theo báo Phụ nữ Việt Nam số 66 ra ngày 03/06/2005) Theo Vũ Nguyên Khiết (2004) trong tạp chí Sức Khoẻ và Đời Sống số 258 (15/01/2004) 1ml dầu gấc có 30 mg carotene tương ứng với 50.000 đơn vị quốc tế vitamin A, cao hơn so với gan cá thu (1 ml dầu cá chứa 1.000 đơn vị vtamin A)
Trang 19Trong nhân hạt gấc chứa 2,61% protein, 55,3% lipid, 2,9% đường, 1,8% tannin, 2,8% cellulose Trong lá gấc có chứa vitamin E Trong rễ gấc chứa một số
saponin triterpenoid: monordin I, monordin II, monordin III, monordin Ia,
monordin Ib, monordin Ic, monordin Id, monordin Ie, monordin IIa, monordin IIb, monordin IIc, monordin IId, monordin IIe Trong thân củ gấc chứa chondrilasterol (Hasan Choudhury M và ctv., 1987), momorcochin (Yeung H.W và ctv., 1987), cucurbitadienol, một glucoprotein và hai glycosid (trích dẫn bởi Đỗ Tất Lợi, 2003)
1.3.2 Công dụng
Theo cách truyền thống người dân trồng gấc dùng quả để nấu xôi vì cho màu đỏ rất đẹp lại bổ dưỡng hoặc dùng để nhuộm màu Hiện nay, việc sử dụng màu tự nhiên của quả gấc trong chế biến thực phẩm để thay thế cho các phẩm màu hoá học dùng trong thực phẩm, nấu nướng,…là điều vô cùng quan trọng vì rất có lợi cho sức khoẻ
Dầu gấc có tác dụng như những vị thuốc có vitamin A, dùng bôi lên các vết thương, vết loét, vết bỏng làm cho da mau lành Uống dầu gấc, người bệnh chóng lên cân, tăng sức đề kháng cho cơ thể, chống oxy hoá, làm chậm quá trình lão hoá kéo dài tuổi thanh xuân của con người, dùng cho trẻ em chậm lớn, phòng trị các chứng bệnh khô mắt, quáng gà Dầu gấc có những tác dụng tuyệt vời như thế là do trong dầu gấc có nhóm carotenoid Đây là những sắc tố tự nhiên có tác dụng kích thích sự tạo lập melanin và chống lại các gốc tự do Chúng kích thích hệ miễn dịch và góp phần vào sự đổi mới các tế bào β-carotene là tiền chất của vitamin A giúp chống lại sự hình thành collagen là loại enzyme huỷ hoại cấu trúc của làn da Khi vào cơ thể, β-carotene trong quả gấc sẽ biến thành carotene kích thích sự phân chia các tế bào ở đáy biểu mô làm cho tế bào da luôn được tái tạo Vì thế nếu thiếu vitamin A thì da dễ bị hiện tượng tăng sừng da vảy cá, dày sừng chân lông, rụng tóc, tóc bạc sớm Trẻ em thiếu vitamin A sẽ giảm sức đề kháng, khô mắt dẫn tới mù loà,…Vitamin A còn giúp tạo lập tế bào lympho làm tăng khả năng kháng nhiễm của cơ thể, do đó hạn chế các bệnh nhiễm trùng α- tocopherol có trong dầu gấc phòng ngừa sự lão hoá tế bào bằng cách khử các hoá chất độc hại cho cơ thể và cho da do tia cực tím và cải thiện sự dung nạp của da với ánh nắng mặt trời Ngoài vai
Trang 20trò chống lão hoá toàn diện, α-tocopherol còn tác dụng tương hỗ với các tác dụng của vitamin C để phòng ngừa sự thoái hoá các acid béo chính yếu của cơ thể (Theo Tạp chí “Thuốc & Sức khoẻ” số 258 ra ngày 15/01/2004)
Rễ gấc: vị đắng, tính mát, có tác dụng trừ thấp nhiệt, hoạt huyết, lợi tiểu, chữa tê thấp, sưng chân
Hạt gấc: vị đắng, hơi ngọt, tính ôn, hơi có độc, vào 2 kinh can và đại tràng Dùng chữa các chứng bệnh ung thũng, mụn nhọt độc, tràng nhạt, eczema, viêm da thần kinh, trĩ, phụ nữ sưng vú, hậu môn sưng thũng, chữa chai chân, chữa sang chấn đụng giập trong những trường hợp bị ngã, bị thương, tụ máu
Lá gấc: dung làm thuốc tiêu sưng tấy,…(Đỗ Tất Lợi, 2003)
1.3.3 Nghiên cứu và ứng dụng
Le Thuy Vuong và ctv (2000) (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Phương Dung, 2006), đã khảo sát thực nghiệm tác dụng của β-carotene trong dầu gấc đến trẻ em (ở miền Bắc Việt Nam) cho thấy, lượng hồng cầu, β-carotene, vitamin A trong máu của nhóm ăn xôi gấc tăng lên rõ rệt so với hai nhóm ăn dầu gấc và β-carotene tổng hợp
Phạm Gia Tiên và ctv (2004) (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Phương Dung, 2006), nghiên cứu được khả năng ức chế sự phát triển các khối u của nước trích (water extract) từ quả gấc
Theo Báo phụ nữ Việt Nam số 66 ra ngày 03/06/2005, chế phẩm từ quả gấc có tên VINAGA của công ty chế dầu và thực phẩm Việt Nam (VN POFOOD) do Nguyễn Công Suất nghiên cứu và đề xuất cho thấy, chế phẩm này có khả năng điều trị cho các bệnh nhân bị nhiễm chất độc dioxin, ung thư gan Chính những hiệu quả tuyệt vời này đã khiến cho các nhà khoa học Mỹ phải ngỡ ngàng và công nhận hiện nay trên thế giới vẫn chưa có loại quả nào tuyệt vời hơn quả gấc
Từ những giá trị dược liệu quí giá đã được khám phá, công nhận cùng xu hướng thị trường, gấc cần được mở rộng sản xuất với sản lượng lớn nhằm đáp ứng nhu cầu thị trường hiện nay
Trang 211.4 NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT 1.4.1 Giới thiệu
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là sự nuôi cấy vô trùng các cơ quan, mô, tế bào thực vật trên môi trường nuôi cấy được xác định rõ; việc nuôi cấy được duy trì dưới các điều kiện được kiểm soát (Nguyễn Bảo Toàn, 2005)
Đối với thực tiễn sản xuất, phương pháp nuôi cấy mô có nhiều đóng góp quan trọng như: phục tráng và nhân nhanh các giống cây trồng quí, có giá trị kinh tế cao như cây Giá tỵ, cây Ba kích,…;tạo ra quần thể lớn và đồng nhất trong một thời gian ngắn; kiểm soát được dịch bệnh cây trồng như làm sạch virus bằng cách nuôi cấy đỉnh sinh trưởng; cải tiến được chất lượng giống thông qua kiểm soát gen của giống đem vào sản xuất (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002) Đặc biệt đây là phương pháp có thể nhân giống được rất nhiều loại cây từ các vùng khí hậu khác nhau trên
thế giới mà phương pháp in vivo không thể thực hiện được
Hiện nay ở Việt Nam, nhân giống vô tính in vitro đã được đầu tư phát triển
mạnh ở nhiều nơi và đã đạt được nhiều thành công trên nhiều loại cây trồng, trong đó có những cây quan trọng về mặt kinh tế như: lúa, bắp, khoai tây, rau, các loại hoa, cà phê, ca cao,…(Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002)
1.4.2 Quá trình vi nhân giống
Thông thường thực vật sinh sản theo 2 cách: sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính Cả 2 phương pháp này đều có thể xảy ra hoặc không thể xảy ra trong
những điều kiện xác định Trong điều kiện in vivo có thể tiến hành bằng cách giâm
cành, chiết cành, ghép cành,…nhưng thường phải tốn thời gian, đôi khi khó thực
hiện và hiệu quả không cao Ngược lại, phương pháp in vitro có thể tiến hành bằng
các phương pháp như nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, đốt thân, cành bên, tạo cơ quan bất định từ các mẫu mô nuôi cấy (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002)
Mục đích chính của phương pháp này là nhân những dòng cây thành số lượng lớn, nhằm nhân một cá thể có sẵn với một mảnh thực vật đặt vào môi trường dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng Cở sở sinh học của phương pháp này là phát triển các mầm chồi trên các mảnh thân cây qua nuôi cấy mô, hay tạo chồi bất định
Trang 22(adventif, neoformation), tạo rễ trên các mẫu cấy (Lâm Ngọc Phương, 2001) (trích dẫn bởi Đỗ Thị Trang Nhã, 2005)
Mức độ thành công của phương pháp vi nhân giống phụ thuộc vào 2 thao
tác thực hiện ở điều kiện bên ngoài (in vivo) và thực hiện trong ống nghiệm (in vitro), được chia thành 5 giai đoạn sau (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002)
In vivo Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây mẹ
In vitro Giai đoạn 2: Khử trùng mẫu cấy Giai đoạn 3: Tăng sinh mô Giai đoạn 3a: Tạo phôi soma
Giai đoạn 3b: Tăng cường sự phát triển chồi bên Giai đoạn 3c: Sự phát triển chồi bất định
In vitro Giai đoạn 4: Sự ra rễ in vitro và điều kiện ra rễ In vivoGiai đoạn 5: Giai đoạn ra rễ in vivo
Tăng cường sự phát triển của chồi bên trong giai đoạn tăng sinh mô để có hệ số nhân tối đa là phương pháp thường được ứng dụng đối với nhiều loại cây
trồng Khi đó, chồi bên và chồi ngọn có thể được cảm ứng và phát triển in vitro
bằng cách sử dụng sự phát triển của những mầm chồi đang hiện hữu Từ một chồi đơn sau khi cấy sẽ phát triển thành một chồi hay thành một cụm chồi tuỳ thuộc vào loài thực vật và môi trường nuôi cấy Chồi bên sẽ được hình thành từ những mầm chồi ban đầu, qua những lần cấy chuyền quá trình này sẽ được lặp lại một cách chính xác Sự hình thành mô sẹo (callus) có thể xảy ra cùng với sự phát triển của chồi Cytokinin nồng độ 1-3% thường được sử dụng để kích thích sự tăng sinh chồi bên Sau vài lần cấy chuyền các cây con được tạo ra và được chuyển sang giai đoạn 4 để cảm ứng ra rễ
Tuy nhiên giai đoạn tạo chồi, tạo rễ có thể được quyết định bởi chiều cao của chồi hoặc trọng lượng của chồi và tuỳ thuộc vào loài thực vật, có thể kéo dài từ 2-4 tuần (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002) Nhưng việc cảm ứng ra rễ không phải dễ, sự hình thành rễ còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như: khoáng đa lượng, vi
Trang 23lượng, các hợp chất hữu cơ, chất làm đặc môi trường, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều hoà sinh trưởng thực vật,…Ở một số loài để cảm ứng ra rễ nhất thiết phải chuyển sang môi trường hoàn toàn không có cytokinin, nhưng cũng có những loài nhất thiết phải có sự hiện diện của auxin Tuy nhiên, khi rễ hình thành trong môi trường có auxin đôi khi lại không tiếp tục tăng trưởng trong chính môi trường đó Nồng độ của khoáng đa lượng và vi lượng trong môi trường ra rễ thường giảm xuống còn một nữa so với bình thường (tuỳ loài thực vật), nguyên nhân là do nhu cầu về đạm của chồi trong giai đoạn tạo rễ giảm xuống (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002)
Có nhiều cách thức tiến hành trong phương pháp vi nhân giống Trong đó, giữa 2 phương pháp nuôi cấy nốt thân đơn và phương pháp nhân chồi bên, về nguyên tắc 2 phương pháp này cơ bản giống nhau, đó là việc sử dụng mẫu cấy là chồi ngọn hoặc chồi bên có mang một đoạn thân ngắn Chồi này sẽ được kích thích cho tăng trưởng, ra rễ để tạo cây hoàn chỉnh Nhưng sự khác nhau giữa hai phương pháp là phương pháp nuôi cấy nốt thân đơn có sự kéo dài chồi, thân và thường không cần cytokinin để phát triển Phương pháp nuôi cấy nốt thân đơn đã được thực
hiện thành công trên nhiều cây: khoai tây (Morel và Martin, 1955), Manihot esculenta (Kartha và ctv., 1974), Vitis rupestris (Galzy, 1969), lê (Quoirin, 1974),
hoa hồng (Heliott, 1970) (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002) Phương pháp này cũng được áp dụng để nhân giống cà chua, dưa chuột, cà tím Ngược lại, phương pháp nhân chồi bên thì chồi ngọn được cô lập trên môi trường dinh dưỡng và các chồi bên từ các nách lá phát triển dưới ảnh hưởng của cytokinin với nồng độ cao Vai trò của cytokinin lúc này là hạn chế ưu thế của chồi ngọn để cho các chồi bên có thể phát triển Các chồi bên này được tiếp tục chuyển sang môi trường mới có bổ sung cytokinin thì các chồi bên mới lại tiếp tục được tạo ra…Sau đó, các chồi này được chuyển sang môi trường ra rễ và được đưa ra ngoài vườn ươm khi đã có rễ hoàn chỉnh
Sự hình thành những chồi bên thì phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố
+ Loại và nồng độ cytokinin tuỳ loài thực vật Số lần cấy chuyền càng nhiều thì nhu cầu về cytokinin càng giảm do cây đã quen với cytokinin và mô đã được trẻ hoá, đa số cây phản ứng tốt với Benzyl Adenine (BA)
Trang 24+ Nồng độ cytokinin thay đổi tuỳ theo giai đoạn nuôi cấy Mô cấy non đòi hỏi cytokinin ít hơn mô trưởng thành
+ Khi sử dụng auxin với nồng độ thấp phối hợp với cytokinin ở nồng độ cao (tỷ lệ cytokinin/auxin thường là 10/1) cho hiệu quả tạo chồi cao
+ Nên để chồi ngọn phát triển trước khi tăng nồng độ cytokinin để cảm ứng sự tạo chồi bên
+ Trường hợp chồi bên không tăng trưởng, cần cắt bỏ hoặc làm chết chồi ngọn thì các chồi bên mới có thể hoạt động Nên sử dụng cytokinin ở nồng độ thấp để tránh tạo ra các chồi bất định mang các đột biến
+ Khi cấy chuyền nhiều lần, tốc độ tăng sinh chồi bị thay đổi Ví dụ sự tăng sinh chồi Rosaceae tăng sau 1-3 tuần cấy chuyền đầu tiên, rồi sau đó giảm xuống dù có bổ sung BA với nồng độ khác nhau (Norton & Orton, 1986) (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002) Thêm vào đó, khi cấy chuyền nhiều lần thì chiều dài chồi, kích thước lá giảm và đồng thời có sự tạo mô sẹo
Tuy nhiên, cả 2 phương pháp nuôi cấy nốt thân đơn và phương pháp nhân chồi bên thường được áp dụng chung Đầu tiên là để chồi tăng trưởng bình thường sau đó bổ sung cytokinin vào môi trường nuôi cấy để cảm ứng sự hình thành các chồi bên Điều quan trọng là phải chọn cây mẹ khoẻ, sạch bệnh
Phương pháp này mang nhiều ý nghĩa thực tế
+ Cách tiến hành đơn giản hơn so với các phương pháp khác
+ Tốc độ nhân giống cao phụ thuộc vào số lượng chồi có sẵn Nếu số lượng chồi ít thì tốc độ nhân giống sẽ chậm Chồi tăng trưởng tạo ra càng nhiều lá thì số lượng chồi bên càng nhiều dẫn đến sự tăng tốc độ nhân giống
+ Sản phẩm ổn định về mặt di truyền
+ Cây con tăng trưởng tốt do đã được trẻ hoá
Hiện nay, nhân giống vô tính in vitro từ chồi bên được áp dụng cho nhiều
đối tượng thực vật và phổ biến là ở một số cây ăn trái (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002)
Trang 251.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy
Một trong những yếu tố quan trọng trong sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và mô thực vật là thành phần môi trường nuôi cấy Thành phần môi trường nuôi cấy của tế bào và mô thực vật thay đổi tuỳ theo loài, theo bộ phận nuôi cấy và theo giai đoạn phân hoá của mẫu cấy và mục đích thí nghiệm Tất cả môi trường nuôi cấy đều bao gồm 5 thành phần:
- Khoáng đa lượng - Khoáng vi lượng - Vitamin
- Đường và nguồn cung cấp carbon - Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật
Nguyên tố khoáng đa lượng
Khoáng đa lượng rất cần cho cây và ảnh hưởng đến sự hấp thu dinh dưỡng của mô cấy và chúng không gây độc Các nguyên tố khoáng thường sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm Các nguyên tố này bao gồm Nitrogen (N), Phosphorus (P), Potassium (K), Calcium (Ca), Magnesium (Mg),…
+ Nguồn nitơ: thường được sử dụng dưới dạng (NO3-) và ammonium
(NH-4+), đồng thời cũng sử dụng dưới dạng hữu cơ như amino acid Việc sử dụng đồng thời nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ ở hàm lượng thích hợp sẽ thúc đẩy tế bào sinh trưởng mạnh hơn so với việc chỉ dùng amino acid làm nguồn nitơ (Vũ Văn Vụ và ctv., 1998) (trích dẫn bởi Đỗ Thị Trang Nhã, 2005)
+ Potassium: (K+) là một cation chủ yếu trong cây, giúp cây cân bằng các
anino vô cơ và hữu cơ K+ có vai trò điều hoà pH và áp suất thẩm thấu của môi trường nội bào (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002) Sự thiếu K+ trong môi trường nuôi cấy sẽ gây nên tình trạng thừa nước và làm giảm tốc độ hấp thu phosphate (Miller và ctv., 1996) (trích dẫn bởi Đỗ Thị Trang Nhã, 2005) Tuy nhiên, sự chênh lệch về nồng độ K+ trong môi trường nuôi cấy chỉ ảnh hưởng rất nhỏ trên sự tăng trưởng hoặc tăng sinh của chồi cây Lê (Loreti và ctv., 1988) (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002)
Trang 26+ Phosphorus (P): là nguyên tố tham gia vào vận chuyển năng lượng, sinh
tổng hợp protein, nucleic acid và tham gia vào cấu trúc của màng Nồng độ phosphorus hoà tan cao trong môi trường sẽ làm giảm sự tăng trưởng của mô Nồng độ ion phosphate được đưa vào môi rường nuôi cấy cao nhất là 18,9 mM, trung bình 1,7 mM và hầu hết các loại môi trường đều chứa phosphate khoảng 1,3 mM Mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu về phospho rất cao vì nó là thành phần cấu trúc của phân tử nucleic acid Phospho ở dạng H2PO4- và HPO42- có tác dụng như một hệ thống đệm làm ổn định pH của môi trường trong suốt quá trình nuôi cấy (Lê Trần Bình và ctv., 1997)
+ Calcium (Ca2+): có vai trò trong sự phát sinh hình thái, đồng thời cảm
ứng các chất điều hoà sinh trưởng đặc biệt là cytokinin và auxin Trên khúc cắt thân torenia sự tạo chồi bất định được cảm ứng bởi cytokinin bị ảnh hưởng do sự gia tăng hàm lượng Ca2+ nội bào (Tanimoto và Harada, 1986) (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002)
+ Sắt (Fe): là yếu tố cần thiết cho sự chuyển hoá, khi thiếu sắt thì các tế
bào sẽ mất khả năng phân chia, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây Sự hiện diện của nguyên tố sắt đặc biệt quan trọng cho quá trình tạo chồi và rễ bất định (Legrand, 1975) (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002) Sắt thường sử dụng ở dạng phức chelate (Fe-EDTA) với nồng độ 10-30 mg/l, ở dạng này sắt không bị kết tủa mà phóng thích từ từ vào môi trường nuôi cấy theo nhu cầu của mô thực vật (Nguyễn Văn Uyển, 1993) (trích dẫn bởi Đỗ Thị Trang Nhã, 2005)
Những nguyên tố vi lượng thường được sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30 ppm Các nguyên tố khoáng đa lượng có thể ảnh hưởng đến sự phân hoá tế bào khi kết hợp với các chất điều hoà sinh trưởng thực vật (Beasley và ctv., 1974) Sự thiếu ion Mn2+ làm giảm sự khởi tạo chồi trên mẫu cấy tử diệp Xà lách (Doerschug và Miller, 1976) Welander (1977) (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002), đã đưa ra những bằng chứng cho thấy rằng tế bào thực vật trong quá trình phát sinh hình thái sẽ cần nhiều khoáng vi lượng hơn
Trang 27Nguồn carbon và năng lượng
Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị
dưỡng, mặc dù ở nhiều trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng nhờ điều kiện ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp Vì vậy việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn carbon hữu cơ là điều bắt buộc (Lê Trần Bình và ctv., 1997) Nhưng hàm lượng đường quá cao sẽ hạn chế hiệu quả hấp thu nước của mô cây Đường cần thiết cho sự ra rễ ở nhiều loài thực vật, Gautheret chứng minh rằng
glucose là nguồn carbohydrate giúp cho sự ra rễ của chồi in vitro thích hợp hơn là
fructose và sucrose (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002) Glucose và
sucrose được sử dụng nhiều trong in vitro nhưng trong đó sucrose được sử dụng phổ biến hơn (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002) Trên cây Cucumis hystrix (Michael và
ctv., 2001), cây dâu tây (Hyung, 1996), và cây hàng (Teruyuki, 1999) cho thấy hàm lượng đường 30 g/l thích hợp cho chồi phát triển tốt Tuy nhiên, theo Rier và ctv (1987), đường giúp cho mô cấy tăng trưởng nhưng đồng thời ức chế sự tổng hợp diệp lục tố (trích dẫn bởi Đỗ Thị Trang Nhã, 2005)
Nước dừa
Bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng sự sinh trưởng và phát triển của mô Theo Tulecke và ctv (1961) (trích dẫn bởi Nguyễn Minh Hùng, 2006) trong nước dừa có hàm lượng amino acid tự do đạt nồng độ từ 190,5-685 ppm trong nước dừa tuỳ theo tuổi của quá trình từ non đến già Khi hấp ở nhiệt độ cao chỉ còn 70 ppm Ngoài ra, nước dừa còn chứa các hoạt chất có hoạt tính như auxin, các cytokinin dạng glycoside có lợi cho sự tạo mô sẹo, tạo chồi, tạo rễ và tái sinh cây (Nguyễn Đức Thành, 2000) (trích dẫn bởi Đỗ Thị Trang Nhã, 2005) Trong nuôi cấy mô, nước dừa thường được sử dụng với lượng 10-20% thể tích môi trường (Nguyễn Văn Uyển, 1993) (trích dẫn bởi Đỗ Thị Trang Nhã, 2005)
Thạch (Agar)
Được sử dụng để làm cứng môi trường, để làm giá đỡ cho môi trường nuôi cấy tế bào thực vật Tuỳ theo đối tượng mà hàm lượng thạch được đưa vào biến động từ 0,8-1,5%, có thể tăng đến 1,6% (Nguyễn Bảo Toàn, 2005) Nồng độ thạch cao trong môi trường nuôi cấy sẽ hạn chế được hiện tượng cây bị thuỷ tinh thể, thuỷ
Trang 28tinh thể là hiện tượng các cơ quan nuôi cấy bị mọng nước, trong suốt, chồi biến dạng và hơi vàng, những chồi này sẽ không có sức sống khi đưa ra vườn ươm (Nguyễn Quốc Thiện, 2003) (trích dẫn bởi Đỗ Thị Trang Nhã, 2005) Theo Debergh (1981) (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002), khi sử dụng nồng độ thạch 1,1-2% trong môi trường nuôi cấy cây artichoke thì sẽ hạn chế gần như hoàn toàn hiện tượng này Bên cạnh đó, nếu cấy trong môi trường quá đặc thì rễ khi hình thành sẽ mọc hướng lên trên không khí (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002) Thêm vào đó, khi cấy chồi trên môi trường agar thì lông rễ sẽ không phát triển bình thường vì trong môi trường agar điều kiện thông khí kém, thiếu O2 Lông hút xuất hiện nhiều trên rễ khi rễ hình thành trong môi trường lỏng và càng nhiều lông hút được hình thành khi chồi được cắm trên một cầu giấy trong môi trường lỏng (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002)
Vitamin
Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có khả năng
tự tổng hợp được hầu hết các loại vitamin, nhưng thường không đủ về lượng, do đó cần phải bổ sung từ bên ngoài vào, đặc biệt là các vitamin thuộc nhóm B (Lê Trần Bình và ctv., 1997) Các vitamin thường được sử dụng là thiamin (B1), nicotinic acid (B3), pyridoxine (B6) và myo-inositol Trong đó, thiamin được xem là loại vitamin thiết yếu cho hầu hết các loại cây trồng trong nuôi cấy mô (Gamborg và ctv., 1976), thường được dùng ở nồng độ 0,1-10 mg/l (Bùi Bá Bổng, 1995) (trích dẫn bởi Nguyễn Minh Hùng, 2006)
Than hoạt tính
Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy thường được tiến hành khi cảm ứng ra rễ Than có tác dụng làm đen môi trường, khử độc môi trường bằng cách kết hợp với các hợp chất phenol độc do mô cây tiết ra trong suốt thời gian nuôi cấy, hút các chất điều hoà sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy Than tính than có vai trò quan trọng trong sự tạo rễ bất định Tuy nhiên, nó có thể làm thay đổi pH của môi trường (Nguyễn Văn Uyển, 1984) (trích dẫn bởi Nguyễn Minh Hùng, 2006)
Trang 29Chất điều hoà sinh trưởng thực vật
Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật, thành phần quan trọng nhất quyết định đến kết quả nuôi cấy là chất điều hoà sinh trưởng thực vật Có thể là các chất nội sinh hay ngoại sinh dù với một lượng nhỏ (10-9), nhưng lại là yếu tố điều khiển Hiệu lực tác dụng của chúng rất khác nhau, tuỳ thuộc vào bản chất, nồng độ và từng loại tế bào Có 2 nhóm chất điều hoà sinh trưởng thực vật được sử dụng rộng rãi là auxin và cytokinin (Vũ Văn Vụ, 1990), (trích dẫn bởi Đỗ Thị Trang Nhã, 2005)
+ Auxin
Auxin là thuật ngữ chung đại diện cho lớp của những hợp chất được đặc tính hoá bởi khả năng gây ra sự vươn dài trong tế bào chồi trong vùng gần đỉnh Auxin nói chung mang tính acid với một nhân không bão hoà hoặc những dẫn xuất của chúng (Nguyễn Minh Chơn, 2005)
Ngoài IAA (indole-3-acetic acid) nội sinh do đầu bao lá mầm tự tổng hợp được Went, nhà sinh lý học Hà Lan phát hiện ra đầu tiên vào năm 1926 Sau này người ta còn phát hiện ra cây còn tổng hợp 2 loại chất điều hoà sinh trưởng thực vật có hoạt tính giống IAA là PAA (phenylacetic acid) và 4-chloroIAA (4-chloroindoleacetic acid) Ngoài ra, người ta còn tổng hợp được một số chất có hoạt tính tương tự như auxin là NAA (naphthaleneacetic acid), IBA (indole-3-butyric
(2,4,5-trichlorophenolxyacetic acid), MCBA (2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid) (Salisbury and Ross, 1992) (trích dẫn bởi Đỗ Thị Trang Nhã, 2005)
Auxin được tổng hợp chủ yếu ở đỉnh chồi ngọn, đỉnh thân, lá non, những bộ phận còn non của cây, các mô phân sinh, mầm hoa, hột đang phát triển Auxin vận chuyển trong cây mang tính phân cực theo hướng từ đỉnh chồi ngọn xuống đến rễ Sự di chuyển mang tính phân cực này thậm chí xảy ra khi chồi bị đảo ngược (Torry, 1981) (trích dẫn bởi Đỗ Thị Trang Nhã, 2005)
Trong nuôi cấy mô, auxin có các vai trò chính gồm: tạo rễ bất định (ở nồng độ cao), tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp), kích thích phôi sinh dưỡng, phân chia tế bào, thành lập mô sẹo và phát triển, ức chế sự phát triển chồi nách, ức chế sự phát triển rễ (Nguyễn Bảo Toàn, 2005) Ngoài ra, auxin còn có tác động quang hướng
Trang 30động, địa hướng động, sự sản sinh ethylene, sự phát triển của trái, trinh quả sinh, sự rụng và sự thể hiện giới tính (Nguyễn Minh Chơn, 2005)
Ở một số loài thực vật sự cảm ứng ra rễ nhất thiết phải chuyển chồi sang môi trường không có cytokinin, có một số loài có thể ra rễ trực tiếp mà không cần môi trường cảm ứng là aechmea, anh đào, đỗ quyên Tuy nhiên ở một số loài sự ra rễ nhất thiết phải có sự hiện diện của auxin Những loại auxin thường được bổ sung vào môi trường tạo rễ là IAA (0,1-10 mg/l), NAA (0,05-1 mg/l), IBA (0,5-3,0 mg/l) Sự đáp ứng của chồi và sự hình thành rễ hoàn toàn phụ thuộc vào loại thực vật (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002) Áp dụng auxin ngoại sinh có thể kích thích sự tượng rễ và sự phát triển sớm của rễ, trái lại sự vươn dài của rễ nói chung bị ức chế trừ khi áp dụng với nồng độ đủ nhỏ (Nguyễn Minh Chơn, 2005) Do đó, trong
điều kiện in vitro thường sử dụng auxin với nồng độ cao để cảm ứng sự tạo rẽ (rễ sơ
khởi) NAA và IBA thường dùng để cho sự ra rễ và phối hợp với cytokinin, các auxin tổng hợp này cũng được sử dụng để tạo rễ cành giâm các loại cây ăn trái và hoa kiểng phục vụ cho công tác nhân giống (Lê Văn Hoà và ctv., 2001) (trích dẫn bởi Nguyễn Minh Hùng, 2006)
+Cytokinin
Cytokinin được Skoog (1950), phát hiện đầu tiên trong một thí nghiệm chiết xuất nucleic acid bị sơ suất, đó là những cấu tử của nucleic acid bị phân huỷ thành (trích dẫn bởi Lê Trần Bình và ctv., 1997)
Cytokinin là chất điều hoà sinh trưởng thứ ba được phát hiện sau auxin và gibberellins Trong nuôi cấy mô cytokinin có các tác dụng chính gồm: tạo chồi phụ (ở nồng độ cao), ức chế tạo rễ, phân chia tế bào, thành lập và tăng trưởng mô sẹo, kích thích mọc chồi nách, ức chế sự vươn dài chồi, ức chế sự lão hoá lá (Nguyễn Bảo Toàn, 2005) Cytokinin có khả năng kích thích chồi bên và đặc biệt là vượt qua ảnh hưởng ưu thế chồi ngọn, nhưng khi chồi bên được tạo ra thì cần phải loại bỏ cytokinin ra khỏi môi trường đồng thời bổ sung auxin để chồi có thể tạo rễ (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002) Ưu thế chồi ngọn được điều khiển bởi sự cân bằng giữa mức độ cytokinin và auxin nội sinh Điều này là do cytokinin có thể ức chế enzyme IAA oxidase trong chồi bên cho phép tích luỹ auxin và gây ra sự vươn dài của chồi
Trang 31bên, có thể cytokinin khởi đầu cho cơ chế liên quan đến sức chứa ở chồi bên bằng cách kích thích sự vận chuyển dinh dưỡng, vitamin, khoáng và những chất sinh trưởng khác để tác động đến sự sinh trưởng (Nguyễn Minh Chơn, 2005)
Cytokinin hiện diện trong tất cả các thực vật khác nhau Ngoài ra, bằng con đường hoá học người ta đã tổng hợp được một số chất có hoạt tính tương tự cytokinin như BAP (6-benzylamino-9-(-2tetrahydropyranyl)-9H-purine), BA (6-benzylaminopurine), kinetin (6-furfurylaminopurine) Trong nuôi cấy mô BA và kinetin được sử dụng thông dụng nhất
Khó có thể đoán trước là loại cytokinin nào phù hợp với mẫu cấy Khi sử dụng cytokinin với nồng độ cao sẽ tạo ra những chồi không bình thường, tốt hơn là nên chuyển các chồi bất định hình thành trên môi trường có nồng độ cytokinin cao sang môi trường có nồng độ cytokinin thấp hơn để chồi tăng trưởng
Cytokinin ức chế sự hình thành rễ bất định, điều này đã có nhiều tranh luận liên quan đến vai trò của cytokinin, đặc biệt là BA trong sự tạo rễ đã được công bố Sử dụng BA ở nồng độ tối hảo, có thể đưa đến khởi sự tạo rễ, nên cytokinin được sử dụng trong môi trường vươn dài trước giai đoạn ra rễ hoặc giảm nồng độ cytokinin xuống thấp, khi cấy chuyền lần cuối trước khi chuyển chồi vào môi trường tạo rễ
Theo Nguyễn Minh Chơn (2005), chất điều hoà sinh trưởng có tác dụng kích thích sẽ thể hiện tác động kích thích ở nồng độ thấp và tăng dần đến ảnh hưởng tối đa Khi nồng độ vượt qua mức kích thích tối đa sẽ gây ra ảnh hưởng ức chế
Hình 1.1 Đường cong diễn tả mức độ đáp ứng điển hình đối với nồng độ chất
điều hoà sinh trưởng
Trang 32Mối tương quan giữa cytokinin và auxin trong nuôi cấy mô tế bào thực
vật
Theo Miller và Skoog (1957) (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002), là người đầu tiên nhận thấy tỷ lệ auxin/ cytokinin xác định dạng phân hoá cơ quan của tế bào thực vật nuôi cấy Khi tỷ lệ cân đối giữa auxin và cytokinin điều khiển sự thành lập rễ, chồi và mô sẹo, sự thành lập chồi nách và rễ bất định Khi tỷ lệ nồng độ auxin/cytokinin cao thì mô cấy phát triển mạnh theo khuynh hướng hình thành rễ, ngược lại mô cấy phát triển mạnh theo hướng phát sinh nhiều chồi Do đó trong quá trình tạo chồi người ta sử dụng auxin với nồng độ thấp phối hợp cùng với cytokinin ở nồng độ cao Tỷ lệ cytokinin/auxin thường là 10/1 (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002)
Mối tương quan này được biểu diễn theo mô hình của Edwin (1993) (theo trích dẫn bởi Nguyễn Bảo Toàn, 2005)
Trang 33
Hình 1.2 Mối tương quan giữa hàm lượng auxin và cytokinin trong nuôi cấy
mô
Nồng độ auxin
thấp Nồng độ
cytokinin cao
Nồng độ auxin
cao Nồng độ
cytokinin thấp
Trang 34CHƯƠNG II
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 PHƯƠNG TIỆN
2.1.1 Thời gian và địa điểm
Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, Bộ môn Sinh Lý-Sinh Hoá, Khoa Nông Nghiệp & SHƯD, trường Đại học Cần Thơ từ tháng
- Nồi hấp khử trùng - Cân vi phân tích, pH kế - Máy khuấy từ, microwave
- Các dụng cụ thuỷ tinh: keo, ống đong, …
2.1.4 Hoá chất
- Khoáng đa lượng: N, P, K, Ca, Mg, S
- Khoáng vi lượng: B, Mn, Zn, Cu, Mo, Cl, Ni, Al, Co, I, Fe
- Các chất hữu cơ: agar, đường, vitamin (thiamin, pyridoxin, nicotinic acid), nước cất,…
- Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật: cytokinin là Benzyl Adenine (BA), auxin là Naphthaleneacetic acid (NAA) và Indole-3-butyric acid (IBA)
- Than hoạt tính
- Các chất khác: HCl 0,1 N, NaOH 0,1 N, cồn 700…
2.1.5 Điều kiện phòng nuôi cấy
- Nhiệt độ (26 ± 2oC)
Trang 35- Cường độ ánh sáng 1.000 lux, chu kỳ quang 16 giờ/ngày
2.2 PHƯƠNG PHÁP 2.2.1 Môi trường nuôi cấy
- Sử dụng môi trường cơ bản là môi trường đa vi lượng MS (Murashige & Skoog, 1962) Có bổ sung vitamin theo Morel (1951), nước dừa (100 ml/l), đường (25 g/l) và agar (7,375 g/l)
- pH=5,7
- Mỗi keo chứa 50 ml môi trường
- Môi trường được tiệt trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1 kg/cm2 trong 20 phút
2.2.2 Cách tiến hành
Các mẫu chồi được chuyển sang môi trường cơ bản MS không có chất điều hoà sinh trưởng từ 5-7 ngày trước khi tiến hành bố trí thí nghiệm
Cân trọng lượng, đo chiều cao mẫu khi bố trí thí nghiệm
2.2.2.1 Thí nghiệm 1: Hiệu quả của Benzyl Adenine (BA) và butyric acid (IBA) đến sự tạo chồi gấc in vitro
Mục đích: Nhằm tìm ra môi trường có nồng độ BA và IBA thích hợp cho
sự tạo chồi của gấc in vitro
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu
nhiên một nhân tố (nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng thực vật khác nhau) với 11 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 5 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 keo, mỗi keo chứa 5 mẫu chồi
Trang 36Thí nghiệm được bố trí như sau
Nghiệm thức Nồng độ (ppm) BA IBA 1 (Đối chứng) 0
Chỉ tiêu theo dõi
- Số lượng chồi hữu hiệu (chiều cao > 1 cm) - Chiều cao chồi (cm)
- Trọng lượng cụm chồi gia tăng - Số chồi bất thường
- Quan sát chỉ tiêu 3 tuần/lần
2.2.2.2 Thí nghiệm 2: Hiệu quả của Naphthaleneacetic acid (NAA) và than hoạt tính trên sự tạo rễ chồi gấc in vitro
Mục đích: Nhằm tìm ra môi trường có nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng
thích hợp cho sự ra rễ gấc in vitro
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 2
nhân tố (nồng độ chất điều hoá sinh trưởng và than hoạt tính) gồm 12 nghiệm thức với 5 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 1 keo, mỗi keo chứa 5 mẫu chồi
Trang 37Thí nghiệm được bố trí như sau
Nồng độ NAA Than hoạt tính (g/l) (ppm) 0 2
0,1 NT 2 NT 8 0,2 NT 3 NT 9
- Trọng lượng cụm chồi gia tăng (g)
2.2.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng thích ứng ban đầu của cây gấc khi chuyển từ ống nghiệm ra vườn ươm trên 3 nền giá thể khác nhau: tro trấu, xơ dừa, tro trấu + xơ dừa (tỷ lệ 1:1) và nylon giữ ẩm
Để đảm bảo cho các cây con sinh trưởng và phát triển tốt thì các chất làm nền: xơ dừa, tro trấu được ngâm trong nước tối thiểu 3 ngày để không còn chất chát hay mặn Sau đó các nền môi trường này được khử trùng hoặc được trộn với thuốc diệt nấm
Mục đích: nhằm tìm ra loại nền môi trường có giá thể thích hợp cho cây
gấc in vitro khi chuyển ra vườn ươm có tỷ lệ sống cũng như có khả năng sinh
trưởng và phát triển tốt nhất
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 2
nhân tố, nhân tố thứ nhất là 3 loại nền giá thể (tro trấu, xơ dừa, tro trấu + xơ dừa), nhân tố thứ hai là có phủ và không phủ nylon lên các rổ đựng các mẫu cây, với 5 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 4 cây, mỗi cây trồng trong 1 chậu
Trang 38Thí nghiệm được bố trí như sau
Chỉ tiêu theo dõi
- Chiều cao (cm) - Số lá
- Tỷ lệ sống (%)
Xử lý số liệu
Tất cả số liệu thu thập được đều được tiến hành:
- Các số liệu là tỷ lệ phần trăm biến động từ 0-100% được chuyển sang dạng Arcsin√x theo công thức trong bảng tính Excel: với x là giá trị phần trăm cần đổi (%); giá trị x là 0% được tính bởi công thức ASIN(SQRT(x) + 1/4n), giá trị x là 100% được tính bởi công thức ASIN(SQRT(x) – 1/4n), ngược lại là
ASIN(SQRT(x), n là cỡ mẫu dựa trên để tính phần trăm
- Các số liệu là số đo và số đếm được chuyển sang dạng Log+1 theo công thức trong bảng tính Excel
- Phân tích thống kê bằng chương trình MSTATC với phép thử DUNCAN ở mức ý nghĩa 5%
- Dùng chương trình Microsoft Excel để vẽ đồ thị Loại giá thể
Nylon Xơ dừa Tro trấu Xơ dừa + Tro trấu
Trang 39CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Thí nghiệm 1: Hiệu quả của Benzyl Adenine (BA) và Indole-3-butyric acid (IBA) đến sự tạo chồi gấc in vitro
Thí nghiệm này nhằm tìm ra nồng độ BA và IBA thích hợp để đạt được hệ số nhân chồi cao nhất Kết quả ghi nhận như sau:
3.1.1 Chiều cao chồi gia tăng (cm)
Qua kết quả trình bày ở Bảng 3.1 cho thấy, vào thời điểm 3 tuần sau khi cấy (TSKC) nghiệm thức 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA có chiều cao cụm chồi gia tăng cao nhất (4,09 cm) và khác biệt có ý nghĩa thống kê 5% so với ba nghiệm thức: đối chứng, 0,8 ppm BA và 1 ppm BA Tuy nhiên không khác biệt so với các nghiệm thức còn lại Trong đó nghiệm thức 0,8 ppm BA có chiều cao cụm chồi gia tăng thấp nhất (3,21 cm)
Vào thời điểm 6 TSKC, ba nghiệm thức 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA, 0,1 ppm BA+0,01 ppm IBA và 0,4 ppm BA+0,04 ppm IBA có chiều cao cụm chồi cao hơn so với các nghiệm thức còn lại, và có khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1%, nhưng giữa chúng lại không có sự khác biệt thống kê Trong đó nghiệm thức 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA có chiều cao cụm chồi gia tăng cao nhất (6,72 cm), nghiệm thức 1 ppm có chiều cao cụm chồi gia tăng thấp nhất (3,71 cm)
Trong suốt quá trình tiến hành thí nghiệm ghi nhận, hai nghiệm thức 0,1 ppm BA+0,01 ppm IBA và 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA cây sinh trưởng và phát triển tốt với lá mới hình thành to hơn so với các nghiệm thức còn lại Các nghiệm thức ở nồng độ BA cao (0,6 ppm; 0,8 ppm) lá hình thành nhỏ, thuôn nhọn, xanh vàng Điều này có thể do cytokinin ngoài vai trò phân chia tế bào, còn kính thích sự biến đổi của những lục lạp còn non thành lục lạp, giúp chồi bên tránh bớt sự ức chế của chồi ngọn, làm chậm sự lão hoá đặc biệt là đối với bộ lá (Bùi Tuấn Anh và ctv., 2000) Do đó, cytokinin ở nồng độ cao đã gây bất lợi cho sự phát triển của bộ lá