Thiết lập quy trình tái sinh cây in vitro và đánh giá kết quả bước đầu chuyển nạp gen vào cây dầu mè (Jatropha curcas L.) thông qua Agrobacterium tumefaciens

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Thiết lập quy trình tái sinh in vitro đánh giá kết bước đầu chuyển nạp gen vào dầu mè (Jatropha curcas L.) thơng qua Agrobacterium tumefaciens Ngành học : CƠNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : MÃ YẾN THANH Niên khóa : 2007 – 20011 Tháng 07/2011 i LỜI CẢM ƠN Để trưởng thành đạt kết ngày hôm nay, trước tiên xin gửi lòng biết ơn sâu sắc tới ba mẹ em trai, người dõi theo bước đường thời gian học xa nhà, điểm tựa để vực dậy sau lần vấp ngã, động lực để sống, học tập phấn đấu Xin chân thành cảm ơn cô Võ Thị Thúy Huệ trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt kiến thức quý báu thầy Bùi Minh Trí tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành khố luận Cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM tạo điều kiện cho bốn năm học tập trường Các Thầy Cơ dạy dỗ tơi q thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học truyền đạt cho tơi kiến thức chun ngành bổ ích Bạn bè người thân xung quanh cảm thơng chia sẻ khó khăn với tơi suốt thời gian thực đề tài ii TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu “Thiết lập quy trình tái sinh in vitro đánh giá kết bước đầu chuyển nạp gen vào dầu mè (Jatropha curcas L.) thơng qua Agrobacterium tumefaciens” tiến hành phòng nuôi cấy mô, Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật - Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Đại học Nông Lâm Tp HCM Thời gian thực từ tháng - 7/2011 Các thí nghiệm tiến hành để xác định thời gian khử trùng mẫu hạt thích hợp, theo dõi khả tái sinh chồi khả thu nạp gen ngoại lai mẫu J curcas Qua q trình thực thí nghiệm chúng tơi nhận thấy: Chế phẩm NaOCl 5% cho hiệu khử trùng mẫu hạt tốt xử lý khử trùng lần, 10 phút nồng độ 10% 20 phút nồng độ 20% Đạt tỉ lệ 96,66% mẫu sạch, không bị nhiễm nấm khuẩn Chồi tái sinh từ callus mẫu mầm, số chồi cao ghi nhận môi trường MS bổ sung BA 1,5 mg/l kết hợp với IBA 0,05 mg/l, tỉ lệ mẫu tạo chồi đạt 70%, trung bình khoảng 4,72 chồi mẫu (ghi nhận sau 45 ngày nuôi cấy) GA3 nồng độ 0,1 mg/l bổ sung vào môi trường (môi trường MS bổ sung BA 1,5 mg/l kết hợp với IBA 0,05 mg/l) cho hiệu nhân chồi tốt (8,91 chồi/ mẫu) Đối với mẫu phôi, nồng độ BA 0,5 mg/l kết hợp với IBA 0,25 mg/l cho hiệu tái sinh chồi từ callus đạt 20%, trung bình khoảng 1,27 chồi mẫu tái sinh (ghi nhận sau 45 ngày nuôi cấy) Các chồi khỏe mạnh đem tạo rễ môi trường 1/2 MS bổ sung IBA 0,5 mg/l, tỉ lệ hình thành rễ đạt 75% (sau tuần) Nồng độ kháng sinh kanamycin dùng chọn lọc mẫu phôi mầm chưa chuyển gen 30 mg/l Nồng độ glufosinate 1,5 mg/l dùng cho chọn lọc mầm mg/l dùng chọn lọc phôi chưa chuyển gen Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA101pIB-GUS Jabcobsen cung cấp mang plasmid pGII0229 (gồm gen bar kháng thuốc diệt cỏ, gen nptII kháng kanamycin gen thị gusA) sử dụng để chuyển vào J curcas Bước đầu ghi nhận kết biểu gen gusA chuyển vào genome cho thấy: Hiệu chuyển gen đạt 40% phôi 66,67% mầm ủ dịch khuẩn thời gian 30 phút, đồng nuôi cấy ngày iii SUMMARY The thesis "Establishment of an efficient in vitro regeneration protocol and assessment for initial results of gene transfer into J curcas via Agrobacterium tumefaciens" was carried out at Research Institute for Biotechnology and Environment, Nong Lam university from 1/2011 to 7/2011 The goal of this study was to develop an efficient regeneration protocol to be used for genetic transformation of Jatropha curcas Results shown that the surfacesterilised protocol which seeds were surface-sterilised with 70% (v/v) ethanol for 30 sec, followed by 10% and 20% (v/v) commercial bleach (with NaOCl as the active agent) containing - drop Tween 80 for 10 and 20 minutes is the highest percentages of aseptic cultures (96.66%) Shoot regeneration from cotyledon and embryo - derived callus is generally influenced by a combination of auxin and cytokinin Zygotic embryo - derived callus regenerated shoot on low concentration of BA (0.5 mg/l) MS Medium supplemented with 0.5 mg/l BA in combination with 0.25 mg/l IBA gave callus regeneration frequency of 20% and produced on avegare 1.27 shoots per plant (after 45 days) In the case of cotyledon explants, the highest number of shoots was obtained on MS medium supplemented with 1.5 mg/l BA in combination with 0.05 mg/l IBA The callus regeneration frequency of 70% and produced on avegare 4.72 shoots per explant (after 45 days) Efficient adventitious shoot multilication rate was achieved on MS medium supplemented with 1.5 mg/l BA + 0.05 mg/l IBA + 0.1 mg/l GA3, producing on average 8.91 shoots per explant Regenerated shoots were cut off and placed onto root induction media for rooting About 75% of the shoots (after weeks) successfully produced roots on 1/2 MS medium supplemented with 0.5 mg/l Optimal concentration of kanamycin for selecting transformed cotyledon and embryo were 30 mg/l mg/L of glufosinate for selection of transformed embryo and 1.5 mg/L for selection of transformed cotyledon Agrobacterium tumefaciens strain EHA101pIB-GUS, harboring a binary transformation vector pGII0229 (containing Trgus cp148 luc carrying β-glucuronidase (gusA) gene, neomycin phosphotransferase (nptII) gene and bialaphos resistance (bar) gene with nos poly–A promoter and CaMV iv 35S terminator) was used to assess transformation efficiency in J curcas Initial result of expression of gusA gene was observed: Embryo explants produced high transformation frequency of 40% when coincubated in Agrobacterium suspension for 30 (cocultured for days) In the case of cotyledon explant, frequency of transformation obtained 66.67% when co-incubated in Agrobacterium suspension for 30 (cocultured for days) v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii SUMMARY iv MỤC LỤC vi DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH CÁC BẢNG xi DANH SÁCH CÁC HÌNH xi Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu .2 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Giới thiệu dầu mè 2.1.1 Vị trí phân loại .3 2.1.2 Nguồn gốc 2.1.3 Phân bố 2.1.4 Đặc điểm hình thái .3 2.1.5 Điều kiện sinh thái 2.1.6 Giá trị dầu mè 2.2 Sự tái sinh in vitro 2.2.1 Cơ chế tái sinh thực vật 2.2.2 Ý nghĩa tái sinh quy trình chuyển nạp gen .6 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình tái sinh 2.2.3.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy 2.2.3.2 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy .8 2.2.4 Các nghiên cứu vấn đề tái sinh J.curcas in vitro 2.3 Giới thiệu chung chuyển gen thực vật 10 2.3.1 Khái niệm 10 2.3.2 Các biện pháp chuyển gen vào thực vật 10 2.3.2.1 Biện pháp sinh học 10 vi 2.3.2.2 Biện pháp học 11 2.3.2.3 Biện pháp vật lí 13 2.3.3 Thành phần gen chuyển nạp 13 2.3.3.1 Promoter 13 2.3.3.2 Gen thông báo 13 2.3.3.3 Chỉ thị chọn lọc 14 2.3.4 Các gen kháng thuốc diệt cỏ phổ biến 15 2.3.4.1 Gen bxn 15 2.3.4.2 Gen bar 15 2.3.5 Hiện trạng xu hướng phát triển trồng biến đổi gen giới .18 2.3.6 Tình hình trồng chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ giới .19 2.3.7 Tình hình nghiên cứu trồng chuyển gen Việt Nam 20 2.4 Các nghiên cứu chuyển nạp gen vào Jatropha curca Agrobacterium 21 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 24 3.2 Vật liệu thí nghiệm 24 3.2.1 Giống 24 3.2.2 Vi khuẩn 24 3.2.3 Vật liệu 25 3.2.3.1 Vật liệu dùng hệ thống tái sinh 25 3.2.3.2 Vật liệu dùng quy trình chuyển gen 25 3.2.3.3 Vật liệu dùng phản ứng PCR 25 3.2.4 Thiết bị dùng thí nghiệm 25 3.2.5 Điều kiện nuôi cấy .26 3.2.6 Phương pháp bố trí xử lý số liệu .26 3.3 Phương pháp thí nghiệm .26 3.3.1 Khảo sát quy trình khử trùng hạt 26 3.3.2 Nhóm thí nghiệm tái sinh Jatropha curcas in vitro 27 3.3.3 Nhóm thí nghiệm tiền chuyển gen .29 3.3.4 Nhóm thí nghiệm chuyển gen 31 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1 Khảo sát quy trình khử trùng hạt 34 vii 4.2 Nhóm thí nghiệm tái sinh .34 4.3 Nhóm thí nghiệm tiền chuyển gen 40 4.4 Nhóm thí nghiệm chuyển gen .44 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1 Kết luận 46 5.1.1 Quy trình khử trùng hạt .46 5.1.2 Môi trường tái sinh 46 5.1.3 Nồng độ kanamycin glusinate dùng chọn lọc 46 5.1.4 Ảnh hưởng thời gian ủ đến hiệu chuyển gen 46 5.2 Đề nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO .49 PHỤ LỤC viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT µl Microlit µM Micromol A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens AS Acetosyringone BA 6-benzyl adenin BAP 6-benzyl aminopurine Bp Base pair Bromoxynil 3,5–dibromo–4–hydroxybenzonitrile Bxn Bromoxynil nitrilase DNA Deoxiribonucleic Axit g (mg) Gram (miligram) GA3 Gibberellic axit Glufosinate DL–homoalanin–4-yl (methyl) phosphinic axit GM Genetically Modified GMC Genetically Modified Crops gusA β–glucuronidase IAA Indole-3-acetic axit IBA Indolebutyric axit J curcas Jatropha curcas Linn KN Kinetin l (ml) Lit (mililit) LB Luria-Bertania mM Milimol MS Murashige Skoog NAA α-naphthaleneacetic axit nptII Neomycin phospho transferase NT Nghiệm thức OD Mật độ quang (Optical density) PCR Polymerase Chain Reaction ix PEG Polyethylene glycol TDZ Thidiazuron Ti-plasmid Tumor-inducing plasmid Vir Virulence X-gluc 5–bromo–4–chloro–3–indolyl glucuronide x Bảng 4.7 Nồng độ plasmid dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Chủng vi khuẩn Nồng độ plasmid Tỉ số A-260/A-280 (ng/µl) EHA101pIB-GUS 75,91 1,95 Một dung dịch nucleic axit xem (không tạp nhiễm protein) tỉ số OD 260nm/OD 280nm nằm khoảng 1,8 - 2,0 Kết cho thấy lượng plasmid thu nhiều tinh Do chúng tơi sử dụng plasmid để thực phản ứng PCR 750 pb A B Hình 4.9 Ladder kết điện di phản ứng PCR A: Ladder; B: kết qua điện di Giếng 1: thang 1kb (O’GenerulerTM 1kb DNA ladder); 2, 3: đối chứng âm; 4: đoạn gen bar khuyết đại Quan sát kết điện di (hình 3.9) ta thấy có xuất vạch tương ứng 748 bp so với thang chuẩn kb cho thấy có hiện gen bar plasmid Kết khẳng định dòng khuẩn lạc chọn có mang plasmid pGII0229 chứa gen bar Do đó, sử dụng dòng vi khuẩn cho thí nghiệm chuyển gen 4.4 Nhóm thí nghiệm chuyển gen Thí nghiệm xác định thời gian ủ với vi khuẩn cho hiệu chuyển gen cao Trong thí nghiệm yếu tố ảnh hưởng đến hiệu chuyển gen xem xét thời gian ủ với vi khuẩn Hiệu chèn gen ngoại lai vào gen J curcas đánh giá thông qua việc nhuộm GUS, nhằm kiểm tra biểu gen gusA Sự biểu gen làm xuất điểm màu xanh bề mặt mô nuôi cấy Các điểm quan sát kính hiển vi (độ phóng đại 4X) sau ngày đồng nuôi cấy Kết ghi nhận sơ ban đầu lần thí nghiệm (bảng 4.10) 44 Bảng 4.8 Ảnh hưởng thời gian ủ với vi khuẩn đến hiệu chuyển gen Thời gian ngâm (phút) 10 20 30 Tỉ lệ biểu gen gusA (%) Phôi 0 20 ngày Lá mầm 40 40 60 Phôi 10 20 40 ngày Lá mầm 60 60 66,67 Hiệu biểu gen gusA mầm cao so với phôi Nghiên cứu Meiru Li ctv, (2007) đề cập mầm Jatropha curcas dễ bị lây nhiễm Agrobacterium so với mẫu khác cuống lá, thân mầm Thời gian ủ với vi khuẩn có ảnh hưởng đến hiệu chuyển, tỉ lệ biểu gen gusA tăng lên tăng thời gian ủ Thời gian ủ cho hiệu biểu gen gusA cao 30 phút (phôi 40% mầm 66,67%) ĐC 45 Hình 4.10 Kết nhuộm GUS phôi Mũi tên điểm màu xanh chàm biểu gen gus ĐC Hình 4.11 Kết nhuộm GUS mầm Mũi tên điểm có màu xanh chàm biểu gen gus 46 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ  5.1 Kết luận Từ kết thu nhận thông qua q trình nghiên cứu chúng tơi rút số kết luận sau: 5.1.1 Quy trình khử trùng hạt - Hạt bóc bỏ vỏ cứng - Khử trùng bề mặt với cồn 70% 30 giây, rửa lại nước vô trùng - lần - Ngâm hạt 10%, 20% nước tẩy (chứa 5% sodium hypochlorite), bổ sung - giọt Tween 80 10, 20 phút, rửa nước vô trùng - lần Hiệu khử trùng đạt 96,66% 5.1.2 Môi trường tái sinh Lá mầm 15 ngày tuổi thu từ hạt nảy mầm in vitro vật liệu tái sinh tốt môi trường MS bổ sung 1,5 mg/l BA 0,05 mg/l IBA với 70% số mẫu tái sinh Môi trường nhân chồi môi trường MS + 1,5 mg/l BA + 0,05 mg/l IBA bổ sung thêm GA3 0,1 mg/l, môi trường cho số lượng chồi mẫu cấy cao (8,91 chồi) Đối với mẫu phôi, môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA 0,25 mg/l IBA cho hiệu tái sinh cao so với nghiệm thức bố trí khác (20%) Tuy nhiên tỉ lệ tái sinh chồi môi trường tương đối thấp, không hiệu so với mẫu mầm Các chồi tái sinh in vitro tạo rễ môi trường ½ MS bổ sung 0,5 mg/l IBA Hiệu tạo rễ môi trường đạt 75% 5.1.3 Nồng độ kanamycin glusinate dùng chọn lọc Kanamycin nồng độ 30 mg/l dùng chọn lọc cho phôi mầm chưa chuyển gen Glufosinate nồng độ 1mg/l dùng chọn lọc phôi nồng độ 1,5 mg/l dùng chọn lọc mầm chưa chuyển gen Đây nồng độ kanamycin glufosinate tối thiểu gây chết 100% mẫu chưa chuyển gen 5.1.4 Ảnh hưởng thời gian ủ đến hiệu chuyển gen 47 Thời gian ủ với dịch vi khuẩn tăng làm hiệu chuyển gen tăng Với thời gian ủ 30 phút cho hiệu biểu gen gusA mầm 66,67% , phôi 40% (sau ngày đồng nuôi cấy) 5.2 Đề nghị - Tiếp tục nghiên cứu cải tiến quy trình tái sinh chồi từ phơi nhằm tăng hiệu tái sinh từ mẫu phôi J curcas - Tiếp tục kiểm tra ảnh hưởng thời gian ủ đến hiệu chuyển gen Tiến hành khảo sát yếu tố khác ảnh hưởng đến hiệu chuyển gen q trình tiền ni cấy, kĩ thuật tạo vết thương, nồng độ Agrobacterium, nồng độ acetosyringone môi trường đồng ni cấy v.v nhằm thiết lập qui trình chuyển gen vào J curcas đạt hiệu cao - Tái sinh hoàn chỉnh J curcas chuyển gen bar kiểm tra biểu gen chuyển vào phương pháp PCR 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Hà Trần Minh Dũng, 2009 Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro nghiên cứu chuyển nạp gen kháng thuốc diệt cỏ glufosinate đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) vi khuẩn Agrobacterium tumefacient Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp, Đại Học Nơng Lâm, Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Huỳnh Liên, 2010 Thiết lập qui trình nhân giống đánh giá khả sinh trưởng long (Hylocereus undatus (Haw) Britt.Rose) nuôi cấy mô Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Đại Học Nơng Lâm, Tp Hồ Chí Minh Trần Lê Lưu Ly, 2011 Chuyển gen mã hóa Retrotransposon Tntl vào đậu nành( Glycinei c max) phương pháp Agrobacterium tumefaciens Luận văn thạc sĩ sinh học, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Tp HCM Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 2004 Di truyền phân tử Nhà xuất Nơng nghiệp, TP Hồ Chí Minh, 473 – 526 Vũ Văn Vụ, 1999 Sinh lý thực vật ứng dụng Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội, – 14 Tài liệu tiếng anh Ajay C Deore, T Sudhakar Johnson 2008 High-frequency plant regeneration from leaf-disc cultures of Jatropha curcas L.: an important biodiesel plant Plant Biotechnol Rep 2: 7–11 Jingli Pan, Qiantang Fu and Zeng-Fu Xu, 2010 Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of biofuel plant Jatropha curcas using kanamycin selection African Journal of Biotechnology 9: 6477-6481 Li MR, Li HQ, Jiang HW, Pan XP, Wu GJ 2008 Establishment of an Agrobacteriuimmediated cotyledon disc transformation method for Jatropha curcas Plant Cell Tissue Organ Cult 92: 173-181 LU Wei-Da, LIAO Yi, PAN Shu-Lin, XU Ying, TANG Lin, CHEN Fang 2004 Plant Regeneration from Epicotyl Explant of Jatropha curcas.Journal of plant physiology molecular biology 30: 475 – 478 10 Mayuree Kaewpooa, Sompong Te-chatob 2009 Influence of explant types and plant growth regulators on multiple shoot formation from Jatropha curcas ScienceAsia 35: 353–357 11 Sujatha, M and N Mukta 1996 Morphogenesis and plant regeneration from tissue cultures of Jatropha curcas Plant Cell Tiss Organ Cult., 44: 135 – 141 49 12 Warakagoda and Subasinghe 2009 In vitro culture establishment and shoot proliferation of Jatropha curcas L Tropical Agricultural Research & Extension 12: 77 – 80 13 Wei Q, Lu W-D, Liao Y, Pan S-L, Xu Y, Tang L, Chen F (2004) Plant regeneration from epicotyl explant of Jatropha curcas J Plant Physiol Mol Bio 30: 475–478 14 Wei Q, Lu W-D, Liao Y, Pan S-L, Xu Y, Tang L, Chen F 2004 Plant regeneration from epicotyl explant of Jatropha curcas J Plant Physiol Mol Bio 30: 475–478 15 Zong, H., S Wang, C Ouyang, X Deng, L Li, J Li and F Chen 2010 Agrobacteriummediated transformation of Jatropha curcas young leaf explants with lateral shoot-inducing factor (LIF) Int J Agric Biol.12: 891 – 896 Tài liệu từ internet 16 Phạm Xuân Tùng & Phạm Thị Lan Ảnh hưởng biện pháp xử lí khử trùng mẫu yếu tố mơi trường nhân nhanh giống dâu tây in vitro http://iasvn.org/uploads/files/dautay_1008085239.pdf 17 Nghiên cứu trồng biến đổi gene: Bức tranh Việt Truy cập ngày 2/7/2011 http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Nghiên_cứu_cây_trồng_biến_đổi_gene:_Bức_tranh_ Việt> 18 Cây trồng biến đổi gen giới năm 2009 : Hiện trạng, tác động triển vọng Truy cập ngày 30/6/2011 http://www2.hcmuaf.edu.vn/contents.php?ur=pvhien&ids=4945 19 Cây trồng biến đổi gen Trung tâm Tri thức Toàn cầu CNSH Cây Trồng, truy cập ngày 31/6/2011 20 James C., “Hiện trạng trồng biến đổi gen thương mại hố tồn cầu”, ISAAA, Brief no 35, 2006 http://www.clrri.org/news/htctbdg.pdf 21 Hình Jatropha curcas :http//www.jatropha.de/news/jcl-news.htm 50 PHỤ LỤC Mơi trường khống MS (Murashige Skoog, 1962) Đa lượng Hàm lượng(mg/l) NH4NO3 1650 KNO3 1900 KH2PO4 170 MgSO4.7H2O 370 CaCl2.2H2O 440 Vi lượng H3BO3 6,2 MnSO4 4H2O 22.3 CoCl2 6H2 O 0.025 CuSO4 5H2O 0.025 ZnSO4 7H2 O 6.8 NaMoO4 H2O 0.25 KI 0.83 Sắt EDTA FeSO4 7H4O 27.8 Na2-EDTA 37.3 Vitamin Myo-Inositol 100 Thiamin-HCl 0.1 Nicotinic Axite 0.5 Glycine Pyridoxin-HCl 0.5 Môi trường LB (Luria-Bertani) Hàm lượng(g/l) Tryptone 10 Yeast extract NaCl 10 51 Agar 18 Kết xử lí thống kê Bảng Số liệu dùng xử lí thống kê thí nghiệm khảo sát qui trình khử trùng hạt Qui trình Lần lặp lại Tỉ lệ mẫu 80 90 100 90 100 100 70 78 Tĩ lệ hạt nảy mầm 68 66 74 70 Bảng Bảng ANOVA cho thí nghiệm khảo sát quy trình khử trùng hạt số liệu có Bảng Bảng Số liệu dùng cho xử lí thống kê thí nghiệm ảnh hưởng BA IBA đến tái sinh từ phôi hạt J curcas Nghiệm thức Lần lặp lại Tỉ lệ callus tạo thành Tỉ lệ callus tái sinh chồi 3 0 0 0 50 90 80 10 0 0 0 40 70 80 10 20 20 70 80 90 10 30 20 52 Bảng Bảng ANOVA cho thí nghiệm ảnh hưởng BA IBA đến tỉ lệ tạo callus từ phôi hạt J curcas dựa số liệu bảng Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng cho thí nghiệm ảnh hưởng BA IBA đến tỉ lệ tạo callus từ phôi hạt J curcas dựa số liệu bảng Bảng Bảng ANOVA cho thí nghiệm ảnh hưởng BA IBA đến tỉ lệ callus tái từ phôi hạt J curcas dựa số liệu bảng 53 Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng cho thí nghiệm ảnh hưởng BA IBA đến tỉ lệ callus tái từ phôi hạt J curcas dựa số liệu bảng Bảng Số liệu dùng cho xử lí thống kê thí nghiệm ảnh hưởng BA IBA đến tái sinh từ mầm J curcas Nghiệm thức Lần lặp lại Tỉ lệ callus tạo thành Tỉ lệ callus tái sinh chồi 3 0 0 0 100 80 90 50 60 65 100 95 95 70 65 75 100 84 73 0 50 85 90 0 Bảng Bảng ANOVA cho thí nghiệm ảnh hưởng BA IBA tỉ lệ tạo callus từ mầm J curcas dựa số liệu bảng Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng cho thí nghiệm ảnh hưởng BA IBA tỉ lệ tạo callus từ mầm J curcas dựa số liệu bảng 54 Bảng 10 Bảng ANOVA cho thí nghiệm ảnh hưởng BA IBA đến tỉ lệ callus tái sinh từ mầm J curcas số liệu bảng Bảng 11 Bảng trắc nghiệm phân hạng cho thí nghiệm ảnh hưởng BA IBA đến tỉ lệ callus tái sinh từ mầm J curcas số liệu bảng Bảng 12 Số liệu dùng cho xử lí thống kê thí nghiệm ảnh hưởng kanamycin đến tái sinh mô (phôi mầm)cây J curcas Glufosinate (mg/l) Lần lặp lại Tỉ lệ mẫu khả tái sinh (%) Phôi Lá mầm 55 0,3 0,5 1,0 1,5 50 100 100 40 100 100 0 100 100 0 30 100 0 60 100 0 30 100 Bảng 13 Bảng ANOVA cho thí nghiệm ảnh hưởng kanamycin đến tái sinh mầm J curcas số liệu bảng 12 Bảng 14 Bảng trắc nghiệm phân hạng cho thí nghiệm ảnh hưởng kanamycin đến tái sinh mầm J curcas số liệu bảng 12 Bảng 15 Bảng ANOVA cho thí nghiệm ảnh hưởng kanamycin đến tái sinh phôi hạt J curcas số liệu bảng 12 56 Bảng 16 Bảng trắc nghiệm phân hạng cho thí nghiệm ảnh hưởng kanamycin đến tái sinh phôi hạt J curcas số liệu bảng 12 Bảng 17 Số liệu dùng cho xử lí thống kê thí nghiệm ảnh hưởng glufosinat đến tái sinh mô (phôi mầm) J curcas Kanamycin (mg/l) Lần lặp lại Tỉ lệ mẫu khả tái sinh (%) Phôi Lá mầm 3 0 0 0 20 90 70 50 60 50 30 30 100 100 100 100 100 100 40 100 100 100 100 100 100 50 100 100 100 100 100 100 Bảng 18 Bảng ANOVA cho thí nghiệm ảnh hưởng glufosinat đến tái sinh mầm J curcas số liệu Bảng 17 57 Bảng 18 Bảng trắc nghiệm phân hạng cho thí nghiệm ảnh hưởng glufosinat đến tái sinh mầm J curcas số liệu Bảng 17 Bảng 19 Bảng ANOVA cho thí nghiệm ảnh hưởng glufosinat đến tái sinh phôi hạt J curcas số liệu Bảng 17 Bảng 20 Bảng trắc nghiệm phân hạng cho thí nghiệm ảnh hưởng glufosinat đến tái sinh phôi hạt J curcas số liệu Bảng 17 58 ... terminator) was used to assess transformation efficiency in J curcas Initial result of expression of gusA gene was observed: Embryo explants produced high transformation frequency of 40% when coincubated... frequency of transformation obtained 66.67% when co-incubated in Agrobacterium suspension for 30 (cocultured for days) v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii SUMMARY ... quy trình tạo trồng chuyển gen Nhờ đường tái sinh ta đưa đoạn T-DNA mang gen có ích vào tế bào thực vật, ta thu nhận tái sinh mang gen Trong trình xây dựng hệ thống tái sinh cần xác định chất điều