Báo cáo " SỰ PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MẪU CẤY LÁ CÂY DẦU MÈ (JATROPHA CURCAS L.) " doc

Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011 193 SỰ PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MẪU CẤY LÁ CÂY DẦU MÈ (JATROPHA CURCAS L.) Bùi Văn Thế Vinh 1 , Chu Thị Bích Phượng 1 , Thái Xuân Du 2 , Đỗ Đăng Giáp 2 , Dương Tấn Nhựt 3 1 Trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ Tp.HCM; 2 Viện Sinh học Nhiệt đới; 3 Viện sinh học Tây Nguyên TÓM TẮT Mẫu cấy lá cây Dầu mè đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng WPM có bổ sung Kinetin kết hợp với IBA hoặc 2,4-D ở những nồng độ khác nhau để cảm ứng sự hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi. Trên môi trƣờng có bổ sung 1,5 – 2,0 mg/l Kinetin kết hợp với 0,5 mg/l 2,4-D có sự xuất hiện của khối mô sẹo mềm, dễ vỡ vụn cùng với một số cấu trúc hình cầu giống phôi có màu kem sáng. Ảnh hƣởng của các thành phần khoáng đa lƣợng khác nhau lên khả năng phát sinh phôi vô tính của cây Dầu mè cũng đã đƣợc nghiên cứu. Thành phần khoáng đa lƣợng của môi trƣờng MS tỏ ra hiệu quả hơn trong việc cảm ứng sự hình thành các khối tiền phôi hình cầu. Những khối tiền phôi này đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng có nồng độ Kinetin và 2,4-D thấp hơn để cảm ứng sự biệt hóa và trƣởng thành phôi. Phôi vô tính Dầu mè có thể nảy mầm và phát triển thành cây con hoàn chỉnh trên môi trƣờng MS½ không bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng thực vật. Cây con có bộ rễ hoàn chỉnh và phát triển mạnh nhƣ cây con gieo từ hạt. Từ khóa: Jatropha curcas L., diesel sinh học, mô sẹo sinh phôi, phôi vô tính, khoáng đa lượng GIỚI THIỆU Trong tình hình khủng hoảng năng lƣợng hiện nay, các nƣớc trên thế giới đều đi tìm những nguồn năng lƣợng không truyền thống hoặc năng lƣợng có khả năng tái sinh đƣợc để trƣớc mắt thay thế một phần năng lƣợng dầu mỏ, trong đó nhiên liệu sinh học (biodiesel) là một lĩnh vực đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Cây Dầu mè (Jatropha curcas L.) là một trong những loại cây nhiên liệu đƣợc đầu tƣ phát triển ở rất nhiều nƣớc trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Cây Dầu mè thuộc họ Euphorbiaceae, có nguồn gốc từ Trung, Nam Mỹ và vùng biển Carribê. Đây là một loại cây đa mục đích vì tất cả các phần của cây đều có giá trị sử dụng, cây có dạng thân bụi, sống lƣu niên, có thể cao tới 5 m, nhƣng trong sản xuất thƣờng để chiều cao không quá 2 m cho tiện việc thu hái. Dầu từ hạt đƣợc xem là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất nhiên liệu sinh học, đây là loại nhiên liệu sạch, không độc, thân thiện với môi trƣờng và kinh tế nhờ chi phí sản xuất thấp. Ngoài ra, dầu cũng đƣợc sử dụng một cách truyền thống để sản xuất xà phòng, nến, sơn, dầu nhờn và dùng trong y học để làm thuốc xổ (Sujatha, Mukta, 1996). Ở Việt Nam, cây Dầu mè mọc hoang dại trong tự nhiên ở độ cao trên 1000 m so với mặt nƣớc biển, chúng có mặt ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nƣớc. Có giống có hàm lƣợng dầu đạt 40% nhƣ ở huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng. Năng suất hạt của cây Dầu mè, cũng nhƣ bao cây trồng khác, phụ thuộc vào giống, lọai đất, mức độ đầu tƣ phân bón và lƣợng nƣớc tƣới. Trên vùng đất xấu, ít đƣợc chăm sóc năng suất hạt của cây Dầu mè có thể đạt 4-5 tấn hạt/ha/năm và đạt 10-12 tấn hạt/ha/năm ở vùng đất tốt cùng với sự đầu tƣ thích hợp. Hàm lƣợng dầu của hạt khoảng 35-40% tuỳ theo giống. Nếu chiết ép tốt, 3-3,5 kg hạt có thể cho 01 lít dầu thô (Du và Uyển, 2006). Hạt Dầu mè là thể dị hợp tử từ phức hợp lai giữa 2 dạng Jatropha sp. tự nhiên và nhân tạo gây ra vấn đề khó khăn trong tính ổn định về di truyền (Prabakaran và Sujatha, 1999). Vì vậy, hàm lƣợng dầu dao động trong khoảng 4 – 40%. Nhân giống truyền thống cây Dầu mè gặp phải vấn đề về khả năng sống sót của hạt kém, tỉ lệ nảy mầm thấp, khả năng ra rễ của cây con gieo từ hạt và của cành giâm ít và chậm (Heller, 1996; Openshaw, 2000). Những cây con đƣợc nhân giống bằng cành giâm có tuổi thọ ngắn và khả năng kháng bệnh cũng nhƣ kháng hạn kém hơn so với cây con gieo từ hạt. Cây con từ cành giâm không tạo đƣợc rễ cọc thật sự (dẫn đến khả năng kháng hạn kém), thay Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011 194 vào đó, chúng tạo ra các rễ cọc giả chỉ có thể cắm sâu xuống đất khoảng 1/2 – 2/3 so với rễ cọc đƣợc tạo ra từ cây con gieo từ hạt (Heller, 1996). Xét về tiềm năng to lớn của cây Dầu mè thì cần phải có một lƣợng lớn cây giống có chất lƣợng tốt để sử dụng trong tƣơng lai. Chính vì vậy, việc cải thiện chất lƣợng cây trồng thông qua việc áp dụng các phƣơng pháp công nghệ sinh học thực vật là hết sức cần thiết. Trong những nghiên cứu trƣớc đây, một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự phát sinh hình thái của cây Dầu mè in vitro đã đƣợc khảo sát nhƣ loại mô dùng làm mẫu cấy, vị trí lấy mẫu, tuổi sinh lý của mẫu cấy, nồng độ các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật, thành phần của môi trƣờng nuôi cấy,… (Sujatha và Mukta, 1996; Sardana và cs., 2000; Rajore và Batra, 2005; Jha và cs., 2007; Shrivastava, Banerjee và 2008). Trong đó, mẫu cấy đoạn thân có mang chồi bất định đƣợc xem là nguyên liệu tốt nhất để tái sinh cây in vitro do có tỉ lệ nhiễm thấp, giúp giảm đáng kể những biến dị sinh dƣỡng nhƣng hệ số nhân giống đạt đƣợc không cao. Phƣơng pháp phát sinh phôi vô tính là một công cụ mạnh của ngành Công nghệ sinh học đƣợc áp dụng để nhân giống đối với nhiều loại cây trồng khác nhau. Việc ứng dụng phƣơng pháp phát sinh phôi vô tính ở cây Dầu mè hứa hẹn sẽ mang lại nhiều ƣu điểm vì có thể tạo ra một số lƣợng lớn cây con có chất lƣợng tốt trong một thời gian ngắn. Trong bài báo này, chúng tôi nghiên cứu ảnh hƣởng của Kinetin kết hợp với IBA và 2,4-D lên sự hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi từ mẫu cấy lá cây Dầu mè. Ảnh hƣởng của các thành phần khoáng đa lƣợng khác nhau trong môi trƣờng nuôi cấy lên sự phát sinh phôi vô tính ở cây Dầu mè cũng đƣợc khảo sát. Cây con in vitro đƣợc chuyển ra vƣờn ƣơm để đánh giá khả năng sống sót và hoàn thiện quy trình nhân giống cây Dầu mè thông qua con đƣờng phát sinh phôi vô tính từ mẫu cấy lá trƣởng thành với hệ số nhân giống đạt đƣợc tƣơng đối cao. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Vật liệu Vật liệu thí nghiệm là lá của cây Dầu mè Ấn độ đƣợc trồng tại vƣờn giống Viện Sinh Học Nhiệt Đới thuộc Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam. Phƣơng pháp Khử trùng mẫu cấy Lá đƣợc đặt dƣới vòi nƣớc chảy trong 30 phút sau đó tiến hành rửa sạch bề mặt lá bằng xà phòng loãng (Viso, Việt Nam) và rửa lại bằng nƣớc cất vô trùng. Sau đó, lá đƣợc khử trùng bằng dung dịch Javel 7% trong thời gian 15 phút và rửa lại 5 lần bằng nƣớc cất vô trùng. Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi Lá đƣợc cắt thành những mảnh nhỏ và đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng WPM (Lloyd, McCown, 1980) có bổ sung 30 g/l sucrose, 9 g/l agar, Kinetin (0,1 – 2,0 mg/l) kết hợp với IBA (0,1 – 1,0 mg/l) hoặc 2,4-D (0,1 – 1,0 mg/l). pH môi trƣờng đƣợc điều chỉnh về 5,8 trƣớc khi hấp khử trùng ở nhiệt độ 121ºC, áp suất 1 atm trong thời gian 30 phút. Các mảnh lá đƣợc nuôi trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày ở nhiệt độ 22 ± 2ºC. Ảnh hưởng của khoáng đa lượng lên sự hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi Bảy loại môi trƣờng khác nhau có chứa thành phần khoáng đa lƣợng của MS, MS½ (Murashige và Skoog, 1962), WPM (Lloyd và McCown, 1980), B5 (Gamborg và cs., 1968), White (White, 1963), SH (Schenk và Hildebrandt, 1972), Nitsch (Nitsch và Nitsch, 1969) đƣợc sử dụng. Mỗi môi trƣờng đều đƣợc bổ sung thành phần vi lƣợng và vitamin của MS, 100 mg/l myo-inositol, 3% sucrose, 1,5 mg/l Kinetin và 0,5 mg/l 2,4-D. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự phát triển của mô sẹo có khả năng phát sinh phôi Mô sẹo có khả năng phát sinh phôi đƣợc cấy chuyền sang môi trƣờng MS có bổ sung 1,5 mg/l Kinetin và 0,5 mg/l 2,4-D với 3 điều kiện nuôi cấy khác nhau: bán rắn (bổ sung 9 g/l agar), lỏng tĩnh (không bổ sung agar), lỏng lắc (không bổ sung agar, lắc với tốc độ 120 vòng/phút). Bảng 1. Thành phần ion trong các môi trƣờng sử dụng (theo George và Sherrington, 1984). Ion Nồng độ (mM) MS MS ½ WPM B5 White SH Nitsch NO 3 - 39,4 19,7 9,7 24,7 3,3 24,7 18,4 H 2 PO 4 - 1,3 0,7 1,3 1,1 0,1 2,6 0,5 Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011 195 SO 4 2- 1,5 0,8 7,2 2,0 4,4 1,6 0,8 Cl - 6,0 3,0 1,3 2,0 0,9 2,7 3,0 K + 20,0 10,0 12,6 24,7 1,7 24,7 9,9 Ca 2+ 3,0 1,5 3,0 1,0 1,2 1,4 1,5 Na + - - - 1,1 2,9 - - Mg 2+ 1,5 0,8 1,5 1,0 2,9 1,6 0,8 NH 4 + 20,6 10,3 5,0 2,0 - 2,6 9,0 N tổng 60,0 30,0 14,7 26,7 3,3 27,3 27,4 NH 4 + /NO 3- 0,52 0,52 0,52 0,08 - 0,11 0,49 Nồng độ ion tổng 93,3 46,7 41,5 59,6 17,4 61,9 43,9 Sự trưởng thành, biệt hóa và nảy mầm của phôi vô tính Mô sẹo với các khối tiền phôi đƣợc tách thành những cụm nhỏ và cấy sang môi trƣờng MS có bổ sung 1,0 mg/l Kinetin kết hợp với 2,4-D ở những nồng độ khác nhau (0 – 1,0 mg/l). Tách các phôi ở giai đoạn lá mầm hoặc đã nảy chồi ra khỏi đám mô sẹo và cấy sang môi trƣờng tái sinh cây (môi trƣờng MS½ không bổ sung chất điều hòa tăng trƣởng thực vật). Xử lý thống kê Các thí nghiệm đƣợc thiết kế theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên. Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần, số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Statgraphics Centurion XV theo phƣơng pháp DMRT (Ducan, 1995) ở mức ý nghĩa 5%. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi Mẫu cấy lá cây Dầu mè đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng WPM cơ bản có bổ sung Kinetin kết hợp với IBA và 2,4-D ở những nồng độ khác nhau bắt đầu phồng lên sau 5 – 7 ngày. Trên môi trƣờng không bổ sung chất điều hòa tăng trƣởng thực vật, mẫu cấy lá cũng phồng lên sau đó dần hóa nâu và chết (Hình 1a 1 ). Đáp ứng đầu tiên của mẫu cấy là gân chính phình ra, sự hình thành mô sẹo chỉ đƣợc quan sát ở bề mặt cắt của mảnh lá sau 2 tuần nuôi cấy. Mô sẹo bắt đầu hình thành từ gân chính sau đó lan rộng ra bề mặt lá. Quan sát hình thái bên ngoài và cấu trúc giải phẫu bên trong của mẫu cấy cho thấy sau khoảng 7 – 10 ngày nuôi cấy, bắt đầu có sự tăng sinh tế bào từ vùng tế bào nhu mô của mô thịt lá, khối mô sẹo ban đầu có màu trắng, xốp. Jha và cộng sự (2007) cho rằng các chất điều hòa tăng trƣởng thực vật đƣợc sử dụng ở các nồng độ khác nhau là những yếu tố chính xác định sự hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi vô tính ở cây Jatropha curcas. Trong thí nghiệm này, kết quả đƣợc chỉ ra cho thấy Kinetin khi sử dụng phối hợp với IBA hoặc 2,4-D ở những nồng độ khác nhau có ảnh hƣởng đến sự hình thành mô sẹo và hình thái của mô sẹo từ mẫu cấy lá cây Dầu mè (Bảng 2). Bảng 2. Ảnh hƣởng của Kinetin kết hợp với IBA và 2,4-D lên sự hình thành mô sẹo từ lá cây Dầu mè Kinetin (mg/l) IBA (mg/l) 2,4-D (mg/l) Tỉ lệ hình thành mô sẹo (%) Hình thái mô sẹo - - - - Mẫu cấy phồng lên, màu nâu đen 0,1 0,1 - 37,5 e (*) Mềm, màu vàng sáng 0,5 0,1 - 40,8 de Mềm, màu vàng sáng 1,0 0,1 - 42,9 de Mềm, màu xanh sáng 0,5 0,5 - 62,1 c Mềm, màu vàng sáng 1,0 0,5 - 70,3 bc Đặc, chắc, màu kem sáng 1,5 0,5 - 65,4 c Đặc, chắc, màu xanh sáng 2,0 0,5 - 43,8 d Đặc, chắc, màu xanh sáng 0,5 1,0 - 56,1 cd Đặc, chắc, màu xanh sáng 1,0 1,0 - 60,3 c Đặc, chắc, màu xanh sáng 1,5 1,0 - 61,6 c Đặc, chắc, màu nâu đen 2,0 1,0 - 49,8 d Đặc, chắc, màu nâu đen 0,1 - 0,1 45,2 d Mềm, dễ vỡ vụn, màu kem 0,5 - 0,1 46,7 d Mềm, dễ vỡ vụn, màu kem 1,0 - 0,1 46,9 d Mềm, dễ vỡ vụn, màu kem sáng 0,5 - 0,5 72,4 bc Mềm, dễ vỡ vụn, màu kem sáng 1,0 - 0,5 89,3 a Mềm, dễ vỡ vụn, màu kem sáng Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011 196 1,5 - 0,5 75,1 b Mềm, dễ vỡ vụn, có nốt hình cầu 2,0 - 0,5 53,1 d Mềm, dễ vỡ vụn, có nốt hình cầu 0,5 - 1,0 76,1 b Mềm, nhão, màu trắng 1,0 - 1,0 80,3 b Mềm, nhão, màu trắng 1,5 - 1,0 63,7 c Mềm, nhão, màu trắng 2,0 - 1,0 56,2 cd Mềm, nhão, màu trắng Chú thích: (*) Những chữ cái khác nhau (a,b,c,…) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α = 0,05 trong phép thử DMRT Kinetin (0,5 – 2,0 mg/l) kết hợp với IBA (0,5 – 1,0 mg/l) có tác dụng cảm ứng sự hình thành mô sẹo có dạng đặc, chắc, màu từ vàng đến xanh sáng (Hình 1a 2 ). Mô sẹo tăng sinh mạnh mẽ. Tuy nhiên, sau khoảng 8 tuần nuôi cấy thì phần bên dƣới của khối mô sẹo tiếp xúc với môi trƣờng xuất hiện vùng hóa nâu đen, phần mô sẹo phía trên mất dần màu xanh. Tỉ lệ hình thành mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung Kinetin kết hợp với IBA (37,5 – 65,4%) thấp hơn so với trên môi trƣờng có bổ sung Kinetin kết hợp với 2,4-D (45,2 – 89,3%). Mô sẹo đƣợc tạo ra trên môi trƣờng có bổ sung Kinetin (0,5 – 2,0 mg/l) kết hợp với 2,4-D (0,1 – 0,5 mg/l) đều có dạng mềm, dễ vỡ vụn. Đặc biệt, trên môi trƣờng có bổ sung Kinetin và 0,5 mg/l 2,4-D có sự xuất hiện của khối mô sẹo cùng với một số cấu trúc hình cầu giống phôi có màu kem sáng (Hình 1a 3 ). Jha và cộng sự (2007) đã nhận thấy rằng những mẫu cấy lá cây Jatropha curcas đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng MS có bổ sung 2,0 mg/l Kinetin có sự cảm ứng hình thành mô sẹo cao hơn đáng kể so với các môi trƣờng khác. Môi trƣờng này cho thấy sự phát triển các mô sẹo có khả năng phát sinh phôi có nhiều nốt nhỏ màu kem trong khoảng 4 tuần nuôi cấy. Hình 1. Mô sẹo từ lá cây Dầu mè trên các môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy khác nhau a 1 . Mô sẹo trên môi trƣờng WMP không bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng thực vật; a 2 .Mô sẹo trên môi trƣờng WMP + 1,5 mg/l Kinetin + 0,5 mg/l IBA; a 3 .Mô sẹo trên môi trƣờng WMP + 1,5 mg/l Kinetin + 0,5 mg/l 2,4-D; b 1 .Mô sẹo trên môi trƣờng bán rắn; b 2 .Mô sẹo trong môi trƣờng lỏng tĩnh; b 3 .Mô sẹo trên môi trƣờng lỏng lắc Ảnh hưởng của khoáng đa lượng lên sự hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi Bảng 3. Ảnh hƣởng của khoáng đa lƣợng lên sự hình thành mô sẹo từ lá cây Dầu mè Thành phần khoáng đa lƣợng Tỉ lệ hình thành mô sẹo (%) Trọng lƣợng tƣơi mô sẹo (mg) Số cấu trúc giống phôi Hình thái mô sẹo MS 100 a (*) 28,7 a 4,5 a Mềm, xốp, có nốt hình cầu MS ½ 74,6 b 24,0 a 2,9 b Mềm, xốp, có nốt hình cầu WPM 78,2 b 24,1 a 2,7 b Mềm, xốp, có nốt hình cầu B5 100 a 26,6 a 3,2 b Mềm, xốp, có nốt hình cầu White 61,9 c 23,5 a 0 c Mềm, xốp, dễ vỡ vụn SH 100 a 27,2 a 3,5 b Mềm, xốp, có nốt hình cầu Nitsch 100 a 27,8 a 3,4 b Mềm, xốp, có nốt hình cầu Chú thích: (*) Những chữ cái khác nhau (a,b,c,…) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α = 0,05 trong phép thử DMRT Sự hấp thu các nguyên tố khoáng từ môi trƣờng nuôi cấy trong quá trình cảm ứng và suốt giai đoạn đầu phát sinh phôi vô tính đã đƣợc chứng minh (Dussert và cs., 1995; Fisichella và cs. 2000). Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng thành phần khoáng đa lƣợng của 7 loại môi trƣờng thƣờng đƣợc sử dụng trong lĩnh vực nuôi cấy mô và tế bào thực vật: MS, MS ½, WPM, B5, White, SH, Nitsch. Mỗi môi trƣờng đều đƣợc bổ sung thành phần vi lƣợng và vitamin của MS, đồng thời bổ sung thêm 1,5 mg/l Kinetin và 0,5 mg/l 2,4-D. Sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả cho thấy hầu hết các Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011 197 môi trƣờng đều cảm ứng sự hình thành mô sẹo với tỉ lệ cao. Số lƣợng cấu trúc hình cầu giống phôi vô tính hình thành nhiều nhất ở mẫu lá đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng có thành phần khoáng đa lƣợng của MS. Không có sự khác biệt đáng kể nào giữa các nghiệm thức khoáng đa lƣợng khác nhau đƣợc ghi nhận ngoại trừ trên môi trƣờng White không có sự hình thành cấu trúc hình cầu giống phôi. Trên môi trƣờng White, tất cả các mẫu cấy đều phát triển thành mô sẹo mềm, kết cấu xốp và dễ vỡ vụn mà không có sự hiện diện của cấu trúc giống phôi nào (Bảng 3). Sự kết hợp các thành phần khoáng đa lƣợng cảm ứng sự phát sinh phôi vô tính hiệu quả nhất đối với cây Cọc rào là môi trƣờng MS. Kết quả này có thể do hàm lƣợng nitơ trong môi trƣờng cao, ít nhất là gấp hai lần so với những môi trƣờng khác; một nguyên nhân khác có thể là do sự cân bằng giữa nitrate và ammonium trong môi trƣờng nuôi cấy. Nhƣ đƣợc chỉ ra trong Bảng 1, môi trƣờng MS có chứa 60 mM nitơ trong đó hàm lƣợng NO 3 - chiếm 39,4 mM và hàm lƣợng NH 4 + chiếm 20,6 mM trong khi trong tất cả các môi trƣờng khác, hàm lƣợng nitơ không vƣợt quá 30 mM. Kết quả phân tích tƣơng quan tuyến tính cũng chỉ ra mối quan hệ giữa hàm lƣợng nitơ trong môi trƣờng và đáp ứng phát sinh phôi ở cây Dầu mè (Biểu đồ 1). Có một sự tƣơng quan mạnh đƣợc ghi nhận giữa số lƣợng cấu trúc giống phôi trung bình trên mỗi mẫu lá và hàm lƣợng nitơ tổng trong các môi trƣờng khác nhau (R 2 = 0,7284). y = 0.0686x + 1.0291 R 2 = 0.7284 0 1 2 3 4 5 6 0 10 20 30 40 50 60 70 Hàm lượng nitơ tổng (mM) Số cấu trúc giống phôi Biểu đồ 1. Mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng nitơ tổng (mM) trong các môi trƣờng nuôi cấy và sự hình thành các cấu trúc hình cầu giống phôi Kết quả tƣơng tự cũng đã đƣợc báo cáo trên 2 dòng sắn (Manihot esculenta), sự hình thành cấu trúc giống phôi đạt đƣợc trên môi trƣờng MS lớn hơn so với trên môi trƣờng SH, WPM hay B 5 (Taylor và cs., 1996). Hơn nữa, việc loại bỏ NH 4 + hay NH 4 NO 3 ra khỏi môi trƣờng MS làm giảm sự hình thành những cấu trúc phôi. Sự phát sinh phôi vô tính trên môi trƣờng SH thấp hơn so với trên môi trƣờng MS (Trigiano và cs., 1992) nhƣng khi bổ sung NH 4 + vào môi trƣờng SH làm kích thích sự phát sinh phôi ngang bằng với trên môi trƣờng MS. Môi trƣờng MS cũng hiệu quả hơn trong việc cảm ứng phát sinh khối mô sẹo có khả năng phát sinh phôi ở cây Pistacia vera so với môi trƣờng WPM (Onay và cs., 1995) và trong nuôi cấy bao phấn cây Helianthus annuus, môi trƣờng MS cũng gây ra đáp ứng phát sinh phôi tốt hơn môi trƣờng Nitsch, B 5 và White (Thengane và cs., 1994). Tác động kích thích của nguồn nitơ khử trong môi trƣờng lên sự phát sinh phôi vô tính cũng đƣợc ghi nhận trong quá trình nuôi cấy cỏ Linh lăng trên môi trƣờng SH có bổ sung thêm muối ammonium (Walker và Sato, 1981). Bên cạnh hàm lƣợng nitơ tổng, có thể nhận thấy rằng sự khác biệt về khả năng hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi còn chịu ảnh hƣởng bởi hàm lƣợng ion K + và Ca 2+ . Ion K + liên quan đến bơm proton và trong sự vận chuyển gián tiếp các chất hòa tan (Briskin và Hanson, 1992) có thể là yếu tố giới hạn sự phát sinh phôi vô tính. Vì vậy, trong nuôi cấy huyền phù Cà rốt, hàm lƣợng potassium thấp trong môi trƣờng nuôi cấy làm hạn chế sự hình thành phôi vô tính mà không ảnh hƣởng đến sự tăng trƣởng tế bào trong khi hàm lƣợng potassium cao làm tăng mạnh số lƣợng phôi (Brown và cs., 1976). Sự phát sinh phôi vô tính cũng có thể chịu ảnh hƣởng bởi calcium. Ca 2+ hoạt động nhƣ là một tín hiệu thứ cấp trong con đƣờng truyền tín hiệu kích thích ngoại bào bằng cách gắn với calmodulin hay các protein gắn calcium khác để kiểm soát nhiều đáp ứng sinh lý tế bào (Bush, 1995). Ở Cà rốt, sự phân cực hình thái của các cụm tế bào sinh phôi kết hợp với Ca 2+ nội bào tự do (Timmers và Schel, 1991). Hơn nữa, sự gia tăng hàm lƣợng CaCl 2 trong môi trƣờng cảm ứng hình thành số lƣợng phôi nhiều hơn (Silva và Ricardo, 1992). Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự phát triển của mô sẹo có khả năng phát sinh phôi Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011 198 Trong thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy rằng các nhân tố môi trƣờng nhƣ trạng thái vật lý của môi trƣờng và điều kiện khí oxy hòa tan có những ảnh hƣởng chuyên biệt trong sự cảm ứng tạo các cấu trúc hình cầu giống phôi và gia tăng sự phát sinh phôi từ mô sẹo. Sinh khối mô sẹo mang đi nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng tĩnh tăng sinh rất chậm so với trong môi trƣờng thạch rắn và môi trƣờng lỏng lắc (Bảng 4); không những vậy, cấu trúc mô sẹo từ nuôi cấy lỏng tĩnh cũng không có khả năng phát triển thành những khối hình cầu có cấu trúc giống phôi (Hình 1b 2 ). Bảng 4. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy lên sự phát triển của mô sẹo sinh phôi Điều kiện nuôi cấy Trọng lƣợng tƣơi mô sẹo (mg) Số cấu trúc giống phôi Hình thái mô sẹo Đặc 28,7 ab (*) 4,5 b Mềm, xốp, màu xanh nhạt, có cấu trúc hình cầu Lỏng tĩnh 22,4 b 0 c Mềm, màu vàng nhạt, bề mặt ƣớt, không có cấu trúc hình cầu Lỏng lắc 34,5 a 10,2 a Mềm, màu kem, bề mặt ƣớt, có nhiều cấu trúc hình cầu Chú thích: (*) Những chữ cái khác nhau (a,b,c,…) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α = 0,05 trong phép thử DMRT Sự gia tăng sinh khối mạnh mẽ của cụm mô sẹo trên môi trƣờng đặc so với môi trƣờng lỏng tĩnh trong một thời gian ngắn là rất đáng đƣợc ghi nhận (Bảng 4). Hoạt động phân chia của cụm mô sẹo trên môi trƣờng bán rắn rất tốt, khi đƣợc nuôi cấy ngoài sáng, các tế bào mô sẹo sinh tổng hợp diệp lục tốt, có màu xanh mƣớt và có sự hình thành những cấu trúc hình cầu từ rất sớm (sau 20 ngày nuôi cấy) (Hình 1b 1 ). Mô sẹo đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng đặt trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút phát triển thành các khối tế bào có màu vàng kem, hơi rời rạc, bề mặt dạng nốt, có thể nhận thấy rõ sự xuất hiện của những cấu trúc tiền phôi hình cầu có đƣờng kính lớn khoảng 1 mm (Hình 1b 3 ). Số lƣợng cấu trúc giống phôi trong môi trƣờng lỏng tĩnh (10,2 phôi hình cầu/mẫu mô sẹo) tăng đáng kể so với trên môi trƣờng rắn (4,5 phôi hình cầu/mẫu mô sẹo) tuy nhiên khả năng gia tăng sinh khối vẫn không có sự khác biệt đáng kể. Sau 30 ngày, thể tích môi trƣờng giảm dần, có thể do môi trƣờng bốc hơi và do sự hấp thu dinh dƣỡng lỏng của mẫu cấy để tiếp tục tăng sinh, do đó phải tiến hành cấy chuyền trên cùng loại môi trƣờng. Trong suốt thời gian cấy chuyền này, các tế bào liên tục trải qua các chu kỳ phân chia tế bào để cuối cùng có thể đạt đến trạng thái sinh phôi. Ngoài ra, việc duy trì khối mô sẹo trong môi trƣờng cảm ứng trong một thời gian dài không chỉ có tác dụng cảm ứng tế bào sang trạng thái sinh phôi, mà còn có thể duy trì và gia tăng khả năng sinh phôi của mẫu cấy. Sự trưởng thành, biệt hóa và nảy mầm của phôi vô tính Mô sẹo với các khối tiền phôi đƣợc tách thành những cụm nhỏ và cấy sang môi trƣờng có bổ sung Kinetin và 2,4-D ở nồng độ thấp hơn cho thấy những kết quả khác nhau (Bảng 5) Bảng 5. Ảnh hƣởng của Kinetin và 2,4-D lên sự trƣởng thành và biệt hóa phôi Kinetin (mg/l) 2,4-D (mg/l) Tỉ lệ phát sinh phôi (%) Số lƣợng phôi ở các giai đoạn Hình cầu Hình tim Hình thủy lôi Lá mầm 1,0 - 73 12 3 2 1 1,0 0,05 82 15 2 3 3 1,0 0,10 67 17 2 2 1 1,0 0,25 58 14 4 2 1 1,0 0,50 54 12 1 1 0 1,0 0,75 50 11 2 1 0 1,0 1,00 41 9 1 1 0 Kết quả đƣợc chỉ ra cho thấy tần suất mô sẹo phát sinh phôi vô tính hình cầu cao nhất (82%) đƣợc ghi nhận trên môi trƣờng có sự kết hợp 1,0 mg/l Kinetin và 0,05 mg/l 2,4-D sau 4 – 6 tuần nuôi cấy. Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011 199 Hình 2. Sự trƣởng thành, biệt hóa và nảy mầm của phôi vô tính Dầu mè a 1 . Phôi hình cầu; a 2 . Phôi hình tim; a 3 . Phôi hình thủy lôi; a 4 . Phôi giai đoạn lá mầm; b. Hình thái giải phẫu phôi vô tính Dầu mè; c. Cây con nảy mầm từ phôi; d. Cây con ngoài vƣờn ƣơm Khi chuyển mô sẹo có các khối tiền phôi sang môi trƣờng chỉ bổ sung 1,0 mg/l Kinetin, chúng tôi nhận thấy có những thay đổi đáng kể từ phần sinh khối tiền phôi về màu sắc và kết cấu, đặc biệt là những biểu hiện phát triển biệt hóa rất nhanh chóng của phôi vô tính trên môi trƣờng này. Kết quả giải phẫu hình thái phôi vô tính cho thấy có sự hình thành của các cấu trúc lƣỡng cực gồm những tế bào nhỏ, tế bào chất đậm đặc, bắt màu đậm (Hình 2b). Vai trò của cytokinin và auxin trong các giai đoạn phát sinh phôi vô tính khác nhau đã đƣợc báo cáo (Fujimura và Komamine, 1980; Lo Schiavo và cs., 1989; Litz và Gray, 1995). Sự kết hợp của auxin và cytokinin trong nghiên cứu này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu phát sinh phôi vô tính ở cây Coffea Arabica (Neuenschwnader và Baumann, 1992). Cụm phôi vô tính hình cầu có thể đƣợc quan sát trong suốt 2 – 3 tuần đầu trên môi trƣờng tăng sinh phôi. Phôi vô tính hình cầu có màu kem, tròn và có tổ chức cao đƣợc biệt hóa từ phần rìa của khối mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy. Chúng bám vào khối mô sẹo có khả năng phát sinh phôi trong khi phần còn lại của mô sẹo vẫn trắng và hơi mờ. Phôi vô tính hình cầu đƣợc cấy chuyền sang môi trƣờng tăng sinh phôi tƣơng tự dần dần chuyển sang các giai đoạn phôi hình tim, hình thủy lôi và giai đoạn lá mầm với 2 cực rõ ràng so với phôi hình cầu chiếm đa số trong quá trình nuôi cấy (Hình 2a). Bảng 6. Hàm lƣợng hormone nội sinh trong phôi vô tính Dầu mè ở những giai đoạn phát triển khác nhau Hormone nội sinh Nồng độ Phôi hình cầu Phôi hình tim/ Thủy lôi Phôi lá mầm Zeatin (μg/kg) 3880,2 2784,3 26,9 IAA (mg/kg) ND (*) ND ND GA 3 (mg/kg) ND ND ND Chú thích: (*) ND – Không phát hiện ở mức LOD (giới hạn phát hiện) = 0,1 mg/kg Kết quả phân tích hàm lƣợng hormone nội sinh trong phôi vô tính ở những giai đoạn khác nhau cho thấy ở giai đoạn phôi hình cầu, hàm lƣợng cytokinin nội sinh rất cao, tuy nhiên không phát hiện thấy có sự hiện diện của auxin nội sinh (Bảng 6). Điều này có thể do trong những giai đoạn cảm ứng mô sẹo trƣớc đó đã sử dụng 2,4-D ở nồng độ tƣơng đối cao nên các tế bào đã sử dụng 2,4-D thay thế cho vai trò của IAA nội sinh. Khi phôi vô tính phát triển sang những giai đoạn tiếp theo, hàm lƣợng cytokinin nội sinh giảm dần. Đến giai đoạn xuất hiện lá mầm, hàm lƣợng Zeatin chỉ còn lại rất thấp (26,9 μg/kg). Phôi vô tính trƣởng thành đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng nảy mầm không bổ sung chất điều hòa tăng trƣởng trong 2 tuần để kích thích phát triển thành cây con hoàn chỉnh có chồi và rễ. Ban đầu, cây con phát triển tốt với nhiều lá xanh. Phôi vô tính đƣợc tạo thành cũng nhƣ đã nảy mầm xuất hiện lẫn lộn trong đám mô sẹo, do đó một động tác tách các phôi đã nảy mầm để cấy sang môi trƣờng mới cho cây con phát triển hoàn chỉnh và mạnh khỏe là điều cần thiết. Sau khi đƣợc cấy sang môi trƣờng mới, rễ mầm bắt đầu đƣợc kéo dài. Dần dần, cây phát triển nên một hệ thống rễ dày đặc và khỏe, bộ rễ đâm thẳng xuống môi trƣờng thạch (Hình 2c). Hệ rễ phát triển khỏe mạnh hút chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng cung cấp cho cây tăng trƣởng và phát triển chồi. Thời gian Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011 200 các phôi vô tính trong cùng một mẫu mô sẹo nảy mầm cũng khác nhau. Tuy nhiên, sau 45 ngày thì tỷ lệ nảy mầm của các phôi vô tính là 70%. Nhƣ vậy, phôi vô tính Dầu mè đƣợc tạo thành gián tiếp thông qua giai đoạn tạo mô sẹo dƣới sự tác động của Kinetin và 2,4-D cho thấy có sự nảy mầm tốt, ngoài ra cây con tạo thành không có những biểu hiện gì bất thƣờng. KẾT LUẬN Cây Dầu mè là một trong những loại cây trồng đa mục đích mang lại hiệu quả kinh tế cao, nhất là đối với những nƣớc đang phát triển nhƣ Việt Nam. Đã có nhiều nghiên cứu trong việc tái sinh loài cây trồng có giá trị này. Tuy nhiên, kết quả đạt đƣợc trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy mẫu cấy lá là một loại mô cấy thích hợp để nhân giống cây Dầu mè thông qua con đƣờng phát sinh phôi vô tính. Kết quả đạt đƣợc là tiền đề cho những nghiên cứu chuyển gene trong tƣơng lai nhằm nâng cao sản lƣợng quả và hàm lƣợng dầu trong quả phục vụ cho ngành công nghiệp năng lƣợng. TÀI LIỆU THAM KHẢO Briskin D, Hanson JB (1992) How does the plant plasma membrane HC-ATPase pump protons. J Exp Bot 43: 269-289. Brown S, Wetherell DF, Dougall DK (1976) The potassium requirement for growth and embryogenesis in wild carrot suspension cultures. Physiol Plant 37: 73-79. Bush DS (1995) Calcium regulation in plant cells and its role in signalling. Annu. Rev. Plant Physiol Plant Mol Biol 46: 95-122. Duncan DB (1995) Multiple range and Multiple F tests. Biometrics 11(1): 1-5. Dussert S, Verdeil JL, Buffard-Morel J (1995) Specific nutrient uptake during initiation of somatic embryogenesis in coconut calluses. Plant Sci 111: 229-236. Fisichella M, Silvi E, Morini S (2000) Regeneration of somatic embryos and roots from quince leaves cultured on media with different macroelement composition. Plant Cell Tis Org Cult 63: 101-107. Fujimura T, Komamine A (1980) Mode of action of 2,4-D and zeatin on somatic embryogenesis in carrot suspension culture. Z Pflazenphysiol 99: 1-8. Gamborg OL, Miller RA, Ojima K (1968) Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp Cell Res 50: 151-158. George EF, Sherrington PD (1984) Plant Propagation by Tissue Culture. Edington, UK; Exegetics Ltd Heller J (1996) Physic nut, Jatropha curcas L. International Plant Genetic Resource Institute, Rome: 1-66. Jha TB, Mukherjee P, Datta MM (2007) Somatic embryogenesis in Jatropha curcas Linn., an important biofuel plant. Plant Biotech Rep 1: 135-140. Litz RE, Gray DJ (1995) Somatic embryogenesis for agricultural improvement. World J Microbiol Biotechnol 11: 416-425. Lloyd G, McCown BH (1980) Commercially feasible micropropagation of mountain laurel (Kalmia latifolia) by use of shoot tip culture. Int Plant Prop Soc, Comb Proc 30: 421-427. Lo Schiavo F (1989) DNA methylation of embryogenic carrot cell cultures and its variations as caused by mutation, differentiation, hormones and hypomethylating drugs. Theor Appl Genet 77: 325-331. Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15: 473-479. Neuenschwander B, Baumann TW (1992) A novel type of somatic embryogenesis in Coffea arabica. Plant Cell Rep 10: 608-612. Nitsch JP, Nitsch C (1969) Haploid plants from pollen grains. Science 163: 85-87. Onay A, Jeffree CE, Yeoman MM (1995) Somatic embryogenesis in cultured immature kernels of Pistachio (Pistacia vera L). Plant Cell Rep 15: 192-195. Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011 201 Openshaw K (2000) A review of Jatropha curcas: an oil plant of unfulfilled promise. Biomass Bioener 19: 1-15. Prabakaran AJ, Sujatha M (1999) Jatropha tanjorensis Ellis and Saroja, a natural interspecific hybrid occurring in Tamil Nadu, India. Genet Resour Crop Evol 46(3): 213-218. Rajore S, Batra A (2005) Efficient plant regeneration via shoot tip explant in Jatropha curcas. J Plant Biochem Biotech 14: 73-75. Sardana J, Batra A, Ali DJ (2000) An expeditious method for regeneration of somatic embryos in Jatropha curcas L. Phytomorphology 50: 239-242. Schenk RU, Hildebrandt AC (1972) Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Can J Bot 50: 199-204 Shrivastava S, Banerjee M (2008) In vitro clonal propagation of physic nut (Jatropha curcas L.): Influence of additives. Inter J Integrative Bio 3(1): 73-79. Silva P, Ricardo CPP (1992) Beta-fructosidases and in vitro dedifferentiation-redifferentiation of carrot cells. Phytochem 31: 1507-1511. Sujatha M, Makkar HPS, Becker K (2006) Shoot bud proliferation from axillary nodes and leaf sections of non-toxic Jatropha curcas L. Plant Grow Reg 47: 83-90. Sujatha M, Mukta N (1996) Morphogenesis and plant regeneration from tissue cultures of Jatropha curcas. Plant Cell Tis Org Cult 44: 135-141. Taylor NJ, Edwards M, Kiernan RJ, Davey CDM, Blakesley D, Henshaw GG (1996) Development of friable embryogenic callus and embryogenic suspension culture systems in cassava (Manihot esculenta Crantz). Nature Bio 14: 726-730. Thái Xuân Du, Nguyễn Văn Uyển (2006). Triển vọng sản xuất dầu diesel từ cây Cọc rào (Jatropha curcas L.) ở Việt Nam. Hội thảo: Nhiên liệu sinh học ở Việt Nam, tiềm năng và cơ hội phát triển, NXB Khoa học và kỹ thuật, 88-94. Thengane SR, Joshi MS, Khuspe SS, Mascarenhas AF (1994) Anther culture in Helianthus annuus L., influence of genotype and culture conditions on embryo induction and plant regeneration. Plant Cell Rep 13: 222-226. Timmers ACJ, Schel JHN (1991) Localization of cytosolic Ca 2+ during carrot somatic embryogenesis using confocal scanning laser microscopy. In: Karsenn CM, van Loon LC, Vreugdenhil D (eds) Progress in Plant Growth Regulation. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers 347–353. Trigiano RN, May RA, Conger BV (1992) Reduced nitrogen influences somatic embryo quality and plant regeneration from suspension cultures of orchardgrass. In Vitro Cell Dev Biol 28: 187-191. Walker KA, Sato SJ (1981) Morphogesis in callus tissue of Medicago sativa: the role of ammonium ion in somatic embryogenesis. Plant Cell Tiss Org Cult 1: 109-121. White PR (1963) The Cultivation of Animal and Plant Cells, 2 nd edn. New York: Ronald Press. . 2,4-D l n sự hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi từ mẫu cấy l cây Dầu mè. Ảnh hƣởng của các thành phần khoáng đa l ợng khác nhau trong môi trƣờng nuôi cấy l n sự phát sinh phôi vô tính. Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011 193 SỰ PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MẪU CẤY L CÂY DẦU MÈ (JATROPHA CURCAS L. ) Bùi Văn Thế Vinh 1 , Chu Thị Bích Phượng 1 ,. hƣởng đến sự hình thành mô sẹo và hình thái của mô sẹo từ mẫu cấy l cây Dầu mè (Bảng 2). Bảng 2. Ảnh hƣởng của Kinetin kết hợp với IBA và 2,4-D l n sự hình thành mô sẹo từ l cây Dầu mè Kinetin