Luận văn : KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY TIÊU (Piper nigrum) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ part 4 docx

21  Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: Tỉ lệ mẫu sống = (số mẫu sống/tổng số mẫu) * 100 Tỉ lệ mẫu sạch nấm khuẩn = (số mẫu sạch/tổng số mẫu) * 100 3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA kết hợp với IBA lên sự tạo mô sẹo từ lá:  Bố trí thí nghiệm: - Thực hiện thí nghiệm về môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng là BA và IBA. + Chất kích thích sinh trƣởng BA với 3 mức độ: 0mg/L, 1mg/L, 3mg/L + Chất kích thích sinh trƣởng IBA với 3 mức độ: 0mg/L, 1mg/L, 2mg/L - Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 3 chai ứng với một nghiệm thức, mỗi bình đƣợc cấy 4 mẫu. - Tổng số chai: 81 - Tổng số mẫu cho mỗi nghiệm thức: 36 - Tổng số mẫu cho cả thí nghiệm: 324  Tiến hành: Do chồi tiêu vô mẫu lâu mọc lá mà thời gian làm thí nghiệm thì có giới hạn nên chúng tôi sử dụng nguồn mẫu lá tiêu in vitro sạch có sẵn trong phòng thí nghiệm để thực hiện thí nghiệm này. Chuẩn bị mẫu: Lấy lá của cây tiêu in vitro sạch cắt ra thành các mẫu nhỏ khoảng 0,5 × 0,5 cm, đặt mặt trên của lá trên môi trƣờng đã chuẩn bị sẵn. Các thao tác chuẩn bị này đƣợc tiến hành trong điều kiện hoàn toàn vô trùng. 22 Bảng 3.3 Mô tả thí nghiệm 2 Nghiệm thức BA (mg/L) IBA (mg/L) Mẫu cấy Số chai Số mẫu MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 MS6 MS7 MS8 MS9 0 0 0 1 1 1 3 3 3 0 1 2 0 1 2 0 1 2 lá tiêu lá tiêu lá tiêu lá tiêu lá tiêu lá tiêu lá tiêu lá tiêu lá tiêu 9 9 9 9 9 9 9 9 9 36 36 36 36 36 36 36 36 36  Điều kiện thí nghiệm: Mẫu đƣợc nuôi trên môi trƣờng: khoáng MS + 8,5g/L Agar + 10g/L Đƣờng saccharose + BA + IBA với sự thay đổi hàm lƣợng của BA và IBA. Môi trƣờng đã đƣợc khử trùng ở 1.2 atm, 121 o C trong thời gian 25 phút. pH môi trƣờng: 5.8 Thể tích môi trƣờng: 30ml / bình 250ml Cƣờng độ ánh sáng: Tối hoàn toàn Nhiệt độ: 25 ± 2 0 C Ẩm độ: 65 ± 5% Thời gian theo dõi thí nghiệm: 45 ngày  Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: Ngày xuất hiện mô sẹo: Ngày đầu tiên nhìn thấy mô sẹo Trọng lƣợng tƣơi mô sẹo: Cân lần lƣợt các mô sẹo của từng nghiệm thức bằng cân phân tích trong điều kiện hoàn toàn vô trùng Hệ số tăng trƣởng của mô sẹo: HSTTMS = Ln(m c ) – Ln(m đ ) / số ngày theo dõi m đ : trọng lƣợng của mẫu lá khi cấy m c : trọng lƣợng của mô sẹo khi kết thúc thí nghiệm 23 3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo  Bố trí thí nghiệm: Thực hiện thí nghiệm về môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng là BA và TDZ hoặc Ki. - Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 5 chai tƣơng ứng với một nghiệm thức, mỗi chai cấy 3 mô sẹo. - Tổng số chai trong thí nghiệm: 75 - Tổng số mẫu cấy: 225 Bảng 3.4 Mô tả thí nghiệm 3 Nghiệm thức BA(mg/L) TDZ(mg/L) Ki(mg/L) Mẫu cấy Số chai Số mẫu C1 C2 C3 C4 C5 3 3 3 3 3 0,1 0,3 0,5 0 0 0 0 0 1 0 mô sẹo mô sẹo mô sẹo mô sẹo mô sẹo 15 15 15 15 15 45 45 45 45 45  Tiến hành: Chuyển các mô sẹo có khả năng phát triển thành chồi sang các chai đã chuẩn bị sẵn môi trƣờng nhân chồi. Các thao tác đƣợc tiến hành trong điều kiện hoàn toàn vô trùng.  Điều kiện thí nghiệm: Môi trƣờng: Các mẫu mô sẹo đƣợc nuôi trên môi trƣờng khoáng MS + 8,5g/L Agar + 30g/L Đƣờng saccharose + 3mg/L BA + TDZ hoặc Ki với sự thay đổi về nồng độ của TDZ và Ki, môi trƣờng đƣợc khử trùng ở 1,2 atm, 121 0 C trong 25 phút. pH môi trƣờng: 5,8 Thể tích môi trƣờng: 30ml / bình 250ml Cƣờng độ ánh sáng: 100µmol/m 2 .s Thời gian chiếu sáng: 16 giờ / ngày Nhiệt độ nuôi: 25 ± 2 0 C Ẩm độ: 65 ± 5% Thời gian thí nghiệm là 60 ngày 24  Chỉ tiêu theo dõi: Số chồi mới: Đếm số chồi mới xuất hiện ở mỗi cụm chồi Trọng lƣợng tƣơi cụm chồi: Cân các cụm chồi bằng cân phân tích trong điều kiện vô trùng. Hệ số nhân chồi/tháng: HSNC/tháng = Số chồi mới xuất hiện/tháng 3.5 Phân tích thống kê: Xử lý số liệu thống kê bằng ANOVA trong phần mềm STATGRAPHICS7.0 25 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu cấy Kết quả xử lý chồi mẫu tiêu bằng hai loại kháng sinh Tetracylin và Streptomycin. Bảng 4.1 Kết quả xử lí mẫu với kháng sinh Tetracylin Nghiệm thức Tỉ lệ mẫu sống (%) Tỉ lệ mẫu sạch (%) T2 T6 T10 30.95 23.19 29.77 17.86 a 21.74 c 21.43 b ANOVA ns ** Ghi chú ns: không khác biệt **: khác biệt rất có ý nghĩa Trong cùng một cột các số tận cùng không cùng một mẫu tự khác biệt rất có ý nghĩa ở mức P ≤ 0.01. Kết quả bảng 4.1 cho thấy: Nhìn chung, khi tăng thời gian xử lí thì tỉ lệ mẫu sống giảm. Sau khi xử lí mẫu bằng Tetracylin với các khoảng thời gian 2 giờ, 6 giờ và 10 giờ thì tỷ lệ mẫu sống không cho sự khác biệt giữa các nghiệm thức mà đây chỉ là sự thăng giáng ngẫu nhiên không có ý nghĩa về mặt thống kê. Thí nghiệm khử trùng bằng Tetracylin cho chỉ tiêu tỉ lệ mẫu sạch sai khác rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức P ≤ 0.01. Trong đó nghiệm thức T6 cho tỉ lệ mẫu sạch cao nhất (21.74%), nghiệm thức T10 cũng cho tỉ lệ mẫu sạch khá cao (21.43%) và nghiệm thức T2 cho tỉ lệ mẫu sạch thấp nhất (17.86%). 26 Bảng 4.2 Kết quả xử lí mẫu với kháng sinh Streptomycin Nghiệm thức Tỉ lệ mẫu sống (%) Tỉ lệ mẫu sạch (%) S2 S6 S10 28.3 b 20.03 a 16.3 a 12.12 a 16.7 b 16.7 b ANOVA * * Ghi chú *: khác biệt có ý nghĩa. Trong cùng một cột các số tận cùng không cùng một chữ khác biệt có ý nghĩa ở mức 0.01< P ≤ 0.05. Kết quả bảng 4.2 cho thấy: Cả 3 nghiệm thức trong thí nghiệm khử trùng mẫu bằng Streptomycin đều cho chỉ tiêu tỉ lệ mẫu sống và mẫu sạch khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức 0.01 < P ≤ 0.05. Nghiệm thức S6 và S10 cho chỉ tiêu tỉ lệ mẫu sống không khác biệt về mặt thống kê theo thứ tự lần lƣợt là 20.03% và 16.3%, nhƣng khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với chỉ tiêu mẫu sống của nghiệm thức S2 (28.3%). Tỉ lệ mẫu sạch của nghiệm thức S6 và S10 cho kết quả không khác biệt về mặt thống kê, nhƣng khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức S2. Nghiệm thức S6 và S10 đều cho tỉ lệ mẫu sạch đạt 16.7%, còn nghiệm thức S2 cho tỉ lệ mẫu sạch thấp nhất chỉ đạt 12.12%. Kết luận: Cả 2 nghiệm thức T6 và S6 cho tỉ lệ mẫu sạch tốt hơn các nghiệm thức còn lại. Bảng 4.3 Tỉ lệ mẫu sống và mẫu sạch xử lí kháng sinh Tetracylin và Streptomycin trong thời gian 6 giờ Thời gian xử lí 6 giờ Kháng sinh Tỉ lệ mẫu sống (%) Tỉ lệ mẫu sạch (%) Tetracylin Streptomycin 23.19 20.03 21.74 b 16.7 a ANOVA ns ** 27 Ghi chú ns: không khác biệt **: khác biệt rất có ý nghĩa Trong cùng một cột các số tận cùng không cùng một chữ khác biệt có ý nghĩa ở mức P ≤ 0.01. Kết quả bảng 4.3 cho thấy: Kháng sinh Tetracylin cho tỉ lệ mẫu sống không khác biệt về mặt thống kê so với tỉ lệ mẫu sống của kháng sinh Streptomycin. Kháng sinh Tetracylin cho tỉ lệ mẫu sạch khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê so với tỉ lệ mẫu sạch của kháng sinh Streptomycin. Kháng sinh Tetracylin cho hiệu quả khử trùng đạt 21.74% trong khi hiệu quả khử trùng của Streptomycin chỉ đạt 16.7%. Kết luận sơ bộ: Thời gian khử trùng của cả Tetracylin và Streptomycin đều cho hiệu quả tốt nhất ở mức 6 giờ. Nhƣng kháng sinh Tetracylin cho tỉ lệ mẫu sạch (21.74%) cao hơn tỉ lệ mẫu sạch của kháng sinh Streptomycin (16.7%). 4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA kết hợp với IBA lên sự tạo mô sẹo từ lá: Bảng 4.4 Thời gian xuất hiện mô sẹo của cây tiêu nuôi cấy từ mô lá Nghiệm thức MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 MS6 MS7 MS8 MS9 Ngày xuất hiện MS (NSC) 13 11 13 17 17 10 16 7 16 Kết quả thí nghiệm cho thấy nhìn chung khi tăng hàm lƣợng IBA trong môi trƣờng nuôi cấy thì mô sẹo xuất hiện sớm hơn do sự kích thích phân chia tế bào của chất kích thích sinh trƣởng. Môi trƣờng bổ sung 3mg/L BA + 1mg/L IBA (nghiệm thức MS8) xuất hiện mô sẹo sớm nhất vào ngày thứ 7 sau khi cấy, đồng thời mô sẹo phát triển rất tốt và có khả năng phát triển thành chồi. Ngoài ra, ở các nghiệm thức MS5 và MS9 mô sẹo xuất hiện muộn hơn vào ngày thứ 17 và 16 sau cấy ở những nghiệm thức này mô sẹo cũng phát triển tốt và có khả năng phát triển thành chồi. Nghiệm thức MS1 do môi trƣờng không có BA và IBA nên mô sẹo hình thành ít và nhanh thoái hoá, nghiệm thức này có mô sẹo vào ngày thứ 13. 28 MS2 và MS3 do không có BA nên nó kích thích tạo rễ nhiều hơn tạo mô sẹo nên các mẫu lá trong các nghiệm thức này lần lƣợt sau 11 và 13 ngày mô sẹo hình thành ít đồng thời có rễ phát triển. Sau 17 ngày nuôi cấy nghiệm thức MS4 (1mg/L BA + 0mg/L IBA) mới xuất hiện mô sẹo, trễ hơn nghiệm thức MS7 (3mg/L BA + 0mg/L IBA) một ngày do trong môi trƣờng của nghiệm thức MS7 có hàm lƣợng BA cao hơn nghiệm thức MS4. Bảng 4.5 Bảng trọng lƣợng tƣơi của mô sẹo và hệ số tăng trƣởng của mô sẹo vào ngày thứ 45 sau cấy Nghiệm thức TLMS (gam) HSTTMS MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 MS6 MS7 MS8 MS9 0.084 a 0.077 a 0.09 a 0.096 a 0.367 c 0.17 b 0.072 a 0.42 d 0.393 d 0.005 bc 0.003 ab 0.007 cd 0.009 d 0.047 f 0.025 e 0.0009 a 0.051 g 0.049 fg ANOVA ** ** Ghichú ** là khác biệt rất có ý nghĩa Trong cùng một cột các số tận cùng không cùng một chữ khác biệt có ý nghĩa ở mức P ≤ 0.01. NT: nghiệm thức TLMS: trọng lƣợng tƣơi của mô sẹo HSTTMS: hệ số tăng trƣởng của mô sẹo Kết quả thí nghiệm cho thấy trọng lƣợng mô sẹo và hệ số tăng trƣởng mô sẹo giữa các nghiệm thức khác biệt rất có nghĩa về mặt thống kê ở mức P ≤ 0.01. Bảng 4.5 cho thấy môi trƣờng cho kết quả trọng lƣợng mô sẹo và hệ số tăng trƣởng mô sẹo cao nhất là môi trƣờng có 3mg/L BA + 1mg/L IBA (nghiệm thức MS8), tiếp đó là môi trƣờng 3mg/L BA + 2mg/L IBA (nghiệm thức MS9) và môi trƣờng 1mg/L BA + 1mg/L IBA (nghiệm thức MS5) cũng cho kết quả rất tốt. 29 Kết quả về chỉ tiêu TLMS: Nghiệm thức MS8 và MS9 cho TLMS không khác biệt nhau (lần lƣợt là 0.42g và 0.393g), nhƣng khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Nghiệm thức MS5 cho chỉ tiêu TLMS cũng khá cao (0.367g), nghiệm thức MS6 cho chỉ tiêu TLMS là 0.17g. Các nghiệm thức MS1, MS2, MS3, MS4, và MS7 cho chỉ tiêu TLMS rất thấp (theo thứ tự lần lƣợt là 0.084g, 0.077g, 0.09g, 0.096g và 0.072g) và các nghiệm thức này cho kết quả không khác biệt về mặt thống kê. Kết quả về chỉ tiêu HSTTMS: Nghiệm thức MS8 cho kết quả cao nhất (0.051), kết quả này không sai khác với nghiệm thức MS9 (0.049) về mặt thống kê, nhƣng nghiệm thức MS8 lại khác biệt rất có ý với các nhiệm thức còn lại. Nghiệm thức MS5 (0.047) cho kết quả không sai khác so với nghiệm thức MS9, nhƣng nghiệm thức này lại khác biệt rất có ý nghĩa với nghiệm thức MS8. Các nghiệm thức MS1, MS2, MS3, MS4, MS6 và MS7 cho kết quả thấp mặc dù các nghiệm thức này sai khác với nhau theo thứ tự các nghiệm thức này cho các kết quả nhƣ sau: 0.005, 0.003, 0.007, 0.009, 0.025 và 0.0009. Các nghiệm thức MS1, MS2, MS3 tạo mô sẹo rất kém và các mẫu có sự xuất hiện rễ do tác dụng kích thích tạo rễ của IBA. Ở nghiệm thức MS7 chúng tôi nhận thấy mô sẹo hình thành rất kém, sau khi cấy khoảng một tuần thì các mẫu hoá vàng và một số mẫu bị chết. 4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự tái sinh chồi từ mô sẹo Bảng 4.6 Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng hình thành chồi của cây tiêu nuôi cấy từ lá sau 60 ngày Nghiệm thức Số chồi (chồi) TLTCC (gam) HSNC (chồi/tháng) C1 C2 C3 C4 C5 16 a 27 b 10 c 9 d 8 d 1.2367 c 2.2 d 1.08 b 1.098 a 0.965 a 8 b 13.5 c 5.2 a 4.7 a 4 a ANOVA ** ** ** Ghichú **: là khác biệt rất có ý nghĩa. Trong cùng một cột các số tận cùng không cùng một chữ khác biệt có ý nghĩa ở mức P ≤ 0.01. 30 NT: nghiệm thức HSNC: hệ số nhân chồi TLTCC: trọng lƣợng tƣơi cụm chồi Kết quả thí nghiệm cho thấy nhìn chung khi tăng hàm lƣợng TDZ hoặc Ki trong môi trƣờng có hàm lƣợng 3mg/L BA thì tế bào phân chia nhanh và sớm tạo chồi. Kết quả bảng 4.6 cho thấy sự khác biệt về chỉ tiêu số chồi và trọng lƣợng tƣơi cụm chồi và hệ số nhân chồi của nghiệm thức C1 (3mg/L BA + 0,1mg/L TDZ) và C2 (3mg/L BA + 0,3mg/L TDZ) so với các nghiệm thức C3, C4, C5 là có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức P ≤ 0.01. Trong cả 5 nghiệm thức thì nghiệm thức C2 cho số chồi, trọng lƣợng tƣơi cụm chồi và hệ số nhân chồi cao nhất (lần lƣợt là 27 chồi, 2.2g và 13.5 chồi/tháng) và có sự sai khác rất lớn so với các nghiệm thức còn lại. Trong quá trình làm thí nghiệm chúng tôi nhận thấy nghiệm thức C1 (3mg/L BA + 0,1mg/L TDZ) cho các chỉ tiêu về số chồi, trọng lƣợng tƣơi cụm chồi và hệ số nhân chồi lần lƣợt là 16 chồi, 1.2367g và 8 chồi/tháng; đồng thời nghiệm thức C3 (3mg/L BA + 0,5mg/L TDZ) cũng cho các chỉ tiêu về số chồi, trọng lƣợng tƣơi cụm chồi và hệ số nhân chồi lần lƣợt là 10 chồi, 1.08g và 5 chồi/tháng. Còn ở nghiệm thức C4 (3mg/L BA + 1mg/L Ki) cho các chỉ tiêu về số chồi, trọng lƣợng tƣơi cụm chồi và hệ số nhân chồi lần lƣợt là 9 chồi, 1.098g và 4.5 chồi/tháng; đồng thời nghiệm thức C5 (3mg/L BA + 0mg/L Ki) cho hiệu quả nhân chồi thấp nhất, với các chỉ tiêu về số chồi, trọng lƣợng tƣơi cụm chồi và hệ số nhân chồi lần lƣợt là 8 chồi, 0.965g và 4 chồi/tháng. Hai nghiệm thức này cho hiệu quả nhân chồi thấp nhất do hàm lƣợng Ki trong môi trƣờng nuôi cấy thấp nên quá trình phân chia tế bào theo hƣớng tạo chồi giảm so với các nghiệm thức khác. . C1 C2 C3 C4 C5 3 3 3 3 3 0,1 0,3 0,5 0 0 0 0 0 1 0 mô sẹo mô sẹo mô sẹo mô sẹo mô sẹo 15 15 15 15 15 45 45 45 45 45  Tiến hành: Chuyển các mô sẹo có khả. Ẩm đ : 65 ± 5% Thời gian theo dõi thí nghiệm: 45 ngày  Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: Ngày xuất hiện mô sẹo: Ngày đầu tiên nhìn thấy mô sẹo Trọng lƣợng tƣơi mô sẹo: Cân lần lƣợt các mô sẹo. Mẫu cấy Số chai Số mẫu MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 MS6 MS7 MS8 MS9 0 0 0 1 1 1 3 3 3 0 1 2 0 1 2 0 1 2 lá tiêu lá tiêu lá tiêu lá tiêu lá tiêu lá tiêu lá tiêu