Nghiên cứu nhân giống vô tính cây tiêu bằng phương pháp nuôi cấy mô

Nghiên cứu nhân giống vô tính cây tiêu bằng phương pháp nuôi cấy mô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

  

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY TIÊU

(Piper nigrum) BẰNG PHƯƠNG

PHÁP NUÔI CẤY MÔ

Niên khóa : 2001-2005

Sinh viên thực hiện : NGUYỄN HỮU ĐỊNH

Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 7/2005

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

  

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY TIÊU

(Piper nigrum) BẰNG PHƯƠNG

PHÁP NUÔI CẤY MÔ

KS Nguyễn Thị Kim Linh

Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 7/2005

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn

 Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh

 Quí thầy cô trường Đại học Nông Lâm, đặc biệt là các quí thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường

 Các quí thầy, cô, cán bộ, công nhân viên của khoa Công Nghệ Sinh Học của trường đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khoá luận này

Đặc biệt, tôi xin được tỏ lòng biết ơn chân thành đến o Tiến sĩ Trần Thị Dung

o Kỹ sư Nguyễn Thị Kim Linh

 Đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khoá luận

 Xin được gửi lời cám ơn đến tất cả các bạn bè, các anh chị em trong và ngoài lớp Công Nghệ Sinh Học 27 dã góp ý, động viên và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trường

 Cuối cùng xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và thành kính tới cha mẹ, anh chị em trong gia đình và người thân.

TÓM TẮT

NGUYỄN HỮU ĐỊNH, Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2005

“NGHIÊN CỨU NHÂN GIÔNG VÔ TÍNH CÂY TIÊU (Piper nigrum) BẰNG

PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ”

Giáo viên hướng dẫn: Tiến sĩ TRẦN THỊ DUNG

Kỹ sư NGUYỄN THỊ KIM LINH

Thí nghiệm “Bước đầu nghiên cứu nhân giống vô tính cây tiêu (Piper nigrum)

bằng phương pháp nuôi cấy mô” được tiến hành tại bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trường Đại Học Nông Lâm – TP.HCM từ ngày 3 tháng 3 năm 2005 đến ngày 15 tháng 8 năm 2005 Gồm 3 thí nghiệm

1 Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu cấy

Thí nghiệm 1a: Khảo sát việc khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch chất kháng sinh

Tetracylin

Thí nghiệm 1b: Khảo sát việc khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch chất kháng sinh

Streptomycin

Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường MS

Kết quả đạt được: sau 15 ngày nuôi cấy kết quả cho thấy thời gian khử trùng mẫu tốt nhất là 6 giờ và Tetracylin cho hiệu quả khử trùng tốt hơn Streptomycin

2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với IBA lên sự tạo mô sẹo từ lá

Nghiệm

thức BA (mg/L) IBA (mg/L) Số chai Số mẫu MS1

MS2 MS3 MS4 MS5 MS6 MS7 MS8 MS9

0 0 0 1 1 1 3 3 3

0 1 2 0 1 2 0 1 2

9 9 9 9 9 9 9 9 9

36 36 36 36 36 36 36 36 36

Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường MS có bổ sung chất kích thích sinh trưởng BA và IBA có hàm lượng thay đổi theo 9 nghiệm thức được bố trí theo bảng trên

Kết quả đạt được: sau 45 ngày nuôi cấy mẫu lá cho thấy môi trường có 3mg/L BA + 1mg/L IBA cho mô sẹo mọc sớm nhất (7 ngày sau cấy) và có khả năng phát triển chồi Ngoài ra, môi trường có 3mg/L BA + 2mg/L IBA và môi trường có 1mg/L BA + 1mg/L IBA cũng cho mô sẹo phát triển tốt

Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo

Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường MS có bổ sung chất kích thích sinh trưởng 3mg/L BA và hàm lượng TDZ hoặc Ki thay đổi theo 5 nghiệm thức được bố trí theo bảng sau:

Nghiệm

thức BA (mg/L) TDZ (mg/L) Ki (mg/L) Số bình Số mẫu C1

C2 C3 C4 C5

3 3 3 3 3

0,1 0,3 0,5 0 0

0 0 0 1 0

15 15 15 15 15

45 45 45 45 45

Kết quả đạt được: Sau 60 ngày nuôi cấy mô sẹo kết quả cho thấy môi trường có 0,3mg/L TDZ cho hiệu quả nhân chồi tốt nhất Ngoài ra, môi trường có 0,1mg/L TDZ và môi trường có 0,5 mg/L TDZ cũng cho hiệu quả nhân chồi khá cao

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật 3

2.1.1 Giai đoạn khởi xướng (1898-1930) 3

2.1.2 Giai đoạn nghiên cứu sinh lý (1930-1950) 3

2.1.3 Giai đoạn nghiên cứu phát sinh hình thái (1950-1960) 4

2.1.4 Giai đoạn triển khai nuôi cấy mô vào công nghệ sinh học thực vật 4

2.2 Tổng quan về cây tiêu 5

2.2.1 Nguồn gốc và lịch sử phát triển cây tiêu 5

2.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ hạt tiêu trên thế giới và Việt Nam 5

2.2.2.1 Thế giới 5

2.2.2.2 Việt Nam 7

2.3 Tình hình nuôi cấy mô cây tiêu 10

2.3.1 Công trình nghiên cứu nuôi cấy cây hồ tiêu ở trong nước 11

2.3.2 Một số công trình nghiên cứu nuôi cấy cây hồ tiêu ở nước ngoài 12

2.4 Nhóm các chất điều hòa tăng trưởng ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy mô 12

2.4.1 Auxin 12

2.4.1.1 Tính chất sinh lý của Auxin 13

2.4.1.2 Auxin trong cây trồng 13

2.4.1.3 Các chất auxin tổng hợp 14

2.4.2 Gibbérelline 14

2.4.2.1 Tính chất sinh lý của Gibbérelline 14

2.4.2.2 Gibbérelline trong cây trồng 15

2.4.3 Cytokinine 15

2.4.3.1 Tính chất sinh lý của Cytokinine 15

2.4.3.2 Cytokinine trong cây trồng 16

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 17

3.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 17

3.2.1 Phòng chuẩn bị 17

3.2.2 Phòng cấy 17

3.2.3 Phòng nuôi cây 17

3.2.4 Môi trường cơ bản dùng trong thí nghiệm 17

3.3 Vật liệu nuôi cấy 18

3.4 Phương pháp thí nghiệm 18

3.4.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu cấy 19

3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với IBA lên sự tạo mô sẹo từ lá 21

3.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo 23

3.5 Phân tích thống kê 24

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu cấy 25

4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với IBA lên sự tạo mô sẹo từ lá 27

4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự tái sinh chồi từ mô sẹo 29

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NT: Nghiệm thức

T2: Thời gian xử lí mẫu 2 giờ bằng Tetracylin T6: Thời gian xử lí mẫu 6 giờ bằng Tetracylin T10: Thời gian xử lí mẫu 10 giờ bằng Tetracylin S2: Thời gian xử lí mẫu 2 giờ bằng Streptomycin S6: Thời gian xử lí mẫu 6 giờ bằng Streptomycin S10: Thời gian xử lí mẫu 10 giờ bằng Streptomycin TLMS: Trọng lượng mô sẹo

HSTTMS: Hệ số tăng trưởng mô sẹo HSNC: Hệ số nhân chồi

TLTCC: Trọng lượng tươi cụm chồi NSC: Ngày sau cấy

TDZ: Thidiazuron BA: Benzyladenine

IBA: Indolylbutyrique acid Ki: Kinetine

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Sản lượng tiêu của những quốc gia sản xuất tiêu từ 1991-1996 (đơn vị: tấn) 6

Bảng 2.2 Tình hình sản xuất hồ tiêu các tỉnh trọng điểm (1997 - 1999) 8

Bảng 2.3 Tình hình sản xuất - xuất khẩu hạt tiêu của Việt Nam và thương mại quốc tế9 Bảng 2.4 Thị trường và số lượng hạt tiêu xuất khẩu từ 1996 – 6 tháng đầu năm 200010 Bảng 3.1 Mô tả thí nghiệm 1a 19

Bảng 3.2 Mô tả thí nghiệm 1b 19

Bảng 3.3 Mô tả thí nghiệm 2 22

Bảng 3.4 Mô tả thí nghiệm 3 23

Bảng 4.1 Kết quả xử lí mẫu với kháng sinh Tetracylin 25

Bảng 4.2 Kết quả xử lí mẫu với kháng sinh Streptomycin 26

Bảng 4.3 Tỉ lệ mẫu sống và mẫu sạch xử lí kháng sinh Tetracylin và Streptomycin trong thời gian 6 giờ 26

Bảng 4.4 Thời gian xuất hiện mô sẹo của cây tiêu nuôi cấy từ mô lá 27

Bảng 4.5 Bảng trọng lượng tươi của mô sẹo và hệ số tăng trưởng của mô sẹo vào ngày thứ 45 sau cấy 28

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng hình thành chồi của cây tiêu nuôi cấy từ lá sau 60 ngày 29

DANH MỤC CÁC HÌNH

Tên hình Trang

Hình 4.1 Mô sẹo mọc trên môi trường Khoáng MS + 8,5g Agar + 10g Đường saccharose + 3mgBA/L + 1mgIBA/L (nghiệm thức thứ 8) sau 7 ngày nuôi cấy 31Hình 4.2 Mô sẹo mọc trên môi trường Khoáng MS + 8,5g Agar + 10g Đường saccharose + 3mgBA/L + 2mgIBA/L (nghiệm thức thứ 9) sau 16 ngày nuôi cấy 31Hình 4.3 Mô sẹo mọc trên môi trường Khoáng MS + 8,5g Agar + 10g Đường saccharose + 1mgBA/L + 1mgIBA/L (nghiệm thức thứ 5) sau 17 ngày nuôi cấy 32Hình 4.4 Chồi mọc trên môi trường Khoáng MS + 8,5g Agar + 30g Đường saccharose + 3mgBA/L + 0.3mgTDZ/L (nghiệm thức 2) sau 60 ngày nuôi cấy 32Hình 4.5 Chồi mọc trên môi trường Khoáng MS + 8,5g Agar + 30g Đường saccharose + 3mgBA/L + 0.1mgTDZ/L (nghiệm thức1) sau 60 ngày nuôi cấy 33Hình 4.6 Chồi mọc trên môi trường Khoáng MS + 8,5g Agar + 30g Đường saccharose + 3mgBA/L + 0.5mgTDZ/L (nghiệm thức 3) sau 60 ngày nuôi cấy 33

PHẦN 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Điều kiện khí hậu nước ta nhìn chung rất thích hợp cho việc phát triển cây hồ tiêu.Tuy nhiên, do nước ta có mùa mưa rất tập trung và có mùa nắng kéo dài nên đây sẽ là điều kiện rất thuận lợi cho sâu bệnh phát triển và đây sẽ là nguyên nhân gây giảm năng suất, sản lượng và phẩm chất cho cây tiêu Bên cạnh các loại sâu hại (rầy, rệp sáp, tuyến trùng ) còn có cả virus gây bệnh tiêu điên, thối rễ, rụng đốt Đây là các nhân tố gây bệnh cho cây tiêu mà nó có thể ẩn tích trong thân của cây tiêu Bởi vậy, bằng phương pháp nhân giống thông thường như: Chiết, ghép, giâm cành hoặc trồng bằng hạt thì hệ số nhân giống sẽ thấp mà cây giống khi đem trồng sẽ vẫn mang theo mầm bệnh thông qua các thao tác nhân giống này và sẽ gây hại cho cây giống Vì vậy, hiện nay việc nhân giống vô tính cây tiêu bằng phương pháp nuôi cấy mô thực sự cần thiết vì cho hệ số nhân giống cao đồng thời sẽ làm giảm được tác nhân gây hại cho cây giống và đã đem lại hiệu quả rất thiết thực trong việc nâng cao chất lượng giống cây

con Hiện nay đã có một số công trình nghiên cứu nhân giống in vitro hồ tiêu để kháng

nấm bệnh Phytophthora

Đặc biệt, công tác nhân giống in vitro còn là tiền đề thuận lợi cho việc nuôi cấy

đỉnh sinh trưởng hay xử lí nhiệt để tạo các giống tiêu sạch bệnh để nâng cao năng suất, phẩm chất cho cây tiêu

Ngoài ra, công tác nhân giống in vitro cây tiêu có thể nhân giống được hàng

loạt các cây con giống có năng suất và phẩm chất tốt như các cây bố mẹ đã chọn lọc cũng như có thể cung cấp nhiều giống tiêu thích hợp cho năng suất theo từng vùng để phục vụ cho nhu cầu sản xuất của nông dân

Trước thực trạng trên và đặc biệt để tận dụng điều kiện khí hậu, địa lí của nước ta để phát triển, nâng cao năng suất, phẩm chất và sản lượng cho cây tiêu; đồng thời nhằm từng bước đưa nước ta lên vị trí cao nhất trong các nước sản xuất và xuất khẩu tiêu trên thế giới, được sự đồng ý của bộ môn Công Nghệ Sinh Học chúng tôi đã tiến

hành đề tài “NGHIÊN CỨU NHÂN GIÔNG VÔ TÍNH CÂY TIÊU (Piper nigrum)

BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ”

1.2 Mục đích:

Tìm ra công thức khử trùng mẫu cấy ban đầu đạt hiệu quả cao Khảo sát khả năng tạo mô sẹo từ lá

Tìm ra môi trường thích hợp tái sinh chồi tiêu từ mô sẹo

Theo dõi và ghi nhận số chồi và trọng lượng chồi và hệ số nhân chồi sau 60

ngày nuôi cấy

1.4 Giới hạn đề tài:

Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn nên chúng tôi chưa thực hiện được các thí

nghiệm nhân nhanh chồi và tạo cây hoàn chỉnh

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trải qua gần trăm năm phát triển, và có thể phân chia ra thành 4 giai đoạn phát triển như sau:

2.1.1 Giai đoạn khởi xướng (1898-1930)

Đầu tiên là các thí nghiệm của Haberlandt (1898) khi ông đề xướng ra tính toàn thế của tế bào và tìm cách nuôi cấy tế bào phân lập từ tầng tế bào lược, tế bào tầng nhu mô, tầng biểu bì và lông hút của thực vật để minh chứng cho luận điểm của ông nhưng không thành công

Tiếp theo Haberlandt còn có các thí nghiệm khác của Winkler (1902), Thielmann (1924) và Kuster (1928) tiến hành tương tự nhưng không nhận được tế bào phân chia nào

Phải đến những năm 30 của thế kỷ thứ 20 người ta mới đạt được những tiến bộ thực sự:

Schmucker (1929), Scheitterer (1931), Pfeiffer (1931, 1933), Larue (1933) thông báo về nuôi cấy thành công đoạn đầu rễ riêng rẽ Trong môi trường nhân tạo những đoạn rễ này đã phát triển thành những chiếc rễ hoàn chỉnh Đây là một tiến bộ đánh dấu một giai đoạn phát triển mới

2.1.2 Giai đoạn nghiên cứu sinh lý (1930-1950)

Bắt đầu bằng thành công của White (1934) nuôi cấy được một dòng rễ cà chua sinh trưởng mạnh và liên tục

Năm 1934 Gautheret thông báo thành công trong việc nuôi cấy mô tách từ

tượng tầng của cây Salix apraea và cây Populus nigra Mô nuôi cấy đã liên tục phân

chia trong nhiều tháng trên môi trường Knop bổ sung glucose và cysteinhyochloride Trong thời kỳ này Went và Thimann (1937) đã phát hiện ra IAA là một auxin tồn tại tự nhiên trong cơ thể thực vật IAA đã được Gautheret sử dụng vào môi trường nuôi cấy, kết quả thu được mới chỉ hạn chế ở mô tượng tầng của cây Salix

Năm 1938 Nobecourt nhận được phân bào ở mô củ cà rốt Daucus carota Cùng năm 1938, White đã nuôi cấy được mô tượng tầng của cây thuốc lá lai Nicotiana

glauca lai với N.langsdorffi Vào cuối thời kỳ này đã có những quan sát về sự phân

hóa cơ quan rễ, lá trong mô nuôi cấy của cây cà rốt hoặc cây thuốc lá lai

2.1.3 Giai đoạn nghiên cứu phát sinh hình thái (1950-1960)

Đại diện cho giai đoạn này là: Miller, Skoog, Steward, Reinert

Giai đoạn phát sinh hình thái bắt đầu bằng công trình của Camus (1949) ghép chồi lên khối mô nuôi cấy và thấy quá trình phân hóa ống mạch xảy ra trong khối mô

Năm 1956 Miller và Skoog đã tạo chồi thành công từ mô thuốc lá nuôi cấy Trong giai đoạn này Skoog đã phát hiện ra kinetin là một chất điều khiển quá trình phân bào và phân hóa chồi

Năm 1958-1959 Steward và Reinert đã sử dụng nước dừa vào nuôi cấy tế bào cà rốt và đã thu được phôi từ tế bào cà rốt nuôi cấy

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn trong dịch lỏng được Muir (1953) xây dựng đối với

tế bào của cây Tagetes erecta và Nicotiana tabacum và Nickell (1956) nuôi được tế bào đơn của Phaseolus vulgaris trong dịch lỏng thông qua cấy chuyền 4 năm liên tục

Năm 1960 Bergmann đã phát triển kỹ thuật tế bào đơn lên một bước mới tạo được khối mô sẹo từ một tế bào đơn bằng kỹ thuật gieo trải tế bào thực vật trên đĩa thạch

2.1.4 Giai đoạn triển khai nuôi cấy mô vào công nghệ sinh học thực vật

1959 Melchers sử dụng mô đơn bội của Antirrhinum majus nghiên cứu tính

biến động mức bội thể trong nuôi cấy và gây đột biến

1967 Nitsch, 1968 Nakata và Tanaka tạo được cây đơn bội từ bao phấn thuốc lá 1960 Cocking tách được tế bào trần protoplast

1964 Guha và Maheswari tạo được cây cà độc dược có bộ nhiễm sắc thể đơn bội từ nuôi cấy túi phấn

1968 Niieki và Ono nuôi cấy thành công bao phấn và tạo được cây đơn bội ở

lúa (Ozyza sativa)

1971 Takebe tái sinh được cây thuốc lá hoàn chỉnh từ protoplast thuốc lá giống Xanthi

1977 Melchers lai soma thành công cây cà chua và cây khoai tây 1985 cây thuốc lá mang gen biến nạp đầu tiên được công bố

1994 giống củ cải đường mang gen kháng bệnh virus biến nạp được đưa vào

sản xuất đại trà tại Na Uy

2.2 Tổng quan về cây tiêu

2.2.1 Nguồn gốc và lịch sử phát triển cây tiêu

Cây tiêu (Piper nigrum) thuộc họ Piperaceae Có nguồn gốc từ tây nam Ấn Độ

nằm ở vùng Ghats và Assam, mọc hoang trong rừng, được người Ấn Độ phát hiện, sử dụng đầu tiên và cho rằng việc phát hiện này là rất quý giá

Đến đầu thế kỷ thứ XIII cây tiêu mới được trồng rộng rãi và sử dụng trong bữa

ăn hàng ngày Lúc này, cây tiêu đã được trồng cả ở Indonesia và Malaysia Đến thế kỷ

thứ XVIII cây tiêu được trồng ở Srilanka và Campuchia Vào đầu thế kỷ thứ XX thì cây tiêu được trồng tiếp ở các nước nhiệt đới như Châu Phi như: Madagasca, Nigieria, Congo và ở châu Mỹ như: Brazil, Mexico…

Ở nước ta cây tiêu được trồng rất lâu từ trước khi người Pháp đến xâm chiếm Khi những người Trung Hoa di dân vào Campuchia ở dọc vùng biển vịnh Thái Lan như: Konpong Trach, Kep, Campot và lúc đó tiêu được trồng ở nước ta chủ yếu ở đảo Phú Quốc, Hòn Chông, Hà Tiên, một số ít ở Bà Rịa và Thủ Dầu Một

2.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ hạt tiêu trên thế giới và Việt Nam 2.2.2.1 Thế giới

Theo thống kê của FAO thì hiện nay trên thế giới có khoảng 70 quốc gia trồng tiêu 1954 toàn thế giới có khoảng 64.000 tấn hột tiêu

1978 là 160.000 tấn hột tiêu 1983 là 180.000 tấn hột tiêu

Sau 1982 sản lượng tiêu trên thế giới giảm dần do sâu bệnh và thời tiết Đồng thời một phần cũng do sự ô nhiễm môi trường gây ảnh hưởng tới sự thụ phấn của hoa tiêu

Đến năm 1989-1990 diện tích trồng tiêu trên toàn thế giới đã tăng vọt và sản lượng đạt khoảng 185.000 tấn tiêu hột Các nước sản xuất tiêu nhiều nhất trên thế giới lúc này là Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Brazil, Madagasca và Srilanka

Hiện nay, những nước trồng tiêu nhiều nhất là Ấn Độ, Indonesia và Việt Nam Trên thế giới mức tiêu thụ hạt tiêu hàng năm đạt khoảng 4-5% Các sản phẩm được trao đổi dưới dạng: tiêu đen, tiêu trắng, tiêu xanh và dầu nhựa tiêu Hiện nay, nước Mỹ đang đứng đầu về nhập khẩu tiêu với khoảng 1/3 lượng tiêu của thế giới Sau đó là các nước Nga, Đức, Pháp, Ý và thị trường của Anh Ngoài ra thị trường các nước

Trung Đông và Bắc Phi cũng đang tiêu thụ ngày càng nhiều

Bảng 2.1 Sản lƣợng tiêu của những quốc gia sản xuất tiêu từ 1991-1996 (đơn vị: tấn)

Quốc gia 1991 1992 1993 1994 1995 1996 Trung bình

Asia & Pacific 182,016 183,721 144,976 158,028 169,189 153,988 165,320

India 55,000 60,000 55,000 50,000 55,000 60,000 55,833 Indonesia 61,000 62,000 23,500 42,500 59,000 39,200 47,867 Malaysia 29,000 26,000 17,600 16,000 13,000 12,000 18,933 Vietnam 8,900 7,830 18,500 20,000 20,000 20,000 15,872 China P.R 13,108 12,321 10,461 12,409 5,000 8,000 10,217 Thailand 10,443 10,500 9,000 10,104 10,949 9,773 10,128 Sri Lanka 2,850 3,255 9,000 5,000 3,725 3,000 4,472 Cambodia 1,700 1,800 1,900 2,000 2,500 2,000 1,983 Brunei Darus 15 15 15 15 15 15 15

Africa 5,427 4,543 4,665 4,565 4,565 4,565 5,833

Madagasca 2,160 2,000 2,300 2,300 2,500 2,500 2,327 Malawi 1,000 900 700 700 700 700 900 Zimbabue 700 800 900 700 700 700 750 Benin 894 150 150 150 150 150 299 Kenya 200 300 400 300 300 300 300 Cote di Voire 100 100 100 100 100 100 100 Cameroon 63 63 65 65 65 65 64

2.2.2.2 Việt Nam

a Tình hình sản xuất

Trước năm 1975, Miền Bắc được trồng chủ yếu ở Nghệ An, Quảng Bình và Miền Nam được trồng ở Phú Quốc, Long Khánh, Lộc Ninh Năm 1995 diện tích từng bước gia tăng song biến động không ổn định bởi thiên tai, bệnh tật Từ 1990-1995 do giá tiêu bị giảm mạnh và không có thị trường tiêu thụ nên các vườn tiêu bị phá đi rất nhiều

Từ năm 1996 các nước như Indonesia, Brazil,… bị ảnh hưởng của thiên tai, khu vực Đông Nam Á bị khủng hoảng tài chính, nên giá tiêu đã gia tăng lên 4.000 USD/tấn vào năm 2000, và đó là cơ hội thuận lợi cho hồ tiêu Việt Nam vươn lên chiếm lĩnh thị trường hạt tiêu thế giới

Năm 1997-1999 diện tích tiêu tăng từ 9.777 lên 15.461 ha Diện tích tiêu tăng nhanh nhất ở vùng Đông Nam Bộ từ 5.893 ha tăng lên 9.115 ha (chiếm 60,27% diện tích tiêu của cả nước)

Bảng 2.2 Tình hình sản xuất hồ tiêu các tỉnh trọng điểm (1997 - 1999) Đơn vị tính: DT (ha); NS (tấn/ha); SL (tấn)

Nguồn: Tổng cục thống kê Việt Nam, năm 2000

Số thứ tự

Hạng Mục

Diện tích Tổng số

Năng suất tăng chậm và có sự sai khác rất lớn giữa các vùng và tỉnh có trồng tiêu Năng suất bình quân năm 1997 là 2,08 tấn/ha đến năm 1999 cũng chỉ đạt 2,12 tấn/ha nhưng cao nhất là ở vùng Đông Nam Bộ đạt 2,55 tấn/ha, trong khi năng suất thấp nhất là ở vùng Bắc Trung Bộ chỉ đạt 0,75 tấn/ha (bằng 29,4% so với năng suất tiêu của vùng Đông Nam Bộ) Đặc biệt tỉnh Bình Phước với diện tích thu hoạch 2.405 ha, năng suất đạt 3,8 tấn/ha (gấp 6,9 lần năng suất tiêu của tỉnh Quảng Bình)

Năng suất bình quân năm 1997 đạt 18.970 tấn Sản lượng tiêu tính trên diện tích cho thu hoạch theo thống kê năm 1997 là 13.007 tấn và năm 1999 tăng lên 18.970 tấn song thực tế xuất khẩu năm 1999 đạt 34.000 tấn Tổng lượng tiêu 3 năm 1997-1999 là 47.860 tấn trong khi lượng tiêu xuất khẩu lại là 74.500 tấn

Bảng 2.3 Tình hình sản xuất - xuất khẩu hạt tiêu của Việt Nam và thương mại quốc tế

Đơn vị tính: Tấn

Năm Sản lượng hạt tiêu sản xuất

Khối lượng xuất khẩu

Thương mại quốc tế 1996

1997 1998 1999

Tổng cộng

10.500 13.007 15.883 18.970

58.360

25.300 24.700 23.000 34.800

107.800

195.700 243.700 225.000

Nguồn: Bộ thương mại, năm 2000

b.Tình hình tiêu thụ

Nước ta chủ yếu sản xuất mặt hàng tiêu đen, thị trường tiêu thụ trong nước hàng năm chỉ đạt khoảng 3.500-4.000 tấn/năm, còn phần lớn sản lượng tiêu dành cho xuất khẩu

Theo Bộ Thương Mại, hạt tiêu Việt Nam đã xuất khẩu cho 30 nước trên thế giới Cả nước xuất khẩu từ 1996-1999 là 107.800 tấn (bình quân một năm 26.950 tấn), tốc độ tăng 12% /năm Riêng số liệu xuất khẩu mà cơ quan kiểm dịch tại cảng TP.Hồ Chí Minh cho biết từ 1996 đến 20/6/2000 là 110.656 tấn Đặc biệt 6 tháng đầu năm 2000 đã xuất khẩu 28.801 tấn

Thị trường tiêu xuất khẩu chủ yếu của Việt Nam (1996-6/2000) là các nước:

Mỹ, các nước EU, Singapore

Bảng 2.4 Thị trường và số lượng hạt tiêu xuất khẩu từ 1996 – 6 tháng đầu năm 2000

(Tại cảng Sài Gòn - Thành phố Hồ Chí Minh) Năm Số lượng (tấn) Thị trường nhập 1996

1997 1998 1999

6 tháng đầu năm 2000

Tổng cộng

24.776,80 20.815,51 7.669,78 28.593,42 28.801,16

110.656,67

Mỹ, Ấn Độ, Singapore, EU, Hà Lan, Pháp, Ai Cập, Hồng Kông, Malaysia, Sudan, UAE, Bulgaria, Pakistan, Kuwait, Israel, Hy

lạp, Đức, Hungari, Nga, Tây Ban Nha

Nguồn: Kiểm dịch - Cục BVTV, năm 2000

2.3 Tình hình nuôi cấy mô cây tiêu

2.3.1 Công trình nghiên cứu nuôi cấy cây hồ tiêu ở trong nước:

Nghiên cứu nhân giống in vitro một số giống hồ tiêu sạch virus do Đoàn Thị Ái

Thuyền, TS.Thái Xuân Du và Đỗ Đăng Giáp; Viện Sinh học Nhiệt Đới thực hiện Mẫu chồi sau khi lấy được rửa sạch và sát trùng bằng cồn 700 rồi dung nước tẩy Javel pha loãng 1/3 khử trùng mẫu trong khoảng 30-40 phút Có thể dùng HgCl2 (0,1%) hoặc ngâm trong dung dịch kháng sinh Cefotaxin (1%) từ 1-2 giờ Sau khi ngâm trong dung dịch kháng sinh Cefotaxin 1% (1, 2, 24 giờ) Kết quả cho 20-70% mẫu bị nhiễm sau 7-14 ngày nuôi cấy Khi bổ sung kháng sinh Cefotaxin (1%) vào môi trường nuôi cấy Kết quả cho khoảng 20-30% mẫu được vô trùng hoàn toàn sau 3-4 tuần nuôi cấy Đồng thời khi cấy chuyền sang môi trường mới không có kháng sinh, chồi mới không có khả năng tái nhiễm trở lại

Ngoài ra, thử nghiệm khử trùng bằng cách kết hợp dung dịch Acid Benzoic bão hòa, dung dịch tẩy Javel và kháng sinh Kết quả thu được khoảng 40-50% mẫu khử

trùng không tái nhiễm

Khả năng tạo chồi mới của đốt gốc là tốt nhất so với đốt giữa và đốt ngọn Khả năng tạo mô sẹo ở mỗi loại đốt cũng tương tự như ở tạo chồi Khi nồng độ BA hơn 5,0mg/L hoặc TDZ sẽ ức chế khả năng hình thành chồi, và khi bổ sung một nồng độ Cytokinin và Auxin thích hợp sẽ làm tăng số chồi hình thành ở đốt cấy hồ tiêu Nồng độ NAA hoặc IBA càng cao thì khối mô sẹo tạo ra càng nhiều Các mô sẹo trắng, xốp khi cấy chuyền sang môi trường tạo chồi sẽ ít có khả năng tái tạo chồi Môi trường MS

có bổ sung BA (5,0mg/L), Ki (0,5mg/L) và IBA (0,5mg/L) là thích hợp cho khả năng biệt hóa chồi từ mô sẹo Ở nồng độ BA (3,0mg/L), Ki (0,5mg/L) và IBA (0,5mg/L) chồi sẽ phát triển mạnh hơn, chồi lớn hơn và khi cắt chồi nuôi cấy trên môi trường MS thì khả năng tạo rễ và phát triển tốt hơn những môi trường còn lại Môi trường tạo rễ là ½ MS + NAA (0,1-1,0mg/L) hoặc IBA (0,1-1,0mg/L) Môi trường ½ MS có bổ sung than hoạt tính (1,0mg/L) là thích hợp để cây ra rễ ở cây hồ tiêu, không cần sử dụng Auxin cho mục đích ra rễ (Đoàn Thị Ái Thuyền, Thái Xuân Du và Đỗ Văn Giáp, 2003)

2.3.2 Một số công trình nghiên cứu nuôi cấy cây hồ tiêu ở nước ngoài:

Phương pháp vi nhân giống tạo dòng cây hồ tiêu sử dụng các mảnh cấy như: đầu rễ, mắt nhánh và chồi ngọn từ cả cây tiêu non và cây trưởng thành (Mathews và Rao, 1984; Agarwal, 1988; Philip và ctv 1992; Nazeem và ctv 1993; Nirmal Babu và ctv 1993; Joseph và ctv 1996; Lissamma và ctv 1996) Trong phương pháp vi nhân giống cây tiêu bị gây trở ngại do sự nhiễm của vi sinh vật (Kelkar và Krishnamurthy, 1996) Trong đó việc nuôi cấy hạt tiêu là ít bị nhiễm nhất Tốc độ nhân chồi của tiêu khoảng 6 chồi / 90 ngày nuôi cấy

Các cây con in vitro phải được để trong phòng ẩm mát khoảng 20-30 ngày để

cây con có điều kiện phát triển cứng cáp và thích nghi dần với điều kiện sống bên

ngoài Cây tiêu in vitro phát triển khá tốt trên đồng ruộng Qua báo cáo sớm về phương pháp nuôi cấy in vitro cây tiêu (Chua 1981, Fitchet 1988), phenolic được tiết

ra từ vết cắt của mẫu cấy và vi sinh vật gây nhiễm nội sinh trong mẫu cấy (Mohan

1985, Fitchet 1988) là hai yếu tố ngăn cản qui trình nhân giống in vitro cây tiêu

Madhusudhanan và Rahiman (1996) báo cáo họ đã sử dụng hoạt chất charcoal (200mg/L) kết quả là đã làm giảm được sự hóa nâu mẫu cấy của các giống tiêu

P nigrum, P longum, P attenuatum và P betle Sự kết hợp chất kháng sinh

trong môi trường nuôi cấy đã kiểm soát được vi sinh vật nội sinh trong cây tiêu nuôi cấy theo Kelkar và Krishnamurthy (1996)

Tái sinh cây tiêu từ nuôi cấy mô sẹo đã được hệ thống hóa mô sẹo phát triển thành lá và chồi để tái sinh cây tiêu mới (Nirmal Babu và ctv 1993, Nazeem và ctv 1993, Bhat và ctv 1995) Cây mới được tái sinh trực tiếp từ mô lá thông qua giai đoạn mô sẹo (Nirmal Babu và ctv 1993)

Những báo cáo về phương pháp vi nhân giống cây tiêu đã đóng góp quan trọng

cho nền kinh tế và mối liên hệ giữa các giống tiêu: Piper viz, P longum, P chaba, P

betle, P colubrinum, P attenuatum và P barberi

Các Protocol của P longum có tốc độ nhân dòng nhanh bắt đầu từ các đầu rễ

(Sarasan và ctv 1993, Nirmal Babu và ctv 1993, Rema và ctv 1995) Phương pháp vi

nhân giống cây tiêu P chaba đã được (Nirmal Babu và ctv 1993, Rema và ctv 1995)

tiêu chuẩn hóa Sự chuyển hóa của mô phân sinh rễ và mô phân sinh ngọn đã giúp cây

con phát triển, ở cây tiêu P longum và P.colurinum đã được báo cáo về vấn đề này (Nirmal Babu và ctv 1993) Các cây con in vitro của giống tiêu này đã được đánh giá,

thử nghiệm ở phòng thí nghiệm nghiên cứu chủng loại Calicus ở Ấn Độ Cây tiêu đã

được tái sinh từ lá và thân là: P longum, P betle, P chaba, P attenuatum và P

colubrinum chúng tái tạo các cơ quan một cách trực tiếp hoặc gián tiếp (Bhat và ctv

1992, Bhat, ctv 1995, Rema và ctv 1995, Madhusudhanan và ctv 1996)

2.4 Nhóm các chất điều hòa tăng trưởng ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy mô

Sự hiện diện của các hormone tăng trưởng đã được khám phá ra cuối thế kỷ 20 Trong đó chất Auxin là chất được khám phá đầu tiên vào năm 1934, kế đến là các chất Gibbérellines và chất cytokinin trong những năm 1950 Các hormone này đều có tác dụng kích thích lên sự chuyển hóa của tế bào Các chất này có nguồn gốc nội sinh, ngoài ra còn có các chất tổng hợp khác do con người điều chế mà nó có công thức hóa học gần giống hoặc khác với các chất trong thiên nhiên, nhưng chúng biểu hiện một hoạt động về một sinh lý tương tự

*Một số đặc tính cơ bản của các chất kích thích sinh trưởng

Chúng hoạt động ở liều rất yếu; ở liều cao chúng trở nên độc, điều này cho phép một số chất kích thích tố được sử dụng như thuốc diệt cỏ

Chúng can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, điều này bao hàm ít nhiều dạng thức hoạt động của chúng, từ sự kiện này khái niệm về “hormone chuyên biệt” hiện tại đã được bỏ đi

2.4.1 Auxin

Auxin được khám phá ra do các thí nghiệm thực hiện trên các phản ứng về đường cong của loài Coléoptiles họ Graminées Do có tác dụng trong hoạt động kéo dài tế bào nên có tên như vậy Đây là một chất có nhân indole, có công thức nguyên là C10H9O2N, có tên là acid indole β acetique hoặc acid β indolylacétique

2.4.1.1 Tính chất sinh lý của Auxin

Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nó phụ thuộc vào nồng độ và các sự hỗ tương qua lại của chúng với các chất điều hòa khác Các tác động của Auxin được thể hiện như sau:

Kéo dài tế bào: làm ra tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nước vào bên trong tế bào; lúc đó sự đề kháng của thành tế bào giảm đi và tế bào tự kéo dài ra

Sự thay đổi về tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng một sự phóng thích ion H+ , ion này gây ra một hoạt tính acid có tác dụng làm giảm tính đề kháng của thành tế bào và bởi sự hấp thu ion K+

Một hoạt động tổng quát trên sự chuyển hóa và đặc biệt là trên sự tổng hợp ARN robosomique

Sự kích thích về sự phân chia tế bào đối với các tế bào nguồn gốc cambium Hiệu quả này là do chất “histogène” bởi vì nó dẫn đến có nhiều tế bào giống nhau hoàn toàn, các tế bào này tạo nên một “mô sẹo”

Hoạt động lên sự tổng hợp ethylene bắt đầu từ một vài nồng độ; chất etylen tham gia trong giai đoạn trở về để điều chỉnh tỉ lệ chất auxin, ít nhất ở mức độ chuyên chở Hoạt động trong các phản ứng về tăng trưởng và trong các sự hỗ tương giữa các cơ quan với nhau, đặc biệt về tính ưu thế của chồi non

Có tác dụng làm giảm sự rụng lá và trái Có tác dụng kích thích tạo rễ

2.4.1.2 Auxin trong cây trồng

Tất cả cây trồng đều tổng hợp được chất auxin dạng tổng hợp tùy theo giai đoạn phát triển của chúng Chất auxin sinh ra được hiện diện trong các lá rất non, trong các chồi đang hoạt động, ở mức độ phát hoa và ở trên các quả còn non

Auxin lưu thông từ đỉnh xuống phần dưới các cơ quan với một sự phân cực rõ ràng được thấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non, nhưng trong quá trình chuyển vận này chúng bị thoái hóa bởi sự auxin-oxydases, điều này cho thấy nồng độ auxin thì luôn cao hơn gần với những nơi tổng hợp chúng Như vậy, auxin hiện diện với nồng độ vừa đủ ở mức các điểm tăng trưởng hoặc ở phát hoa để đảm bảo sự nhân giống và

kéo dài tế bào

2.4.1.3 Các chất auxin tổng hợp

Gồm các chất chính sau:

 Acid indolylbutyrique (AIB)

 Acid naphtylacetique (ANA) hoặc các chất dẫn xuất của chúng như:  Acid naphtyloxyacetique (ANOA)

 Acid naphtylacétamide (NAD)

 Acid 2,4 dichrolophen-oxyacetique (2,4-D)

Trong lĩnh vực nuôi cấy in vitro, những chất giống được sử dụng và auxin đã

chiếm một vị trí quan trọng hơn, hai tính chất của chúng được nghiên cứu thuộc lĩnh vực nhân tế bào và hiệu quả ra rễ Ngoài ra, trong thực tiễn chúng còn được dùng để giâm cành, để làm sáng quả, sự đậu quả và làm chậm sự thu hoạch quả (Dương Công Kiên, 2002)

2.4.2 Gibbérelline

Gibbérelline đã nổi bật rất lâu trước khi được nhận dạng Chất Gibbérelline đầu tiên được nhận dạng là acid gibbérellique hoặc là GA3, kế đến là GA4 + GA7 và GA7 Tất cả các Gibbérelline thể hiện một nhân giống nhau; chúng có sự khác nhau bởi chất lượng và vị trí của các chất gắn trên nhân

2.4.2.1 Tính chất sinh lý của Gibbérelline

Hoạt động kéo dài các đốt của cây, hoạt động này cũng có thể áp dụng lên các cuống hoa và điều này cho phép có một sự chín tốt hoặc những phát hoa phát triển hơn

Trong nuôi cấy in vitro, Gibbérelline có tác động đối với nhiều đỉnh sinh

trưởng, nếu thiếu Gibbérelline đỉnh sinh trưởng thể hiện một dạng hình cầu, tạo nên các mắt cây

Hoạt động phức tạp trong sự ra hoa

Tác động lên sự đậu trái của các trái không hạt

Tác động gây thức giấc các chồi, mầm ngủ trên các hạt giống làm thuận lợi cho sự nảy mầm

Trong lĩnh vực sinh tạo cơ quan thực vật, Gibbérelline cho thấy các hoạt động đối kháng: chúng dường như đối ngược với hiện tượng phân hóa tế bào Trong

nuôi cấy in vitro Gibbérelline không được sử dụng vào mục đích này, nhưng

chúng có công dụng với các mô đã có tổ chức (đỉnh sinh trưởng, chồi ngọn, chồi thân…)

2.4.2.2 Gibbérelline trong cây trồng

Gibbérelline được tìm thấy trong tất cả các loại cây và trong các loại nấm, ở đây chúng được phân bố không đồng đều, một vài loại có trong vài loại cây, một vài loại nấm và một vài chất Gibbérelline có trong cả hai nhóm (như GA1, 3, 4, 7, 9) Trong cây trồng, một vài loại cây chỉ có một chất Gibbérelline, các loài cây khác có thể có nhiều loại chất Gibbérelline

2.4.3 Cytokinine

Cytokinine được khám phá do trung gian của sự nuôi cấy in vitro Người ta đã

biết sự thêm nước dừa vào môi trường nuôi cấy gây ra hiệu quả làm thuận lợi cho việc nhân chia tế bào và cho việc hình thành các chồi Vào năm 1956, Skoog đã cô lập được một chất rất hoạt động mà người ta đặt tên là kinétine, do ADN biến chất

Cytokinine là các chất adenine được thay thế, chất này được người ta biết qua 2 nhóm nội sinh là:

 Zeatine

 Isopentényladénine (IPA), Cytokinine tự nhiên và các chất tổng hợp Có hai loại được sử dụng nhiều nhất là:

 Kinetine ( 6 furfuryl-aminopurine)

 Benzyladenine (BAP) (6-benzyl- aminopurine)

2.4.3.1 Tính chất sinh lý của Cytokinine

Tác động hiệu quả rất rõ lên sự phân chia tế bào, trong quá trình này, chúng cần thiết nhưng chúng không hiệu quả nếu vắng mặt auxin: Cytokinine là chất bổ sung; auxin làm thuận lợi cho sự nhân đôi của acid desoxyribonucleique (ADN) và Cytokinine cho phép làm tách rời các chromosome

Có vai trò rất rõ trong việc tạo cơ quan thực vật, ở đây chúng sẽ kích thích mạnh mẽ sự thành lập các chồi non Trái lại, chúng là chất đối kháng với sự tạo rễ Hoạt động kích thích trên sự chuyển hóa, làm thuận lợi một phần việc tổng hợp protein, mặt khác trong lúc bảo vệ các chất chuyển hóa chống lại tác động của enzyme li giải

Hiệu quả đối kháng của tính ưu thế chồi non: các chồi nách được xử lí Cytokinine sẽ tăng trưởng và cạnh tranh với chồi tận cùng

Cytokinine có vai trò quan trọng trong nuôi cấy in vitro, nó thể hiện các tính

chất cần thiết để duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hướng tế bào trong con đường phân hóa

2.4.3.2 Cytokinine trong cây trồng

Được tìm thấy đầu tiên vào năm 1963 trong các phôi còn non của cây ngô (là

zeatine); chất thứ hai là IPA thấy ở trong cây bị nhiễm vi khuẩn corynebacterium

fascines Chúng định vị ở lá non trong chồi và ở các đầu của rễ cây

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian thực hiện từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2005

- Địa điểm thực hiện tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trường Đại Học Nông Lâm – TP.HCM

3.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 3.2.1 Phòng chuẩn bị

Tủ sấy: để sấy khô các dụng cụ

Nồi hấp autolave: hấp vô trùng môi trường và dụng cụ nuôi cấy Tủ lạnh: để bảo quản hóa chất và môi trường dự trữ

Bể rửa chai, ống nghiệm

Bếp điện: để nấu môi trường và hấp cách thủy hóa chất Cân phân tích: để cân đường, Agar, các hóa chất

Máy đo pH

3.2.2 Phòng cấy

Tủ cấy vô trùng Đèn cực tím

Giá, bàn để môi trường và mẫu cấy

Các dụng cụ cấy gồm: dao cấy, kéo, pince, đèn cồn, bình phun và bông gòn tất cả đã được hấp vô trùng

Ẩm kế để đo độ ẩm của phòng nuôi cây

3.2.4 Môi trường cơ bản dùng trong thí nghiệm

Môi trường dùng trong thí nghiệm là MS (Murashige & Skoog), gồm các thành phần sau:

Nguyên tố đa lượng:

KNO3 1900 mg/L MgSO4.7H2O 370 mg/L KH2PO4 170 mg/L CaCl2.2H2O 440 mg/L

Nguyên tố vi lượng:

H3BO3 6,2 mg/L MnSO4.4H2O 22,5 mg/L ZnSO4.7H2O 8,6 mg/L KI 0,83 mg/L Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/L CuSO4.5H2O 0,025 mg/L CoCl2.6H2O 0,025 mg/L

Vitamins:

Inositol 100 mg/L Nicotinic 0,5 mg/L Pyridoxin Hcl 0,5 mg/L Thiamin Hcl 0,1 mg/L Glyxin 2 mg/L

Fe EDTA:

FeSO4.7H2O 27,8 mg/L Na2 EDTA.2H2O 37,3 mg/L

3.3 Vật liệu nuôi cấy

Đối tượng được dùng để thí nghiệm là cây tiêu LadaBelangtoeng

3.4 Phương pháp thí nghiệm

Trong giới hạn của đề tài chúng tôi chỉ tập trung nghiên cứu các nội dung: