NHÂN GIỐNG CÂY TỎI TA (Allium sativum L.) THÔNG QUA PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH TỪ CHÓP RỄ in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NHÂN GIỐNG CÂY TỎI TA (Allium sativum L.) THÔNG QUA PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH TỪ CHĨP RỄ in vitro Ngành học : CƠNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : ĐỖ NGỌC THANH MAI Niên khóa : 2008 – 2012 Tháng 07/2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NHÂN GIỐNG CÂY TỎI TA (Allium sativum L.) THÔNG QUA PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH TỪ CHĨP RỄ CÂY TỎI in vitro Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS TÔN BẢO LINH ĐỖ NGỌC THANH MAI KS TÔ THỊ NHÃ TRẦM Tháng 07/2012 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, ban Chủ nhiệm Bộ Mơn Công Nghệ Sinh Học quý Thầy Cô tạo điều kiện tốt đẹp truyền đạt kiến thức cho em suốt trình học tập trường Em xin trân trọng biết ơn Cô Tô Thị Nhã Trầm Tôn Bảo Linh, tận tâm quan sát, hướng dẫn truyền đạt kinh nghiệm quí báu cho em suốt trình thực tập tốt nghiệp Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Thầy Lê Đình Đơn, người gợi ý cho định hướng suốt trình nghiên cứu khoa học Xin cảm ơn giúp đỡ bạn Hằng, Thảo, Vân, Tú bạn phòng người chia khó khăn, vui buồn suốt q trình thực Con xin thành kính ghi ơn ba má, hai người suốt đời trăn trở, dốc hết công lao, động viên, che chở cho ngày hôm Chị xin ghi khắc ơn sâu em, người dành điều kiện tốt đẹp cho chị ăn học nên người Sau xin cảm ơn bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học DH08SH, đặc biệt nhóm G11 chia tơi thời gian học hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ thời gian thực tập Mặc dù có nhiều cố gắng, kiến thức kinh nghiệm hạn chế nên luận văn khơng thể tránh khỏi thiếu xót Chúng tơi mong đóng góp thầy bạn Xin chân thành cảm ơn! Sinh viên thực ĐỖ NGỌC THANH MAI i TÓM TẮT Tỏi ta (Allium sativum L.) trồng quan trọng Củ tỏi sử dụng phổ biến để làm gia vị thảo dược Bởi có khả cải thiện mùi vị cho ăn chứa chất có hoạt tính sinh học (như Allicin) có khả kháng sinh, ngăn ngừa ung thư, giảm cholesterol Tỏi thường trồng theo phương pháp truyền thống sinh dưỡng khơng có khả sinh sản hữu tính; tỏi dễ có nguy mắc bệnh virus Nhằm đáp ứng nhu cầu giống đạt yêu cầu sản lượng giữ chất lượng giống tỏi ta vốn có, nghiên cứu “Nhân giống tỏi ta (Allium sativum L.) thơng qua phát sinh phơi vơ tính từ chóp rễ in vitro” thực thơng qua ni cấy chóp rễ, qua q trình cảm ứng tạo mơ sẹo, phát sinh phơi vơ tính, hình thành tạo củ ống nghiệm Mẫu chóp rễ in vitro sử dụng cho trình cảm ứng mơ sẹo, phát sinh phơi vơ tính, tái sinh chồi tạo củ Mẫu nuôi cấy môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l NAA kết hợp với 1,0 mg/l BA Mô sẹo phát sinh sau tuần ni cấy điều kiện tối hồn tồn Chuyển mẫu sang ni cấy điều kiện có ánh sáng, mơ sẹo phát triển phát sinh phơi vơ tính với tỉ lệ 32,85% tuần Chồi hoàn chỉnh tái sinh với tỉ lệ 33,26% tuần Trong tuần nuôi cấy, củ tỏi ta in vitro tạo với tỉ lệ cao 91,67% đường kính lớn (trung bình 4,37 mm) ni cấy chồi môi trường bổ sung 80 g/l sucrose sau tuần nuôi cấy Cây tỏi in vitro trồng vườn ươm, sinh trưởng tốt sau 15 ngày ii SUMMARY Garlic (Allium sativum L.) is an important which widely used for both culinary and medicinal purposes because of its ability to improve the taste of food and its biological activities (as allicin) that include antibiotic, antitumor, cholesterol lowering Garlic has been traditionally cultivated vegetatively because of its sexual sterility; consequently, viral diseases are a very serious problem To supply the necessitude of breeding garlic, acquired characteristics about yield and the preservation of natural genius, wherefore the study "Micropropagation of garlic (Allium sativum L.) via somatic embryogenesis from in vitro root-tip" was performed Through processing of callus induction, somatic embryogenesis, shoots regeneration and whole plant production The in vitro root-tip explants were used for callus induction, somatic embryogenesis, plantlets regeneration, and bulbs formation process Explants were cultured in MS media supplemented with 1.0 mg/l NAA and 1.0 mg/l BA Callus was induced in the dark after weeks Then, they were grown under the light, developed and fromed into somatic embryo with rate 32.85% in weeks Plantlets were formed at the rate of 33.26% in weeks later Garlic bulbs in vitro were produced with high rate (91.67%) and pretty bulb diameter (4.37 mm) in culture medium supplemented with 80 g/l sucrose in weeks Plantlets were planted in the arboretum, which were growth after 15 days Keywords: Garlic, in vitro, Root-tip, somatic embryo iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vi Danh sách bảng vii Danh sách hình viii Chương Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cần đề tài 1.3 Nội dung thực Chương Tổng quan tài liệu 2.1 Giới thiệu chung tỏi 2.1.1 Phân loại 2.1.2 Nguồn gốc phân bố 2.1.3 Đặc điểm sinh học tỏi 2.1.3.1 Cấu tạo, hình thái củ tỏi 2.1.3.2 Đặc điểm sinh trưởng phát triển tỏi 2.1.4 Thành phần hoạt tính sinh học hợp chất tỏi 2.1.5 Tình hình sản xuất, xuất nhập tỏi 2.2 Giới thiệu chung kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật 2.3 Kỹ thuật ni cấy phơi vơ tính 2.3.1 Giới thiệu phơi vơ tính 2.3.2 Con đường phát sinh phơi vơ tính 10 2.3.3 Sự biệt hóa mơ phơi vơ tính 11 2.3.4 Những nhân tố ảnh hưởng đến cảm ứng hình thành phơi vơ tính 12 2.3.4.1 Ảnh hưởng nhân tố auxin 12 2.3.4.2 Ảnh hưởng nhân tố cytokinin 12 2.3.4.3 Ảnh hưởng nhân tố nhân tố khác 13 iv 2.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu ni cấy mơ in vitro tỏi 14 Chương Vật liệu phương pháp nghiên cứu 16 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 16 3.2 Vật liệu 16 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 16 3.2.2 Hóa chất khử trùng mẫu cấy 16 3.2.3 Môi trường nuôi cấy 17 3.3 Phương pháp nghiên cứu 17 3.3.1 Tạo tỏi in vitro 17 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NAA BA lên mẫu chóp rễ 18 3.3.3 Quan sát hình thái giải phẫu trình tạo mơ sẹo 19 3.3.4 Khảo sát hàm lượng sucrose đến hình thành củ tỏi in vitro 20 3.3.5 Cây tỏi in vitro vườn ươm 20 3.3.6 Điều kiện nuôi cấy in vitro 20 3.3.7 Xử lý số liệu 20 Chương Kết thảo luận 21 4.1 Nuôi cấy tép tỏi tạo in vitro 21 4.2 Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng NAA BA 22 4.2.1 Khả đáp ứng mẫu mô môi trường nuôi cấy 22 4.2.2 Phát sinh hình thái mẫu chóp rễ mơi trường ni cấy 24 4.2.3 Quan sát hình thái giải phẫu mơ sẹo có khả phát sinh phơi vơ tính 29 4.2.4 Số lượng chồi in vitro hình thành từ phơi vơ tính 32 4.3 Khảo sát hàm lượng sucrose đến hình thành củ tỏi in vitro 35 4.4 Cây tỏi in vitro vườn ươm 35 4.5 Quy trình nhân giống tỏi ta in vitro tính kinh tế 35 Chương Kết luận đề nghị 37 5.1 Kết luận 37 5.2 Đề nghị 37 Tài liệu tham khảo 38 PHỤ LỤC v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4 – D : 2,4 – Dichlorophenoxyacetic Acid BA : N6- Benzyladenine Cvt : Cộng tác viên DNA : Deoxyribonucleic acid EDTA : Ethylene diamine tetra acetate FAOSTAT : Food and Agriculture Organization of the United Nations IAA : – indol acetic acid MS : Murashige and Skoog, 1992 NAA : α – Naphthalene acetic acid TDZ : Thidiazuron (N-phenyl-N’-1,2,3-thidiazol-5-ylurea) vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Cách chẻ mẫu tép tỏi nuôi cấy in vitro 18 Bảng 3.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật 19 Bảng 3.3 Khảo sát hàm lượng sucrose đến hình thành củ tỏi in vitro 20 Bảng 4.1 Ảnh hưởng cách chẻ mẫu tép tỏi 21 Bảng 4.2 Sự đáp ứng mẫu lá, chóp rễ đoạn sau chóp rễ 23 Bảng 4.3 Sự đáp ứng mẫu chóp rễ mơi trường ni cấy theo thời gian 25 Bảng 4.4 Tỉ lệ hình thành mơ sẹo, phơi vơ tính chồi 29 Bảng 4.5 Số lượng chồi in vitro hình thành từ phơi vơ tính 32 Bảng 4.6 Kết khảo sát củ môi trường nuôi cấy tạo củ 33 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Cấu tạo tỏi ta Hình 2.2 Cấu trúc củ tỏi ta Hình 2.3 Tình hình sản xuất tỏi giới năm 2009 Hình 2.4 Tình hình xuất tỏi giới năm 2009 Hình 2.5 Tình hình nhập tỏi giới năm 2009 Hình 2.6 Hai đường phát sinh phơi vơ tính 10 Hình 2.7 Các giai đoạn phát sinh hình thái phơi vơ tính loquat 11 Hình 3.1 Củ tỏi giống 16 Hình 4.1 Các mẫu tép tỏi nuôi cấy môi trường MS sau 15 ngày 22 Hình 4.2 Đáp ứng mẫu mẫu chóp mơi trường ni cấy 24 Hình 4.3 Sự kéo dài nhân rễ 26 Hình 4.4 Sự phát sinh hình thái từ mơ sẹo 27 Hình 4.5 Giải phẫu mơ sẹo từ chóp rễ tỏi sau tuần ni cấy 30 Hình 4.6 Giải phẫu mơ sẹo từ chóp rễ tỏi sau tuần ni cấy 30 Hình 4.7 Khối mơ sẹo phát sinh phơi vơ tính 31 Hình 4.8 Các giai đoạn phát triển phơi vơ tính tỏi ta 32 Hình 4.9 Chồi sinh từ phơi vơ tính từ chóp rễ sau 10 tuần ni cấy 32 Hình 4.10 Kích thước củ tỏi in vitro 34 Hình 4.11 Cây tỏi in vitro 34 Hình 4.12 Cây tỏi in vitro ngồi vườn 35 Hình 4.13 Quy trình nhân giống tỏi ta phương pháp nhân giống in vitro 36 viii Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Mẫu tép tỏi chẻ đôi nuôi cấy môi trường MS sau 15 ngày, nảy mầm phát triển đầy đủ rễ chồi Môi trường nuôi cấy bổ sung chất điều hòa sinh trưởng (NAA BA) thích hợp sử dụng cho cảm ứng hình thành mơ sẹo tối, phát sinh phôi từ mô sẹo ánh sáng mẫu cấy chóp rễ tỏi ta Khi ni cấy ngồi ánh sáng, mơ sẹo phát sinh phơi vơ tính, hình thành chồi với tỉ lệ cao mơi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l NAA 1,0 mg/l BA Sucrose đóng vai trò quan trọng hình thành củ tỏi Củ tỏi hình thành mơi trường MS có bổ sung 60 g/l, 80 g/l sucrose tối ưu cho rễ tạo củ tuần nuôi cấy tỏi in vitro Cây tỏi in vitro hoàn chỉnh trồng vườn ươm phát triển bình thường sau 15 ngày chăm sóc 5.2 Đề nghị Khảo sát yếu tố khác ánh sáng, nhiệt độ, pH môi trường nuôi cấy, nồng độ loại chất điều hòa sinh trưởng ảnh hưởng đến hình thành củ tỏi in vitro Trồng khảo nghiệm tỏi in vitro đồng ruộng địa phương chuyên trồng tỏi vào mùa vụ (mùa thu đông) Tiếp tục khảo sát khả phát triển củ tỏi giống in vitro đồng ruộng, nơi ứng dụng sản phẩm Bên cạnh vấn đề nhân nhanh giống tỏi, tiếp tục tiến hành nghiên cứu số phương pháp cải biến làm gia tăng chất lượng mùi vị hợp chất thứ cấp củ tỏi qua phương pháp nuôi cấy in vitro 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Võ Thị Trà An 2010 Thuốc khử trùng thuốc sát trùng Giáo trình dược lý đại cương Bộ mơn Nội dược, Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trường ĐHNL Tp HCM Nguyễn Minh Chính, Nguyễn Văn Long, Đào Văn Đơn, Nguyễn Duy Thức 2000 Nghiên cứu thành phần hóa học tỏi Lý Sơn Tạp chí y dược, trang Dương Công Kiên 2002 Nuôi cấy mô thực vật, tập Nhà xuất Đại học Quốc gia, Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy Tiên 2006 Công nghệ tế bào Nhà xuất Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh, trang 87-196 Trần Văn Minh 1997 Công nghệ tế bào thực vật Viện Sinh học Nhiệt đới, trung tâm KHTN CN Quốc gia, trang 99 – 121 Dương Tấn Nhựt 2007 Phơi vơ tính Cơng nghệ sinh học thực vật, tập Nhà xuất Nơng nghiệp, Tp Hồ Chí Minh, trang 103-130 Dương Tấn Nhựt 2010 Một số phương pháp, hệ thống nghiên cứu công nghệ sinh học thực vật Nhà xuất Nông nghiệp, Tp Hồ Chí Minh, trang 17-39 Bùi Trang Việt 2000 Phát triển Sinh lý thực vật đại cương Nhà xuất Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh Bùi Trang Việt 2005 Sinh học tế bào Nhà xuất Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh, trang 333-340 Tài liệu tiếng Anh 10 Akitsu Nagasawa and John J Finer, 1988 Development of morphogenic suspension cultures of garlic (Allium sativum L.) Plant cell, tissue and organ culture, 15 (2): 183-187 11 Alejandrina Robledo-Paz, Viactor M Villalobos-Araa Mbula and Alba E JofreGarfias, 2000 Efficient plant regeneration of garlic (Allium sativum L.) by root-tip culture In Vitro Cell, 36: 416 - 419 12 Binzel ML, Sankhla N, Joshi S and Sankhla D 1996 Induction of direct somatic embryogenesis and plant regeneration in pepper (Capsicum annuum L.) Plant Cell Reports 15: 536 – 540 13 Cellini, L., E., Di Campli, M Masulli, S.Di Bartolomeo, and N Allocati 1996 Inhibition of Helicobacter pyroliby garlic extract (Allium sativum) FEMS Immunol Med Mic., 13: 273-277 38 14 Ekweney, U.N and N.N Elegalan 2005 Antibacterial activity ofgingerandgarlic extracts on Escherichia coli and Salm one llatyphi J M ol Med Adv Sci., 1(4):411-416 15 Francisco R Quiroz-Figueroa, Rafael Rojas-Herrera, Rosa M Galaz-Avalos, Vıctor M Loyola-Vargas 2006 Embryo production through somatic embryogenesis can be used to study cell differentiation in plants Plant Cell Tiss Organ Cult 86: 285 – 301 16 George EF 1993 Plant Propagation by Tissue Culture: The Technology Exegetics Ltd., Edington, UK 17 Juan Yan, Yong-qing Wang, Jun-qiang Li, Lian Tao, Qun-xian Deng and Xiu-lan Lv 2012 Morphological and histological observationson the induction of anther calluses and embryos in loquat (Eriobotrya japonica Lindl.) African Journal of Agricultural Research (1): 123 - 127 18 Kahane R, Teyssendier de la Serve B, Rancillac M 1992 Bulbing in long- day onion (Allium cepa L.) cultured in vitro: comparison between sugar feeding and light induction Annals of Botanay 69: 551- 555 19 Kiyoshi Masuda, Etsuko Hatakeyama, Akiko Ito, Seiko Takahashi and masayasu Inoue, 1994 Micropropagation of garlic Bull Akita Pref Coll Agr (20): 43-48 20 Khan N., M.S Alam and U.K Nath 2004 In vitro Regeneration of Garlic Through Callus Culture Journal of Biological Sciences (2): 189-191 21 Leandro Ma1s, 2011 Analysis of the garlic market DOCTRAV/AGRI.C.2./2011 22 Muhammad Shahidul Haque, Tomikichi Wada and Kazumi Hattori 1997 High frequency shoot regeneration and plantlet formation from root tip of garlic Plant Cell, Tissue and Organ Culture 50: 83–89 23 Muhammad Shahidul Haque, Tomikichi Wada and Kazumi Hattori 2003 Shoot Regeneration and Bulblet Formation from Shoot and Root Meristem of Garlic Cv Bangladesh Local Asian Journal of Plant Sciences (1): 23-27 24 Pan,X.Y., Q Lif, R.J.Yu and H W ang 1985 Comparisonof the cytotoxic effects of fresh g arlic diallyltrisulphide,5-flurouracil,mitomycin and cis-DDPon two lin es of gastric cancer cells Chin J Oncol., 7:103-105 25 Reinert J 1959 Uber die kontrolle der morphogenese und die induktion von adventivembryonen an gew- ebekulturen aus karotten Planta 53:318–333 26 Rice RD, Alderson PG, Wright NA 1983 Induction of bulbing of tulip shoots in vitro Scientia Horticulturaee 20: 377- 390 27 Salam M.A., M.R Ali, Md Eunus Ali, K.A Alam, M.S.H Reza, S Islam and S.M.M Rahman, 2008 Callus Induction and Regeneration of Indigenous Garlic (Allium sativum L.) American Journal of Plant Physiology (1): 33-39 28 Saos F Le Guen-Le, A Hourmant, F Esnault andvJ E Chauvin 2002 In vitro bulb development in Shallot (Allium cepa L Aggregatum group): effect of antigibberellins, sucrose and light Annals of Botanay 89: 419-425 39 29 Sata J., S B Bagatharia V S Thaker 2001 Induction of direct somatic embryogenesis in garlic (Allium sativum) Method in cell science 22, Number 4, 299-304 30 Shobana S., V.G Vidhya and M Ramya 2009 Antibacterial Activity of Garlic Varieties (Ophioscordonand Sativum) on Enteric Pathogens Current Research Journalof BiologicalSciences 1(3): 123-126 31 Sook Young Lee, Haeng Hoon Kim, Yong Kyoung Kim, Nam Il Park and Sang Un Park 2009 Plant regeneration of garlic (Allium sativum L.) via somatic embryogenesis Scientific Research and Essay (13): 1569-1574 32 Stavelikova H 2008 Morphological characteristics of garlic (Allium sativum L.) genetic resources collection – Information Hort SCI 35 (3): 130 – 135 33 Steward F.C., Mapes, M.O., and Smlth, J 1958 Growth and organized development of cultured cells I Growth and division of freely suspended cells Am J Bot 45, 693-703 34 Takayuki Nagakubo, Akitsu Nagasawa and Hideo Ohkawa 1993 Micropropagation of garlic through in vitro bulblet formation Plant Cell, Tissue and Organ Culture 32: 175-183 35 Totik Sri Mariani, Hiroshi Miyake, Rizkita Rachmi Esyanti, Ida Nurwendah 2003 Effect of 2,4-D on Indirect Somatic Embryogenesis and Surface Structural Changes in Garlic (Allium sativum L.) cv Lumbu Hijau Jurnal Matematika dan Sains 8(4) 36 Yasseen Mohamed-Yassen, Sheryl A Barringer and Walter E Splittstoesser 1995 In vitro buld production from Allium spp In Vitro Cell Dev Biol 31: 51-52 37 Yeh, Y and S Yeh 1994 Garlicreduces plasma lipids by inhibiting hepatic cholesterol and triacylglycerol synthesis Lipids, 29:189-193 38 Ying Hua Su and Xian Sheng Zhang 2009 Auxin gradients trigger de novo formation of stem cells during somatic embryogenesis Plant signaling and behavior (7): 574 – 576 Tài liệu internet 39 Allium sativum 2003 Steve Christman http://www.floridata.com/ref/a/alli_sat.cfm Ngày cập nhật: 11/07/2011 40 Gary L Huber, MD, 2012 The Medicinal Use of Garlic in History http://www.amazingherbs.com/meduseofgari.html Texas Nutrition Institute Ngày cập nhật: 12/06/2012 41 Garlic (allium sativum) 27/1/2010 http://allotmentheaven.blogspot.com/2010/01/garlic-allium-sativum.html cập nhật: 15/07/2011 Ngày 42 Garlic (Allium sativum L.) 8/8/2009 http://www.unigraz.at/~katzer/engl/Alli_sat.html Ngày cập nhật: 04/08/2011 40 43 Jurnal Matematika dan Sains 2003 Effect of 2,4-D on Indirect Somatic Embryogenesis and Surface Structural Changes in Garlic (Allium sativum L.) cv Lumbu Hijau http://jms.fmipa.itb.ac.id/index.php/jms/article/view/211 Ngày cập nhật: 22/06/2012 44 Nguyễn Văn Mạnh 2009 Cây tỏi ta http://www.ninhthuan.gov.vn/chinhquyen/sonnnt/Pages/Cay-toi-ta.aspx Ngày cập nhật: 14/08/2011 45 Ninh Thuận: Giá hành tím, tỏi giống tăng chóng mặt 10/11/2010 http://www.congan.com.vn/?mod=detnews&catid=707&id=180076 nhật: 12/06/2011 Ngày cập 46 Peggy Trowbridge Filippone, 2012 Garlic History http://homecooking.about.com/od/foodhistory/a/garlichistory.htm Ngày cập nhật: 10/06/2012 47 Sant S Bhojwani 2003 In vitro propagation of garlic by shoot proliferation http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0304423880900217 Ngày cập nhật: 48 Growing Garlic Planting & Care 18/3/2009 http://www.blogdivvy.com/growing-vegetables/growing-garlic-planting-care.htm Ngày cập nhật: 02/06/2012 49 http://www.bachkhoatrithuc.vn/encyclopedia/112-112633325463430712500/Cuoc-song-quanh-ta/Xa-phong-co-tac-dung-tay-sach-nhuthe-nao.htm Ngày cập nhật: 15/07/2012 50 Tỏi-Vị thuốc từ thiên nhiên 04/07/2010 http://www.dongtayy.com/Bai-thuocdong-y/toi-vi-thuoc-tu-thien-nhien.html Ngày truy cập: 13/8/2011 41 PHỤ LỤC Bảng Số mẫu sống sau 15 ngày nuôi cấy Nghiệm thức T1 T2 T3 T4 12 13 15 15 Lần lập lại 13 16 17 15 Trung bình 14 13 17 16 13 14 16,333 15,333 Bảng Bảng ANOVA tỉ lệ (%) mẫu sống sau 15 ngày nuôi cấy A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 406.250 135.417 3.611 0.0650 Within 300.000 37.500 Total 11 706.250 Coefficient of Variation = 8.30% Var V A R I A B L E No Bảng Số rễ /mẫu hình thành sau 15 ngày ni cấy Nghiệm thức T1 T2 T3 T4 1 10 Lần lặp lại 2 8 Trung bình 1,3333 1,6667 8,6667 8,6667 Bảng Bảng ANOVA số lượng rễ/ tép hình thành sau 15 ngày nuôi cấy A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 136.869 45.623 222.551 0.0000 Within 1.640 0.205 Total 11 138.509 Coefficient of Variation = 9.26% Var V A R I A B L E No Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng số lượng rễ/ tép hình thành sau 15 ngày ni cấy Error Mean Square = 0.2050 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 1.240 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 1.350 B Mean = 8.320 Mean = 1.680 B Mean = 8.220 Mean = 8.220 A Mean = 1.680 Mean = 8.320 A Mean = 1.350 A A B B Bảng Chiều dài rễ sau 15 ngày nuôi cấy Nghiệm thức T1 T2 T3 T4 0,52 0,66 3,56 3,54 Chiều dài rễ (cm)/ Lần lặp lại 0,48 0,58 0,58 0,72 3,55 3,85 3,85 3,65 Trung bình 0,527 0,653 3,657 3,680 Bảng Bảng ANOVA chiều dài rễ trung bình sau 15 ngày nuôi cấy A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 28.453 9.484 336.029 0.0000 Within 0.226 0.028 Total 11 28.679 Coefficient of Variation = 7.89% Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng chiều dài rễ trung bình sau 15 ngày nuôi cấy Error Mean Square = 0.02800 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 0.4584 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 0.5300 B Mean = 3.680 Mean = 0.6500 B Mean = 3.660 Mean = 3.660 A Mean = 0.6500 Mean = 3.680 A Mean = 0.5300 A A B B Bảng Chiều dài sau 15 ngày nuôi cấy Nghiệm thức T1 T2 T3 T4 Chiều dài (cm)/ Lần lặp lại 0,417 0,356 0,367 0,91 0,86 1,13 8,34 8,53 9,02 3,563 3,58 3,86 Trung bình 0,380 0,967 8,630 3,667 Bảng 10 Bảng ANOVA chiều dài trung bình sau 15 ngày ni cấy A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 127.395 42.465 148.965 0.0000 Within 2.281 0.285 Total 11 129.676 Coefficient of Variation = 15.65% Bảng 11 Bảng trắc nghiệm phân hạng chiều dài trung bình sau 15 ngày ni cấy Error Mean Square = 0.2850 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 1.463 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 0.3800 C Mean = 8.630 Mean = 0.9700 C Mean = 3.670 Mean = 8.630 A Mean = 0.9700 Mean = 3.670 B Mean = 0.3800 A B C C Bảng 12 Số mẫu hình thành mơ sẹo sau tuần ni cấy tối Nghiệm thức R11 R12 R13 R14 R15 R16 R17 R18 11 14 15 14 20 18 19 10 Số mô sẹo/ Lần lặp lại 13 11 16 17 20 19 20 12 10 18 17 11 19 18 20 11 Trung bình 11.333 14.333 16 14 19.667 18.333 19.667 11 Bảng 13 Bảng ANOVA tỉ lệ mơ sẹo từ chóp rễ mơi trường R11 đến R18 sau tuần nuôi cấy tối A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 6478.829 925.547 11.235 0.0000 Within 16 1318.136 82.383 Total 23 7796.965 Coefficient of Variation = 11.58% Bảng 14 Bảng trắc nghiệm phân hạng tỉ lệ mơ sẹo từ chóp rễ mơi trường R11 đến R18 sau tuần nuôi cấy tối Error Mean Square = 82.38 Error Degrees of Freedom = 16 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 21.65 s_ = 5.240 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 57.44 C Mean = 99.91 Mean = 71.01 BC Mean = 99.91 Mean = 82.01 AB Mean = 90.91 Mean = 70.06 BC Mean = 82.01 Mean = 99.91 A Mean = 71.01 Mean = 90.91 AB Mean = 70.06 Mean = 99.91 A Mean = 57.44 Mean = 56.00 C Mean = 56.00 A A AB AB BC BC C C Bảng 15 Số mẫu hình thành phơi vơ tính sau tuần ni cấy ngồi sáng Nghiệm thức R11 R12 R13 R14 R15 R16 R17 R18 6 Số phơi vơ tính/ Lần lặp lại 4 7 5 Trung bình 4,33 6,33 3,67 6,67 3,67 6,33 Bảng 16 Bảng ANOVA tỉ lệ hình thành phơi vơ tính từ chóp rễ mơi trường R11 đến R18 sau tuần ni cấy ngồi sáng A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 1094.965 156.424 5.299 0.0028 Within 16 472.285 29.518 Total 23 1567.250 Coefficient of Variation = 22.09% Bảng 17 Bảng trắc nghiệm phân hạng tỉ lệ hình thành phơi từ chóp rễ mơi trường R11 đến R18 sau tuần ni cấy ngồi sáng Error Mean Square = 29.52 Error Degrees of Freedom = 16 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 12.96 s_ = 3.137 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 19.98 ABC Mean = 33.28 Mean = 18.19 BC Mean = 32.85 Mean = 31.93 AB Mean = 31.93 Mean = 25.48 ABC Mean = 25.48 Mean = 18.98 ABC Mean = 19.98 Mean = 32.85 A Mean = 18.98 Mean = 16.06 C Mean = 18.19 Mean = 33.28 A Mean = 16.06 A A AB ABC ABC ABC BC C Bảng 18 Số mẫu hình thành chồi sau tuần ni cấy ngồi sáng Nghiệm thức R11 R12 R13 R14 R15 R16 R17 R18 4 4 Số mẫu / Lần lặp lại 7 3 6 Trung bình 4,3333 6,6667 3,3333 4,3333 6,6667 3,6667 5,6667 3,6667 Bảng 19 Bảng ANOVA tỉ lệ hình thành chồi mơi trường R11 đến R18 sau tuần ni cấy ngồi sáng A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 1036.669 148.096 6.565 0.0009 Within 16 360.922 22.558 Total 23 1397.590 Coefficient of Variation = 19.34% Bảng 20 Bảng trắc nghiệm phân hạng tỉ lệ hình thành chồi môi trường R11 đến R18 sau tuần nuôi cấy sáng Error Mean Square = 22.56 Error Degrees of Freedom = 16 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 11.33 s_ = 2.742 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 23.26 AB Mean = 34.60 Mean = 33.26 A Mean = 33.26 Mean = 18.24 B Mean = 30.24 Mean = 19.67 B Mean = 23.26 Mean = 34.60 A Mean = 19.67 Mean = 18.88 B Mean = 18.88 Mean = 30.24 AB Mean = 18.33 Mean = 18.33 B Mean = 18.24 A A AB AB B B B B Bảng 21 Số lượng chồi in vitro hình thành từ phơi vơ tính sau tuần nuôi cấy Nghiệm thức R13 R16 R18 11 Số chồi con/ Số mẫu 10 11 8 12 Trung bình 5,25 11 7,5 Bảng 22 Bảng ANOVA số lượng chồi in vitro hình thành từ phơi vơ tính sau tuần nuôi cấy A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 67.167 33.583 17.028 0.0009 Within 17.750 1.972 Total 11 84.917 Coefficient of Variation = 17.74% Bảng 23 Trắc nghiệm phân hạng số lượng chồi in vitro hình thành từ phơi vơ tính sau tuần nuôi cấy Error Mean Square = 1.972 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 3.227 s_ = 0.7021 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 5.250 B Mean = 11.00 Mean = 11.00 A Mean = 7.500 Mean = 7.500 B Mean = 5.250 A B B Bảng 24 Số mẫu hình thành củ môi trường bổ sung sucrose sau tuần Nghiệm thức MS20 MS40 MS60 MS80 14 16 19 Số mẫu/ Lần lặp lại 13 17 18 Trung bình 12 16 18 5,67 13 16,33 18,33 Bảng 25 Bảng ANOVA tỉ lệ hình thành củ môi trường bổ sung sucrose sau tuần ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 6961.000 2320.333 83.365 0.0000 Within 222.667 27.833 Total 11 7183.667 Coefficient of Variation = 7.89% Bảng 26 Trắc nghiệm phân hạng tỉ lệ hình thành củ mơi trường bổ sung sucrose Error Mean Square = 27.83 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 14.45 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 28.33 C Mean = 91.67 Mean = 65.67 B Mean = 81.67 Mean = 81.67 A Mean = 65.67 Mean = 91.67 A Mean = 28.33 A A B C Bảng 27 Kích thước củ tỏi hình thành mơi trường bổ sung sucrose sau tuần Nghiệm thức MS20 MS40 MS60 MS80 Kích thước củ (mm)/ Lần lặp lại 2.5 2.4 2.8 3.2 4.35 3.5 4.35 4.2 4.6 4.3 Trung bình 2.3 4.067 4.367 Bảng 28 Bảng ANOVA kích thước củ tỏi hình thành môi trường bổ sung sucrose A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 8.233 2.744 35.797 0.0001 Within 0.613 0.077 Total 11 8.847 Coefficient of Variation = 8.06% Bảng 29 Trắc nghiệm phân hạng kích thước (mm) củ tỏi hình thành mơi trường bổ sung sucrose sau tuần Error Mean Square = 0.07700 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 0.7602 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 2.300 B Mean = 4.370 Mean = 3.000 B Mean = 4.070 Mean = 4.070 A Mean = 3.000 Mean = 4.370 A Mean = 2.300 A A B B Bảng 30 Số lượng rễ tỏi hình thành môi trường bổ sung sucrose sau tuần Nghiệm thức MS20 MS40 MS60 MS80 1 10 Số rễ/ Lần lặp lại 2 Trung bình 3 2,33 5,33 9,33 Bảng 31 Bảng ANOVA số lượng rễ tỏi hình thành mơi trường bổ sung sucrose sau tuần A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 78.000 26.000 24.000 0.0002 Within 8.667 1.083 Total 11 86.667 Coefficient of Variation = 19.52% Bảng 32 Trắc nghiệm phân hạng số lượng rễ tỏi hình thành môi trường bổ sung sucrose sau tuần Error Mean Square = 1.083 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 2.851 at alpha = 0.010 Original Order Ranked Order Mean = 2.330 C Mean = 9.330 Mean = 5.330 B Mean = 5.330 Mean = 9.330 A Mean = 4.330 Mean = 4.330 BC Mean = 2.330 A B BC C Bảng 33 Thành phần môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) sử dụng mơi trường ni cấy Khống đa lượng Khoáng vi lượng Sắt EDTA Vitamine Thành phần NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4 MnSO4.4H2O Nồng độ ( mg/l ) 1650 1900 440 370 170 23,3 ZnSO4.7H2O H3BO3 KI Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O Na2.EDTA.2H2O FeSO4.7H2O Myo-Inositol Thiamin (B1) Nicotinic acid Pyridoxine HCl Glycine 8,6 6,2 0,83 0,25 0,025 0,025 37,3 27,8 100 0,1 0,5 0,5 Bảng 34 Sự đáp ứng mẫu môi trường theo thời gian Nghiệm thức R0 R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 Thời gian nuôi cấy tuần ( tối) Không phản ứng, mẫu xanh Phồng lên bên phần mẫu lá, màu xanh héo Ngã sang màu vàng héo Ngã sang màu vàng héo Thịt phồng lên, màu xanh héo Thịt phồng lên, màu xanh héo Ngã vàng héo Thịt phồng lên, màu xanh héo tuần ( tối) Không phản ứng, mẫu xanh, hai đầu vết cắt héo dần Phồng phần mẫu, ngã sang màu vàng, hai đầu vết cắt héo dần tuần ( tuần ánh sáng) Mất màu dần Màu nâu, chết hồn tồn Hóa nâu, chết Chết hồn tồn hóa nâu, chết Chết hồn tồn Màu vàng héo Màu vàng héo Mẫu hóa nâu Màu vàng héo Màu nâu, chết hoàn toàn Màu nâu, chết hoàn toàn Chết hoàn toàn Màu nâu, chết hoàn toàn R8 R9 R10 R11 R12 R13 R15 R16 R17 R18 Phồng phần thịt, màu vàng héo Phồng phần thịt, màuvàng héo Màu xanh héo Màu xanh héo Không phản ứng Phồng phần thịt lá, màu vàng héo Phồng phần thịt lá, màu vàng héo Không phản ứng Không phản ứng Khơng phản ứng Mẫu hóa nâu Phồng lên, màu nâu Không cảm ứng, màu vàng Không cảm ứng, mẫu chết Khơng phản ứng Có cảm ứng tạo mơ xốp, trắng Cảm ứng tạo mô sẹo, xốp,trắng Không phản ứng Không phản ứng Không phản ứng, mẫu tươi 10 Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết Mẫu chết ... TÍNH TỪ CHĨP RỄ CÂY TỎI in vitro Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS TÔN BẢO LINH ĐỖ NGỌC THANH MAI KS TÔ THỊ NHÃ TRẦM Tháng 07/2012 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu... thiếu xót Chúng tơi mong đóng góp thầy bạn Xin chân thành cảm ơn! Sinh viên thực ĐỖ NGỌC THANH MAI i TÓM TẮT Tỏi ta (Allium sativum L.) trồng quan trọng Củ tỏi sử dụng phổ biến để làm gia vị