NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Bt (CryIAb) VÀO PHÔI TRƯỞNG THÀNH VÀ TIỀN PHÔI THÔNG NHỰA (Pinus merkusii) BẰNG Agrobacterium tumefaciens

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH *************** LÂM NGỌC VÂN THANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Bt (CryIAb) VÀO PHÔI TRƯỞNG THÀNH VÀ TIỀN PHÔI THÔNG NHỰA (Pinus merkusii) BẰNG Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 02/2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH *************** LÂM NGỌC VÂN THANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Bt (CryIAb) VÀO PHÔI TRƯỞNG THÀNH VÀ TIỀN PHÔI THÔNG NHỰA (Pinus merkusii) BẰNG Agrobacterium tumefaciens Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Mã số : 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hướng dẫn Khoa học: TS VƯƠNG ĐÌNH TUẤN TS LÊ ĐÌNH ĐƠN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 02/2012 NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Bt (CryIAb) VÀO PHÔI TRƯỞNG THÀNH VÀ TIỀN PHÔI THÔNG NHỰA (Pinus merkusii) BẰNG Agrobacterium tumefaciens LÂM NGỌC VÂN THANH Hội đồng chấm luận văn: Chủ tịch: PGS.TS TRẦN CÔNG LUẬN Trung tâm Sâm Dược liệu TP HCM Thư ký: TS TRẦN THỊ LỆ MINH                                  ĐH Nông Lâm TP HCM Phản biện 1: TS BÙI MINH TRÍ                                  ĐH Nông Lâm TP HCM  Phản biện 2: TS LÊ THỊ DIỆU TRANG                                  ĐH Nông Lâm TP HCM  Ủy viên: TS VƯƠNG ĐÌNH TUẤN                                  Phân viện Nghiên cứu Khoa học Lâm nghiệp Nam ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH HIỆU TRƯỞNG i LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tôi tên Lâm Ngọc Vân Thanh sinh ngày 13 tháng 07 năm 1983 Bến Tre Con Ông Lâm Tấn Phú Bà Nguyễn Thị Túy Vân Tốt nghiệp Tú tài Trường Trung học phổ thơng Bình Long, tỉnh Bình Phước, năm 2001 Tốt nghiệp Đại học ngành Cơng nghệ Sinh học hệ quy Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh năm 2006 Từ năm 2007 đến theo học Cao học ngành Công nghệ Sinh học Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Tình trạng gia đình: Độc thân Địa liên lạc: 19/30 Nguyễn Cửu Đàm, P Tân Sơn Nhì Q Tân Phú TP HCM Điện thoại: 0918448221 Email: jujin832003@yahoo.com ii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết luận văn trung thực Ký tên Lâm Ngọc Vân Thanh iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc đến: Q Thầy Cơ trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh tận tâm hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho suốt thời gian học tập Thầy Vương Đình Tuấn thầy Lê Đình Đơn tận tình hướng dẫn tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Q Nhà trường, Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Môi trường, Phân viện nghiên cứu khoa học Lâm nghiệp Nam bộ, Viện Sinh học Nhiệt đới Phòng Sau Đại học tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khóa học Anh Nguyễn Xuân Cường chị Phan Thị Mỵ Lan giúp đỡ tơi thời gian thực tập Gia đình, bạn động viên, chia sẻ góp ý cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu iv TÓM TẮT Đề tài: “Nghiên cứu chuyển gen Bt (CryIAb) vào phôi trưởng thành tiền phôi thông nhựa (Pinus merkusii) Agrobacterium tumefaciens” tiến hành Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Môi trường, đại học Nông Lâm TPHCM, Phân viện khoa học kỹ thuật lâm nghiệp Nam Viện Sinh học Nhiệt đới TP HCM, thời gian từ tháng 8/2009 đến 5/2011 Mục tiêu đề tài tạo vật liệu biến nạp mang gen Cry IAb đồng thời xác định vài thơng số phục vụ q trình chuyển gen chọn lọc vật liệu biến nạp gen Kết cho thấy nồng độ kanamycin thích hợp chọn lọc phơi trưởng thành thơng nhựa dịng 60 mg/l, tiền phôi soma thông nhựa 35 mg/l Nồng độ timentin để diệt khuẩn dư phôi trưởng thành dịng tiền phơi soma dịng 31 400 mg/l Đối với q trình biến nạp gen vào phơi trưởng thành có tương tác thời gian đồng nuôi cấy nồng độ vi khuẩn, OD600nm= 0,9 kết hợp với ngày đồng nuôi cấy cho kết thể GUS cao Tuy nhiên, phôi sau biến nạp không phát triển hay chết dần môi trường chọn lọc chứa kanamycin Trong biến nạp gen vào tiền phơi soma thơng nhựa dịng 31, có tương tác cặp yếu tố ba yếu tố: thời gian lây nhiễm, thời gian đồng nuôi cấy mật số vi khuẩn Thực nghiệm cho thấy tiền phôi soma dòng 31 biến nạp với thời gian lây nhiễm 90 phút, OD600nm= 0,6 đồng nuôi cấy tối ngày cho kết tốt Tiền phôi chuyển gen phát triển môi trường chọn lọc bổ sung kanamycin tuần, tỷ lệ thể GUS từ 75 – 100% số cụm tiền phôi Kết phản ứng PCR ghi nhận diện gen Cry1Ab (khoảng 520 bp) tế bào tiền phôi biến nạp gen v SUMMARY The study on “Transformation Bt (CryIAb) gene into zygotic embryos and embryogenic tissues of Pinus merkusii Jungh & De Vries by Agrobacterium tumefaciens” was carried out at the Research Institute for Biotechnology and Environment (Nong Lam University), Forestry Science Sub-Institute of South Vietnam, Institute of Tropical Biology Ho Chi Minh city Aim of the study is to obtain transgenic lines of Pinus merkussi carrying Cry IAb gene and to find out important factors necessary for transformation and selection processes The results showed that kanamycin at 60mg/l was an appropriate concentration for selection of the transformed zygotic embryos and 35 mg/l for embryogenic tissues Timentin, an another antibitotic, at 400 mg/l was suitable for elimination of exceeded A tumefaciens The data also revealed that there was an interaction between time of cocultivation and concentration of the bacteria i.e concentration of OD600nm= 0,9 in combination with a day co-cultivation resulted in the highest GUS expression However, transformed embryos did not develop or died slowly on the selective medium afterwards Experiments on transforming CryIAb gene into embryogenic tissues of the line No 31, on the other hands, had also shown that there was an interaction between each pair of factors and three factors: time of infection, co-cultivation time and concentration of bacteria The results showed that infection of 90 minutes with concentration of OD600nm= 0,6 then cocultivation for day in the dark produced the best GUS expression Samples from the transformed materials cultured eight weeks on the selection medium showed GUS expression from 75 to 100% PCR reaction with primers corresponding to Cry1Ab gene has confirmed presence of CryIAb in the transformed materials with 520bp vi MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Trang Chuẩn Y i Lý Lịch Cá Nhân ii Lời Cam đoan iii Lời Cảm ơn iv Tóm tắt v Summary vi Mục lục vii Danh sách từ viết tắt xi Danh sách hình xiii Danh sách bảng xiv MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Yêu cầu 1.2.3 Giới hạn đề tài 2 TỔNG QUAN 2.1 Thông nhựa 2.1.1 Phân loại 2.1.2 Đặc điểm 2.1.3 Tình hình phân bố giá trị sử dụng thông nhựa vii 2.1.4 Tiền phôi soma 2.1.5 Tình hình nghiên cứu giống thơng kháng sâu bệnh 2.2 Giới thiệu gen Cry 2.2.1 Bacillus thuringensis 2.2.2 Gen cry 10 2.2.3 Tạo dịng vơ tính gen Cry 11 2.3 Kỹ thuật biến nạp gen 12 2.3.1 Phương pháp trực tiếp 12 2.3.2 Phương pháp gián tiếp 13 2.3.2.1 Đặc điểm Agrobacterium tumefaciens 14 2.3.2.2 Cơ sở phân tử phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium tumefaciens 14 2.3.3 Ứng dụng công nghệ sinh học cải thiện giống rừng 16 2.3.3.1 Thành tựu biến nạp gen lâm nghiệp 16 2.3.3.2 Thành tựu biến nạp gen thông 17 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Nội dụng 20 3.2 Thời gian địa điểm 20 3.2.1 Thời gian 20 3.2.2 Địa điểm 20 3.3 Vật liệu, dụng cụ hoá chất 20 3.3.1 Vật liệu 20 3.3.2 Dụng cụ thiết bị 21 3.3.2.1 Dụng cụ thiết bị dùng cho trình chuyển gen 21 viii ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH *************** LÂM NGỌC VÂN THANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Bt (CryIAb) VÀO PHÔI TRƯỞNG THÀNH VÀ TIỀN PHÔI THÔNG NHỰA (Pinus merkusii) BẰNG Agrobacterium. .. Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 02/2012 NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Bt (CryIAb) VÀO PHÔI TRƯỞNG THÀNH VÀ TIỀN PHÔI THÔNG NHỰA (Pinus merkusii) BẰNG Agrobacterium tumefaciens LÂM NGỌC VÂN THANH Hội đồng chấm... iv TĨM TẮT Đề tài: ? ?Nghiên cứu chuyển gen Bt (CryIAb) vào phôi trưởng thành tiền phôi thông nhựa (Pinus merkusii) Agrobacterium tumefaciens? ?? tiến hành Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Môi trường,