Nuôi cấy mô cây dầu mè

Nuôi cấy mô cây dầu mè

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NUÔI CẤY MÔ CÂY DẦU MÈ

(Jatropha curcas L.)

Nghành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VĂN HẠNH

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 08/2007

**************

NUÔI CẤY MÔ CÂY DẦU MÈ

(Jatropha curcas L.)

Luận văn kỹ sƣ

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

GVHD: Sinh viên thực hiện: PGS.TS TRẦN VĂN MINH NGUYỄN VĂN HẠNH

iii

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn:

 Cha mẹ đã suốt đời tận tụy để con có được ngày hôm nay

 Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường

 Thầy Trần Văn Minh đã tận tình hướng dẫn, ân cần chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

 Cô Bùi Thị Tường Thu, Thạc sĩ Trần Văn Định, Kỹ sư Khưu Hoàng Minh, các anh chị nhân viên cùng các bạn sinh viên thực tập tại Phòng Thí Nghiệm Trọng Điểm Phía Nam về Công Nghệ Tế Bào Thực Vật thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành khoá luận này

 Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã gắn bó, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt 4 năm qua

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Văn Hạnh

iv

TÓM TẮT

NGUYỄN VĂN HẠNH, Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh Tháng

8/2007 “NUÔI CẤY MÔ CÂY DẦU MÈ (Jatropha curcas L.)”

Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS TRẦN VĂN MINH

Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm phía Nam về Công Nghệ Tế Bào Thực Vật, Viện Sinh Học Nhiệt Đới tại TP.HCM Thời gian thực hiện tháng 2 đến tháng 8 năm 2007

Hạt của cây dầu mè có chứa một lượng lớn chất béo (37%) là nguồn nguyên liệu để sản xuất dầu diesel sinh học (biodiesel) Đây là nguồn nguyên liệu mới an toàn cho môi trường, hiệu quả kinh tế và có khả năng tái sinh được Nguồn năng lượng này hứa hẹn sẽ thay thế cho thủy điện, dầu diesel, dầu hỏa, khí hóa lỏng, than, củi … Dầu của cây còn sử dụng để sản xuất chất tẩy rửa, chất nhuộm và dầu thơm Lá, vỏ và rễ cây chứa những chất có đặc tính dược liệu Cây có thể phát triển rất tốt trên những vùng đất khô cằn và không đòi hỏi nhiều sự chăm sóc của con người Do đó, cây dầu mè rất thích hợp trở thành cây công nghiệp mang lại hiệu quả kính tế cao cho người dân Và để đáp ứng cho nhu cầu giống, chúng tôi thực hiện đề tài

“Nuôi cấy mô cây dầu mè (Jatropha curcas L.)”

Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi đạt được một số kết quả sau:

 Mẫu hạt cây dầu mè được vô trùng tốt nhất với Natri hypochlorit 15% trong thời gian 60 phút, mẫu chồi cây dầu mè được vô trùng tốt nhất trong Natri hypochlorit 10% thời gian 45 phút

 Môi trường khoáng cơ bản thích hợp để nuôi cấy mô cây dầu mè in vitro là

v

SUMMARY

NGUYEN VAN HANH, Nong Lam University, HCMC August, 2007

“TISSUE CULTURE OF PHYSIC NUT (Jatropha curcas L.)”

Guided teacher: A.Professor Dr TRAN VAN MINH

This thesis was completed at Southern Key Laboratory for Plant Cell Technology, Institute of Tropical Biology from Frebruary to August 2007

Seeds of Jatropha contain a large amount of fat (37%), are a source to produce biodiesel This is an environmentally safe, cost effective and renewable source of non-conventional energy as a promising substitute to hydel power, diesel, kerosene, LPG, coal, firewood etc Jatropha oil can be used to produce washing agent, dye and perfume Leave, bark and root contain medicinal substance Jatropha can grow in arid and semi-arid condition and does not require so much human care So jatropha is suitable to become an economic industrial plant To produce breed of

jatropha we’ve done this thesis “Tissue culture of physic nut (Jatropha curcas

L.)”

Some results of this thesis:

 Seeds are steriled with Natri hypochlorit 15% for 60 min axillary nodes with Natri hypochlorit 10% for 45 min

 Salt basal culture medium is MS

 Suitable medium for bud proliferation is MS supplemented with BA (0,1 mg/l) and IBA (0,01 mg/l)

 Medium for rooting is MS complemented IBA (0,3 mg/l)

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Nhân giống cây trồng in vitro 3

2.1.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 3

2.1.2 Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật 3

2.1.3 Lợi ích của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật 5

2.1.4 Các giai đoạn nhân giống in vitro 5

2.1.4.1 Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy 5

2.1.4.2 Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy 6

2.1.4.3 Giai đoạn 3: Nhân nhanh 6

2.1.4.4 Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh 6

2.1.4.5 Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất 7

2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô 7

2.1.5.1 Mô nuôi cấy 7

2.1.5.2 Vô trùng trong nuôi cấy 7

2.1.5.3 Điều kiện nuôi cấy 9

vii

2.1.5.4 Môi trường nuôi cấy 12

2.1.5.5 Vai trò của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy 12

2.2.4.1 Phương pháp nhân giống cổ truyền 22

2.2.4.2 Phương pháp nhân giống hiện đại 23

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 25

3.2 Vật liệu 25

3.2.1 Đối tượng thí nghiệm 25

3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ 25

3.2.3 Môi trường nuôi cấy 25

3.2.4 Điều kiện nuôi cấy in vitro 27

3.3 Phương pháp nghiên cứu 27

3.3.1 Phương pháp khử trùng mẫu 27

3.3.2 Bố trí thí nghiệm 28

3.3.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng và thời gian khử mẫu đến tỉ lệ sống của mẫu cây dầu mè 28

viii

3.3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát môi trường khoáng cơ bản

thích hợp để nuôi cấy mô cây dầu mè in vitro 29

3.3.2.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của BA đến khả năng tạo chồi của cây dầu mè 30

3.3.2.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng tạo chồi của cây dầu mè trong điều kiện in vitro 31

3.3.2.5 Thí nghiệm 5: Nuôi cấy tạo rễ cây dầu mè in vitro 32

3.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 33

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

4.1 Thí nghiệm 1: Vô trùng mô cấy ban đầu từ cây thực sinh 34

4.1.1 Vô trùng mẫu hạt 35

4.1.2 Vô trùng mẫu chồi 36

4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát môi trường khoáng cơ bản cho cây dầu mè in vitro 39

4.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của BA đến sự hình thành chồi của cây dầu mè 41

4.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của BA và IBA đến sự hình thành chồi của cây dầu mè 43

4.5 Thí nghiệm 5: Nuôi cấy tạo rễ cây dầu mè in vitro 45

ix

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

x

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1: Cây dầu mè (Jatropha curcas L.) 16

Hình 2.2: Lá và hoa cây dầu mè 18

Hình 2.3: Hoa, quả và hạt cây dầu mè 18

Hình 2.4: Các cây sản xuất dầu thực vật 22

Hình 4.2: Chồi cây dầu mè nảy từ các hạt vô trùng 38

Hình 4.1: Mẫu thực sinh cây dầu mè được vô trùng phát sinh chồi 38

Hình 4.3: Sự phát triển của cây dầu mè trên các môi trường khoáng cơ bản 40

Hình 4.4: Ảnh hưởng của BA đến sự tạo chồi của cây dầu mè 42

Hình 4.5: Ảnh hưởng của BA và IBA đến sự tạo chồi của cây dầu mè 44

Hình 4.6: Nuôi cấy tạo rễ cây dầu mè in vitro 44

Hình 4.7: Cây dầu mè in vitro 46

xi

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Năng suất dầu của cây dầu mè 20

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của nồng độ NaOCl và thời gian xử lý vô trùng mẫu 29

Bảng 3.2: Thí nghiệm xác định môi trường khoáng cơ bản 30

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tạo cụm chồi in vitro cây dầu mè 31

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của BA và IBA đến sự tạo chồi của cây dầu mè 32

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của IBA đến tạo rễ cây dầu mè 33

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử mẫu đến tỉ lệ mẫu hạt vô trùng 35

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử mẫu đến tỉ lệ mẫu chồi vô trùng 36

Bảng 4.3: Khảo sát môi trường khoáng cơ bản cho cây dầu mè 39

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của BA đến sự tạo chồi của cây dầu mè 41

Bảng 4.5: Ảnh hưởng của BA và IBA đến sự tạo chồi của cây dầu mè 43

Bảng 4.6: Tác động của IBA đến việc tạo rễ cây dầu mè in vitro 45

Sản lượng xăng dầu tiêu thụ trên thế giới tăng tỉ lệ thuận với tốc độ tăng trưởng kinh tế, các nước tiêu thụ xăng dầu lớn nhất hiện nay là Mỹ và Trung Quốc Theo ước tính trữ lượng dầu mỏ trên thế giới là có giới hạn Với xu hướng khai thác và sử dụng như hiện nay, chắc chắn trong một thời gian không lâu nguồn nguyên liệu hóa thạch này sẽ cạn kiệt

Do vai trò cực kì quan trọng của dầu mỏ nên trước khi nguồn nguyên liệu này cạn kiệt, con người phải nhanh chóng tìm ra nguồn nguyên liệu thay thế Có nhiều nguyên liệu đã được đề xuất như khai thác năng lượng mặt trời, năng lượng gió, thủy triều, sử dụng nguyên liệu hydrô … Và khoảng 30 năm trở lại đây, có một hướng rất mới là sử dụng dầu diessel sinh học (biodiesel) để thay thế cho dầu diesel bình thường Diessel sinh học là dầu được chiết xuất hoàn toàn từ thực vật như hạt cải dầu (Mỹ), hạt hướng dương (Ý và Miền nam nước Pháp), đậu nành (Mỹ và Braxil), hạt cây bông (Hy Lạp), dầu cọ (Malaysia) và từ hạt cây dầu mè (Nicaragoa và Nam Mỹ) So với các cây khác, cây dầu mè có ưu điểm chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường tốt hơn Ngoài lấy hạt để ép dầu, trồng cây còn giúp cải tạo đất và môi trường nhất là ở những vùng đất hoang, khô cằn

Cây dầu mè là cây có tiềm năng kinh tế rất lớn lại thích hợp với điều kiện khí hậu nhiệt đới của Việt Nam Nếu nhận được sự quan tâm đúng mức của bộ Nông nghiệp, cây hoàn toàn có thể trở thành một cây giúp nông dân làm giàu ngay trên những vùng đất bỏ hoang mà nhiều cây trồng khác không phát triển được

Phương pháp nhân giống cây dầu mè truyền thống là giâm cành, tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm là nhân chậm và rễ tạo ra không sâu nên cây trồng

dễ bị ngã đổ Do đó, tôi thực hiện đề tài “Nuôi cấy mô cây dầu mè (Jatropha

curcas L.)” để tạo ra nguồn cây giống nhanh và liên tục cung ứng cho những yêu

cầu lớn về số lượng cây con

1.2 Mục đích và yêu cầu 1.2.1 Mục đích

Nghiên cứu khả năng nhân giống nhanh cây dầu mè (Jatropha curcas L.) in vitro nhằm tạo nguồn giống cây ban đầu sạch bệnh có tính đồng nhất về mặt di

truyền đáp ứng yêu cầu cây giống phục vụ cho nhu cầu sản xuất

1.2.2 Yêu cầu

o Vô trùng mẫu nuôi cấy để tạo nguồn nguyên liệu ban đầu

o Khảo sát môi trường khoáng cơ bản thích hợp để nuôi cấy in vitro cây dầu

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nhân giống cây trồng in vitro

2.1.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học Nhờ áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên Do đó, tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất

Hơn nữa, dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản cây trồng quý hiếm

Nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô bắt đầu bằng một mảnh nhỏ thực vật vô trùng đặt vào môi trường dinh dưỡng thích hợp Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này tạo ra bằng sự tăng sinh, được phân chia và cấy chuyền để nhân giống

Nuôi cấy mô tế bào thực vật cho đến nay được chứng minh là phương pháp nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan hiệu quả nhất Năm 1939, nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan trên sự hình thành chồi và rễ (White và Nobercourt, 1939) Và các kết quả nghiên cứu về sự tác động của các nhân tố bên trong và bên ngoài ảnh hưởng đến sự hình thành cơ quan (Thorpe, 1980, 1988) Qua kết quả nghiên

cứu quá trình hình thành cơ quan in vitro, cho thấy có 3 nhân tố ảnh hưởng trực

tiếp: môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy và mẫu được sử dụng trong nuôi cấy

Vận dụng quá trình hình thành cơ quan in vitro qua sự tác động tương hỗ của

các nhân tố nói trên, có hàng ngàn loài thực vật đã được nghiên cứu quá trình hình thành chồi và rễ

2.1.2 Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học trẻ nằm trong sinh lý thực vật Ở nước ta ngành này mới được chú ý và phát triển khoảng 15 – 20 năm trở lại đây Trong công tác giống cây trồng, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã

được phát triển những cơ sở lý thuyết về tế bào học và cơ sở sinh lý thực vật học như Nguyễn Văn Uyển (1996) và một số nhà nuôi cấy mô nước ngoài đã nhận định:

- Đó là tính toàn thể của mô và tế bào thực vật, cho phép tái sinh được cây hoàn chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào nuôi cấy tách rời Đây là một điểm rất quan trọng, bởi vì trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện được những kỹ thuật tiên tiến cho việc chọn, cải thiện và cả lai tạo giống cây trồng

- Khả năng loại trừ virus bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tạo các dòng vô tính sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính Vấn đề này được các nhà khoa học khai thác để phục tráng các giống khoai tây, cây ăn trái (cam, quýt)

- Khả năng dùng chồi nách, các thể chồi protocorm vào nhân giống vô tính với tốc độ cực nhanh cây trồng phục vụ sản xuất: cây lương thực (khoai tây), cây cảnh (phong lan), cây lâm nghiệp (bạch đàn, tếch, )

- Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm, khả năng trao đổi quốc tế các nguồn gen sạch bệnh dưới dạng cây nuôi trong ống nghiệm

- Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn, từ đó tạo ra các dòng đồng hợp tử tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn được chu trình lai tạo

- Khả năng hấp thu DNA ngoại lai vào tế bào nhờ công nghệ gen

- Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật như nuôi cấy vi sinh vật và qua đó ứng dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao phục vụ công tác tạo giống

- Kỹ thuật nuôi cấy protoplast và khả năng dung hợp protoplast tái sinh cây hoàn chỉnh từ các protoplast lai

- Khả năng sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất thụ khi lai xa - Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài và ở nhiệt độ thấp không mất tính toàn thể của tế bào

Đồng thời việc nuôi cấy mô tế bào cũng tạo những cơ sở cho quá trình nghiên cứu di truyền thực vật, vai trò chất điều hoà sinh trưởng thực vật

Ngày nay cùng với công nghệ gen, nuôi cấy mô tế bào là một phần quan trọng không thể thiếu, thúc đẩy việc ứng dụng công nghệ sinh học trong ngành kinh

tế Hai nhiệm vụ lớn của công nghệ sinh học thực vật ở nước ta từ nay tới năm 2010 là: tạo ra các giống cây trồng mới bằng phương pháp công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là công nghệ gen và nhân nhanh các giống, dòng ưu việt bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (Nguyễn Văn Uyển, 1996)

2.1.3 Lợi ích của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo Bùi Bá Bổng (1995), nhân giống bằng nuôi cấy mô có những lợi điểm sau:

Nuôi cấy mô giống như nhân giống vô tính vì phương pháp này tạo ra cây con đồng nhất và giống như cây mẹ về mặt di truyền Đối với các cây trồng thuộc nhóm thụ phấn chéo như phần lớn các loài cây ăn trái, các cây con sinh ra từ hạt không hoàn toàn đồng nhất, và có thể không giống như cây mẹ, trong trường hợp này nhân giống vô tính có lợi điểm hơn nhân giống từ hạt

So với kiểu nhân giống vô tính thông thường (chiết cành, hom), nhân giống bằng nuôi cấy mô có ưu điểm là có thể nhân một số lượng cây con lớn từ một cá thể ban đầu trong thời gian ngắn

Có thể tạo ra cây con sạch bệnh nhờ áp dụng việc chọn lọc vật liệu ban đầu một cách chặt chẽ hoặc làm cho vật liệu ban đầu trở nên sạch bệnh Không chiếm nhiều diện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh Một giống cây quý có thể được nhân ra nhanh chóng để đưa vào sản xuất

2.1.4 Các giai đoạn nhân giống in vitro

Theo Trần Thị Dung (2003), sự thành công của việc nhân giống in vitro chỉ

đạt được khi trải qua các giai đoạn:

2.1.4.1 Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy

Đây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống in vitro Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro

Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên Tuy vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chắn sẽ đạt kết quả

2.1.4.2 Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của các giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin, cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, bên cạnh điều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy Thường mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành Người ta còn nhận thấy rằng mẫu nuôi cấy trong thời gian sinh trưởng nhanh của cây cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi

2.1.4.3 Giai đoạn 3: Nhân nhanh

Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình Để tăng hệ số nhân, ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hoà sinh trưởng (Auxin, Cytokynin, Gibberellin,…), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm men,… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp Tuỳ thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành qua các cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính

2.1.4.4 Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ Thường 2 – 3 tuần, từ những chồi riêng lẽ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy

2.1.4.5 Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất

Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của

quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình

này trong thực tiễn sản xuất

Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang

sống hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt dộ, ánh sáng, ẩm độ, giá thể,…) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như ruộng sản xuất

2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô 2.1.5.1 Mô nuôi cấy

Theo lý thuyết tất cả các mô chưa hóa gỗ đang sinh trưởng mạnh như: Mô phân sinh ngọn, tượng tầng, đầu rễ, phôi đang phát triển, thịt quả non…, khi đặt vào môi trường có chứa một lượng hormon thích hợp đều có khả năng tạo mô sẹo Tuy nhiên, mỗi tế bào ở mỗi mô khác nhau có khả năng tạo mô sẹo, phân hóa thành rễ, thân, cành, lá… rất khác nhau

Do đó kết quả thu được cũng rất khác nhau ở những mẫu khi đưa vào nuôi cấy Việc chọn mẫu thực vật để sử dụng trong quá trình nuôi cấy có vai trò quyết định, nếu chọn sai mẫu chúng ta sẽ không thu nhận được kết quả, hoặc thu được những cây sẽ không phát triển mạnh, thậm chí cây có thể ngưng phát triển ở một giai đoạn nhất định (Nguyễn Đức Lượng, 2002) Các kết quả nghiên cứu cho thấy để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định, người ta chú trọng đến các chồi bên và mô phân sinh đỉnh

2.1.5.2 Vô trùng trong nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy mô thực vật có chứa đường, muối khoáng và vitamin, thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển Do tốc độ phân chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật Nếu môi trường nuôi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần toàn bộ bề mặt môi trường nuôi cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn, thí nghiệm phải loại bỏ vì trong điều kiện này mô cấy không thể phát triển và chết dần Khác với thí nghiệm vi

sinh có thể kết thúc trong vài ngày, mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đòi hỏi rất cao mới có hi vọng thành công

Để đảm bảo điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi cấy đòi hỏi chúng ta phải thực hiện các yêu cầu sau:

- Vô trùng mô cấy

- Vô trùng dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy

- Trong thao tác nuôi cấy cần phải tránh làm rơi nấm, khuẩn lên bề mặt môi trường nuôi cấy

Mô cấy có thể là các bộ phận khác nhau của thực vật, tùy theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài mà các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn, nấm Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm, khuẩn Hiệu lực diệt nấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng trên bề mặt mô cấy Các chất kháng sinh ít được sử dụng vì tác dụng không triệt để và ảnh hưởng xấu lên sự sinh trưởng của mô cấy Ngoài ra, người ta còn sử dụng các chất làm giảm sức căng bề mặt như: Tween 80, fotoflo, teepol vào dung dịch diệt nấm khuẩn

Street (1974), đưa ra khái niệm về nồng độ và thời gian sử dụng các chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô cấy như sau (Trần Văn Minh, 2004):

Tác nhân vô trùng Nồng độ % Thời gian xử lý (phút)

phòng và nước máy Sau khi xử lý xong, mô cấy được rửa sạch nhiều lần bằng nước cất vô trùng (tối thiểu 3 lần), loại bỏ những phần bị tác nhân vô trùng trước khi đặt mô cấy lên môi trường nhằm tránh ảnh hưởng trực tiếp của tác nhân vô trùng lên mô cấy (Trần Văn Minh, 2004)

Sơ đồ xử lý mẫu thực sinh:

Đặt lên môi trường nuôi cấy

2.1.5.3 Điều kiện nuôi cấy  Nhiệt độ:

Nhiệt độ có ảnh hưởng sâu sắc đến sinh trưởng và phát triển cây in vitro qua

các tiến trình sinh lý như hô hấp, hình thành tế bào và cơ quan, nhiệt độ thích hợp nhất thường được dùng trong nuôi cấy mô tế bào là từ 20 – 270C (Trần Văn Minh, 2004) Còn theo Hughes (1981), nhiệt độ thích hợp trong nuôi cấy mô là 32 – 350C, trong khi những báo cáo khác ghi nhận nhiệt độ thích hợp cho Streptocapus là 120C

(Appelyren và Heide, 1972), với nhiều loài cây Begonia nhiệt độ thích hợp là 15 – 240C (Heide, 1965; Fonnesbad, 1974) Tuy nhiên nhiều đề nghị cho rằng nên tránh nhiệt độ cao, bởi vì nhiệt độ cao có thể làm cho chức năng kích thích tạo chồi của Cytokinin giảm Hầu hết, những thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật được thực hiện trong phòng thí nghiệm khống chế nhiệt độ, một vài loài cây như Lily sự hình thành thể giò được thực hiện bằng tăng cường sử dụng chu kỳ nhiệt độ ngày và đêm Những người trồng cây công nghiệp cũng sử dụng nhiệt độ để duy trì khả năng sinh trưởng khi yêu cầu nhiệt cho cây non còn thấp Nuôi cấy ở ngăn lạnh làm giảm sinh trưởng và làm giảm giá thành cần thiết do cấy truyền, những cây nuôi cấy này được di chuyển từ ngăn lạnh đến nơi bắt đầu nhân chồi lại khi yêu cầu nhân giống tăng (Hartmann và ctv, 1997)

 Ánh sáng:

Ảnh hưởng của ánh sáng có thể được chia ra trong sự tác động của cường độ ánh sáng (bức xạ hoạt động quang hợp), thời gian chiếu sáng (quang chu kỳ) và chất lượng ánh sáng đến sinh trưởng, phát triển của thực vật Cường độ ánh sáng là nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đến khả năng nuôi cấy in vitro ở những cây có diệp lục tố, mức cường độ ánh sáng điển hình cho vi nhân giống là từ 40 – 80 µmol/m2/giây trong nuôi cấy vươn thân, nhưng cường độ ánh sáng bên trong các bình nuôi cấy có thể thấp hơn nhiều

Kiểu nút đậy kín có thể làm giảm sự truyền ánh sáng vào trong bình cấy, các loài cây khác nhau thì yêu cầu mức độ ánh sáng khác nhau, biên độ ánh sáng này rất thấp so với bức xạ bên ngoài và trong nhà kính (600 – 1200 µmol/m2/giây) Bức xạ ánh sáng cao hơn trong nuôi cấy dị dưỡng có thể làm mất diệp lục (Chlorophyll) và hoại tử lá (Hartmann và ctv, 1997) Rất nhiều nghiên cứu có hệ thống về tác động của quang chu kỳ trong sự phát triển mô nuôi cấy, nhưng chiều dài ngày dài hơn từ 12 – 16 giờ thường là thích hợp nhất Phản ứng quang chu kỳ của hoa có thể được

tạo ra trong in vitro, chồi cây cẩm chướng có thể ra hoa bằng cách xử lý 16 giờ

chiếu sáng, nhưng các thực vật còn lại chỉ 12 giờ là đã có thể ra hoa (Hartmann và ctv, 1997)

Chất lượng ánh sáng là chức năng của đèn chiếu sáng trong nuôi cấy và kiểu bình cấy được sử dụng Thông thường trong các phòng nuôi cấy mô sử dụng đèn ánh sáng trắng hoặc ánh sáng trắng pha đỏ, chất lượng ánh sáng bị ảnh hưởng bởi chất lượng đường truyền của bình và kiểu nút đậy Bình thủy tinh không truyền được ánh sáng có bước sóng ngắn hơn 290 nm, trong khi đó bình polycarbonate không truyền được ánh sáng có bước sóng ngắn hơn 390 nm, mặc dù đây là những số đo khác nhau, nhưng ánh sáng có bước sóng quang trọng nhất cho quang hợp và sự phát sinh quang hình thái là từ 400 – 800 nm Chất lượng ánh sáng cũng làm thay

đổi phản ứng sinh trưởng của chồi in vitro Nuôi cấy cây phong lữ (Pelargonium)

trong ánh sáng đỏ làm tăng chiều dài chồi hơn so với ánh sáng trắng, trong khi đó ánh sáng xanh làm giảm sự kéo dài chồi, ngược lại khả năng quang hợp cao nhất

khi chồi cây Bulo (Betula) đặt trong ánh sáng xanh so với ánh sáng trắng hoặc đỏ,

ánh sáng xanh cũng kích thích phát sinh diệp lục và gia tăng kích thước lá Người ta cho rằng chất lượng ánh sáng là quan trọng trong giai đoạn thuần hóa cây non và có thể bị kích thích bởi xử lý ánh sáng xanh trước khi di chuyển cây từ nuôi cấy Chất lượng ánh sáng cũng có thể tác động gián tiếp lên sự phát triển chồi, là nguyên nhân làm các yếu tố môi trường phát triển trong nuôi cấy thay đổi (Hartmann và ctv, 1997) Nhìn chung ánh sáng kiềm hãm sự phát triển của rễ và có vài chỉ dẫn rằng ngăn không cho ánh sáng từ vùng rễ thì có lợi cho việc hình thành rễ (Hartmann và ctv, 1997)

 Không khí:

Các chất khí có tác động lên sự phát triển chồi trong nuôi cấy in vitro bao

gồm oxy, carbon dioxide và ethylene Các nhà trồng cây thương mại không nỗ lực làm thay đổi mức không khí trong nuôi cấy, tuy nhiên tất cả sự đóng kín và nắp đậy sử dụng cho nuôi cấy mô là trao đổi khí được ở một vài mức độ khác nhau, thường có sự thúc đẩy tăng trưởng thông qua lỗ thông khí bị đóng kín hoặc cung cấp qua màng lọc trao đổi khí (Hartmann và ctv, 1997)

2.1.5.4 Môi trường nuôi cấy

Trong tất cả các môi trường nuôi cấy đều bao gồm năm thành phần chính sau đây:

 Các muối khoáng đa lượng  Các muối khoáng vi lượng  Các Vitamin

 Đường làm nguồn cacbon  Các chất điều hòa sinh trưởng

Ngoài ra, người ta còn bổ sung thêm một số chất hữu cơ có thành phần xác định như acid amin, EDTA, hoặc không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men…vào trong môi trường tùy theo nhu cầu riêng của từng đối tượng nuôi cấy

Trong hàng trăm môi trường do rất nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây khác nhau, có thể phân loại ra 3 môi trường:

- Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: White, Knop

- Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: B5, Gamborg - Môi trường giàu chất dinh dưỡng: MS (Mura shige – Skoog)

2.1.5.5 Vai trò của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy

Chất điều hoà sinh trưởng là những chất với liều lượng thấp hiệu ứng sinh học cao, được tổng hợp tại một cơ quan và gây ảnh hưởng điều tiết đến các quá trình sinh lý, trao đổi chất nào đó trong những cơ quan khác Chất điều hoà sinh trưởng là sản phẩm trao đổi chất bình thường của cơ thể thực vật Nó đóng vai trò chủ đạo trong quá trình sinh trưởng, phát triển và những quá trình sinh lý, hoá sinh khác cũng như trong phản ứng thích nghi của thực vật đối với điều kiện của môi trường (Bùi Trang Việt, 2000)

 Auxin:

Auxin hoạt hoá sự phân bào, sinh trưởng kéo dài, cần cho sự tạo mạch dẫn và ra rễ, tăng trưởng của quả, tạo quả không hạt, kích thích sinh trưởng của ống phấn (Bùi Trang Việt, 2000)

Sự vận chuyển auxin có vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng và phân hoá, auxin giúp kéo dài và phân chia tế bào, các hiện tượng hướng động, ưu thế ngọn, lão suy, rụng, đậu, tăng trưởng và chín của quả….(Nguyễn Văn Kế, 2000)

Auxin kích thích mạnh sự kéo dài tế bào diệp tiêu Sự kéo dài của tế bào rễ cần những nồng độ auxin thấp hơn nhiều so với thân và chồi Hiệu ứng auxin giảm khi nồng độ auxin nhỏ hơn nồng độ tối ưu và trở nên độc ở các nồng độ quá cao

Tất cả cây trồng đều tổng hợp được chất auxin (dạng tổng hợp) tuỳ theo giai đoạn phát triển của chúng Ngay từ khi chất auxin được nhận dạng, có nhiều chất có cấu trúc gần nhau và giống nhau về mặt hoá học đã được thí nghiệm

Một vài chất này đã thể hiện các đặc tính tương tự như các đặc tính của chất auxin, nhưng thường với các liều lượng thấp hơn, hơn nửa chúng ít bị kiểm soát bởi các enzyme và có thể có một tác động kéo dài trong đó có NAA Trong lĩnh vực

nuôi cấy in vitro, những chất này đã chiếm một vị trí quan trọng, hai tính chất được

nghiên cứu nhiều là kích thích sự phân chia tế bào và sự hình thành rễ (Trần Văn Minh, 2004)

Auxin chẳng những kích thích sự tăng trưởng của chồi non mà còn khởi phát cho sự tạo mới Ở nồng độ thấp và thường dùng kết hợp với cytokinin thì auxin khởi phát mô phân sinh ngọn, vượt quá nồng độ giới hạn thì auxin ngăn cản sự phát triển của lá mới hay của mô phân sinh bên (Bùi Trang Việt, 2000)

 Cytokinin:

Các cytokinin kích thích mạnh sự phân chia tế bào với điều kiện có sự hiện diện của auxin Cytokinin cũng giúp sự gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein Cytokinin ngăn cản sự lão hoá mô, thúc đẩy sự hình thành chồi non nhưng lại ức chế sự tạo rễ (Dương Công Kiên, 2002)

Sự sinh trưởng tổng hợp Cytokinin ở trong cây xảy ra ở những vùng rất khác nhau, đặc biệt là ở những nơi có sự phân chia tế bào mạnh (ở ngọn thân hay rễ) Nó hiện diện hầu hết trong các mô, đặc biệt trong hạt, trái và trong rễ Tuy nhiên, rễ là nơi tổng hợp nhiều nhất Vì vậy khi rễ bị tổn thương thì thấy nụ phát triển yếu do không tạo đủ cytokinin Nó hoạt hoá sự phân bào, song tác động này chỉ thể hiện

trong sự phối hợp với auxin (Trần Văn Minh, 2004) Trong nuôi cấy mô, cytokinin thể hiện các tính chất cho phép chúng ta giải quyết những khó khăn trong việc duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hướng tế bào trong con đường phân hoá (Trần Văn Minh, 2004)

Ảnh hưởng của than hoạt tính

Nồng độ sử dụng thường là từ 0,2 – 3% Than hoạt tính có những tác dụng sau:

Hấp thụ độc tố nâu/đen (hợp chất phenol và melanin) và các độc tố không màu khác

Hấp thụ các hợp chất hữu cơ khác (auxin, cytokinin, ethylene, vitamin, chelate Fe và Zn…)

Thúc đẩy sự tạo phôi soma Ổn định độ pH

2.1.5.6 Ảnh hưởng của pH và Agar

pH của môi trường nuôi cấy thường ở khoảng 5,8 – 6 thì tốt trong nuôi cấy mô Nếu pH môi trường thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 7 đều ức chế sự phát triển của mô (Nguyễn Văn Uyển, 1993 và Bùi Bá Bổng, 1995)

Agar xuất phát từ rong biển, được sử dụng như là chất keo trong hầu hết môi trường dinh dưỡng Agar là polysaccharide, trọng lượng phân tử cao có khả năng làm đông môi trường Agar hoà tan hình thành chất keo kết dính với nước và hấp thụ hoá chất Nồng độ agar thường sử dụng trong nuôi cấy mô là 0,6 – 0,8 %

Trong những năm gần đây sử dụng môi trường hai pha (pha rắn và pha lỏng) trở nên khá phổ biến vì tốc độ nhân giống cao và giảm hiện tượng thuỷ tinh thể Đầu tiên mẫu cấy được đặt trên môi trường rắn, sau đó thêm vào một lớp môi trường lỏng Một phần mẫu cấy ở trong môi trường lỏng, một phần ở trong môi trường rắn, một phần ở trong không khí

Nếu nuôi cấy trong môi trường lỏng cần phải cung cấp oxy tạo sự thoáng khí bằng cách sử dụng máy lắc Tế bào, mô nuôi cấy có thể bị tổn thương nhưng thường sinh trưởng và phát triển tốt vì mẫu cấy hấp thu dinh dưỡng dễ dàng trên toàn bộ mẫu cấy

2.2 Giới thiệu về cây dầu mè (Jatropha curcas L.)

của cây dầu mè tại vùng Malabar, Ấn Độ

Hình 2.1: Cây dầu mè (Jatropha curcas L.)

Tên bản xứ của cây dầu mè ở một số nước:( Heller, 1996) Physic nut, purging nut (Anh)

Pignon d’Inde (Pháp) Purgeernoot (Hà Lan) Purgiernu, Brechnu (Đức) Purgueira (Bố Đào Nha) Fafiola d’India (Ý)

Dand barri, habel meluk arand (Hindi) Kadam (Nepal)

Yu-lu-tzu (Trung Quốc) Sabudam (Thái Lan)

Túbang-bákod (Philippine) Jarak dudeg (Indonesia) Bagani (Cô te d’Ivoire) Kpoti (Togo)

Tabanani (Senegal) Mupuluka (Angola) Butuke (Nigeria) Makaen (Tanzania) Pinoncillo (Mexico)

Coquillo, tempate (Costa Rica) Tartago (Puerto Rico)

Ở Việt Nam cây được gọi là cây dầu mè hay cây cọc rào (vì thường được trồng làm rào dậu)

2.2.2 Đặc điểm sinh học 2.2.2.1 Mô tả

Cây dầu mè là cây bụi gỗ mềm, thân thẳng cao trung bình 6m với tán rộng Cành non mập và mọng nước, nhựa cây có màu trắng sữa hay màu vàng nhạt, lá rụng sớm, mọc dày ở phần ngọn Lá có hình ovan, hoặc hình trái tim, có lá chẻ thùy

3 đến 5 thùy Lá dài 6 – 40cm, rộng 6 – 35cm, cuống dài 2,5 – 7,5cm Hoa thường nở vào tháng 4 – 5 tạo thành nhiều chùm có màu vàng nhạt, hình chuông Hoa đực có 10 nhị trong đó 5 nhị dính vào phần chân đế, 5 nhị kết lại thành bó Hoa cái rời rạc với bầu nhuỵ hình elip, chia làm 3 ô, với 3 núm nhuỵ phân nhánh Quả có dạng nang, kích thước 2,5 – 4cm về chiều ngang và đường kính Quả chia thành 3 ngăn, hạt nằm trong các ngăn này Hạt cây thuôn màu đen kích thước 2 x 1cm

Hình 2.2: Lá và hoa cây dầu mè

Hình 2.3: Hoa, quả và hạt cây dầu mè 2.2.2.2 Sinh thái

Cây dầu mè có thể phát triển trong các điều kiện khí hậu khô cằn Điều kiện thích hợp nhất cho cây phát triển là mưa ít (200mm) nhưng cây vẫn có thể sống được ở nơi có lượng mưa cao lên đến 1200mm Khi gặp hạn hán, cây thích ứng bằng cách rụng hầu hết lá để làm giảm sự thoát hơi nước Nhiệt độ thích hợp cho cây là 18 – 28,5oC Điều kiện để hạt nẩy mầm là khí hậu nóng ẩm Hoa nở trong mùa mưa và tạo quả trong mùa đông

Có nhiều bằng chứng cho thấy cây dầu mè có nguồn gốc từ Mexicô và Trung Mỹ, nhưng hiện nay cây được tìm thấy ở hầu hết các nước có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới như Brazil, Honduras, Fiji, Ấn Độ, Jamaica, Panama, Puerto Rico và Salvador

Cây dầu mè đã có mặt ở Việt Nam từ trước thế kỷ XIV.Cho đến nay cây đã được trồng rải rác ở nhiều địa phương: Đức Trọng, Bắc Bình, Lạng Sơn, Hàm Thuận Bắc, Hàm Thuận Nam, Ninh Sơn, Thanh Hoá, Lào Cai, Đồng Nai, thành phố Hồ Chí Minh …

2.2.3 Công dụng 2.2.3.1 Nhựa mủ

Nhựa cây dầu mè có chứa các alkaloid như jatrophine, jatropham, jatrophone và curcain là những chất có tính kháng bệnh ung thư Lá có chứa apigenin, vitexin và isovitexin Ngoài ra trong lá và cành non còn chứa amyrin, stigmosterol và stigmastenes là những chất có tính kháng khuẩn, chống viêm, chống dị ứng và ôxi hóa Chất béo có trong hạt cây giàu palmitic, oleic acid và linoleic acid Hạt cây có tính độc là do thành phần alkaloid curcin của nó Nhựa cây được dùng để trị các bệnh ngoài da như u nhọt, hắc lào, xuất huyết da Cành non có tác dụng làm sạch răng miệng (NIIR Board of Consultants and Engineers, 2006)

2.2.3.2 Lá, vỏ và rễ cây

Lá cây được chú ý với khả năng kích thích tạo sữa, gây xung huyết da và kháng kí sinh trùng Lá được sử dụng để chống ghẻ, thấp khớp, tê liệt, u xơ

Rễ cây có tác dụng tẩy giun sán, chữa rắn cắn

Vỏ cây dùng để thuốc cá, và dùng điều trị các vết thương ngoài da

Nước sắc của vỏ và rễ cây dùng điều trị thấp khớp, bệnh hủi, chứng khó tiêu và tiêu chảy (NIIR Board of Consultants and Engineers, 2006)

2.2.3.3 Hạt và dầu

Hạt cây là loại thuốc trị bệnh phù, bệnh gút (gout), chứng liệt và các bệnh về da Dầu cây dầu mè có tính tẩy rửa

2.2.3.4 Dầu mè và nguyên liệu sinh học

Ngoài các tác dụng trị bệnh kể trên, cây dầu mè được sự chú ý đặc biệt bởi nó là nguồn nguyên liệu sinh học (biofuel) Hạt của cây có độ ẩm (6.62%), protein (18.2%), chất béo (38%), carbohydrate (17.3%), sợi (15.5%) và tro (4.5%) Dầu chiếm 35 – 40% hạt và 50 – 60% nhân hạt Trong dầu chứa 21% các acid béo không bão hòa Hạt được xay và ép lấy dầu hoặc dầu được tách bằng các dung môi Tên thương mại của loại dầu này là Jatropha Dầu sau khi lọc được sử dụng ngay như là nguồn nguyên liệu sinh học ở dạng bổ sung, dầu Jatropha có thể trộn với dầu thường với tỉ lệ lên đến 20% Đây là nguồn năng lượng mới an toàn, chi phí thấp và là nguồn năng lượng tái sinh được, hứa hẹn sẽ là nguồn năng lượng thay thế cho thủy điện, dầu diessel, dầu lửa, khí hóa lỏng (LPG), than, củi … Nguồn năng lượng này sẽ giúp các nước cắt giảm một khoản tiền cho năng lượng và phần nào xóa đi sự mất cân bằng về sử dụng năng lượng giữa các vùng Dầu Jatropha có thể hoàn toàn thay thế cho dầu lửa để sưởi ấm và nấu ăn Ưu điểm là khói từ dầu Jatropha không có mùi và không cay như khói dầu hỏa và không để lại mùi cho thức ăn sau khi nấu (NIIR Board of Consultants and Engineers, 2006)

Việt Nam phải chi khoảng 2 tỉ 410 triệu đô la một năm để nhập khẩu các sản phẩm dầu (năm 2003) và ngày càng tăng theo các năm Đây là khoản chi rất lớn của ngân sách quốc gia, có ảnh hưởng đến toàn bộ nền kinh tế Trong tương lai dầu Jatropha sẽ thay thế dầu diesel bởi nó có những đặc tính lý hóa tương tự như dầu diesel, các động cơ chạy bằng dầu diesel thường khi chuyển sang sử dụng dầu Jatropha cũng không phải thay đổi nhiều về cấu trúc động cơ

2.2.3.4.1 Hiệu quả kinh tế của dầu Jatropha

Bảng 2.1: Năng suất dầu của cây dầu mè

Tuổi cây (năm) Năng suất dầu (kg/ha)

Nguồn: NIIR Board of Consultants and Engineers, 2006

Như vậy với 1 ha cây dầu mè 6 năm tuổi hằng năm có thể thu được 10 tấn dầu Hiện nay giá dầu Jatropha được bán trên thị trường thế giới với giá khoảng 320 USD/ tấn (Trích từ trang web www.bulkoil.com ngày 7/8/2007)

2.2.3.4.2 Dầu Jatropha so với các loại dầu thực vật khác

Trên thế giới hàng năm sản xuất khoảng 110 tỉ tấn dầu thực vật, 70% trong số đó được sản xuất từ 4 loại cây sau: đỗ tương (26%), dầu cọ (18%), hướng dương

(13%), cải dầu (12%) [Internet 1]

Hình 2.4: Các cây sản xuất dầu thực vật

Cây đỗ tương Cây dầu cọ Cây hướng dương Cây cải dầu

Cây dầu mè so với những cây trên là một cây còn khá mới mẻ, chưa được biết nhiều đến Nhưng nếu tính về phương diện sản xuất dầu sinh học thì cây dầu mè cho hiệu quả kinh tế lớn hơn rất nhiều bởi cây dầu mè là cây lâu năm có thể tạo quả trong nhiều thâp niên, cây có thể phát triển mà không cần phải chăm sóc nhiều trên những vùng đất khô cằn

2.2.4 Nhân giống

Những nghiên cứu về nhân giống cây dầu mè trên thế giới và ở Việt Nam còn rất hạn chế Cho đến nay phương pháp nhân giống cây dầu mè chủ yếu vẫn theo lối cổ truyền là giâm cành và gieo hạt Các phương pháp nhân giống hiện đại áp dụng trên cây dầu mè mới chỉ mới phát triển trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây

2.2.4.1 Phương pháp nhân giống cổ truyền

Ở Nam Phi, người dân trồng cây dầu mè làm rào dậu hoặc trồng cây để chống xói mòn và bảo vệ đất thường sử dụng phương pháp giâm cành vì ưu điểm của phương pháp này là nhanh chóng tạo được cây trưởng thành Cành được cắt từ các cây dầu mè đã trưởng thành cắm xuống đất, nếu được chăm sóc cẩn thận thì sau khoảng 2 đến 3 tháng là có được cây đủ lớn để đem trồng Cây tạo ra từ phương pháp giâm cành sau khoảng 1 năm sẽ bắt đầu sinh sản (NIIR Board of Consultants and Engineers, 2006)

Trồng cây để khai thác dầu lâu năm thì phương pháp nhân giống bằng gieo hạt được sử dụng nhiều hơn Bởi những nghiên cứu đã chỉ ra rằng, cây tạo thành từ nhân giống bằng giâm cành có đời sống ngắn hơn và khả năng chống hạn và bệnh tật kém hơn cây nhân giống bằng hạt Rễ của cây giâm cành phát triển yếu dễ bị gẫy đổ (Heller, 1996) Hạt trước khi đem gieo được lựa chọn là những hạt to, chắc, mẩy Hạt được ngâm nước qua đêm để làm tăng tỉ lệ nẩy mầm Hôm sau, hạt được gieo vào trong các bầu đất Hạt sẽ nẩy mầm sau khoảng 1 tuần và cây con có thể đem đi trồng sau 45 ngày Rễ của cây con mọc từ hạt phát triển, thường có 1 rễ cái và 4 rễ bên Cây trồng ngoài thực địa sẽ sinh sản sau khoảng 3 – 4 năm (Heller, 1996) Nhược điểm của phương pháp nhân giống bằng hạt là chất lượng cây con không đồng nhất bởi cây dâu mè là cây thụ phấn chéo nên giữa các hạt có sự khác nhau về

mặt di truyền Như xét tính trạng hàm lượng dầu trong hạt, các cây tạo ra bằng gieo hạt có hàm lượng dầu trong hạt không ổn định, giao động từ 4 đến 40 % (Timir baran Jha và ctv, 2007) Trong khi kiểm tra chất lượng hạt giống là một việc khó khăn thì tỉ lệ sống và nẩy mầm của hạt thấp do đó nhân giống bằng phương pháp gieo hạt không thể đáp ứng đủ nhu cầy cây giống chất lượng tốt cho việc trồng cây trên qui mô công nghiệp

2.2.4.2 Phương pháp nhân giống hiện đại

Các phương pháp nhân giống hiện đại có ưu điểm lớn là có khả năng tạo giống cây với số lượng lớn trong khoảng thời gian ngắn với chất lượng cao và đồng nhất Tuy nhiên những nghiên cứu này còn ít hoặc ít được công bố

Năm 1995, M Sujatha và N Mukta đã phát triển kĩ thuật tái sinh cây dầu mè từ nhiều bộ phận khác nhau của cây như phần trụ dưới lá mầm, cuống lá và lá Sự tạo thành chồi non bất định được chứng minh là hiệu quả nhất ở môi trường MS bổ sung 2,22 M BA và 4,9 M IBA Sau đó mô sẹo được tái sinh gián tiếp trên môi trường MS bổ sung 0,44 M BA và 0,49 M IBA Chồi non hình thành được nuôi và tạo rễ trong môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng cho đến khi phát triển thành cây hoàn chỉnh để đưa ra vườn ươm

Năm 2005, M Sujatha và các cộng sự đã thành công trong nhân giống in vitro cây dầu mè bằng phương pháp tạo cụm chồi Nghiên cứu đã tạo chồi non bằng

cách nuôi nách lá cây dầu mè trên môi trường MS bổ sung TDZ nồng đô 2,3 – 4,5 % sau đó chuyển sang môi trường MS bổ sung IBA và BA Hiệu quả tạo chồi cao 10 – 12,3 chồi/mẫu cấy Việc tạo chồi bất định từ lá thu được bằng cách nuôi mẫu lá trên môi trường bổ sung 8,9 – 44,4 M BA + 4,9 M indole-3-butyric acid (IBA) để tạo thành mô sẹo có màu trắng xanh, các chồi bất định sẽ được tạo thành sau khoảng 3 tuần sau đó chuyển sang môi trường bổ sung 8,9 M BA + 2,5 M IBA

Phương pháp phát sinh phôi từ tế bào soma (somatic embryogenesis) - một công cụ mạnh của nghành công nghệ sinh học để tạo giống cây trồng – đã được áp dụng thành công lần đầu tiên trên cây dầu mè bởi Timir baran Jha và các cộng sự

(Timir baran Jha và ctv, 2007) Sụ phát sinh phôi soma được tạo ra bằng nuôi mẫu lá trên môi trường MS có các chất kích thích sinh trưởng thực vật Kinetin và IBA, phôi được khích thích phát triển bằng cách bổ sung thêm adenine sulphate trong môi trường Các phôi soma chín sẽ tạo các cây non trên môi trường ½ MS Toàn bộ quá trình nhân giống kéo dài 12 – 16 tuần Đây là nghiên cứu tiền đề cho những nghiên cứu về chuyển gen trên cây dầu mè về sau

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 2 đến tháng 7 năm 2007 tại Phòng thí nghiệm trọng điểm phía Nam về Công nghệ tế bào Thực Vật, Viện Sinh Học Nhiệt Đới thuộc Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam tại TP.HCM

3.2 Vật liệu

3.2.1 Đối tượng thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành trên cây dầu mè (Jatropha curcas L.) được trồng

tại vườn giống Viện Sinh Học Nhiệt Đới thuộc Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam tại Thành phố Hồ Chí Minh

3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ

Thiết bị: tủ vô trùng, nồi hấp, máy đo pH, cân điện tử, máy lạnh, nhiệt kế, ẩm kế, kệ đặt bình, đèn neon,…

Dụng cụ: pince, kéo, dao cấy, bình thuỷ tinh 500ml, đĩa, đèn cồn

3.2.3 Môi trường nuôi cấy

Các môi trường được sử dụng gồm: Môi trường MS, ½ MS, WPM, ½ WPM Trong đó môi trường ½ MS và ½ WPM là môi trường MS và WPM mà thành phần đa lượng được giảm đi một nửa

- Môi trường MS cải tiến (Murashige và Skoog, 1962)