khi chuyển từ ống nghiệm ra vườn ươm trên 3 nền giá thể khác nhau: tro trấu, xơ dừa, tro trấu + xơ dừa (tỷ lệ 1:1) và nylon giữ ẩm
Để đảm bảo cho các cây con sinh trưởng và phát triển tốt thì các chất làm nền: xơ dừa, tro trấu được ngâm trong nước tối thiểu 3 ngày để không còn chất chát hay mặn. Sau đó các nền môi trường này được khử trùng hoặc được trộn với thuốc diệt nấm.
Mục đích: nhằm tìm ra loại nền môi trường có giá thể thích hợp cho cây gấc in vitro khi chuyển ra vườn ươm có tỷ lệ sống cũng như có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt nhất.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 2 nhân tố, nhân tố thứ nhất là 3 loại nền giá thể (tro trấu, xơ dừa, tro trấu + xơ dừa), nhân tố thứ hai là có phủ và không phủ nylon lên các rổđựng các mẫu cây, với 5 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 4 cây, mỗi cây trồng trong 1 chậu.
Thí nghiệm được bố trí như sau
Chỉ tiêu theo dõi
- Chiều cao (cm) - Số lá
- Tỷ lệ sống (%)
Xử lý số liệu
Tất cả số liệu thu thập được đều được tiến hành:
- Các số liệu là tỷ lệ phần trăm biến động từ 0-100% được chuyển sang dạng Arcsin√x theo công thức trong bảng tính Excel: với x là giá trị phần trăm cần đổi (%); giá trị x là 0% được tính bởi công thức ASIN(SQRT(x) + 1/4n), giá trị x là 100% được tính bởi công thức ASIN(SQRT(x) – 1/4n), ngược lại là
ASIN(SQRT(x), n là cỡ mẫu dựa trên để tính phần trăm.
- Các số liệu là sốđo và sốđếm được chuyển sang dạng Log+1 theo công thức trong bảng tính Excel.
- Phân tích thống kê bằng chương trình MSTATC với phép thử DUNCAN ở mức ý nghĩa 5%.
- Dùng chương trình Microsoft Excel để vẽđồ thị. Loại giá thể
Nylon Xơ dừa Tro trấu Xơ dừa + Tro trấu Phủ NT1 NT3 NT5
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Thí nghiệm 1: Hiệu quả của Benzyl Adenine(BA) và Indole-3-butyric acid (IBA) đến sự tạo chồi gấc in vitro
Thí nghiệm này nhằm tìm ra nồng độ BA và IBA thích hợp để đạt được hệ số nhân chồi cao nhất. Kết quả ghi nhận như sau:
3.1.1 Chiều cao chồi gia tăng (cm)
Qua kết quả trình bày ở Bảng 3.1 cho thấy, vào thời điểm 3 tuần sau khi cấy (TSKC) nghiệm thức 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA có chiều cao cụm chồi gia tăng cao nhất (4,09 cm) và khác biệt có ý nghĩa thống kê 5% so với ba nghiệm thức: đối chứng, 0,8 ppm BA và 1 ppm BA. Tuy nhiên không khác biệt so với các nghiệm thức còn lại. Trong đó nghiệm thức 0,8 ppm BA có chiều cao cụm chồi gia tăng thấp nhất (3,21 cm).
Vào thời điểm 6 TSKC, ba nghiệm thức 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA, 0,1 ppm BA+0,01 ppm IBA và 0,4 ppm BA+0,04 ppm IBA có chiều cao cụm chồi cao hơn so với các nghiệm thức còn lại, và có khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1%, nhưng giữa chúng lại không có sự khác biệt thống kê. Trong đó nghiệm thức 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA có chiều cao cụm chồi gia tăng cao nhất (6,72 cm), nghiệm thức 1 ppm có chiều cao cụm chồi gia tăng thấp nhất (3,71 cm).
Trong suốt quá trình tiến hành thí nghiệm ghi nhận, hai nghiệm thức 0,1 ppm BA+0,01 ppm IBA và 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA cây sinh trưởng và phát triển tốt với lá mới hình thành to hơn so với các nghiệm thức còn lại. Các nghiệm thức ở nồng độ BA cao (0,6 ppm; 0,8 ppm) lá hình thành nhỏ, thuôn nhọn, xanh vàng. Điều này có thể do cytokinin ngoài vai trò phân chia tế bào, còn kính thích sự biến đổi của những lục lạp còn non thành lục lạp, giúp chồi bên tránh bớt sựức chế của chồi ngọn, làm chậm sự lão hoá đặc biệt là đối với bộ lá (Bùi Tuấn Anh và ctv., 2000). Do đó, cytokinin ở nồng độ cao đã gây bất lợi cho sự phát triển của bộ lá.
Bảng 3.1 Hiệu quả của BA và IBA lên sự gia tăng chiều cao cụm chồi của mẫu chồi gấc in vitro theo thời gian (tuần sau khi cấy)
Nghiệm thức Tuần sau khi cấy 3 6 Đối chứng 3,46 bc 4,68 de 0,1 ppm BA 3,78 abc 5,65 bc 0,2 ppm BA 3,62 abc 5,67 bc 0,4 ppm BA 3,67 abc 5,10 cd 0,6 ppm BA 3,45 ab 4,29 def 0,8 ppm BA 3,21 c 4,13 ef 1 ppm BA 3,34 bc 3,71 f 0,1 ppm BA+0,01 ppm IBA 4,06 a 6,38 ab 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA 4,09 a 6,73 a
0,4 ppm BA+0,04 ppm IBA 3,90 ab 5,87 abc 0,8 ppm BA+0,08 ppm IBA 3,73 abc 5,07 cde F tính * ** CV (%) 11,23 9,9
Ghi chú:
Trong cùng một cột các số có chữ số theo sau giống nhau không khác biệt có ý nghĩa thống kê.
ns: không khác biệt có ý nghĩa thống kê
*: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%
**: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1%
Qua kết quả phân tích chiều cao cho thấy, vào cả 2 thời điểm 3 và 6 TSKC ở các nghiệm thức có sự kết hợp giữa BA và IBA chiều cao cụm chồi gia tăng cao hơn so với các nghiệm thức chỉ sử dụng BA, và sự khác biệt này biểu hiện càng rõ vào thời điểm 6 TSKC. Trong suốt quá trình tiến hành thí nghiệm, quan sát thấy ở ba nghiệm thức 0,1 ppm BA+0,01 ppm IBA, 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA và nghiệm thức đối chứng có sự xuất hiện rễ. Điều này có thể do hàm lượng auxin nội sinh trong cây gấc cao nên đã gây ra sự xuất hiện rễ. Đồng thời auxin được biết đến là chất điều hoà sinh trưởng có vai trò quan trọng trong sự kiểm soát sự tăng dài của tế bào từ đó đã làm gia tăng chiều dài thân chính. Theo Bùi Tuấn Anh và ctv.
(2000), khi có sự kết hợp giữa cytokinin nồng độ cao và auxin nồng độ thấp thì thân và lá được tạo ra ngược lại thì sự tăng trưởng của rễ bắt đầu. Do đó, có thể sự kết hợp ở nghiệm thức 0,1 ppm BA +0,01 ppm IBA đã xác định được sự phát triển của lá, thân, rễ, còn ở nghiệm thức 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA chỉ giúp cho cây vươn chiều cao và tạo lá còn sự hình thành rễ rất ít.
3.1.2 Trọng lượng cụm chồi gia tăng (g)
Qua kết quả trình bày ở Bảng 3.2 cho thấy, vào thời điểm 3 và 6 TSKC trọng lượng cụm chồi ở tất cả các nghiệm thức đều gia tăng.
Vào thời điểm 3 TSKC, nghiệm thức 0,4 ppm BA+0,04 ppm IBA có trọng lượng cụm chồi gia tăng cao nhất (0,39 g) có khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa1% so với 2 nghiệm thức: đối chứng và 0,2 ppm BA. Tuy nhiên không khác biệt so với các nghiệm thức còn lại.
Vào thời điểm 6 TSKC, nghiệm thức 0,4 ppm BA+0,04 ppm IBA và nghiệm thức 0,8 ppm BA+0,08 ppm IBA có trọng lượng cụm chồi gia tăng cao nhất (1,37 g và 1,38 g) và có khác biệt thống kê so với các nghiệm thức còn lại ở mức ý nghĩa 1%. Nghiệm thức đối chứng có trọng lượng cụm chồi gia tăng thấp nhất (0,58 g).
Bảng 3.2 Hiệu quả của BA và IBA lên sự gia tăng trọng lượng cụm chồi của mẫu chồi gấc in vitro theo thời gian (tuần sau khi cấy)
Nghiệm thức Tuần sau khi cấy 3 6 Đối chứng 0,24 c 0,58 d 0,1 ppm BA 0,33 ab 0,70 cd 0,2 ppm BA 0,27 bc 0,72 cd 0,4 ppm BA 0,36 a 0,82 bcd 0,6 ppm BA 0,31 ab 1,05 b 0,8 ppm BA 0,35 a 0,95 bc 1 ppm BA 0,34 ab 1,00 bc 0,1 ppm BA+0,01 ppm IBA 0,33 ab 0,75 bcd 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA 0,35 a 0,91 bc 0,4 ppm BA+0,04 ppm IBA 0,39 a 1,37 a 0,8 ppm BA+0,08 ppm IBA 0,35 a 1,38 a F tính * ** CV (%) 17,64 17,36 Ghi chú:
Trong cùng một cột các số có chữ số theo sau giống nhau không khác biệt có ý nghĩa thống kê.
ns: không khác biệt có ý nghĩa thống kê
*: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%
**: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1%
Từ kết quả phân tích ở Bảng 3.3 cũng cho thấy, có sự tác động phối hợp giữa 2 nồng độ BA và IBA, nhưng ở 3 TSKC sự biểu hiện khác biệt chưa lớn có thể do sự tác động phối hợp này chưa đủ thời gian để biểu hiện. Trong suốt quá trình tiến hành thí nghiệm quan sát ở tất cả các nghiệm thức đều có sự hình thành mô sẹo ở phần gốc của mẫu chồi cấy, trong đó 2 nghiệm thức 0,8 ppm BA, 1 ppm BA và 0,8 ppm BA+0,08 ppm IBA có phần mô sẹo hình thành to, màu nâu vàng vào thời điểm 6 TSKC. Trọng lượng cụm chồi gia tăng bao gồm sự gia tăng về số chồi, chiều cao, số lá và khối mô sẹo hình thành. Khi tăng nồng độ BA thì mô sẹo gia tăng theo. Do đó trọng lượng cụm chồi ở các nghiệm thức có sử dụng kích thích tố đều có xu
hướng gia tăng cao. Theo Đặng Phương Trâm (1997), sự tăng sinh của mô sẹo chính là kết quả của sự cân bằng giữa trạng thái sinh lý của mẫu cấy và tác động của chất điều hoà sinh trưởng thực vật ngoại sinh trong môi trường nuôi cấy. Những mảnh cơ quan đã trưởng thành thường không có khả năng tạo mô sẹo. Ngược lại, những mảnh thân non hay cây con cắt đoạn dễ tạo mô sẹo trên môi trường có chất điều hoà sinh trưởng thực vật, đặc biệt khi có auxin vì auxin có vai trò trong sự tạo mô sẹo (Ahloowalia, 1991; Komamin và ctv., 1992; Liu và ctv., 1993; Zimmerman, 1993) (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002).Khi nồng độ auxin thấp thì sự tạo rễ bất định chiếm ưu thế, khi nồng độ auxin cao thì không có sự tạo rễ nhưng lại xảy ra sự tạo ra mô sẹo (Torres, 1989) (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002). Nhưng khi nồng độ auxin tăng cao kích thích sự tạo mô sẹo dạng bở và khi giảm nồng độ auxin thì mô sẹo có dạng nốt và chắc. Theo Nguyễn Đức Lượng và ctv. (2002), đa số mẫu cấy thực vật thuộc nhóm song tử diệp không có khả năng tạo mô sẹo trong môi trường chỉ có auxin mà cần phải có sự phối hợp giữa cytokinin và auxin, nhưng cytokinin lại không cần thiết trong sự tạo mô sẹo từ cây một lá mầm và auxin phải được sử dụng với nồng độ cao, ví dụ: 2,4-D 9,0 - 45,2 µM (2,0 - 10,0 mg/l).
3.1.3 Số chồi lớn (chồi hữu hiệu, chiều cao chồi ≥ 2 cm)
Một chồi được xem là hữu hiệu khi chồi này có thể được dùng để nhân tiếp hay tạo rễ cũng như có thểđem ra nhà lưới cho việc thuần dưỡng. Qua quá trình thử nghiệm, chọn các chồi có chiều cao từ 2 cm trở lên, có từ 3-5 lá là chồi hữu hiệu (chồi lớn) và chồi trung bình là chồi có từ 1 đến nhỏ hơn 2 cm chiều cao (chồi nhỏ).
Kết quả trình bày ở Bảng 3.3 cho thấy, vào thời điểm 3 TSKC các nghiệm thức có sự kết hợp giữa BA và IBA thì sự phát sinh chồi cũng như chiều cao chồi cao hơn so với các nghiệm thức chỉ sử dụng BA. Trong đó nghiệm thức 0,4 ppm BA+0,04 ppm IBA có số chồi lớn nhiều nhất (1,23 chồi) và có khác biệt thống kê so với các nghiệm thức còn lại ở mức ý nghĩa 1%. Tuy nhiên lại không khác biệt so với 2 nghiệm thức 0,1 ppm BA+0,01 ppm IBA và 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA, giữa các nghiệm thức còn lại có số chồi lớn vẫn không có sự khác biệt. Điều này có thể do trong thời gian đầu các mẫu chồi đang trong giai đoạn phân hoá.
Vào thời điểm 6 TSKC, nghiệm thức 0,4 ppm BA+0,04 ppm IBA vẫn có số chồi lớn nhiều nhất (4,19 chồi) và khác biệt có ý nghĩa thống kê 1% so với các nghiệm thức còn lại ở mức. Tuy nhiên lại không khác biệt so với nghiệm thức 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA (3,78 chồi). Nghiệm thức 1 ppm BA có số chồi lớn ít nhất (0,28 chồi).
Bảng 3.3 Hiệu quả của BA và IBA lên sự hình thành số lượng chồi lớn của mẫu chồi gấc in vitro theo thời gian (tuần sau khi cấy)
Nghiệm thức Tuần sau khi cấy 3 6 Đối chứng 0,1 ppm BA 0,2 ppm BA 0,4 ppm BA 0,6 ppm BA 0,8 ppm BA 1 ppm BA 0,1 ppm BA+ 0,01 ppm IBA 0,2 ppm BA+ 0,02 ppm IBA 0,4 ppm BA+ 0,04 ppm IBA 0,8 ppm BA+0,08 ppm IBA 0,04 c 0,15 c 0,21 c 0,14 c 0,10 c 0,08 c 0,09 c 0,28 ab 0,73 a 1,23 a 0,23 bc 0,44 de 0,46 de 1,03 c 0,95 cd 0,60 de 0,55 de 0,28 e 2,08 b 3,78 ab 4,19 a 1,81 b Ftính CV (%) ** 80,54 ** 26,52 Ghi chú:
Trong cùng một cột các số có chữ số theo sau giống nhau không khác biệt có ý nghĩa thống kê.
ns: không khác biệt có ý nghĩa thống kê
*: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%
**: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1%
3.1.4 Số chồi nhỏ (1 cm ≤ chiều cao chồi < 2 cm)
Kết quả trình bày ở Bảng 3.4 cho thấy, sự kết hợp giữa BA và IBA đã có hiệu quảđáng kể trong giai đoạn nhân chồi gấc in vitro.
Vào thời điểm 3 TSKC, nghiệm thức 0,4 ppm BA+0,04 ppm IBA có số chồi nhỏ nhiều nhất (3,59 chồi) và khác biệt có ý nghĩa thống kê 5% so với các nghiệm thức còn lại. Tuy nhiên lại không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA. Nghiệm thức đối chứng có số chồi nhỏ ít nhất (0,44 chồi).
Vào thời điểm 6 TSKC, nghiệm thức 0,4 ppm BA+0,04 ppm IBA vẫn cho thấy có sự phát sinh chồi nhỏ nhiều nhất (3,7 chồi) và khác biệt có ý nghĩa thống kê 1% so với các nghiệm thức còn lại. Tuy nhiên lại không khác biệt so với hai nghiệm thức: 0,8 ppm BA+0,08 ppm IBA và 0,4 ppm BA. Nghiệm thức đối chứng có sự hình thành số chồi ít nhất (0,24 chồi).
Bảng 3.4 Hiệu quả của BA và IBA lên sự hình thành số lượng chồi nhỏ của mẫu chồi gấc in vitro theo thời gian (tuần sau khi cấy)
Nghiệm thức Tuần sau khi cấy 3 6 Đối chứng 0,1 ppm BA 0,2 ppm BA 0,4 ppm BA 0,6 ppm BA 0,8 ppm BA 1 ppm BA 0,1 ppm BA+0,01 ppm IBA 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA 0,4 ppm BA+0,04 ppm IBA 0,8 ppm BA+0,08 ppm IBA 0,44 e 0,46 e 0,51 e 0,58 cde 0,62 de 0,90 bcd 0,72 de 1,04 cde 2,26 ab 3,59 a 1,86 bc 0,24 f 1,60 e 2,30 bcd 2,91 ab 2,01 cde 1,84 de 1,52 e 1,64 bc 2,45 bc 3,70 a 2,92 ab F tính CV (%) ** 48,79 ** 12,15 Ghi chú:
Trong cùng một cột các số có chữ số theo sau giống nhau không khác biệt có ý nghĩa thống kê.
ns: không khác biệt có ý nghĩa thống kê
*: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%
Qua kết quả trình bày ở Bảng 3.4 cũng cho thấy, vào thời điểm 3 TSKC ở các nghiệm thức có sử dụng nồng độ BA cao (1 ppm BA; 0,8 ppm BA) và các nghiệm thức có sự kết hợp giữa BA và IBA (0,8 ppm BA+0,08 ppm IBA) thì sự phát sinh chồi nhỏ nhanh hơn so với các nghiệm thức chỉ sử dụng BA. Nhưng sau 6 TSKC ở các nghiệm thức sử dụng nồng độ BA cao, các chồi hầu như không phát sinh hoặc phát sinh rất ít. Các chồi này ngắn hoặc tăng trưởng chậm sau khi hình thành, các lá nhỏ có màu xanh vàng. Điều này có thể do nồng độ cytokinin quá cao đã kích thích sự hình thành nhiều chồi nhỏ, nhưng những chồi này không thể kéo dài, làm lá biến dạng, làm cho chồi chứa nhiều nước (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002).
Ở ba nghiệm thức 0,2 ppm BA; 0,4 ppm BA và 0,6 ppm BA sự phát sinh chồi nhỏ nhiều vào thời điểm 6 TSKC. Điều này có thể do thời gian đủ để nồng độ cytokinin có tác dụng tăng sinh chồi bên bằng cách kính thích sự tăng trưởng của chồi bên và làm giảm hiện tượng ưu thế ngọn của mẫu chồi sau khoảng 4-6 tuần.
Trong quá trình tiến hành thí nghiệm ghi nhận, ở nghiệm thức 0,4 ppm BA+0,04 ppm IBA có sự phát sinh chồi cao nhất (chồi lớn và chồi nhỏ sau 3 và 6 TSKC). Nhưng chồi hữu hiệu ở nghiệm thức này có chiều cao chồi ngắn hơn so với chiều cao chồi hữu hiệu ở hai nghiệm thức 0,1 ppm BA+0,01 ppm IBA và 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA, kèm theo kích thước lá nhỏ hơn, có màu xanh nhạt và hình thái cây phát triển không tốt.