KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ LÂY NHIỄM Agrobacterium tumefaciens VÀO PHÔI HỮU TÍNH THÔNG NHỰA (Pinus merkusii) VÀ SỰ THỂ HIỆN GEN uidA

  BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ LÂY NHIỄM Agrobacterium tumefaciens VÀO PHƠI HỮU TÍNH THƠNG NHỰA (Pinus merkusii) VÀ SỰ THỂ HIỆN GEN uidA Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NGUYỄN CAO LÊ HIỀN Niên khóa : 2006 - 2010 Tháng 07/2010     BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC   KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ LÂY NHIỄM Agrobacterium tumefaciens VÀO PHƠI HỮU TÍNH THƠNG NHỰA (Pinus merkusii) VÀ SỰ THỂ HIỆN GEN uidA Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS VƯƠNG ĐÌNH TUẤN NGUYỄN CAO LÊ HIỀN Tháng 07/ 2010     LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: − Ban Giám Hiệu trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh − Q Thầy Cô Bộ môn Công nghệ sinh học, Quý Thầy Cô trực tiếp giảng dạy hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập trường − TS Vương Đình Tuấn ln tận tình hướng dẫn nghiên cứu khoa học Những lời thầy nói, thầy dạy học quí giá cho chặng đường phía trước − TS Lê Đình Đơn, Trưởng khoa Cơng nghệ sinh học, trau dồi cho học q giá, ln tận tình quan tâm, giúp đỡ, thuyết phục dẫn dắt đến với đề tài vô lý thú − Chị Lâm Ngọc Vân Thanh, người đồng hành em suốt sáu tháng làm đề tài Với kiến thức, kĩ chị truyền đạt lời động viên, chia sẻ vui buồn em, chị tạo cho em thêm nhiều nghị lực niềm vui để vượt qua giai đoạn khó khăn giúp em hồn thành tốt đề tài Trong thời gian thực đề tài chị dạy em nhiều học quí giá sống − Anh Nguyễn Xuân Cường - Phân viện Nghiên cứu Khoa học Lâm nghiệp Nam ln tận tình giúp đỡ em gặp khó khăn suốt q trình thực đề tài − Các bạn lớp CNSH khóa 06 động viên nhiều thời gian làm đề tài − Người bạn thân thiết - Lý Sơn Tùng nhiệt tình nổ lực không mệt mỏi bạn, bạn bên cạnh ủng hộ, động viên giúp lấy lại niềm tin thăng lúc tơi gặp khó khăn − Cảm ơn hai chị em trai tơi người tin tưởng vào − Cuối cùng, xin gửi tới ba má, Nguyễn Thông Lê Thị Sen lòng biết ơn… tất ba má giành cho Tp Hồ Chí Minh ngày 14 tháng 07 năm 2010 Nguyễn Cao Lê Hiền i     TĨM TẮT Pinus merkusii lồi thông cung cấp sản lượng nhựa cao giới, nhựa thơng có giá trị kinh tế nhiều ngành công nghiệp khác Tuy nhiên, năm gần hàng ngàn hecta thông nhựa số vùng nước ta Hoàng Mai (Nghệ An), Sơn Viện (Thanh Hóa), Yên Lập (Quảng Ninh)… bị tàn phá nghiêm trọng dịch sâu róm gây hại Vì vậy, việc tạo giống thơng nhựa kháng sâu róm cần thiết sản xuất Phương pháp lai tạo truyền thống tốn nhiều thời gian công sức Những tiến ứng dụng khoa học công nghệ gen thập kỉ qua cho thấy tiềm ứng dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để chuyển gen kháng sâu (Bt) tạo kháng sâu số loại nơng lâm nghiệp Vì thế, định hướng tạo giống thơng kháng sâu róm Agrobacterium tumefaciens thực bước khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến lây nhiễm Agrobacterium tumefaciens vào phơi hữu tính thơng nhựa (pinus merkusii) thể gen uidA Kết thực việc chuyển gen thị uidA vào phơi chín thơng nhựa dòng nồng độ OD600nm = 0,5; 0,7; 0,9 với thời gian lây nhiễm 60 phút 90 phút Gen thị uidA nồng độ OD600nm = 0,9, thời gian lây nhiễm 90 phút, có gây vết thương giới cho biểu cao yếu tố khảo sát Nồng độ timentin 600 mg.l-1 cho hiệu cao việc loại vi khuẩn dư sau lây nhiễm Các phôi biến nạp ni cấy mơi trường có chứa 40 mg.l-1 kanamycin phục vụ cho chọn lọc chuyển thành gen bền vững Việc theo dõi phôi biến nạp môi trường chọn lọc tiếp tục theo dõi ii     SUMMARY The title of graduation thesis is “Investigation of some factors affecting transformation of Bt gen in zygotic embryos of Pinus merkusii mediated by Agrobacterium tumefaciens” This thesis was supervised by Dr VUONG DINH TUAN The work was carried out from January to June 2010 at Nong Lam university Pinus merkusii (Jungh et de Vriese) is one of the few truly tropical pine species of the world with great ecological and economic importances Especially, this species give high content of resin with a high economic value in many different industries Our country has the potential to grow, exploitation and processing of resin However, recently years, thousand hectare P.merkusii were severely demaged by an epidemic of Dendrolimus Punctatus insect in several provines such as Nghe An, Thanh Hoa, Quang Ninh… It is therefore, development of Pinus variety resistant to Dendrolimus insect is a very critical requirement for improving this highly economic value species Traditional breeding programe can help to develop such a variety However, the method is required time and labour Recent successful results in application of gene transformation technique in several agriculture and forestry species imply that this technique can be applied to improve resistance of Pinus merkusii using Agrobacterium tumefaciens This study aims at finding out some factors affecting transformation of Bt gene in zygotic embryos of Pinus merkusii mediated by Agrobacterium tumefaciens Our result showed that kanamycin at 40 mg.l-1 can be used as a lethal threshold level for selection of stable transformation Concentration of Agrobacterium tumefaciens at OD600nm = 0,9 gave the highest ratio of GUS expression on the transformed embryos Timentin at 600mg.l-1 could be used to eliminate excess Agrobacterium tumefaciens after transformation Transformants are under selection process on kanamycin containing medium iii     MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt .ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt .vii Danh sách bảng viii Danh sách hình viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung thông nhựa 2.1.1 Phân loại 2.1.2 Phân bố 2.1.3 Đặc điểm sinh thái 2.1.4 Giá trị kinh tế giá trị sử dụng thông nhựa 2.1.5 Tình hình sản xuất tiêu thụ nước giới 2.1.5.1 Trên giới 2.1.5.2 Ở Việt Nam 2.1.6 Tình hình nghiên cứu chuyển gen Pinus nước giới 2.1.6.1 Trên giới 2.1.6.2 Ở Việt Nam 2.2 Giới thiệu chung chuyển gen thực vật 2.2.1 Định nghĩa chuyển gen 2.2.2 Thực vật chuyển gene iv     2.2.3 Tóm tắt lịch sử phát triển công nghệ chuyển gen thực vật 2.2.4 Các phương pháp chuyển gen vào thực vật 10 2.3 Chuyển gen vi khuẩn A tumefaciens 11 2.3.1 Giới thiệu đặc điểm nuôi cấy vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 11 2.3.2 Những nghiên cứu chuyển gen thông qua A.tumefaciens 11 2.3.3 Các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chuyển gen A tumefaciens 15 2.3.4 Chuyển gen có hình nón thơng qua vi khuẩn A.tumefaciens 16 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Thời gian địa điểm thí nghiệm 17 3.2 Vật liệu 17 3.2.1 Đối tượng thí nghiệm 17 3.2.2 Hóa chất sử dụng 17 3.2.3 Vi khuẩn A.tumefaciens 17 3.2.4 Môi trường nuôi cấy 17 3.3 Phương pháp nghiên cứu 18 3.3.1 Bố trí thí nghiệm 18 3.3.2 Cách thu phôi hữu tính 18 3.4 Khảo sát ngưỡng gây chết kanamycin phơi hữu tính dòng 18 3.5 Xác định nồng độ timentin thích hợp để loại vi khuẩn dư sau lây nhiễm 19 3.6 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến xâm nhiễm A.tumefaciens vào phôi 19 3.6.1 Khảo sát ảnh hưởng phương pháp gây vết thương giới 20 3.6.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ vi khuẩn thời gian lây nhiễm 20 3.7 Nghiên cứu chọn lọc vật liệu biến nạp gen sau chuyển gen môi trường chọn lọc 21 3.8 Phương pháp xử lí số liệu 21 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Kết 22 4.1.1 Kết ngưỡng gây chết kanamycin phơi hữu tính 22 4.1.2 Kết nồng độ timentin thích hợp để loại vi khuẩn dư sau lây nhiễm…… 23 4.1.3 Kết khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến xâm nhiễm 25 4.1.3.1 Kết khảo sát ảnh hưởng phương pháp gây vết thương giới 25 4.1.3.2 Kết ảnh hưởng thời gian lây nhiễm nồng độ vi khuẩn 26 4.1.4 Kết loại vi khuẩn dư sau lây nhiễm timentin 28 v     4.1.5 Kết nghiên cứu chọn lọc vật liệu biến nạp gen sau chuyển gen 29 4.2 Thảo luận 30 4.2.1 Ngưỡng gây chết kanamycin 30 4.2.2 Nồng độ timentin để diệt khuẩn dư sau lây nhiễm 31 4.2.3 Ảnh hưởng vết thương giới lên biến nạp 31 4.2.4 Ảnh hưởng nồng độ vi khuẩn thời gian lây nhiễm đến biến nạp……… 32 4.2.5 Tỉ lệ phôi sống khuẩn sau lây nhiễm thể 33 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34 5.1 Kết luận 34 5.2 Đề nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 PHỤ LỤC vi     DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BA: 6-Benzyl Adenin Ctv: Cộng tác viên DNA: Deoxyribonucleic acid GUS: enzyme β-glucuronidase LB: Luria Bertani broth, 1951 µg: Microgam µl: Microlitre µM: Micromol/litre OD: Optical density TE: Tang et al, 1998 T-DNA: Transferring DNA UidA: β-glucuronidase gene vii     DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Tóm tắt lịch sử chuyển gen thực vật Bảng 2.2 Các tính trạng chuyển gen quan tâm 10 Bảng 2.3 Các biến nạp di truyền 11 Bảng 2.4 Các biến nạp gián tiếp qua A.tumefaciens 12 Bảng 3.1 Bảng bố trí nghiệm thức thí nghiệm 21 Bảng 4.1 Tỉ lệ sống phôi môi trường TE bổ sung kanamycin 22 Bảng 4.2 Tỉ lệ phôi sống môi trường TE rắn bổ sung timentin 23 Bảng 4.3 Kết ảnh hưởng vết thương giới đến trình lây nhiễm 25 Bảng 4.4 Kết ảnh hưởng vết thương giới đến tỉ lệ phôi thể GUS 25 Bảng 4.5 Kết ảnh hưởng nồng độ vi khuẩn thời gian lây nhiễm 26 Bảng 4.6 Tỉ lệ phôi sống, khuẩn sau lây nhiễm 28 Bảng 4.7 Tỉ lệ phôi sống môi trường 40 mg.l-1 kanamycin sau bốn tuần 29 DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 4.1 Màu sắc hình thái phơi mơi trường TE có bổ sung kanamycin 23 Hình 4.2 Tỉ lệ phôi sống môi trường TE bán rắn bổ sung timentin 24 Hình 4.3 Biểu GUS phơi hạt chín thơng nhựa dòng 26 Hình 4.4 Biểu GUS nồng độ OD600nm = 0.7; 60 phút 28 Hình 4.5 Phơi mơi trường TE rắn bổ sung 400 mg.l-1 timentin 29 Hình 4.6 Phôi môi trường TE rắn bổ sung 40 mg.l-1 kanamycin 30 viii     Tiếp tục cấy chuyền phôi sống hai nồng độ môi trường bổ sung kanamycin, tiếp tục quan sát tuần thứ bảy thấy phôi nồng độ OD600nm = 0,5; 60 phút sống tăng trưởng a b c Hình 4.6 Phôi môi trường TE rắn bổ sung 40 mg.l-1 kanmycin (a) OD600nm = 0,7; 60 phút, bốn tuần; (b) OD600nm = 0,5; 60 phút, bốn tuần (c) OD600nm = 0,5; 60 phút, bảy tuần 4.2 Thảo luận 4.2.1 Ngưỡng gây chết kanamycin phơi hữu tính thơng nhựa dòng Dựa vào kết bảng 4.1 phụ lục ta nhận thấy rằng: Sự khác biệt nồng độ thí nghiệm có ý nghĩa Sau ba tuần nuôi cấy, bắt đầu quan sát thấy tín hiệu chọn lọc mơi trường có bổ sung kanamycin Kết phù hợp với báo cáo khả kháng kanamycin có hình nón Klimaszewska et al 2001; Tereso et al 2006 Ở nồng độ 30 mg.l-1, Tang Wei ctv (1997) báo cáo lồi Pinus taeda L dòng số 9- 30     1003 có tỉ lệ phơi chín đề kháng với kanamycin cao 20,8% Dòng thơng nhựa số cho thấy đề kháng tốt với tỉ lệ sống 73,3% Tuần thứ tư sau nuôi cấy, nồng độ 40mg.l-1 cho tỉ lệ phôi sống thấp (31,67%) Tuy nhiên mốc thời gian chưa xác định ngưỡng gây chết cho phôi hữu tính thơng nhựa dòng Trên đối tượng Pinus taeda L., Tang Wei ctv (1997) xác định sau bốn tuần ni cấy ngưỡng gây chết lồi 15 mg.l-1 Sau sáu tuần nuôi cấy xác định nồng độ cho chọn lọc phù hợp với mục đích thí nghiệm dòng thơng nhựa số 40mg.l-1 Ở nồng độ kanamycin 30mg.l-1, tỉ lệ phơi sống cao (31,67%), cao hai dòng 31 54 nồng độ thời gian (dòng 31 (12%) dòng 54 (16%)) (Võ Thành Tín, 2008) Khả kháng kháng sinh thơng nhựa dòng số có lẽ cao lồi Pinus kesiya Theo thí nghiệm Klimaszewska et al 2001; Tereso et al 2006 nồng độ kanamycin tốt cho chọn lọc mơ chuyển gen lồi Pinus kesiya 35mg.l-1 Qua ta thấy khả kháng kháng sinh lồi dòng thơng khác Dòng thơng nhựa số cho thấy tỉ lệ kháng kanamycin cao so với nhiều dòng thơng khác Điều mang đến tiềm sử dụng dòng thông nhựa số để chọn lọc tái sinh chuyển gen để đáp ứng cho nhu cầu thực tiễn nước ta tốt 4.2.2 Nồng độ timentin để diệt khuẩn dư sau lây nhiễm Quan sát tỉ lệ sống phôi sau bốn tuần nồng độ timentin thí nghiệm 4.1.2 kết luận nồng độ timentin 600 mg.l-1 ngưỡng cao không ảnh hưởng đến tỉ lệ sống phôi, điều giúp khảo sát nồng độ cao khơng gây độc cho phơi Vì vậy, ta chọn nồng độ timentin 600 mg.l-1 để tiến hành diệt khuẩn dư sau lây nhiễm thí nghiệm 4.1.4 4.2.3 Ảnh hưởng vết thương giới lên biến nạp A.tumefaciens vào phơi hữu tính Dựa vào bảng 4.4 ta thấy tỉ lệ phơi biểu GUS dòng điều kiện lây nhiễm thời gian 90 phút, đồng ni cấy 72h có gây vết thương tương đối thấp (2,5%) Tang Wei ctv (1997) tiến hành chuyển gen vào phơi hạt chín lồi Pinus taeda L cho kết biểu GUS 32h 9,8%, tỉ lệ cao 16,3% với thời gian đồng nuôi cấy 56h 31     4.2.4 Ảnh hưởng nồng độ vi khuẩn thời gian đồng nuôi cấy lên biến nạp A.tumefaciens vào phơi hữu tính Qua kết thấy không nên sử dụng nồng độ vi khuẩn lớn để tiến hành biến nạp gen mong muốn vào phơi sau thời gian đồng ni cấy hầu hết phôi bị nhũn nhuộm GUS hay tiếp tục chuyển sang môi trường TE rắn có bổ sung 600 mg.l-1 timentin để tiếp tục theo dõi Sự tác động cộng gộp hai nhân tố thời gian lây nhiễm nồng độ vi khuẩn tới biểu GUS khác với tác động nhân tố riêng rẽ Khi sử dụng vi khuẩn nồng độ OD600nm = 0,5 kết hợp với thời gian lây nhiễm 30 phút chưa thể GUS phôi sau ba ngày Kết khác biệt với kết OD600nm = 0,5 hai dòng 31 54 Võ Thành Tín (2008) Theo Võ Thành Tín nồng độ OD600nm = 0,5; lây nhiễm 30 phút phôi bắt đầu xuất đốm GUS nhỏ, màu nhạt với tỉ lệ phôi biểu 0,13% Tuy nhiên nồng độ với thời gian lây nhiễm 60 phút lại cho tỉ lệ biểu GUS giống với OD600nm = 0,5; lây nhiễm 30 phút hai dòng 31 54 Các nồng độ OD600nm = 0,5; OD600nm = 0,7; OD600nm = 0,9 dùng để chuyển gen Bt thời gian sử dụng 60 phút 90 phút Tuy nhiên thời gian 60 phút cho hiệu tốt Trên nghiệm thức đối chứng không lây nhiễm GUS Nồng độ OD600nm = 0,5 với thời gian lây nhiễm 60 phút cho thấy hiệu biến nạp khả sống môi trường có kháng sinh chọn lọc tốt nồng độ khảo sát Có thể nhận định nồng độ cung cấp vật liệu tiềm việc tái sinh chuyển gen hoàn chỉnh Kết nghiên cứu số nghiên cứu sinh giới cho thấy biểu GUS phụ thuộc vào yếu tố sau: + Kiểu gen (Loopstra ctv 1990; McAfee ctv, 1993; Tang ctv 2001) + Gen đánh dấu chọn lọc (select maker gene), chất chọn lọc promoter sử dụng (J M Humara ctv 1999) + Nồng độ vi khuẩn, vết thương giới mẫu (Tang Wei 2001) 32     + Tình trạng sinh lí giai đoạn phát triển phôi nuôi cấy điều kiện tối ưu nhiệt độ, pH diện Acetosyringone (Dillen ctv 1997; Godwin ctv 1991; Jame ctv 1993) Xác định biểu GUS điều kiện quan trọng để biến nạp thành công gen mục tiêu, chuẩn bị vật liệu cho tái sinh chuyển gen 4.2.5 Tỉ lệ phôi sống khuẩn sau lây nhiễm thể Dựa vào kết tỉ lệ phôi sống khuẩn thể ghi nhận nồng độ timentin 600 mg.l-1 tốt để loại khuẩn dư sau lây nhiễm Qua thí nghiệm biến nạp gián tiếp A.tumefaciens vào phơi có nhiều giá trị biến thiên kiểm tra bao gồm điều kiện đồng nuôi cấy, tác nhân chọn lọc thời gian môi trường chọn lọc Trong tất giá trị biến thiên yếu tố quan trọng sống sót phơi sau đồng ni cấy Sự sống sót phơi nhân tố để thu chuyển gen từ mẫu phơi chín Sự sống sót mức độ thấp phơi sau đồng ni cấy phơi nhạy cảm với Agobacterium giới hạn hợp chất diện mẫu cấy Sự sống sót phơi mơi trường chọn lọc khẳng định tạm thời vật liệu mang gen kháng Cry1Ab 33     Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận − Ngưỡng kháng sinh kanamycin thích hợp để chọn lọc chuyển gen cho dòng thông nhựa số 40 mg.l-1 − Thời gian lây nhiễm 60 phút 90 phút thích hợp cho biểu GUS Tuy nhiên, thời gian 60 phút ghi nhận sử dụng để lây nhiễm vi khuẩn vào phôi chuẩn bị cho chọn lọc dòng chuyển gen − Nồng độ OD600nm = 0,5 với thời gian lây nhiễm 60 phút cho biểu GUS tốt sử dụng cho thí nghiệm chuyển gen sau − Nồng độ kháng sinh timentin thích hợp để diệt khuẩn dư 600 mg.l-1 5.2 Đề nghị − Tiếp tục nghiên cứu điều kiện đồng nuôi cấy (điều kiện nuôi cấy, nồng độ OD600nm, thời gian đồng nuôi cấy, cách thức gây vết thương, chủng A.tumefaciens) để tìm điều kiện cho hiệu biến nạp tốt − Tiếp tục nghiên cứu chọn lọc vật liệu chuyển gen bền vững phục vụ bước (PCR, Southern blot, tái sinh chuyển gen, thử nghiệm sinh học) tạo chuyển gen 34     TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Trần Nguyễn Thúy An 2007 Tối ưu qui trình chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phương pháp tiếp hợp ba thành phần Luận văn tốt nghiệp, trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh Vi sinh vật học (tuyển tập), tập I 1971 Nhà xuất khoa học kĩ thuật Hà Nơi Võ Thành Tín, 2004 Nghiên cứu kĩ thuật chuyển gen Gus vào phơi hạt chín thông nhựa (Pinus merkusii) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Luận văn tốt nghiệp, trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Văn Uyển 1995 Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật, tập I Nhà xuất nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam, Viện tư vấn phát triển KT – XH nông thôn miền núi, nhóm tác giả 2002 Kĩ thuật trồng làm nguyên liệu giấy Nhà xuất lao động – xã hội Hà Nơi Tài liệu nước ngồi Bernier M – Cardou K Chapman; Lachance D L – Hamel P – Pelletier.F – Valero.J; Van Frankenhuyzen.K – Seguin.A 2007 Expression of a Bacillus thuringiensis cry1Ab gene in transgenic white spruce and its efficacy against the spruce budworm (Choristoneura fumiferana) Tree Genetic & Genomes 3:153-167 Charity JA, Holland L, Donaldson SS, Grace L and Walter C 2002 Agrobacteriummediated transformation of Pinus radiata organogenic tissue using vacuuminfiltration Plant Cell Tissue Organ Cult 70: 51 – 60 Cooling, E N G 1968 Pinus merkusii Fast growing timber tree of the lowland tropics No 4, Commonw For Inst Oxford 169 pp Fillattii J J, Selmer J, McCown B, Haissig B and Comai L 1987 Agrobacteriummediated transformation and regeneration in Populus Mol Gen Genet 206: 192199 10 Godwin I, Gordon T, Ford-lloyd, B., Newbury, H J 1991 The effect of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species [J] Plant Cell Rep, 9: 671-675 11 Gould JH, Zhou Y, Padmanabhan V, Magallanes-Cedeno ME Newton RJ 2002 Transformation and regeneration of loblolly pine: shoot apex inoculation with Agrobacterium Mol Breed 10: 131-141 12 Grace L J., Julia A Charity J A., Gresham B., Kay N.and Walter C 2005 Insectresistant transgenic Pinus radiata Plant cell rep 24: 103 – 111 13 Grant J E, Cooper P A, Dale T M 2004 Transgenic Pinus radiata from Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of cotyledons Plant Cell Rep 22:894 – 902 14 Hong Y and Bhatnagar S 2007.Tropical tree legumes In Biotechnology in a Agriculture and Forestry Transgenic Crops V Edited by E.C Pua and M.R Davey Springer-Verlag Berlin Heidelberg, pp 407-434 15 Humara J M, Lopez M, Ordas R J 1999 Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Pinus pinea L cotyledons: an assessment of factors influencing the efficiency of uidA gene transfer Plant cell Rep 19: 51 – 58 35     16 Hyang Young Joung 2009 Long-term gus expression from Gladiolus callus line containing either a bar-uidA delivered on separate plasmid Plant cell tiss organ cult (98): 263 – 272 17 Iskandar Z Siregar1,2 and Hans H Hattemer2 1999 Genetic variation of Pinus Merkusii jungh et de vriese in Indonesia Biodiversity and Development of Plant Genetic Resources: 1-12 18 Jame, D.J, Uratsu, S., Cheng, J., Negry, P., Viss, P., Dandekar, A.M 1993 Acetosyringone osmoprotectant like betaine or proline synergistically enhance Agrobacterium-mediated transformation of apple [J] Plant Cell Rep., 12: 559-563 19 Jefferson, R A., T A Kavanagh, B W Bevan 1987 GUS fusion: β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants EMBO 6: 3901-3907 20 Jelvin S.B 2003 Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the “Gene-Jockeying” Tool Microbiology and Molecular Biology Reviews 67:16-37 21 Klimaszewska, K et al 2001 Regeneration of transgenic Picea glauca, P mariana and P abies after cocultivation of embryogenic tissue with Agrobacterium tumefaciens In Vitro Cell Dev Biol.-Plant (in press) 22 Koskela, J., S Appanah, A.P Pedersen & M.D Markopoulos (eds.) 2002 Proceeding of the Southeast Asian Moving Workshop on Conservation, Mannagement and Utilization of Forest Genetic Resource FORSPA, Bangkok, June 2002 23 Levee V, Lelu M-A, Jouanin L, Cornu D, Pilate G 1997 Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of hybrid larch (Larix kaempferi x L deciduas) and transgenic plant regeneration Plant Cell Rep 16: 680-685 24 Levee, V et al 1999 Stable genetic transformation of white pine (Pinus strobes L ) after cocultivation of embryogenic tissues with Agrobacterium tumefaciens Mol Breed 5: 429-440 25 Loopstra, C A, Weissinger, A K, Sederoff R R 1990 Transient gene expression in differentiating pine wood using microprojectile bombardment Can J For Res 22: 993-996 26 McAfee, B.J., White, E.E., Pelcher, L E., Lapp, M S 1993 Root induction in pine (pinus) and larch (Larix) spp Using Agrobacterium rhizogenes [J] Plant Cell, Tiss Org Cult., 34: 53-62 27 Malabadi R.B and Nataraza K 2007 Stable transformation and recovery of transgenic plants by particle bombardment in Pinus wallichiana A B Jacks (Himalayan blue pine) Biotechnology (1): 105 – 111 28 Nghia, Razal, R.A., Tolentino E L T Jr., Carandang, W M., N H., Hao, P S., Luoma-Aho, T 2005 Status of Genetic Resources of Pinus merkusii(Jungh et De Vriese) and Pinus kesiya (Royleex Gordon) in Southeast Asia 29 Patnalk P.,Vishnudasan D and Khurana P 2006 Agrobacterium-mediated transformation of mature embryos of Triticum aestivum and Triticum durum Current science, 91(3): 307-315 30 Pena and A Seguin 2001 Recent advances in the genetictranformation of tree Trends Biotechnol 19: 500-506 31 Poupin M J and Jonhson P A 2005 Transgenic trees for new era In Vitro Cell Del Biol 41: 91 – 101 32 Rajendra K.C., Reiner Finkeldey 2008 Needle morphological variation within and among population of Pinus merkusii Jungh & De Vries in Central Aceh, Indonesia 36     33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 Conference on International Research on Food Security, Natural Resource Management and Rural Development Ravindra B Malabadi1,2*; Jaime A.Teixeira da Silva3; K Nataraja1 2008 Agrobacterium tumefaciens-mediated Genetic Transformation of Pinus kesyja Royle ex Gord (Khasi Pine) The Asian and Australasian Journal of Plant Science and Biotechnology ©2008 Global Science Books, p8-14 Tang Wei, Tian Yingchuan, Ouyang Fan 1997 Preliminary Student on Establishment of Genetic Transformation System in Loblolly Pine Journal of Forestry Research Vol 8: 201-205 Tang W 2000 Genetic transformation of loblolly pine using mature zygotic embryo by Agrobacterium tumefaciens Journal of forestry research 11(4): 215 – 222 Tang W 2001 Conifer genetic engineering: Particle bombardment and Agrobacterium - mediated gene transfer and its application in future forests Journal of forestry research 12(4): 220 – 228 Tang W and Tian Y 2003 Transgenic loblolly pine (Pinus taeda L.) plants expressing a modified δ-endotoxin gene of Bacillus thuringiensis with enhanced resistance to Dendrolimus punctatus Walker and Crypyothelea formosicola Staud Journal of Experimental Botany 54 (383): 835 – 844 Tang W., Harris L., Newton R.J 2003 Influences of antibiotics on plantlet regeneration via organogenesis in Ioblolly pine (Pinus taeda L.) Journal of Forestry Research, 14(3): 185-190 Trontin J F., Walter C., Klimaszewska K., Park Y J and Walter L.A 2007 Recent Progress in Genetic Transformation of Four Pinus spp Transgenic Plant Journal 1(2): 314 – 329 Walter C., Grace L J., Wagner A., White D.W R., Walden A R., Donaldson S S., Hinton H., Gardner R.C and Smith D R 1998 Stable transformation and regeneration of transgenic plants of Pinus radiata D Don Plant Cell Reports 17: 460 – 468 Wei Tang1*, Zhongchen Guo1 Fan Ouyang2 2001 Plant regeneration from embryogenic cultures initiated from mature loblolly pine zygotic embryos In Vitro Cell Dev Biol.-Plant 37: 558 – 563 Wenck, A.R et al 1999 Hight – efficiency Agrobacterium-mediated transformation of Norway spruce (Picea abies) and loblolly pine (Pinus taeda) Plant Mol Biol.39: 407416 37     PHỤ LỤC Bảng Bảng ANOVA, trắc nghiệm đa biên độ ngưỡng gây chết kanamycin sau ba tuần ANOVA Table for BATUAN by NT Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 8916.67 2229.17 102.88 0.0000 Within groups 216.667 10 21.6667 Total (Corr.) 9133.33 14 Multiple Range Tests for BATUAN by NT -Method: 95.0 percent LSD NT Count Mean Homogeneous Groups -5 35.0 X 55.0 X 3 73.3333 X 95.0 X 100.0 X -Contrast Difference +/- Limits -1 - 5.0 8.46825 - *26.6667 8.46825 - *45.0 8.46825 - *65.0 8.46825 - *21.6667 8.46825 - *40.0 8.46825 - *60.0 8.46825 - *18.3333 8.46825 - *38.3333 8.46825 - *20.0 8.46825 -* denotes a statistically significant difference Table of Means for BATUAN by NT with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error NT Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -1 100.0 2.68742 95.7659 104.234 95.0 2.68742 90.7659 99.2341 3 73.3333 2.68742 69.0992 77.5675 55.0 2.68742 50.7659 59.2341 35.0 2.68742 30.7659 39.2341 -Total 15 71.6667     Bảng Bảng ANOVA, trắc nghiệm đa biên độ ngưỡng gây chết kanamycin sau bốn tuần ANOVA Table for BONTUAN by NT Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 11666.7 2916.67 109.38 0.0000 Within groups 266.667 10 26.6667 Total (Corr.) 11933.3 14 Multiple Range Tests for BONTUAN by NT -Method: 95.0 percent LSD NT Count Mean Homogeneous Groups -5 21.6667 X 31.6667 X 3 53.3333 X 85.0 X 91.6667 X -Contrast Difference +/- Limits -1 - 6.66667 9.39468 - *38.3333 9.39468 - *60.0 9.39468 - *70.0 9.39468 - *31.6667 9.39468 - *53.3333 9.39468 - *63.3333 9.39468 - *21.6667 9.39468 - *31.6667 9.39468 - *10.0 9.39468 -* denotes a statistically significant difference Table of Means for BONTUAN by NT with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error NT Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -1 91.6667 2.98142 86.9693 96.364 85.0 2.98142 80.3027 89.6973 3 53.3333 2.98142 48.636 58.0307 31.6667 2.98142 26.9693 36.364 21.6667 2.98142 16.9693 26.364 -Total 15 56.6667     Bảng Bảng ANOVA, trắc nghiệm đa biên độ ngưỡng gây chết kanamycin sau sáu tuần ANOVA Table for SAUTUAN by NT Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 15123.3 3780.83 252.06 0.0000 Within groups 150.0 10 15.0 Total (Corr.) 15273.3 14 Multiple Range Tests for SAUTUAN by NT -Method: 95.0 percent LSD NT Count Mean Homogeneous Groups -5 0.0 X 0.0 X 3 31.6667 X 68.3333 X 73.3333 X Contrast Difference +/- Limits -1 - 5.0 7.04601 - *41.6667 7.04601 - *73.3333 7.04601 - *73.3333 7.04601 - *36.6667 7.04601 - *68.3333 7.04601 - *68.3333 7.04601 - *31.6667 7.04601 - *31.6667 7.04601 - 0.0 7.04601 -* denotes a statistically significant difference Table of Means for SAUTUAN by NT with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error NT Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -1 73.3333 2.23607 69.8103 76.8563 68.3333 2.23607 64.8103 71.8563 3 31.6667 2.23607 28.1437 35.1897 0.0 2.23607 -3.52301 3.52301 0.0 2.23607 -3.52301 3.52301 -Total 15 34.6667     Bảng Bảng ANOVA, trắc nghiệm đa biên độ ảnh hưởng nồng độ vi khuẩn thời gian lây nhiễm đến xâm nhiễm A.tumefaciens vào phơi hữu tính Analysis of Variance for GUS1.GUS - Type III Sums of Squares -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -MAIN EFFECTS A:GUSHIE1.NT1 26.328039 13.164019 18.825 0000 B:GUSHIE1.NT2 24.274697 8.091566 11.571 0001 INTERACTIONS AB 15.183494 2.5305824 3.619 0107 RESIDUAL 16.782600 24 6992750 -TOTAL (CORRECTED) 82.568831 35 -0 missing values have been excluded All F-ratios are based on the residual mean square error Table of Least Squares Means for GUS1.GUS -95% Confidence Level Count Average Stnd Error for mean -GRAND MEAN 36 1.2013889 1393711 9136725 1.4891053 A:GUS1.NT1 A1 12 0000000 2413978 -.4983394 4983394 A2 12 1.9225000 2413978 1.4241606 2.4208394 A3 12 1.6816667 2413978 1.1833273 2.1800060 B:GUS1.NT2 B1 1844444 2787422 -.3909883 7598772 B2 9522222 2787422 3767895 1.5276549 B3 1.2022222 2787422 6267895 1.7776549 B4 2.4666667 2787422 1.8912339 3.0420994 AB A1 B1 0000000 4827957 -.9966787 9966787 A1 B2 0000000 4827957 -.9966787 9966787 A1 B3 0000000 4827957 -.9966787 9966787 A1 B4 0000000 4827957 -.9966787 9966787 -A2 B1 0000000 4827957 -.9966787 9966787 A2 B2 1.4900000 4827957 4933213 2.4866787 A2 B3 2.5000000 4827957 1.5033213 3.4966787 A2 B4 3.7000000 4827957 2.7033213 4.6966787 A3 B1 5533333 4827957 -.4433454 1.5500120 A3 B2 1.3666667 4827957 3699880 2.3633454 A3 B3 1.1066667 4827957 1099880 2.1033454 A3 B4 3.7000000 4827957 2.7033213 4.6966787 Multiple range analysis for GUS1.GUS by GUS1.NT1 -Method: 95 Percent Duncan Level Count LS Mean Homogeneous Groups -A1 12 0000000 X A3 12 1.6816667 X A2 12 1.9225000 X -contrast difference A1 - A2 -1.92250 * A1 - A3 -1.68167 * A2 - A3 0.24083 -* denotes a statistically significant difference     Multiple range analysis for GUS1.GUS by GUS1.NT2 -Method: 95 Percent Duncan Level Count LS Mean Homogeneous Groups -B1 1844444 X B2 9522222 XX B3 1.2022222 X B4 2.4666667 X -contrast difference B1 - B2 -0.76778 B1 - B3 -1.01778 * B1 - B4 -2.28222 * B2 - B3 -0.25000 B2 - B4 -1.51444 * B3 - B4 -1.26444 * -* denotes a statistically significant difference     Bảng Bảng ANOVA, bảng trung bình bảng so sánh khác biệt thể tỉ lệ phôi sống sau lây nhiễm ba tuần ANOVA Table for BATUAN by Nongdo Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 23.3333 7.77778 2.80 0.1310 Within groups 16.6667 2.77778 Total (Corr.) 40.0 Multiple Range Tests for BATUAN by Nongdo -Method: 95.0 percent LSD Nongdo Count Mean Homogeneous Groups -0 95.0 X 98.3333 XX 100.0 X 3 100.0 X -Contrast Difference +/- Limits -0 - -3.33333 4.7091 - *-5.0 4.7091 - *-5.0 4.7091 - -1.66667 3.32983 - -1.66667 3.32983 - 0.0 3.32983 -* denotes a statistically significant difference Table of Means for BATUAN by Nongdo with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error Nongdo Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -0 95.0 1.66667 92.1163 97.8837 98.3333 0.96225 96.6684 99.9983 100.0 0.96225 98.3351 101.665 3 100.0 0.96225 98.3351 101.665 -Total 10 99.0     Bảng Bảng ANOVA, bảng trung bình bảng so sánh khác biệt thể tỉ lệ phôi sống sau lây nhiễm bốn tuần ANOVA Table for BONTUAN by Nongdo Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 10.0 3.33333 0.13 0.9367 Within groups 150.0 25.0 Total (Corr.) 160.0 Multiple Range Tests for BONTUAN by Nongdo -Method: 95.0 percent LSD Nongdo Count Mean Homogeneous Groups -0 95.0 X 96.6667 X 3 96.6667 X 98.3333 X -Contrast Difference +/- Limits -0 - -3.33333 14.1273 - -1.66667 14.1273 - -1.66667 14.1273 - 1.66667 9.9895 - 1.66667 9.9895 - 0.0 9.9895 -* denotes a statistically significant difference Table of Means for BONTUAN by Nongdo with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error Nongdo Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -0 95.0 5.0 86.3488 103.651 98.3333 2.88675 93.3386 103.328 96.6667 2.88675 91.6719 101.661 3 96.6667 2.88675 91.6719 101.661 -Total 10 97.0   ... tumefaciens Our result showed that kanamycin at 40 mg.l-1 can be used as a lethal threshold level for selection of stable transformation Concentration of Agrobacterium tumefaciens at OD600nm =... (Polyethylene glycol) + Biến nạp qua protoplast (protoplast fusion) + Hấp thu DNA + Dùng xung điện (electroporation) + Vi tiêm (microprojection) + Bắn gen (gen gun) + Qua ống phấn (pollen tube... giành cho Tp Hồ Chí Minh ngày 14 tháng 07 năm 2010 Nguyễn Cao Lê Hiền i     TĨM TẮT Pinus merkusii lồi thông cung cấp sản lượng nhựa cao giới, nhựa thơng có giá trị kinh tế nhiều ngành công nghiệp