Phƣơng pháp xử lý số liệu

Số liệu thu thập đƣợc xử lý trên máy vi tính bằng chƣơng trình thống kê Statgraphic 7.0. Đọc kết quả dựa vào bảng ANOVA, bảng trung bình và bảng so sánh khác biệt giữa các nghiệm thức (Bằng phƣơng pháp LSD).

Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1: Vô trùng mô cấy ban đầu từ cây thực sinh

Môi trƣờng nuôi cấy mô thực vật có chứa đƣờng, muối khoáng và vitamin, thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật. Nếu môi trƣờng nuôi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần toàn bộ bề mặt môi trƣờng nuôi cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn. Thí nghiệm phải loại bỏ vì trong điều kiện này mô cấy không thể phát triển và chết dần. Khác với thí nghiệm vi sinh có thể kết thúc trong vài ngày, mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đòi hỏi rất cao mới có hi vọng thành công.

Đây là bƣớc quan trọng trong nuôi cấy mô cây dầu mè. Mục tiêu đạt đƣợc của thí nghiệm này là xác định nồng độ của hóa chất diệt khuẩn (Natri hypochlorit) và thời gian vô trùng mẫu mô ban đầu để tạo ra nguồn nguyên liệu cho các thí nghiệm sau.

4.1.1. Vô trùng mẫu hạt

Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử mẫu đến tỉ lệ mẫu hạt vô trùng Nghiệm thức Nồng độ NaOCl (%) Thời gian (phút) Tỉ lệ mẫu vô trùng (%) 1 10 15 5,00a 2 10 30 18,33b 3 10 45 16,67b 4 10 60 20,83bc 5 15 15 10,00a 6 15 30 10,83a 7 15 45 20,83bc 8 15 60 26,79d 9 20 15 10,00a 10 20 30 19,55bc 11 20 45 20,37bc 12 20 60 25,00cd CV (%) 18,6

Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thông kê với mức xác suất P = 0,05.

Theo kết quả trong bảng 4.2 cho thấy ở cả 3 nồng độ Natri hypochlorit 10 %, 15 % và 20 % tỉ lệ mẫu hạt vô trùng tăng tỉ lệ thuận với thời gian khử mẫu. Càng kéo dài thời gian khử mẫu tỉ lệ mẫu vô trùng càng cao do hạt cây có lớp vỏ cứng nên khi ngâm khử trùng chất khử không ngấm vào trong hạt gây chết mẫu. 3 nghiệm thức có tỉ lệ mẫu hạt vô sống cao nhất là nghiệm thứ 4, 8 và 12 trong đó nghiệm thức 8 đạt tỉ lệ cao nhất 26,79 %. Do đó kết luận điều kiện khử mẫu hạt tốt nhất là sử dụng Natri hypochlorit nồng độ 15 % và thời gian khử mẫu là 60 phút.

4.1.2. Vô trùng mẫu chồi

Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử mẫu đến tỉ lệ mẫu chồi vô trùng Nghiệm thức Nồng độ NaOCl (%) Thời gian (phút) Tỉ lệ mẫu vô trùng (%) 1 10 15 0,00a 2 10 30 1,28ab 3 10 45 6,30c 4 10 60 4,90bc 5 15 15 1,33ab 6 15 30 2,08abc 7 15 45 4,91bc 8 15 60 4,52abc 9 20 15 1,52abc 10 20 30 4,23abc 11 20 45 3,13abc 12 20 60 3,77abc CV (%) 15,12

Xét ở nồng độ 10 % tỉ lệ mẫu sống tăng tỉ lệ thuận với thời gian khử mẫu. Khi tăng thời gian khử mẫu từ 15 phút lên 60 phút tỉ lệ sống tăng từ 0 % (nghiệm thức 1) tăng lên 4,9 % (nghiệm thức 4) và nghiệm thức đạt cao nhất là nghiệm thức 3 với thời gian khử mẫu 45 phút và tỉ lệ mẫu sống 6,3 %.

Nồng độ Natri hypochlorit 15%, tỉ lệ mẫu sống cũng tăng tỉ lệ thuận với thời gian khử mẫu. Tỉ lệ mẫu sống tăng từ 1,33 % (nghiệm thứ 5) tăng lên 4,52 % (nghiệm thứ 8). Tuy nhiên tỉ lệ mẫu sống cao nhất là nghiệm thức 7 chỉ đạt 4,91 %

thấp hơn so với nghiệm thứ 3. So với nống độ Natri hypochlorit 10% tỉ lệ nhiễm nấm, khuẩn có giảm nhƣng tỉ lệ mẫu chết do ngộ độc chất khử trùng tăng.

Ở nồng độ Natri hypochlorit 20% việc kéo dài thời gian khử trùng mẫu cũng làm tăng tỉ lệ mẫu sống. Tuy nhiên, tỉ lệ mẫu sống ở nồng độ 20 % thấp hơn so với các nghiệm thức ở các nồng độ 10 % và 15 %. Nồng độ Natri hypochlorit cao tác dụng khử trùng nấm và khuẩn rõ ràng cao hơn, nhƣng tác dụng gây độc với mẫu khử cũng cao. Do đó tuy tỉ lệ nhiễm giảm nhƣng tỉ lệ mẫu chết do ngộ độc cao đặc biệt ở các nghiệm thức 11 và 12.

Từ đó chúng tôi kết luận, cách thức khử mẫu thích hợp cho chồi cây dầu mè là ngâm mẫu trong Natri hypochlorit 10% với thời gian 45 phút. So với các cây khác, thời gian khử của cây dầu mè lâu hơn do chồi non của cây dầu mè có kích thƣớc lớn, mọng nƣớc nên chịu đƣợc tác động của chất khử trùng tốt hơn.

Hình 4.2: Chồi cây dầu mè nẩy từ các hạt vô trùng

4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát môi trƣờng khoáng cơ bản cho cây dầu mè invitro vitro

Mục đích của thí nghiệm là khảo sát sự phát sinh chồi của cây dầu mè trên các môi trƣờng khoáng cơ bản. Tuy nhiên, tài liệu công bố về nuôi cấy mô cây dầu mè không nhiều, ít công bố. Do đó thí nghiệm đƣợc thực hiện mang tính chất thăm dò. Do dầu mè là cây thân gỗ nên chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên 4 loại môi trƣờng là MS, WPM, ½ MS và ½ WPM. Các môi trƣờng không bổ sung chất kích thích sinh trƣởng thực vật

Bảng 4.3: Khảo sát môi trƣờng khoáng cơ bản cho cây dầu mè

Nghiệm thức Môi trƣờng Tỉ lệ sống (%) Tỉ lệ nảy chồi (%) Phù gốc 1 MS 100 100 - 2 ½ MS 75 50 - 3 WPM 100 100 + 4 ½ WPM 50 67 +

Mẫu khi cấy vào môi trƣờng MS và WPM sau khoảng 1 tuần đều nẩy chồi (100 %), trên các môi trƣờng ½ MS và ½ WPM thì chậm hơn 5 – 6 ngày và tỉ lệ nảy chồi cũng thấp hơn: ½ MS là 50% ; ½ WPM là 67%.

Trong khoảng thời gian từ tuần thứ 3 đến tuần thứ 4, trên môi trƣờng ½ MS và ½ WPM các chồi có biểu hiện bị úng ngọn. Ngọn dần chuyển sang màu vàng, lan đỉnh xuống gốc và mẫu chết. Hiện tƣợng này chỉ xuất hiện trên các môi trƣờng có khoáng đa lƣợng giảm một nửa chứng tỏ đòi hỏi về khoáng của cây cao và các môi trƣờng này không đáp ứng đƣợc.

Khi xem xét gốc của mẫu cấy nhận thấy môi trƣờng WPM và ½ WPM gốc của mẫu cấy phù to. Trong khi đó trên môi trƣờng MS và ½ MS gốc mẫu hoàn toàn bình thƣờng không bị phù.

Từ những kết quả đạt đƣợc kết luận môi trƣờng khoáng thích hợp để nuôi cấy mô cây dầu mè là môi trƣờng MS.

1 2

3 4

Hình 4.3: Sự phát triển của cây dầu mè trên các môi trƣờng khoáng cơ bản

1: Môi trƣờng MS 2: Môi trƣờng WPM 3: Môi trƣờng ½ MS 4: Môi trƣờng ½ WPM

4.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của BA đến sự hình thành chồi của cây dầu mè

Sử dụng kết quả của thí nghiệm 2, chúng tôi tiến hành nuôi cấy cây dầu mè trên môi trƣờng MS bổ sung BA nồng độ 0 – 0,5 mg/l.

Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của BA đến sự tạo chồi của cây dầu mè

Nghiệm thức Môi trƣờng BA (mg/l) Số chồi Chiều cao chồi (mm) 1 MS 0,1 1,00a 1,86b 2 MS 0,3 2,17b 3,46c 3 MS 0,5 2,38c 3,54c 4 MS 0 0,87a 1,33a CV (%) 12,5 4,8

Kết quả thí nghiệm cho thấy số chồi sinh ra trên một mẫu cấy tăng tỉ lệ thuận với nồng độ BA trong môi trƣờng nuôi cấy. Ở nghiệm thức 1 (BA 0,1 mg/l) số chồi phát sinh là 1.0 chồi/ mẫu, sang nghiệm thức 2 số chồi tăng lên 2,17 chồi/mẫu và đạt cao nhất ở nghiệm thức thứ 3 2,38 chồi/mẫu.

Chiều cao chồi sinh ra cũng tăng tỉ lệ thuận với việc tăng nồng độ BA trong môi trƣờng. Khi bổ sung BA ở mức 0,1 mg/l (NT1) thì chiều cao chồi là 1,86 mm so với nghiệm thức đối chứng (NT4) là 1,33 mm cho thấy mức BA 0,1 mg/l có tác động chƣa lớn đến chiều cao chồi.. Khi tăng nồng độ lên ở NT2 và NT3 chiều cao chồi có sự cải thiện rõ rệt - đạt cao nhất 3,54 mm ở NT3. Điều đó chứng tỏ từ nồng độ 0,3 – 0,5 mg/l, BA có sự tác động đáng kể đến chiều cao chồi tạo thành.

Theo các thí nghiệm thăm dò trƣớc và theo một số tài liệu thì không nên tăng nồng độ BA cao hơn 0,5 mg/l vì cây rất nhạy, nồng độ BA cao mẫu cấy tạo khá nhiều mô sẹo. Hiện tƣợng này không tốt đối với, dễ làm cho mẫu chết và gây xáo trộn di truyền cây.

Nhƣ vậy, chúng tôi kết luận rằng nồng độ BA thích hợp để khích thích sự tạo chồi của cây dầu mè là 0,5 mg/l.

Hình 4.4: Ảnh hƣởng của BA đến sự tạo chồi của cây dầu mè

1: BA 0,1 mg/l 2: BA 0,3 mg/l 3: BA 0,5 mg/l 1

4.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của BA và IBA đến sự hình thành chồi của cây dầu mè dầu mè

Trong môi trƣờng khoáng cơ bản là MS chúng tôi bổ sung BA và IBA để xác định sự tác động của 2 chất khích thích sinh trƣởng này đến sự tạo thành chồi của cây dầu mè.

Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của BA và IBA đến sự tạo chồi của cây dầu mè

Nghiệm thức Môi trƣờng BA (mg/l) IBA (mg/l) Số chồi Chiều cao chồi (mm) Số lá Mô sẹo 1 MS 0,1 0,01 2,13c 4.67c 4,41d + 2 MS 0,3 0,01 2,28d 3.32b 3.81c ++ 3 MS 0,5 0,01 1,89b 3.42b 3.00b +++ 4 MS 0 0 0,87a 1.30a 1.00a - CV (%) 8,85 6,21 13,00

Kết quả thí nghiệm cho thấy khi bổ sung đồng thời 2 loại kích thích sinh trƣởng thực vật (BA và IBA) số chồi trên 1 mẫu cấy gần nhƣ không tăng so với thí nghiệm chỉ bổ sung 1 chất khích thích sinh trƣởng BA (thí nghiệm 3). Nhƣng chiều cao chồi đƣợc cải thiện đáng kể. Điều này là phù hợp vì khi có sự hiện diện của auxin, cytokinin kích thích mạnh hơn sự phân chia tế bào (Dƣơng Công Kiên, 2002).

Khi có sự hiện diện của IBA ở mức thấp 0,01 mg/l, việc tăng nồng độ BA từ 0,1 mg/l đến 0,5 mg/l không làm tăng số chồi, chiều cao chồi cũng nhƣ số lá trên 1 mẫu cấy. Kết quả thí nghiệm cho thấy ở nghiệm thức thứ nhất - chỉ bổ sung BA ở nồng độ 0,1 mg/l và IBA 0,01 mg/l thì kết quả tạo chồi cầy dầu mè tỏ ra vƣợt trội hơn các nghiệm thúc khác về cả 3 chỉ tiêu: số chồi 2,13 chồi/mẫu cầy; chiều cao chồi cao nhất 4,67 mm, số lá 4,41 lá/mẫu cấy. Thí nghiệm cũng cho thấy khi tăng nồng độ BA mô sẹo tạo ra trên các mẫu càng nhiều.

Từ đó chúng tôi kết luận: môi trƣờng thích hợp để nuôi cấy cây dầu mè invitro là môi trƣờng MS bổ sung BA (0,1 mg/l) và IBA (0,01 mg/l).

Hình 4.5: Ảnh hƣởng của BA và IBA đến sụ tạo chồi của cây dầu mè

1: Môi trƣờng MS + IBA (0,01) + BA (0,1) 2: Môi trƣờng MS + IBA (0,01) + BA (0,3) 3: Môi trƣờng MS + IBA (0,01) + BA (0,5) 1 2 3

4.5. Thí nghiệm 5: Nuôi cấy tạo rễ cây dầu mè invitro

Mục tiêu là xác định môi trƣờng thích hợp cho sự tạo rễ của cây dầu mè. Trong nuôi cấy mô, việc bổ sung các auxin vào môi trƣờng nuôi cấy cho hiệu quả kích thích cây khỏe mạnh, tạo nhiều rễ, phát triển tốt (Banerjee và Delanghe, 1985).

Bảng 4.6: Tác động của IBA đến việc tạo rễ cây dầu mè in vitro

Nghiệm thức Môi trƣờng IBA (mg/l) Số rễ Chiều dài rễ (mm) 1 MS 0,1 2,88b 14,46c

2 MS 0,3 5,50c 15,07c

3 MS 0,5 6,38d 11,63b

4 MS 0 0,00a 0,00a CV (%) 10,68 21,00

Tác động của IBA đến việc tạo rễ của cây dầu mè in vitro là khá nhanh và mạnh. Các nghiệm thức 2 và 3 sau khi cấy mẫu khoảng 1 tuần cây bắt đầu mọc rễ , trong nghiệm thức 1 rễ mọc chậm hơn khoảng 2 – 3 ngày. Rễ cây mọc trên các môi trƣờng có màu trắng sau khoảng 2 tuần có màu nâu sậm.

Từ kết quả thí nghiệm trên bảng 4.5 cho thấy nghiệm thức 3 là nghiệm thức cho kết quả tốt nhất. Số rễ tạo ra trên mỗi mẫu cấy là nhiều nhất và chiều dài rễ so với 2 nghiệm thức còn lại có sự khác biệt không nhiều.

Hình 4.6: Nuôi cấy tạo rễ cây dầu mè in vitro

1: Môi trƣờng MS + IBA 0,1 (mg/l) 2: Môi trƣờng MS + IBA 0,3 (mg/l) 3: Môi trƣờng MS + IBA 0,5 (mg/l)

Hình 4.7: cây dầu mè in vitro

3 2

Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận

Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi có một số kết luận sau:

 Mẫu cây dầu mè thực sinh đƣợc vô trùng tốt nhất trong điều kiện Natri hypochlorit 10% trong khoảng thời gian 45 phút.

 Môi trƣờng khoáng cơ bản thích hợp để nuôi cấy mô cây dầu mè in vitro là môi trƣờng MS.

 Môi trƣờng thích hợp để nhân chồi cây dầu mè là môi trƣờng MS bổ sung BA (0,1 mg/l) và IBA (0,01 mg/l).

 Môi trƣờng thích hợp cho sự ra rễ là môi trƣờng MS bổ sung IBA nồng độ 0,3 mg/l.

5.2. Đề nghị

 Cần nghiên cứu thêm môi trƣờng để nuôi cấy cây dầu mè từ sau khi ra rễ cho đến khi cây đủ lớn để đƣa ra vƣờn ƣơm, theo dõi sinh trƣởng cây trong giai đoạn vƣờn ƣơm đến khi đạt tiêu chuẩn đem trồng.

 Xây dụng hoàn chỉnh qui trình nhân giống invitro và trên vƣờn ƣơm cây dầu mè.

Chƣơng 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bùi Bá Bổng, 1995. Nhân giống cây bằng nuôi cấy mô. Sở khoa học công nghệ môi trƣờng An Giang.

2. Trần Thị Dung, 2003, Bài giảng nuôi cấy mô tế bào thực vật, Trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM.

3. Dƣơng Công Kiên, 2002. Nuôi cấy mô thực vật. Nhà xuất bản Đại Học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.

4. Nguyễn Đức Lƣợng, 2002. Công nghệ tế bào. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh

5. Trần Văn Minh, 2004. Công nghệ sinh học – Giáo trình cao học – nghiên cứu sinh. Trƣờng đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, 933 trang.

6. Khƣu Hoàng Minh, 2006. Nuôi cấy mô cây Trai Nam Bộ (Fagraea cochinchinensis A.Chev.). Luận văn kĩ sƣ Công Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM.

7. Nguyễn Văn Uyển, 1996. Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp, tập 1, 2.

8. Bùi Trang Việt, 2000. Sinh lý thực vật đại cương. Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 333 trang

9. NIIR Board of Consultants and Engineers. 2006. The Complete Book on Jatropha (Bio-Diesel) with Ashwagandha, Stevia, Brahmi & Jatamansi Herbs (Cultivation, Processing & Uses) – Asia Pacific Business Press Inc.

10. Heller, J. (1996). Physic nut. Jatropha curcas L. Promoting the conservation and use of underutilized and neglected crops. 1. Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research, Gatersleben, International Plant Genetic Resources Institute, Rome.

11. M. Sujatha & N. Mukta, 1995. Morphogenesis and plant regeneration from tissue cultures of Jatropha curca.Plant Cell, Tissue and Organ Culture 44: 135 – 141, 1996

12. M. Sujatha, H.P.S. Makkar and K. Becker, 2005. Shoot bud proliferation from

Dầu mè và nguyên liệu sinh học

Phƣơng pháp nhân giống cổ truyền