THIẾT LẬP QUI TRÌNH TÁI SINH CÂY IN VITRO VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN VÀO CÂY CÀ CHUA (LYCOPERSICON ESCULENTUM) THÔNG QUA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP QUI TRÌNH TÁI SINH CÂY IN VITRO VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN VÀO CÂY CÀ CHUA (LYCOPERSICON ESCULENTUM) THÔNG QUA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NGUYỄN XUÂN TUẤN Niên khóa : 2008 – 2012 Tháng 07/2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP QUI TRÌNH TÁI SINH CÂY IN VITRO VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN VÀO CÂY CÀ CHUA (LYCOPERSICON ESCULENTUM) THÔNG QUA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Hƣớng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS VÕ THỊ THÚY HUỆ NGUYỄN XUÂN TUẤN ThS TRẦN THỊ THU HÀ Tháng 07/2012 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đề tài này, tơi xin gởi lời cám ơn sâu sắc đến: Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại học Nông Lâm, Ban Lãnh Đạo Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Môi trƣờng tất cán Viện tạo điều kiện thuận lợi cho em trình học tập thực đề tài Cô Võ Thị Thúy Huệ cô Trần Thị Thu Hà trực tiếp hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức quý báu Thầy Bùi Minh Trí hỗ trợ vật chất tinh thần quý báu thời gian dài Con bày tỏ lòng biết ơn Cha Mẹ chăm sóc, động viên lòng kiên nhẫn Các bạn Thƣ, Hiền, Quyết, Tài, Trang, em Nhãn anh chị phòng Cơng nghệ Thực vật giúp đỡ tơi suốt thời gian làm đề tài tốt nghiệp Cuối mong muốn gửi lời cảm ơn đến tất thành viên lớp DH08SH, ngƣời chia sẻ niềm vui khó khăn học tập i TÓM TẮT Đề tài “Thiết lập quy trình tái sinh in vitro khảo sát khả chuyển nạp gen vào cà chua (Lycopersicon esculentum) thông qua Agrobacterium tumefaciens” đƣợc thực nhằm tạo sở cho việc chuyển gen sau Các thí nghiệm đƣợc tiến hành để xác định quy trình khử trùng mẫu hạt thích hợp, theo dõi khả tái sinh chồi khả thu nạp gen ngoại lai mẫu đốt thân hai giống cà chua (F1Fn576 Nicola F1NT538) đƣợc cung cấp công ty giống Trang Nơng Kết cho thấy quy trình khử trùng bề mặt ethanol (700) thời gian 90 giây Ngâm hạt dung dịch sodium hypochlorite 5,25% 90 giây (lặp lại lần) cho hiệu tốt đạt 100% không bị nhiễm nấm khuẩn, 74,12% số hạt nảy mầm Chồi tái sinh từ callus đốt thân đƣợc điều khiển kết hợp nồng độ kinetin giống Quy trình tốt để tái sinh chồi đƣợc ghi nhận giống cà chua F1Fn576 môi trƣờng MS bổ sung mg/l kinetin + mg/l IAA Với mẫu tỉ lệ mẫu tạo chồi đạt 78,87% chồi/mẫu, mẫu đốt thân tỉ lệ đạt 37,77% 0,24 chồi/mẫu (ghi nhận sau tuần nuôi cấy) Môi trƣờng hiệu cho việc nhân chồi đốt thân sau tuần quan sát MS + 1mg/l BA (2,2 chồi/cụm chồi, đạt chiều dài chồi 3,13 cm) Các chồi khỏe mạnh đƣợc đem tạo rễ môi trƣờng MS đạt 27 rễ/mẫu chiều dài rễ đạt 3,49 cm Nồng độ PPT 0,3 mg/l dùng cho chọn lọc mẫu đốt thân, 0,4 mg/l dùng chọn lọc mẫu cà chua chƣa chuyển gen Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens GV3580 mang plasmid pGII0229 (gồm gen bar kháng thuốc diệt cỏ, gen nptII kháng kanamycin, gen thị gusA, promoterpoly–A terminator CaMV 35S) đƣợc sử dụng để chuyển vào cà chua Bƣớc đầu ghi nhận kết biểu gen gusA đƣợc chuyển vào genome cây, hiệu chuyển gen đạt 100% 71% đốt thân ủ dịch khuẩn thời gian 15 phút, nồng độ acetosyringone 100 µM ii SUMMARY The thesis "Establishment of in vitro regenneration and assessment for result gene transfer into Lycopersicon esculentum via Agrobacterium tumerfacient" was carried out to provide the basis for transgenic research in the future In this study, the internode and leaf explants from seeding of two commercially grown such as F1Fn576 and Nicola F1NT5385 obtained from Trang Nong seed company were used For surface sterilization of L Esculentum seeds, ethanol 70% and NaOCl 5% were used Seeds were surface-sterilized in ethanol 70% for 90 seconds and rinsed three times with autoclaved distilled water After that, seeds were treated in NaOCl 5% for 90 seconds (repeated three times) and rinsed three times with autoclaved distilled water With this sterilization protocol, the highest rate of aseptic cultures (100%) and sprouts (74%) were achived Shoot regenration from internode and leaf-derived callus was genrally influenced by a combination of kinetin and variety After four weeks, the highest number of shoots from internode and leaf explants were obtained on MS medium supplemented with mg/l IAA in combination with mg/l kinetin using F1Fn576 variety (78.87% of regenra callus, shoots/explant forinternode explants and 37.77% of regenracallus, 0.24 shoots/explant for leaf explants) Effective adventitious shoot multilication rate of internode explants was achieved on MS medium supplemented with mg/l BA (2.2 shoots/explant) Regenrated shoots were cut off and placed onto root induction media for rooting About 27 shoots with 3.49 cm in aproximate length were successfully produced on MS medium We used mg/l of PPT for selection of transformative internode and 1.5 mg/l of PPT for selection of transformative leaf Agrobacterium tumefaciens strain GV3580, harboring a binary vector pGII0229 (containing Trgus cp148 luc carrying β-glucuronidase (gusA) gene, neomycin phosphotransferase (nptII) gene and bialaphos resistance (bar) gene with nos poly–A promoter and CaMV 35S terminator) was used to assess transformation iii efficiency in L esculentum The result of expression of gusA gene was observed, the internode and leaf explants produced the highest frequency of transformation (100% in leaf explants and 71% in internode explants) when co-incubated in Agrobacterium suspension for 15 minutes with 100 µM of acetosyringone iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT .i SUMMARY ii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH HÌNH VÀ SƠ ĐỒ viii DANH SÁCH BẢNG viii Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan cà chua 2.1.1 Phân loại 2.1.2 Nguồn gốc cà chua 2.1.3 Đặc tính thực vật 2.1.4 Điều kiện sinh trƣởng 2.1.5 Giá trị dinh dƣỡng cà chua 2.1.6 Tình hình sản xuất cà chua giới nƣớc 2.2 Sự tái sinh in vitro 2.2.1 Cơ chế tái sinh thực vật 2.2.2 Ý nghĩa tái sinh quy trình chuyển nạp gen 2.2.3 Môi trƣờng nuôi cấy in vitro 2.3 Chuyển gen vi khuẩn Argobacterium tummefaciens 11 2.3.1 Vi khuẩn Argobacterium tummefaciens 11 2.3.2 Thành phần gen chuyển nạp 12 2.3.3 Các gen kháng thuốc diệt cỏ phổ biến 13 2.4 Hiện trạng xu hƣớng phát triển GMC giới Việt Nam 14 2.4.1 Tình hình nghiên cứu phát triển GMC giới 14 2.4.2 Tình hình nghiên cứu GMC Việt Nam 16 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 18 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 18 3.2 Vật liệu 18 3.2.1 Giống 18 3.2.2 Hoá chất 18 3.3 Phƣơng pháp 19 3.3.1 Khảo sát quy trình khử trùng hạt 20 3.3.2 Phƣơng pháp tái sinh in vitro 21 3.3.3 Khảo sát ảnh hƣởng PPT đến tái sinh cà chua in vitro 22 v 3.3.4 Quy trình chuyển gen vào cà chua vi khuẩn Agrobacterium GV3589 23 3.3.5 Kiểm tra mẫu chuyển gen dung dịch X-Gluc 25 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Khảo sát quy trình khử trùng hạt 27 4.2 Nhóm thí nghiệm tái sinh 27 4.2.1 Khảo sát ảnh hƣởng kinetin lên trình tái sinh chồi cà chua (Lycopersicon esculentum) từ mẫu đốt thân 27 4.2.2 Khảo sát ảnh hƣởng BA lên hệ số nhân chồi cà chua 31 4.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng NAA tới khả tạo rễ cà chua (Lycopersicon esculentum) 32 4.3 Nhóm thí nghiệm tiền chuyển gen 34 4.3.1 Ảnh hƣởng PPT đến tỷ lệ sống sót khả tái sinh mô cà chua (mô đốt thân) chƣa chuyển gen 34 4.3.2 Kiểm tra diện gen bar plasmid pGII0229 phản ứng PCR 36 4.4 Xác định thời gian ủ với vi khuẩn nồng độ acetosyringone cho hiệu chuyển gen cao 37 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38 5.1 Kết luận: 40 5.2 Đề nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens AS Acetosyringone BA 6-benzyl adenin Bp base pair bxn bromoxynil nitrilase CĐHST Chất điểu hòa sinh trƣởng ctv Cộng tác viên DNA Deoxiribonucleic Axit g (mg) gram (miligram) PPT DL–homoalanin–4-yl (methyl) phosphinic axit GMC Gentically Modified Crops gusA β–glucuronidase IAA indole-3-acetic axit l (ml) lit (mililit) L esculentum Lycopersicon esculentum mM miliMol NAA α-naphthaleneacetic axit nptII neomycin phospho transferase NT Nghiệm thức OD Mật độ quang (Optical density) PCR Polymerase Chain Reaction Ti-plasmid Tumor-inducing plasmid vir Virulence X-gluc 5–bromo–4–chloro–3–indolyl glucuronide µl microlit µm Micromol vii DANH SÁCH HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Trang Hình 2.1 Cây cà chua Hình 2.2 Diện tích trồng cơng nghệ sinh học tồn cầu 16 Hình 2.3 Các nƣớc có diện tích trồng GMC lớn giới năm 2008 17 Hình 3.1 Plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc 20 Hình 4.1 Ảnh hƣởng giống nồng độ kinetin lên tái sinh in vitro từ đốt thân 33 Hình 4.2 Ảnh hƣởng giống nồng độ kinetin lên tái sinh in vitro từ 35 Hình 4.3 Ảnh hƣởng nồng độ BA đến tốc độ nhân chồi 36 Hình 4.4 Ảnh hƣởng NAA tới khả tạo rễ cà chua 37 Hình 4.5 Ảnh hƣởng nồng độ PPT đến tỷ lệ sống khả tái sinh đốt thân cà chua 39 Hình 4.6 Ảnh hƣởng nồng độ PPT đến tỷ lệ sống khả tái sinh cà chua 40 Hình 4.7 Kết điện di plasmid tổng số sản phẩm phản ứng PCR 41 Hình 4.8 Kết số hình nhuộm GUS tiêu biểu 43 Sơ đồ 3.1 Quy trình ly trích plasmid kit QIAprep Spin Miniprep 25 Sơ đồ 3.2 Quy trình kiểm tra gen thị gusA dung dịch X-Gluc 28 viii Glycine Pyridoxin-HCl Môi trƣờng LB (Luria-Bertani) 0,5 Hàm lƣợng(g/l) Tryptone 10 Yeast extract NaCl 10 Agar 18 Số liệu kết xử lý thống kê Bảng Số liệu dùng cho xử lý thống kê nghiệm thức khử trùng Lần lặp lại Nghiệm thức Trung bình Quy trình 0 0 quy trình 70,83 60 73,73 68,1866667 quy trình 75 70 77 74,0883333 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm khử trùng số liệu bảng A N A L Y S I S Degrees of Freedom O F V A R I A N C E Sum of T A B L E Mean Squares Square F-value Prob -Between 10162.370 5081.185 Within 125.436 20.906 243.049 0.0000 -Total 10287.806 Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khử trùng kết bảng Error Mean Square = 20.91 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 13.84 at alpha = 0.010 Original Order Mean = 0.0000 Mean = 74.12 Mean = 68.05 Ranked Order B Mean = 74.12 A A Mean = 68.05 A A Mean = 0.0000 B Bảng Số liệu dùng cho xử lý thống kê nghiệm thức tỉ lệ sống mẫu đốt thân Nghiệm Giống cà Lần lặp lại thức chua 1 0 0 100 100 100 100 100 100 100 100 20 60 66,67 48,8 0 0 2 100 93 93 95,5 100 93 73 88,8 53 40 73 55,5 Trung bình Giống 1: F1Fn576; Giống 2: nicola F1NT538 Nghiệm thức 1, 2, 3, môi trường MS bổ sung 1mg/l NAA 0, 0,5, 1, 1,5 mg/l kinetin Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm tỉ lệ sống mẫu đốt thân số liệu bảng A N A L Y S I S K Value O F V A R I A N C E Degrees of Sum of Source Freedom Squares Mean Square T A B L E F Value Prob -2 Factor A 32592.794 10864.265 2.6556 Factor B 105.752 105.752 0.7072 AB 269.440 89.813 0.6006 Error 16 2392.496 149.531 -7 00000 -Total 23 35360.482 Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm tỉ lệ sống mẫu đốt thân kết bảng Error Mean Square = 149.6 Error Degrees of Freedom = 16 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 29.17 s_ = 7.062 at alpha = 0.010 x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = = = 0.0000 100.0 100.0 48.80 0.0000 95.50 88.80 55.50 Ranked Order C A A B C A A B Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = = = 100.0 100.0 95.50 88.80 55.50 48.80 0.0000 0.0000 A A A A B B C C Bảng Số liệu dùng cho xử lý thống kê nghiệm thức tỉ lệ sống mẫu Nghiệm thức 4 Giống cà chua 1 1 2 2 100 100 20 80 20 20 Lần lặp lại 100 100 6,6 93 6,6 33 90 93 0 66 6,6 6,6 Trung bình 96,6 97,7 8,8 80 11,1 20 Giống 1: F1Fn576; Giống 2: nicola F1NT538 Nghiệm thức 1, 2, 3, môi trường MS bổ sung 1mg/l NAA 0, 0,5, 1, 1,5 mg/l kinetin Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm tỉ lệ sống mẫu số liệu bảng A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob -2 Factor A 29367.642 9789.214 118.8652 0.0000 Factor B 3053.045 3053.045 37.0715 0.0000 AB 8722.450 2907.483 35.3040 0.0000 -7 Error 16 1317.689 82.356 -Total 23 42460.826 Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm tỉ lệ sống mẫu kết bảng RANGE Error Mean Square = 82.36 Error Degrees of Freedom = 16 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 21.64 s_ = 5.239 at alpha = 0.010 x Original Order Ranked Order Mean = 96.67 A Mean = 97.78 A Mean = 82.00 A Mean = 96.67 A Mean = 97.78 A Mean = 82.00 A Mean = 11.11 B Mean = 20.00 B Mean = 8.887 B Mean = 11.11 B Mean = 20.00 B Mean = 8.887 B Mean = 0.0000 B Mean = 0.0000 B Mean = 0.0000 B Mean = 0.0000 B Bảng 10 Số liệu dùng cho xử lý thống kê nghiệm thức tỉ lệ hình thành chồi mẫu đốt thân Nghiệm thức 4 Giống cà chua 1 1 2 2 0 46,6 6,6 20 46,6 6,6 Lần lặp lại 0 26,6 6,6 33 26,6 6,6 0 46,6 6,6 20 46,6 6,6 Trung bình 0 37,7 6,6 24,4 37,7 6,6 Giống 1: F1Fn576; Giống 2: nicola F1NT538 Nghiệm thức 1, 2, 3, môi trường MS bổ sung 1mg/l NAA 0, 0,5, 1, 1,5 mg/l kinetin Bảng 11 Bảng ANOVA thí nghiệm tỉ lệ sống mẫu đốt số liệu bảng 10 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob -2 Factor A 4909.130 1636.377 49.1158 0.0000 Factor B 224.115 224.115 6.7268 0.0196 AB 672.100 224.033 6.7244 0.0038 -7 Error 16 533.067 33.317 -Total 23 6338.411 Bảng 12 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm tỉ lệ sống mẫu đốt thân kết bảng 11 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 13.77 s_ = 3.333 at alpha = 0.010 x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = = = 0.0000 24.44 37.78 37.78 6.670 6.670 0.0000 0.0000 Ranked Order B A A A B B B B Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = = = 37.78 37.78 24.44 6.670 6.670 0.0000 0.0000 0.0000 A A A B B B B B Bảng 13 Số liệu dùng cho xử lý thống kê nghiệm thức tỉ lệ hình thành chồi mẫu Nghiệm thức 4 Giống cà chua 1 1 2 2 40 86,6 20 33 6,6 Lần lặp lại 33 80 6,6 33 6,6 33 70 0 26 6,6 Trung bình 35,5 78,8 8,8 31,1 6,6 Giống 1: F1Fn576; Giống 2: nicola F1NT538 Nghiệm thức 1, 2, 3, môi trường MS bổ sung 1mg/l NAA 0, 0,5, 1, 1,5 mg/l kinetin Bảng 14 Bảng ANOVA thí nghiệm tỉ lệ sống mẫu số liệu bảng 13 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob -2 Factor A 8032.659 2677.553 105.5585 0.0000 Factor B 2739.848 2739.848 108.0144 0.0000 AB 5225.833 1741.944 68.6736 0.0000 -7 Error 16 405.849 25.366 -Total 23 16404.189 Bảng 15 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm tỉ lệ sống mẫu kết bảng 14 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 12.01 s_ = 2.908 at alpha = 0.010 x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = = = 35.55 31.14 78.87 6.670 8.867 0.0000 0.0000 0.0000 Ranked Order B B A C C C C C Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = = = 78.87 35.55 31.14 8.867 6.670 0.0000 0.0000 0.0000 A B B C C C C C Bảng 16 Số liệu dùng cho xử lý thống kê nghiệm thức số chối hình thành mẫu đốt thân Nghiệm thức 4 Giống cà chua 1 1 2 2 0 0,26 0 0,26 0,26 Lần lặp lại 0 0,2 0 0,06 0,3 0,06 0 0,26 0,13 0,06 0,13 0,13 Trung bình 0 0,24 0,04 0,13 0,24 0,06 Giống 1: F1Fn576; Giống 2: nicola F1NT538 Nghiệm thức 1, 2, 3, môi trường MS bổ sung 1mg/l NAA 0, 0,5, 1, 1,5 mg/l kinetin Bảng 17 Bảng ANOVA thí nghiệm tỉ lệ sống mẫu đốt thân số liệu bảng 16 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob -2 Factor A 0.196 0.065 15.0560 0.0001 Factor B 0.008 0.008 1.8598 0.1915 AB 0.017 0.006 1.2757 0.3164 -7 Error 16 0.069 0.004 -Total 23 0.290 Bảng 18 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm số chồi hình thành mẫu đốt thân kết bảng 17 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.1508 s_ = 0.03651 at alpha = 0.010 x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = = = 0.0000 0.1267 0.2400 0.2400 0.04333 0.06333 0.0000 0.0000 Ranked Order B AB A A B B B B Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = = = 0.2400 0.2400 0.1267 0.06333 0.04333 0.0000 0.0000 0.0000 A A AB B B B B B Bảng 19 Số liệu dùng cho xử lý thống kê nghiệm số chồi hình thành mẫu Nghiệm thức 4 Giống cà chua 1 1 2 2 0,6 4,2 0 0,2 0,2 Lần lặp lại 0,7 3,8 0 0,26 0 0,6 3,7 0 0,2 0 Trung bình 0,64 3,94 8,8 0,24 0,067 Giống 1: F1Fn576; Giống 2: nicola F1NT538 Nghiệm thức 1, 2, 3, môi trường MS bổ sung 1mg/l NAA 0, 0,5, 1, 1,5 mg/l kinetin Bảng 20 Bảng ANOVA thí nghiệm tỉ lệ sống mẫu số liệu bảng 19 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob -2 Factor A 15.161 5.054 391.1229 0.0000 Factor B 8.485 8.485 656.6681 0.0000 AB 15.386 5.129 396.9275 0.0000 -7 Error 16 0.207 0.013 -Total 23 39.238 Bảng 21 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm số chồi hình thành mẫu kết bảng 20 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.2719 s_ = 0.06583 at alpha = 0.010 x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = = = 0.6433 0.06667 0.2400 0.0000 3.940 0.0000 0.0000 0.0000 Ranked Order B C C C A C C C Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = = = 3.940 0.6433 0.2400 0.06667 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 A B C C C C C C Bảng 22 Số liệu dùng cho xử lý thống kê nghiệm thức nhân chồi Nghiệm thức Đối chứng 1BA 2BA 0,33 2,3 0,6 Lần lặp lại 0,67 0,4 0,67 2,3 0,4 Trung bình 0,55 2,2 0,51 Bảng 23 Bảng ANOVA thí nghiệm nhân chồi số liệu bảng 22 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 5.670 2.835 91.973 0.0000 Within 0.185 0.031 -Total 5.855 Bảng 24 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm nhân chồi kết bảng 23 Error Mean Square = 0.03100 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 0.5330 s_ = 0.1017 at alpha = 0.010 x Original Order Mean Mean Mean = = = 0.5167 2.220 0.5567 Ranked Order B A B Mean Mean Mean = = = 2.220 0.5567 0.5167 A B B Bảng 25 Số liệu dùng cho xử lý thống kê nghiệm thức chiều cao chồi Nghiệm thức Đối chứng 1BA 2BA 0,35 3,2 4,3 Lần lặp lại 0,75 1,5 1,2 0,5 4,5 3,6 Trung bình 0,54 3,2 3,08 Bảng 26 Bảng ANOVA thí nghiệm chiều cao chồi số liệu bảng 25 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 12.421 6.210 20.548 0.0021 Within 1.813 0.302 -Total 14.234 Bảng 27 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm nhân chồi kết bảng 26 Error Mean Square = 0.3020 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 1.664 at alpha = 0.010 Original Order Mean Mean Mean = = = 3.083 3.133 0.6167 Ranked Order A A B Mean Mean Mean = = = 3.133 3.083 0.6167 A A B Bảng 28 Số liệu dùng cho xử lý thống kê nghiệm thức số ngày hình thành rễ Nghiệm thức Lần lặp lại 2,6 3,3 5,3 NAA 0,5 NAA NAA 3 Trung bình 5,7 Bảng 29 Bảng ANOVA thí nghiệm số ngày hình thành rễ số liệu bảng 28 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 563.709 281.854 3106.026 0.0000 Within 0.544 0.091 -Total 564.253 Bảng 30 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm số ngày hình thành rễ kết bảng 29 Error Mean Square = 0.09100 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 0.9132 at alpha = 0.010 Original Order Mean = 3.000 Ranked Order C Mean = 21.00 A Mean Mean = = 5.767 21.00 B A Mean Mean = = 5.767 3.000 B C Bảng 31 Số liệu dùng cho xử lý thống kê nghiệm thức số rễ Nghiệm thức Lần lặp lại 30 27,6 21,6 26,3 NAA 0,5 NAA NAA 30 28,3 Trung bình 27,2 27,4 Bảng 32 Bảng ANOVA thí nghiệm số rễ số liệu bảng 31 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 1485.140 742.570 90.853 0.0000 Within 49.040 8.173 -Total 1534.180 Bảng 33 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệmsố rễ kết bảng 32 Error Mean Square = 8.173 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 8.654 at alpha = 0.010 Original Order Mean Mean Mean = = = 27.20 27.30 0.0000 Ranked Order A A B Mean Mean Mean = = = 27.30 27.20 0.0000 A A B Bảng 34 Số liệu dùng cho xử lý thống kê nghiệm thức chiều dài rễ Nghiệm thức NAA 0,5 NAA NAA 3,1 0,66 Lần lặp lại 1,3 3,3 1,3 Trung bình 3,5 1,1 Bảng 35 Bảng ANOVA thí nghiệm chiều dài rễ số liệu bảng 34 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 19.155 9.577 83.907 0.0000 Within 0.685 0.114 -Total 19.840 Bảng 36 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm chiều dài rễ kết bảng 35 Error Mean Square = 8.173 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 8.654 at alpha = 0.010 Original Order Mean Mean Mean = = = 27.20 27.30 0.0000 Ranked Order A A B Mean Mean Mean = = = 27.30 27.20 0.0000 A A B Bảng 37 Số liệu dùng cho xử lý thống kê nghiệm thức ảnh hƣởng nồng độ glufosinate đến tỷ lệ tái sinh đốt thân Nghiệm thức PPT 0,1 PPT 0,2 PPT 0,3 PPT 100 100 20 Lần lặp lại 100 100 20 100 80 60 Trung bình 100 93,3 46,6 Bảng 38 Bảng ANOVA thí nghiệm ảnh hƣởng nồng độ glufosinate đến tỷ lệ tái sinh đốt thân số liệu bảng 37 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 28106.667 7026.667 52.700 0.0000 Within 10 1333.333 133.333 -Total 14 29440.000 Bảng 39 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm ảnh hƣởng nồng độ glufosinate đến tỷ lệ tái sinh đốt thân trên kết bảng 48 Error Mean Square = 133.3 Error Degrees of Freedom = 10 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 29.88 at alpha = 0.010 Original Order Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = 100.0 93.33 46.67 0.0000 0.0000 Ranked Order A A B C C Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = 100.0 93.33 46.67 0.0000 0.0000 A A B C C Bảng 40 Số liệu dùng cho xử lý thống kê nghiệm thức ảnh hƣởng nồng độ glufosinate đến tỷ lệ tái sinh mẫu Nghiệm thức PPT 0,1 PPT 0,2 PPT 0,3 PPT 0,4 PPT 100 100 40 20 Lần lặp lại 100 100 40 20 100 80 40 20 Trung bình 100 93,3 40 20 Bảng 41 Bảng ANOVA thí nghiệm ảnh hƣởng nồng độ glufosinate đến tỷ lệ tái sinh mẫu số liệu bảng 39 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob -Between 23626.667 5906.667 221.500 0.0000 Within 10 266.667 26.667 -Total 14 23893.333 Bảng 42 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm ảnh hƣởng nồng độ glufosinate đến tỷ lệ tái sinh mẫu trên kết bảng 41 Error Mean Square = 26.67 Error Degrees of Freedom = 10 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 13.36 at alpha = 0.010 Original Order Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = 100.0 93.33 40.00 20.00 0.0000 Ranked Order A A B C D Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = 100.0 93.33 40.00 20.00 0.0000 A A B C D