khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của giống lan dendrobium mini lai trong điều kiện nuôi cấy in vitro

Nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật bổ sung vào các môi trường cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai .... Điều kiện nuôi cấy và nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực v

Ph ạm Thị Thu Ly

ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY IN VITRO

Chuyên ngành: Sinh h ọc thực nghiệm

- Ban Giám hiệu trường Đại học Sư phạm TP HCM, Phòng Đào tạo Sau đại học, Khoa Sinh học, tất cả thầy cô đã tận tình dạy dỗ, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian theo học tại trường

- Thầy PGS TS Bùi Văn Lệ đã tận tình hướng dẫn, giảng dạy, bồi dưỡng kiến

thức, đóng góp nhiều ý kiến quý báu và luôn tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành luận văn

- ThS Hoàng Minh Tâm, ThS Đặng Thị Ngọc Thanh – thầy cô đã quan tâm, tận tình chỉ bảo và cho em những ý tưởng đề tài

- Thạc sĩ Nguyễn Văn Vinh, Trạm huấn luyện và thực nghiệm nông nghiệp Văn Thánh thuộc Trung tâm khuyến nông thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

- ThS Lê Minh Đức đã giúp đỡ và hỗ trợ cho em trong công tác phòng thí nghiệm

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sơ lược đặc điểm lan Dendrobium và lan Dendrobium mini 3

1.1.1 Đặc điểm hình thái 5

1.1.2 Điều kiện sinh thái 7

1.1.2.1 Nhiệt độ 7

1.1.2.2 Độ ẩm và chế độ tưới nước 8

1.1.2.3 Ánh sáng 8

1.1.2.4 Nhu cầu dinh dưỡng 8

1.1.3 Các phương pháp nhân giống cây lan Dendrobium và Dendrobium mini ngoài tự nhiên 9

1.1.3.1 Giao phấn 9

1.1.3.2 Phương pháp tách chiết 9

1.2 Sơ lược phương pháp nhân giống in vitro 9

1.2.1 Lược sử phát triển của công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật 9

1.2.2 Tầm quan trọng của phương pháp nhân giống in vitro 10

1.2.3 Điều kiện nhân giống in vitro 11

1.2.4 Các giai đoạn nuôi cấy mô thực vật 11

1.2.4.1 Giai đoạn 1: Chọn lựa và khử trùng mẫu 11

1.2.4.2 Giai đoạn 2: Tạo thể nhân giống 11

1.2.4.3 Giai đoạn 3: Nhân giống in vitro 11

1.2.4.4 Giai đoạn 4: Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh 12

1.2.4.5 Giai đoạn 5: Chuyển cây con ra vườm ươm 12

1.2.5.2 Khó khăn 13

1.2.6 Sơ lược các kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô thực vật 14

1.2.6.1 Nuôi cấy phôi 14

1.2.6.2 Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời 14

1.2.6.3 Nuôi cấy mô phân sinh 15

1.2.6.4 Nuôi cấy bao phấn 15

1.2.6.5 Nuôi cấy tế bào đơn 15

1.2.6.6 Nuôi cấy protoplast 16

1.2.7 Các phương pháp nhân giống in vitro cho lan Denrdobium 17

1.2.7.1 Nhân giống bằng chồi nách 17

1.2.7.2 Nhân giống bằng chồi đỉnh 17

1.2.7.3 Nhân giống bằng chồi bất định 17

1.2.7.4 Nhân giống qua nuôi cấy callus 17

1.2.7.5 Nhân giống bằng các đoạn giả hành 17

1.2.7.6 Nuôi cấy hạt lai 18

1.2.7.7 Dung hợp tế bào trần 18

1.3 Sơ lược về phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL) 18

1.4 Sơ lược phương pháp nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng lắc (nuôi cấy dịch treo tế bào) 19

1.5 Giới thiệu về phôi soma và protocorm like bodies (PLBs) 20

1.5.1 Giới thiệu về phôi soma 20

1.5.2 Giới thiệu về PLBs 21

1.6 Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 22

1.7 Một số chất hữu cơ dùng trong nuôi cấy in vitro 23

1.8 Một số công trình nghiên cứu về lan Dendrobium in vitro 24

1.8.1 Trong nước 24

1.8.2 Trên thế giới 24

2.1.1 Vật liệu nuôi cấy 26

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ 26

2.1.3 Hóa chất 26

2.2 Môi trường và điều kiện nuôi cấy 26

2.3 Nội dung nghiên cứu 27

2.4 Phương pháp nghiên cứu 27

2.4.1 Nội dung 1: Khảo sát phương pháp khử trùng mẫu 27

Thí nghiệm 1: Khảo sát phương pháp khử trùng mẫu 27

2.4.2 Nội dung 2: Khảo sát các loại môi trường nuôi cấy cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 29

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng thành phần các loại môi trường nuôi cấy cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 29

2.4.3 Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 30

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng NAA và BA đến khả năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 30

2.4.4 Nội dung 4: Khảo sát các điều kiện nuôi cấy đến khả năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 31

Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 31

2.4.5 Nội dung 5: Khảo sát ảnh hưởng của các hợp chất hữu cơ: vitamin, đường, nước dừa, khoai tây, bánh dầu đến khả năng nhân nhanh chồi và sự sinh trưởng của giống lan Dendrobium mini lai 32

Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ vitamin lên sự tăng sinh chồi trong môi trường lỏng lắc 32

Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của bánh dầu đến khả năng sinh trưởng chồi của giống lan Dendrobium mini lai 33

Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu đến sinh trưởng của giống lan

Dendrobium mini lai ở giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh 36

2.4.6 Xử lý, phân tích số liệu, dữ kiện 37

2.5 Thời gian nghiên cứu 2

2.6 Nơi thực hiện đề tài 2

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 38

3.1 Kết quả 1: Khảo sát phương pháp khử trùng mẫu 38

Thí nghiệm 1: Khảo sát phương pháp khử trùng mẫu 38

3.2 Kết quả 2: Khảo sát các loại môi trường nuôi cấy cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 40

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng thành phần khoáng các loại môi trường nuôi cấy đến cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 40

3.3 Kết quả 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 42

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng NAA và BA đến khả năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 42

3.4 Kết quả 4: Khảo sát các điều kiện nuôi cấy đến khả năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 47

Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 47

3.5 Kết quả 5: Khảo sát ảnh hưởng của các hợp chất hữu cơ: vitamin, đường, nước dừa, khoai tây, bánh dầu và vitamin đến khả năng nhân nhanh chồi và sự sinh trưởng của giống lan Dendrobium mini lai 50

Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ vitamin lên sự tăng sinh chồi trong môi trường lỏng lắc 50

Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của bánh dầu đến khả năng sinh trưởng chồi của giống lan Dendrobium mini lai 53

Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu đến sự sinh trưởng của giống

lan Dendrobium mini lai ở giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh 63

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67

1 Kết luận 67

2 Kiến nghị 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

PH Ụ LỤC

NAA : α-naphthaleneacetic acid

BA : 6-benzyl adenin

ABA : abcisic acid

IAA : indol acetic acid

IBA : indolbutyric acid

TDZ : thidiazuron

MS : Murasgige và Skoog

WPM : Woody Plant Medium

PLBs : Protocorm like bodies

tTCL : Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào cắt theo chiều ngang lTCL : Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào cắt theo chiều dọc

NT : Nghiệm thức

Bảng 2.1 Nồng độ javen và thời gian khử trùng mẫu 27

Bảng 2.2 Nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật bổ sung vào các môi trường cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 30

Bảng 2.3 Điều kiện nuôi cấy và nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật bổ sung vào các môi trường cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 31

Bảng 2.4 Nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và vitamin bổ sung vào các môi trường ảnh hưởng đến sự tăng sinh chồi lan Dendrobium mini lai 33

Bảng 2.5 Nồng độ bánh dầu bổ sung vào các môi trường ảnh hưởng đến sự sinh trưởng chồi lan Dendrobium mini lai 34

Bảng 2.6 Nồng độ cơm dừa và bánh dầu bổ sung vào các môi trường ảnh hưởng đến sự sinh trưởng chồi lan Dendrobium mini lai 35

Bảng 2.7 Nồng độ cơm dừa và bánh dầu bổ sung vào các môi trường ảnh hưởng đến sự sinh trưởng lan Dendrobium mini lai ở giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh 36

Bảng 3.1 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ javen và thời gian lắc mẫu lên quá trình khử trùng 38

Bảng 3.2 Ảnh hưởng thành phần khoáng các loại môi trường nuôi cấy đến cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 41

Bảng 3.3.Tỉ lệ mẫu sống dưới ảnh hưởng của BA và NAA 43

Bảng 3.4 Tỉ lệ mẫu tạo PLBsdưới ảnh hưởng của BA và NAA 43

Bảng 3.5 Tổng số chồi thu đượcdưới ảnh hưởng của BA và NAA 44

Bảng 3.6 Chiều cao chồi trung bình thu được dưới ảnh hưởng của BA và NAA 44

Bảng 3.7 Tỉ lệ mẫu sống dưới ảnh hưởng của BA và NAA nuôi cấy trong điều kiện không có ánh sáng 47

Bảng 3.8 Tỉ lệ mẫu tạo PLBs dưới ảnh hưởng của BA và NAA nuôi cấy trong điều kiện không có ánh sáng 48

Bảng 3.9 Tổng số chồi thu được dưới ảnh hưởng của BA và NAA nuôi cấy trong điều kiện không có ánh sáng 48

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ vitamin lên sự tăng sinh chồi lan trong môi

trường lỏng lắc sau 49 ngày nuôi cấy 51

Bảng 3.12 Tỉ lệ nhân chồi lan dưới ảnh hưởng của bánh dầu 54

Bảng 3.13.Chiều cao cây trung bình dưới ảnh hưởng của bánh dầu 55

Bảng 3.14.Số lá trung bình thu được dưới ảnh hưởng của bánh dầu 56

Bảng 3.15.Hình thái, màu sắc lá dưới ảnh hưởng của bánh dầu 57

Bảng 3.16.Tổng số chồi thu được dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu 59

Bảng 3.17.Tỉ lệ nhân chồi dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu 60

Bảng 3.18.Chiều cao chồi trung bình thu được dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu 60

Bảng 3.19.Số lá trung bình thu được dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu 61

Bảng 3.20.Hình thái, màu sắc lá dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu 61

Bảng 3.21.Chiều cao cây trung bình thu được dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu ở giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh 63

Bảng 3.22 Số lá trung bình thu được dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu ở giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh 64

Bảng 3.23 Số rễ thu được dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu ở giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh 64

Bảng 3.24 Hình thái, màu sắc lá dưới ảnh hưởng của cơm dừa, bánh dầu ở giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh 66

Hình 1.1.Tổng quan về lan Dendrobium 3

Hình 1.2 Cơ quan sinh sản của lan thuộc họ Ochidaceae 7

Hình 1.3 Một số kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 17

Hình 1.4 PLBs được hình thành từ phương pháp tTCL 22

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình khử trùng mẫu 29

Hình 3.1 Chồi lan non thu nhận ngoài vườn, cắt bớt bao lá và lá 39

Hình 3.2 Kết quả khử trùng chồi lan theo các nghiệm thức 40

Hình 3.3 Lan Dendrobium mini lai nuôi cấy trên môi trường MS, Gamborg B5 và WPM sau 60 ngày 42

Hình 3.4 PLBs sau 60 ngày nuôi cấy trên nghiệm thức 1 đến nghiệm thức 8 46

Hình 3.5 PLBs sau 60 ngày nuôi cấy trên nghiệm thức 1 đến nghiệm thức 8 trong điều kiện không có ánh sáng 50

Hình 3.6 Sự tăng sinh chồi lan trong môi trường lỏng lắc sau 49 ngày nuôi cấy từ nghiệm thức 1 đến nghiệm thức 6 52

Hình 3.7 Hình thái chồi lan trong môi trường lỏng lắc sau 49 ngày nuôi cấy từ nghiệm thức 1 đến nghiệm thức 6 53

Hình 3.8 Chồi lan Dendrobium mini lai trên các loại môi trường bánh dầu khác nhau sau 49 ngày nuôi cấy từ nghiệm thức 1 đến nghiệm thức 6 58

Hình 3.9 Chồi lan Dendrobium mini lai trên các loại môi trường bánh dầu khác nhau sau 49 ngày nuôi cấy từ nghiệm thức 7 đến nghiệm thức 12 59

Hình 3.10 Lan Dendrobium mini lai trên môi trường MS có bổ sung cơm dừa và bánh dầu xử lý nhiệt sau 49 ngày nuôi cấy từ nghiệm thức 1 đến 6 62

Hình 3.11 Lan Dendrobium mini lai ở giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh trên môi trường MS có bổ sung cơm dừa và bánh dầu xử lý nhiệt sau 49 ngày nuôi cấy 66

M Ở ĐẦU

 Đặt vấn đề

Ngày nay với nền kinh tế ngày càng phát triển, thì nhu cầu vật chất của con người ngày càng được cải thiện và nâng cao Và đặc biệt nhu cầu tinh thần của người dân là không thể thiếu Một trong những cách mà con người đã chọn để làm đẹp cho cuộc

sống của mình là trồng hoa và cây cảnh Việc lựa chọn từng loại hoa trồng tùy theo sở

người ưa thích Hoa lan là loài hoa vương giả, với vẻ đẹp kiêu kì huyền bí, có vai trò quan trọng trong đời sống tinh thần và kinh tế Ngoài ra chúng có hình dáng, màu sắc, kích thước phong phú và đa dạng, rất phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam nên chúng được sản xuất khá phổ biến

Hoa lan ở nước ta rất phong phú và đa dạng, có nhiều giống khác nhau như:

Cattleya, Phalaenopsis, Oncidium, Mokara, Vanda, Dendrobium… chúng đều cho hoa rất đẹp và mang nhiều màu sắc khác nhau Hoa lan có thể dùng để trang trí, trưng bày,

Dendrobium là giống khá phong phú từ màu sắc, dạng hoa cho đến giống, loài Mặt

và được trồng phổ biến ở nước ta hiện nay nhằm phục vụ cho nhu cầu cuộc sống

Trong nhóm Dendrobium, giống lan Dendrobium mini đang được ưa chuộng tại các

đòi hỏi nhiều diện tích trồng nhưng lại sản xuất được nhiều cây, lợi nhuận mang đến lớn hơn kỳ vọng, ra hoa quanh năm và lâu tàn (hoa có thể kéo dài từ 2-3 tháng), thích

hợp trưng bày trên từng bàn làm việc hoặc cho cả phòng họp lớn, thích hợp cho đủ loại

đến hồng, hồng phớt, hồng nhạt và điểm vàng… Tuy nhiên, giống lan Dendrobium

nhợt nhạt…, số lượng hoa trên thị trường không nhiều để phục vụ cho nhu cầu của con

người Nên việc nhân giống lan Dendrobium mini để thỏa mãn sự hiếu kì của khách

hàng và thu lại lợi ích kinh tế là một việc làm cần thiết

Phương pháp nuôi cấy in vitro là phương pháp duy nhất hiện nay có thể nhân

nhau từ một cây bố mẹ quí mới được lai tạo và được xem là có giá trị sau lần ra hoa

đầu tiên Do đó, đề tài “Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và

phát triển của giống lan Dendrobium mini lai trong điều kiện nuôi cấy in vitro”

được thực hiện

 M ục tiêu của đề tài

- Xác định được phương pháp khử trùng mẫu

- Xác định được môi trường cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai tốt nhất

- Xác định môi trường nhân chồi lan Dendrobium mini lai tối ưu trong điều kiện in

vitro

trong điều kiện in vitro

 Đối tượng nghiên cứu

Giống lan Dendrobium mini lai

 N ội dung nghiên cứu

Khảo sát quy trình khử trùng mẫu

Khảo sát môi trường cảm ứng tạo chồi

Khảo sát môi trường nhân chồi Dendrobium mini lai trong điều kiện in vitro

Khảo sát môi trường tạo cây lan con Dendrobium mini lai hoàn chỉnh trong điều

kiện in vitro

Từ tháng 01/12/2013 đến 31/01/2014: Viết và bảo vệ đề cương

Từ tháng 2/2014 đến tháng 8/2014: Thu mẫu, thực nghiệm, lặp lại nghiệm thức Tháng 8/2014: Hoàn thành luận văn

 Nơi thực hiện đề tài

CHƯƠNG 1

T ỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược đặc điểm lan Dendrobium và lan Dendrobium mini

Vị trí phân loại: Lan Dendrobium thuộc:

Họ Orchidaceae có khoảng 750 chi, 25000 loài, chiếm vị trí thứ hai sau họ Cúc trong ngành thực vật Hạt kín và là họ lớn nhất trong ngành Một lá mầm Các loài trong

hệ thống này phân bố rất rộng, do đó hình thái và cấu tạo cũng hết sức đa dạng và phức tạp [10]

nhất ở Đông Nam Á và Úc Châu

Tên Dendrobium có nguồn gốc từ chữ Hy Lạp Dendron nghĩa là cây gỗ và bios là tôi sống Dendrobium là giống phụ sinh, sống trên cây gỗ Có người gọi là Hoàng Lan,

có người gọi là Đăng Lan Dendrobium có trên 1.600 loài và chia thành 2 dạng chính

[17]:

- Dạng đứng (Dendrobium phalaenopsis) thường mọc ở xứ nóng, chịu ẩm và rất siêng ra hoa với các giống tiêu biểu như: Nhất điểm hồng, Nhất điểm hoàng, Báo hỉ, Ý

thảo, Thủy tiên, Sonia

- Dạng thòng (Dendrobium nobile) chịu khí hậu mát mẽ với các giống tiêu biểu như: Giả hạc, Hạc vĩ, Long tu, Phi điệp vàng

Với 1600 loài khác nhau đòi hỏi nhiều cách chăm sóc khác nhau, nguyên do là vì chúng du nhập từ nhiều địa danh khác nhau như Nhật Bản, Triều Tiên và Newzealand,

đặc biệt là Guinea là nơi sản sinh ra nhiều loài Dendrobium nhất [1] Ở Việt Nam,

lá và hoa [14]

bố nhiều ở Châu Âu và Nam Thái Bình Dương, được tìm thấy nhiều ở Châu Úc, Tân Guinea, Thái Lan, Việt Nam và dãy núi Himalaya Dendrobium được trồng

phục vụ cho lan chậu và lan cắt cành Hiện nay, thị trường Dendrobium ngày càng

đa dạng và phong phú do các loại lan lai có nguồn gốc khác nhau [10]

Điều kiện sinh thái của Dendrobium rất đa dạng, có loài chỉ mọc và ra hoa ở vùng

lạnh, có loài ở vùng nóng, có loài ở trung gian, và cũng có loài thích nghi với điều kiện khí hậu nào

 Lan Dendrobium mini

Lan Dendrobium mini là một loài lai tạo, thân đứng Loài lan này được chọn lọc từ

Thái Lan và được du nhập vào nước ta Đặc điểm của loài lan này là cây dạng bụi, lùn (chỉ cao 15 – 20 cm), nhưng ra hoa rất nhiều, hoa nở quanh năm Cây nhỏ nhưng nhảy chồi rất mạnh, nhảy chồi ngay cả trên các thân già hay cây suy yếu Hoa có kích thước không lớn chỉ khoảng 4 x 5 cm nhưng hoa rất đẹp, số hoa trên cành nhiều từ 6 - 13 hoa, hoa rất bền lâu tàn (1,5 – 2 tháng) Thông thường trên một giả hành có tới 3 - 4 phát (cành) hoa, nếu cây tốt có thể lên đến 5 phát hoa [5]

1.1.1 Đặc điểm hình thái

Dendrobium thuộc nhóm đa thân, vừa có thân thật vừa có giả hành Giống lan này đều có bộ phận sinh dưỡng như rễ, thân, giả hành, lá và cơ quan sinh sản như hoa, trái [14]

tế bào chết chứa đầy không khí nên rễ ánh lên màu xanh bạc Vì vậy, rễ hút được nước mưa chảy dọc trên vỏ cây gỗ hay nước lơ lửng trong không khí, hơi sương và hơi

nước, giúp cây hút dinh dưỡng và chất khoáng, mặt khác giúp cây bám chặt vào giá

thể, không bị gió cuốn Một số loài có thân lá kém phát triển thậm chí tiêu giảm hoàn toàn, có hệ rễ chứa diệp lục tố giúp cây hấp thụ ánh sáng cần thiết cho sự ra hoa và quang hợp [14]

Rễ lan Dendrobium cũng giống như rễ lan Vũ Nữ, Cattleya thuộc loại rễ bán gió,

không chịu được lạnh, nếu bị lạnh trong thời gian dài rễ cây sẽ bị mục nát và cây bị

chết [10] Nhóm này thường có rễ nhỏ nhưng rất nhiều rễ, chủ yếu bám vào giá thể, vào thân cây để hút dưỡng chất dính vào giá thể như nước, cho nên khi trồng vào chậu, phải để giá thể nhiều hơn, gần như toàn bộ rễ đều bám vào giá thể, vào thành chậu, chỉ

có một số ít rễ chìa ra ngoài Đối với lan, rễ bán gió phải trồng với giá thể nhỏ hơn và nhiều hơn, để bộ rễ bám dày đặc hút nhiều dưỡng chất [17]

- Thân: Dendrobium thuộc nhóm đa thân (còn gọi là nhóm hợp trục) có hệ thống nhánh nằm ngang bò dài trên giá thể hoặc nằm sâu trong đất gọi là thân rễ Một số

mùa thu, thân phình to giống như củ không có lá là nơi dự trữ năng lượng [2]

- Giả hành: Là những đoạn phình to, bên trong có các mô mềm chứa dịch nhày làm giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cây trong điều kiện khô hạn khi cây sống bám trên cao Ngoài ra giả hành còn chứa diệp lục tố nên có thể quang

hợp được [14] Hình dạng và kích thước của giả hành rất đa dạng: hình cầu, thuôn dài hay hình trụ xếp chồng lên nhau tạo thành thân có lá mọc xen kẽ Một số loài ở xứ

lạnh chỉ có nhiệm vụ dự trữ chất dinh dưỡng nên giả hành không có màu xanh nhưng phía trên có nang lá [10]

- Lá: Các lá mọc xen kẽ nhau và ôm lấy thân giả do lá có tận cùng bằng một cuốn thay thuôn dài xuống thành bẹ ôm thân, hình dạng và cấu trúc lá rất đa dạng [14] Lá

có hình kim, trụ có rãnh hay phiến mỏng Dạng lá mềm mại mọng nước, nạc, có màu xanh bóng, đậm hay nhạt tùy thuộc vào vị trí sống của cây Phiến lá trải rộng hay gấp lại theo gân vòng cung như cái quạt hay chỉ gấp lại theo gân giữa như hình chữ V

Những lá sát dưới gốc đôi khi giảm đi chỉ còn những bẹ không phát triển hay giảm hẳn thành vảy [10] Các loài thuộc giống Dendrobium vùng nhiệt đới nói riêng và họ

Orchidaceae nói chung đôi khi rụng lá vào mùa khô hạn Sau đó, cây ra hoa hay sống

ẩn để khi gặp mưa thì cho chồi mới [2]

- Hoa: Dendrobium thuộc nhóm phụ ra hoa ở nách lá Chồi hoa mọc từ các mắt

ngủ giữa các đọt lá trên thân gần ngọn và cả trên ngọn cây Sự biểu hiện trước khi ra hoa khác biệt như có nhiều loài rụng hết lá trước khi ra hoa Thời gian ra hoa đầu mùa

mưa hay đầu tết Giống Dendrobium khi đủ dinh dưỡng thì cho hoa thành từng chùm,

phát hoa dài và thời gian ra hoa trung bình 1-2 tháng Hoa có thể mọc từ thân thành từng chùm hay từng hoa Hoa có màu trắng, vàng đến tím Thường lá đài sau nằm một mình, hai lá đài bên dài ra dính lại với nhau ở mép dưới và dính vào đáy

của trụ tạo thành một phần dưới chân của trụ phía dưới gọi là cằm Môi gắn vào cằm, đôi khi kéo dài về phía sau tạo thành cựa, móc hay túi Môi nguyên hay có thùy, gai, sọc có lông hoặc không Hai cánh hoa bên giống như hai lá đài Trụ thấp,

phần đực của đỉnh trụ có nắp đậy, nắp gắn vào trụ nhờ một chỉ ngắn về phía sau, bốn khối phấn nhỏ dính lại với nhau từng cặp [14]

- Quả: Họ Orchidaceae đều có quả thuộc loại quả nang, khi hạt chín, các nang bung ra chỉ còn dính nhau ở phần đỉnh và gốc Ở một số loài, khi chín quả không nứt

ra nên hạt chỉ ra khỏi quả khi quả bị mục nát [10]

Hình 1.2 Cơ quan sinh sản của lan thuộc họ Ochidaceae [20]

a) Cấu tạo hoa chi tiết b) Quả lan

1.1.2 Điều kiện sinh thái

1.1.2.1 Nhiệt độ

Nhiệt độ tác động ở cây lan qua con đường quang tổng hợp, cường độ quang hợp gia tăng theo nhiệt độ, thường nhiệt độ tăng 10 % thì tốc độ quang hợp tăng lên gấp đôi Nhiệt

độ còn ảnh hưởng đến sự ra hoa ở một số loài lan như lan Bạch Câu Dendrobium

C trong vài giây thì 9 ngày sau chúng sẽ

nở hoa đồng loạt Ở 18,5oC, Dendrobium nobile chỉ tăng trưởng mà không ra hoa nhưng

chúng sẽ ra hoa khi nhiệt độ hạ xuống 13oC hay thấp hơn [9]

Căn cứ vào nhu cầu nhiệt độ, có thể tạm chia Dendrobium thành hai nhóm chính

[11]:

- Nhóm ưa lạnh: sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ lý tưởng là 150C, gồm các

giống được lấy từ các vùng cao nguyên ở độ cao trên 1.000m Các loài này nếu được trồng ở nhiệt độ cao hơn hoặc bằng 25oC, thì cây vẫn sống nhưng hiếm khi ra hoa

- Nhóm ưa nóng: nhiệt độ thích hợp cho các loài của nhóm này là 25o

C, gồm đa số các giống Dendrobium ở vùng nhiệt đới, và các loài của giống Dendrobium lai hiện

đang trồng tại thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh phía Nam

Ngoài ra, còn có một nhóm Dendrobium trung gian có thể sống ở cả vùng lạnh

và vùng nóng, nhưng ở vùng lạnh cây sinh trưởng và ra hoa nhiều hơn như

20oC

b) a)

cần từ 60 đến 70 % Thời kỳ nghỉ cần giảm thích đáng

ẩm và thoáng Ẩm độ tương đối cần thiết là 40 – 70% Cấu tạo giá thể quá ẩm và úng thì bộ rễ sẽ bị thối và biểu hiện là cây con mọc ra từ phần ngọn của thân [19]

1.1.2.3 Ánh sáng

những loài yêu cầu ánh sáng tới 80 – 90 % Nhờ đó mà chúng phát triển được các giả hành thật mạnh mẽ, tất nhiên không để ánh nắng chiếu trực tiếp có thể làm cháy lá [16] Nếu thừa ánh sáng cây sẽ bị vàng lá, giả hành bị teo lại, cây xấu đi nhưng cây sẽ thích nghi dần, vẫn ra hoa nhiều và đẹp Nếu thiếu ánh sáng, cây sẽ bị thoái hóa rõ rệt, cây

èo uột và số lượng hoa sẽ ít đi [20]

1.1.2.4 Nhu cầu dinh dưỡng

có thể dùng nhiều dạng phân bón khác nhau Còn các loại Dendrobium thân thòng hấp thu phân chậm nên phải dùng nồng độ thật loãng

Các loại phân hữu cơ như: phân heo, bánh dầu khô, phân tôm cá, phân trâu có thể dùng rất tốt bằng cách phân bò khô pha loãng với nước rồi tưới, hoặc vò chặt từng viên đặt trên bề mặt giá thể, rễ lan sẽ hấp thụ dần dần các dưỡng chất được phóng thích qua quá trình tưới nước Các loại phân vô cơ được dùng thường có công thức

30 – 10 – 10 dùng 3 lần/tuần với nồng độ 1 muỗng cà phê/4 lít Trong suốt mùa tăng trưởng, ta bón phân 10 – 20 – 30 làm 2 lần/tuần để tạo một sức chịu đựng cho cây trước khi bước vào mùa nghỉ Trong mùa tăng trưởng nếu cây có nụ hoa, thay phân 30 –

10 – 10 bằng phân 10 – 20 – 20 với chu kỳ bón như trên cho đến khi hoa tàn Trong

mùa nghỉ hoàn toàn không bón phân cho Dendrobium, hay đúng hơn giảm và không bón phân cho Dendrobium khi cây hoàn tất thời kì tăng trưởng hằng năm của nó Thường

phân bón được dùng ở dạng hỗn hợp và bổ sung thêm các chất phụ gia là các sinh tố và các nguyên tố vi lượng

1.1.3 Các phương pháp nhân giống cây lan Dendrobium và Dendrobium mini

ngoài t ự nhiên

1.1.3.1 Giao phấn

Giao phấn trong tự nhiên là hiện tượng thông thường, gần như bắt buộc đối với

hầu hết các loài lan Đó là nguyên nhân vì sao họ lan có số lượng chủng loại rất phong phú Đó cũng là phương thức tồn tại, phát triển và tiến hoá ưu thế hơn cả của họ thực

vật này trong hướng thụ phấn nhờ côn trùng Việc giao phấn đều tạo ra những giống

mới, qua chọn lọc, có những đặc tính hơn hẳn cây bố mẹ

1.2 Sơ lược phương pháp nhân giống in vitro

1.2.1 Lược sử phát triển của công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là thuật ngữ mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ

phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường trong điều kiện vô trùng Đối tượng nuôi cấy bao gồm từ các cấu trúc có tổ chức như đỉnh sinh trưởng, chồi bất định, phôi đến các cấu trúc không có tổ chức như mô sẹo, dịch huyền phù tế bào, tế bào trần (protoplast) [18]

Năm 1665 Robert Hook quan sát được tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra khái niệm tế bào

Năm 1838 Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào Năm 1904 Hannig tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy phôi thực vật đầu tiên Năm 1924 Hình thành mô sẹo từ rễ cà rốt trong môi trường có acid lactic

Năm 1934 Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, một hormone thực vật đầu tiên có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào

Năm 1939 Gautheret, Nobecourt và White lần đầu tiên nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá

Năm 1946 Sự tạo cây đầu tiên từ đỉnh chồi ở Lupinus và Tropaeolum

Năm 1951 Nitsch lần đầu tiên nghiên cứu nuôi cấy noãn tách rời in vitro Skoog

nghiên cứu sử dụng các hoá chất điều hoà sinh trưởng và phát sinh cơ quan

Năm 1953 Tulecke lần đầu tiên thành công trong nuôi cấy bao phấn và tạo mô

sẹo đơn bội từ hạt phấn Ginkgo biloba

Năm Năm 1959 Tulecke và Nickell thử nghiệm sản xuất sinh khối thực vật quy

mô lớn (134 L) bằng nuôi cấy chìm

Năm 1962 Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật – môi trường MS

Năm 1969 Phân lập tế bào trần từ nuôi cấy tế bào dịch lỏng (huyền phù) của Hapopappus gracilis

Năm 1983 Công ty Mitsui Petrochemicals lần đầu tiên đã sản xuất chất trao đổi

thứ cấp trên quy mô công nghiệp bằng nuôi cấy tế bào dịch lỏng Lithospermum spp

Năm 1985 Flores và Filner lần đầu tiên sản xuất chất trao đổi thứ cấp từ nhân nuôi

cây tự nhiên [15]

1.2.2 Tầm quan trọng của phương pháp nhân giống in vitro

Phương pháp này có ý nghĩa vô cùng to lớn đối với việc nghiên cứu lý luận sinh

học cơ bản, đồng thời có giá trị đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống

- Về mặt lý luận sinh học cơ bản: đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu

sắc về bản chất của sự sống Thực tế đã cho phép tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh (meristem) rồi từ đó cho ra nhóm tế bào không chuyên hoá gọi là mô sẹo (callus) và từ mô sẹo thì có thể kích thích tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh

- Về mặt thực tiễn sản xuất: Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để phục tráng và nhân nhanh các giống cây trồng quí, có giá trị kinh tế cao Hiện nay phương pháp này đã

trở thành phổ biến và áp dụng trong công tác chọn giống cây trồng Ngoài ra, bằng phương pháp này chỉ sau thời gian ngắn có thể tạo được sinh khối lớn có hoạt chất sinh học được tạo ra vẫn giữ nguyên được hoạt tính của mình [13]

1.2.3 Điều kiện nhân giống in vitro

Yêu cầu cơ bản nhất của phòng nuôi cấy mô là phải đảm bảo vô trùng Khái niệm

vô trùng này bao gồm vô trùng môi trường nuôi cấy và cả sự bảo đảm sao cho mẫu nuôi cấy được hoàn toàn vô trùng

Các yêu cầu cơ bản của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật:

- Khi thiết lập phòng nuôi cấy mô thực vật phải đảm bảo được tính liên tục thuận

lợi cho các thao tác, các giai đoạn trong suốt quá trình nuôi cấy mô

- Đảm bảo được vệ sinh (tính vô trùng) của sản phẩm cuối cùng

- Chuẩn bị môi trường đúng cách, chọn đúng môi trường cho từng loại thực vật và

từng giai đoạn nuôi cấy

- Chọn và xử lý mô thích hợp trước khi cấy [10]

1.2.4 Các giai đoạn nuôi cấy mô thực vật

1.2.4.1 Giai đoạn 1: Chọn lựa và khử trùng mẫu

Mẫu cấy là mảnh thực vật được đặt vào môi trường nuôi cấy Để tiến hành nuôi

cấy in vitro thành công, khi lựa chọn mô cấy cần lưu ý tuổi sinh lý của cơ quan được

dùng làm mẫu cấy, vụ mùa lấy mẫu, chất lượng của cây lấy mẫu, kích thước và vị trí

1.2.4.2 Giai đoạn 2: Tạo thể nhân giống

Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân giống in

vitro T ạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên

của cây trồng Đối với những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường

bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác

1.2.4.3 Giai đoạn 3: Nhân giống in vitro

Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật bằng cách tăng sinh khối thể nhân giống Vật liệu nuôi cấy

là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể chồi, đôi khi hàm lượng chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh Cây nhân

giống in vitro ở trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời gian dài

1.2.4.4 Giai đoạn 4: Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh

Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá, rễ để chuẩn bị chuyển

ra vườn ươm Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi trường bình thường Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ Điều kiện nuôi cấy gần với điều kiện tự nhiên bên ngoài, là một bước

làm thích nghi trước khi tách khỏi điều kiện in vitro Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu

tố: hàm lượng auxin nội sinh, ánh sáng, sức trẻ hóa của mẫu, kiểu di truyền Người ta

thường bổ sung auxin để kích thích quá trình ra rễ in vitro

1.2.4.5 Giai đoạn 5: Chuyển cây con ra vườm ươm

Cây con được ra rễ được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt trong

chiếu sáng thấp…Trong những ngày đầu cần phủ nilon để tránh sự thoát hơi nước ở lá

Rễ cây trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần dần lụi đi và rễ mới xuất hiện Cây con thường được xử lý ra rễ bằng cách ngâm rễ hay phun lên lá các hợp chất kích thích ra

rễ ở nồng độ thấp để rút ngắn thời gian ra rễ

Đây là giai đoạn rất quan trọng trong quá trình nhân giống vô tính vì cây con

thường bị chết do sự khác biệt về điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro

1.2.5 Những ưu điểm và khó khăn trong nhân giống in vitro

1.2.5.1 Ưu điểm

Nhân giống in vitro có những ưu điểm sau:

- Tạo các cây con đồng nhất và giống cây mẹ So với kiểu nhân giống thông thường (chiết cành, hom), nhân giống bằng nuôi cấy mô có ưu điểm là có thể nhân một

số lượng cây con lớn từ một cá thể ban đầu trong một thời gian ngắn Không chiếm nhiều diện tích trồng Có thể cung cấp cây giống bất cứ thời điểm nào vì chủ động

được, do không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh và tạo ra các cây con sạch bệnh bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng kết hợp xử lý nhiệt và vi ghép trong ống nghiệm và nhân được các giống mới bằng kỹ thuật cứu phôi, chuyển gen

Một số cây quí có thể nhân nhanh để đưa vào sản xuất và việc trao đổi giống được dễ dàng [3]

- Ngoài ra, kỹ thuật nuôi cấy mô còn giúp cho việc nhân giống hữu tính các đối

tượng quí mà với kỹ thuật nhân giống thông thường khó thực hiện được (như trường hợp gieo hạt lan) Ngày nay đã có nhiều công thức môi trường gieo hạt cho từng loại

lan [14]

1.2.5.2 Khó khăn

Tuy nhân giống in vitro đạt được những thành tựu to lớn nhưng cạnh đó đã gặp

không ít khó khăn, theo Nguyễn Văn Uyển và cs (1984) thì có một số khó khăn sau:

- Nhân giống trên môi trường agar thì giá thành sản xuất vẫn còn cao và thời gian nhân giống dài Khi sản xuất ở qui mô công nghiệp thì chi phí cho năng lượng và nhân công vẫn còn ở mức cao

- Đôi khi xảy ra biến dị soma trong quá trình nuôi cấy, đặc biệt là tái sinh thông qua mô sẹo

- Giới hạn sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống do cây con tạo ra thường đồng nhất về mặt di truyền Quá trình nhân giống phức tạp Tính bất định về mặt di truyền

- Nhân giống in vitro là tạo quần thể đồng nhất với số lượng lớn Tuy nhiên trong

một số trường hợp phương pháp này cũng tạo ra biến dị soma, mà tế bào mô sẹo thì có nhiều biến dị hơn so với đỉnh chồi Những nhân tố thường gây ra biến dị soma là [10]: + Kiểu di truyền: các loài cây khác nhau thì tạo ra các biến dị khác nhau, nói chung cây càng có mức độ bội thể cao thì càng dễ biến dị

+ Số lần cấy chuyền: số lần cấy chuyền càng nhiều thì độ biến dị càng cao Khi nuôi cấy dài hạn thường gây ra biến dị nhiễm sắc thể

+ Ngoài ra, khi cấy chuyền nhiều lần, môi trường phát triển các chồi ngang có thể chuyển sang tạo ra các bất định Kết quả là có thể tạo ra các biến dị tế bào soma Vì vậy, cây con tạo ra không đồng nhất Đối với mục đích vi nhân giống, sự tạo chồi

ngang là kỹ thuật thích hợp đang được sử dụng Theo nguyên tắc, cách này tạo ra đúng kiểu cây

1.2.6 Sơ lược các kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô thực vật

1.2.6.1 Nuôi cấy phôi

Sự ghi nhận đầu tiên về nuôi cấy phôi là công trình của Charles Bonnet ở thế kỷ

lùn Từ đầu thế kỷ XX, các công trình nuôi cấy phôi dần được hoàn thiện hơn Từ các

trong môi trường chứa đường và khám phá ra một điều là nếu thiếu đường thì phôi không thể phát triển thành protocorm

Raghavan (1976, 1980) đã công bố rằng phôi phát triển quan hai giai đoạn dị dưỡng và tự dưỡng Ở giai đoạn dị dưỡng (tiền phôi) cần có các chất điều hòa sinh trưởng để phát triển Trong giai đoạn tự dưỡng, sự phát triển của phôi không cần chất điều hòa sinh trưởng

Đối với nuôi cấy phôi, như đã biết đường đóng vai trò rất quan trọng Trong nhiều trường hợp thì đường sucrose cho kết quả tốt hơn các loại đường khác Ngoài ra một

số chất tự nhiên như nước dừa, nước chiết malt, casein thủy phân, là những chất rất

cần trong nuôi cấy phôi Các chất kích thích sinh trưởng như GA3, auxin, cytokinine thường được dùng nhiều trong nuôi cấy phôi Auxin thường dùng ở nồng độ thấp, kinetin có vai trò đặc biệt cho sự phát triển của phôi

Các yếu tố ngoại cảnh như ánh sáng, nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến sự phát triển

phôi phát triển tự nhiên [7]

1.2.6.2 Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời

Wetmore (1946) nuôi cấy đỉnh chồi cây nho dại, cùng với một số tác giả khác, ông

đã chứng minh các bộ phận của cây đều có thể nuôi cấy khi gặp điều kiện thuận lợi Lon và Ball (1946) với thí nghiệm nuôi cấy đỉnh chồi cây măng tây đã cho thấy khi nuôi cấy các bộ phận của cây như lá, thân, hoa thì khả năng tạo mô sẹo nhiều hơn Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây là khác nhau nhưng có thể thấy một số yêu cầu chung như nguồn carbon dưới dạng đường và các

muối của các nguyên tố đa lượng (nitơ, phospho, kali, canci…) và vi lượng (Mg, Fe,

Mn, Co, Zn…) Ngoài ra cần một số chất đặc biệt như vitamin (B1, B6, B3…) và các

chất điều hòa sinh trưởng Muốn duy trì sinh trưởng và phát triển của cơ quan nuôi cấy

Đối với nuôi cấy mô, ngoài những thành phần dinh dưỡng như đối với nuôi cấy cơ

đường và inositol Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quan trọng hơn vì các mô tách rời không có khả năng tổng hợp các chất này [7]

1.2.6.3 Nuôi c ấy mô phân sinh

Mô phân sinh thường là các mô đỉnh chồi và cành Các mô phân sinh dùng để nuôi

cấy thường tách từ các mầm non, các chồi mới hình thành hay các cành non

Đối với nuôi cấy mô phân sinh sự cân bằng giữa các chất điều hòa sinh trưởng rất quan trọng Muốn kích thích tạo chồi cần bổ sung cytokinine hoặc tổ hợp cytokinine

Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng để loại virus tạo cây sạch virus và nhân giống in vitro Nuôi cấy mô phân sinh còn được sử dụng để nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan, tạo cây đa bội qua xử lý colchicin [7]

1.2.6.4 Nuôi cấy bao phấn

Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn đã phát triển và hoàn thiện nhờ công trình nghiên cứu

của Bourgin và Nitsch (1967) trên cây thuốc lá, Niizeki và Oono (1968) trên lúa Từ cuối những năm 1970 đã nhận được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn trên 30 loại cây

Kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy hạt phấn nuôi cấy có thể phát triển

thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng con đường tạo

phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tạo mô sẹo và tạo cơ quan [7]

1.2.6.5 Nuôi c ấy tế bào đơn

Ngoài khả năng nuôi cấy các cơ quan và mô thực vật, tế bào thực vật có thể được tách và nuôi riêng rẽ trong môi trường phù hợp Những công trình về nuôi cấy tế bào đơn được tiến hành từ những năm 50 của thế kỷ XX

Tế bào đơn có thể nhận được bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý enzyme Mỗi

loại cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy khác nhau

Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc tế bào, nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện khác nhau lên quá trình sinh trưởng, phát triển và phân hóa

của tế bào Nuôi cấy tế bào đơn còn được sử dụng trong chọn dòng tế bào [7]

1.2.6.6 Nuôi cấy protoplast

Nuôi cấy protoplast được phát triển nhờ công trình của Cocking (1960) Ông là người đầu tiên dùng enzyme để thủy phân thành tế bào và tách được protoplast từ tế bào rễ cà chua Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast có thể tái sinh thành tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh

Do không có thành tế bào nên protoplast trở nên một đối tượng lý tưởng trong nghiên cứu biến đổi di truyền ở thực vật Bằng phương pháp dung hợp hai protoplast

protoplast để chuyển các bào quan và chuyển gen [7]

Hình 1.3 Một số kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật [7]

a) Mô sẹo từ Catharanthus roseus b) Nuôi cấy dịch tế bào từ Coryphanta spp

c) Nốt sần C roseus d) Đầu rễ từ C roseus e) Tái sinh cây từ C roseus callus f) Protoplast từ Coffea arabica g) Vi nhân giống của Agave tequilana h) Phôi vô tính

của cây Coffea canephora i) Nuôi cấy rễ cây Psacalium decompositum

1.2.7 Các phương pháp nhân giống in vitro cho lan Denrdobium

1.2.7.1 Nhân giống bằng chồi nách

Chồi nách nhô từ vị trí bình thường trong nách lá mang đỉnh sinh trưởng phụ có

khả năng mọc thành chồi giống như thân chính Khi các mẫu cấy là chồi được giảm ưu thế ngọn sẽ dẫn tới sự tự sản xuất chồi nách ở mỗi lá hay ở cả nách lá Trong nhiều

loại cây trồng, chồi nách xuất hiện tùy vào sự cung cấp cytokinine, chồi nách thường

xuất hiện sớm và phát triển thành chồi bậc hai, bậc ba … Khi các cụm chồi này phát triển chúng ta có thể phân tách để cấy chuyền trong môi trường mới Nói chung kỹ thuật tăng sinh bằng chồi nách được áp dụng cho bất kỳ cây trồng và phản ứng với cytokinine như BAP, Zip và Zeatin [8]

1.2.7.2 Nhân giống bằng chồi đỉnh

Sự thành công trong nuôi cấy đỉnh chồi thay đổi tùy theo mẫu cấy sử dụng và việc

áp dụng kích thích tố riêng biệt Kích thước đỉnh chồi nhỏ (0.1 mm – 0.5 mm) thường khó cắt và cho tỉ lệ sống thấp, nhưng nó lại quan trọng trong việc phát triển nguyên

liệu gốc sạch bệnh Những kích thước đỉnh chồi từ 0.5 mm – 2 mm thì thông dụng hơn

và thích hợp trong việc nhân giống Thường nuôi cấy đỉnh chồi trong môi trường có

chứa auxin kết hợp với cytokinine, nồng độ cytokinine sẽ tăng lên trong những lần cấy chuyền [8]

1.2.7.3 Nhân giống bằng chồi bất định

Chồi bất định là một cấu trúc thân và lá mọc lên một cách tự nhiên trên mô cây trồng, ở vị trí khác với nách lá bình thường Một số các nguyên liệu nuôi cấy gồm: lá,

vẩy, cuống lá … Mặc khác các chồi mới có thể phát triển gián tiếp từ callus hình thành trên mặt cắt của mẫu cấy Chồi nhô lên từ ngoại biên của callus và không liên hệ trực tiếp tới mô mạch của mẫu cấy Tuy nhiên chồi bất định có thể làm tăng tỉ lệ cây bị biến

dị [8]

1.2.7.4 Nhân giống qua nuôi cấy callus

Nuôi cấy mô hay tế bào sẽ sinh ra mô sẹo (qua sự cảm ứng phát sinh cơ quan hay

phôi) là phương pháp nhân giống in vitro có khuynh hướng cho giá trị thấp Nuôi cấy

callus và tế bào đơn cho tần số biến dị cao hơn so với nuôi cấy chồi đỉnh [8]

1.2.7.5 Nhân giống bằng các đoạn giả hành

Chọn những cây lan in vitro từ 5-6 tháng tuổi, sau đó cắt giả hành thành những

đoạn có chiều dài khoảng 5mm và đem nuôi cấy trên những môi trường có bổ sung các

chất điều hoà sinh trưởng [8]

1.2.7.6 Nuôi cấy hạt lai

Khi đã dự đoán kết quả của một phép lai, người ta mạnh dạn nhân giống hỗn hợp

giữa vô tính và hữu tính để rút ngắn thời gian và tạo một số lượng cây giống lớn [8]

1.2.7.7 Dung hợp tế bào trần

Việc tạo giống vô tính theo các phương pháp lai tế bào đã được tiến hành ở một số phòng thí nghiệm, còn gọi là phương pháp dung hợp tế bào trần Một hướng khác là gây đột biến trong ống nghiệm bằng các tác nhân vật lý và hóa học Đây cũng là một hướng tạo giống hiện đại và tốn kém Đơn giản hơn, người ta có thể tạo ra những

giống mới nhờ việc nhân cấy đỉnh sinh trưởng và tạo ra những điều kiện để gây ra những thay đổi đặc điểm di truyền của các tế bào cơ thể bình thường (đột biến soma) như các dạng đột biến sinh lý, đa bội Trong việc nhân giống vô tính, nhược điểm lớn

nhất là cây mẹ có thể bị nhiễm các dạng bệnh virus Nếu không tuyển chọn và kiểm tra

kỹ lưỡng sẽ cho ra đời hàng loạt cây con có chứa mầm bệnh [8]

1.3 Sơ lược về phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL)

thành công trong nhân giống nhiều loài thực vật, cây cảnh Nuôi cấy lát mỏng tế bào là một phương pháp cho nhiều ưu thế hơn các phương pháp nhân giống in vitro truyền

thống khác

thực vật như thân, lá, rễ, hoa, các bộ phận của hoa…Có hai loại lớp mỏng tế bào:

- Nếu cắt theo chiều dọc (ký hiệu lTCL) ta được mẫu cấy chỉ bao gồm một loại tế bào như lớp đơn của tế bào biểu bì hoặc một vài lớp của tế bào vỏ

- Nếu cắt theo chiều ngang (ký hiệu tTCL) ta được mẫu cấy bao gồm nhiều loại tế bào như biểu mô, vỏ, vùng thượng tầng, mô mạch cũng như nhu mô…

Sự phát triển và biệt hóa của các tế bào thực vật đều bị chi phối bởi chương trình điều khiển sự biệt hóa và phát sinh hình thái của cơ thể thực vật Nếu cắt mô thành

những lớp mỏng chừng vài lớp tế bào và đặt vào môi trường nuôi cấy thích hợp thì chúng có thể thoát khỏi sự ức chế và có khả năng phát sinh hình thái một cách độc lập thông qua sự tái lập trình các thông tin di truyền trong tế bào

Đặc điểm mỏng của lớp tế bào nuôi cấy giúp hạn chế sự tương tác giữa các lớp tế bào lân cận, làm giảm sự phân cực của tế bào, nhanh chóng tạo ra một chương trình

biệt hóa và đồng nhất các mô Vị trí lát cắt, loại cơ quan hay kích thước mô khác nhau cũng có thể làm thay đổi chương trình biệt hóa của tế bào khi nuôi cấy trên cùng một loại môi trường

Nuôi cấy lớp mỏng tế bào có nhiều ưu thế và được ứng dụng thành công trên nhiều loài cây khác nhau như African violet (Saintpaulia ionantha); thu hải đường

(Begonia rex), hoa cúc (Dendranthema x grandiflora)… Phương pháp này còn được ứng dụng trong các nghiên cứu sinh lý học, mô học, cũng như trong nghiên cứu kiểu gen của sự tạo hình hoa, chồi và phôi sinh dưỡng Phương pháp này cũng rất hữu hiệu trong nghiên cứu sự phát sinh cơ quan in vitro của các loài cây thân gỗ như tre

(Bambusa spp.), khoai mì (Manihot esculenta), cây thông (Pinus radiate)…[6]

Ở Việt Nam trong những năm gần đây cũng đã ứng dụng phương pháp nuôi cấy

lớp mỏng tế bào rất nhiều trong nghiên cứu phát sinh hình thái thực vật và trong kỹ thuật nhân giống thực vật Chẳng hạn như vi nhân giống cây cảnh (hoa lan, Lay ơn, Thu hải đường, hoa Đồng tiền…

1.4 Sơ lược phương pháp nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng lắc (nuôi cấy dịch treo tế bào)

biệt hóa, trong môi trường lỏng và được chuyển động trong suốt thời gian nuôi cấy Ta cũng có thể nuôi cấy mảnh mô đã biệt hóa, khi đó thời gian nuôi cấy sẽ kéo dài hơn và

khác nhau, ngoài ra còn có các tế bào đang phân chia và những tế bào chết

Danh từ xốp (friability) dùng để chỉ những tế bào tách rời nhau sau khi phân chia Mức độ tách rời tế bào phụ thuộc khả năng tạo nhiều tế bào xốp và được điều khiển

bởi môi trường Tăng tỉ lệ cytokinin/ auxin sẽ sản xuất nhiều tế bào xốp

Những tế bào trải qua quá trình nuôi cấy và sinh trưởng trong dịch huyền phù gọi

là dòng tế bào Dòng tế bào có những đặc điểm sau:

- Khả năng tách tế bào cao

- Phát sinh hình thái đồng nhất

- Nhân to và tế bào chất đậm đặc

- Nhiều hạt tinh bột

- Có những dẫn liệu tạo cơ quan

- Có khả năng nhân đôi trong 24 – 72 giờ

- Mất tính toàn năng

- Tăng mức đa bội thể

Nuôi cấy tế bào thực vật trong điều kiện in vitro để sản xuất các chất tự nhiên có

một số ưu điểm sau:

- Các tế bào thực vật có thể được nuôi cấy trong các điều kiện nhân tạo mà không

lượng lớn các nguyên liệu thô

- Có thể kiểm soát chất lượng và hiệu suất của sản phẩm bằng cách loại bỏ các

trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật, như là chất lượng của nguyên liệu thô và sự đồng nhất giữa các lô sản xuất

- Một số sản phẩm trao đổi chất có thể được sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền phù

có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh

- Một số sản phẩm trao đổi chất có thể được sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền phù

có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh

Chúng ta có thể sử dụng kinh nghiệm và kiến thức từ nuôi cấy vi sinh vật để áp dụng cho nuôi cấy tế bào thực vật Tuy nhiên, vì tế bào thực vật và vi sinh vật vẫn có các đặc điểm khác nhau, nên cần phải cải biến và điều chỉnh các điều kiện nuôi cấy để tìm được các yêu cầu đặc thù cho nuôi cấy tế bào thực vật [7]

1.5 Giới thiệu về phôi soma và protocorm like bodies (PLBs)

1.5.1 Gi ới thiệu về phôi soma

Khái niệm: Phôi vô tính (hay phôi soma) là các thể nhân giống (propagule) có cực tính bắt nguồn từ các tế bào dinh dưỡng (thường là một tế bào đơn hay một nhóm tế bào),

bao gồm cả phần mô phân sinh ngọn và mô phân sinh gốc, do đó có thể hình thành chồi

và rễ

Đặc điểm : Phôi soma thường là một tế bào đơn và dễ dàng được tách ra khỏi mẫu

cấy để tiếp tục nhân giống để hình thành cây con in vitro hoàn chỉnh

Phôi soma bao gồm: phôi soma trực tiếp và phôi soma gián tiếp

- Phôi soma trực tiếp: Được hình thành trực tiếp từ một tế bào hoặc một nhóm tế bào

mà không qua sự hình thành callus

- Phôi soma gián tiếp: Hình thành chủ yếu từ callus

Vai trò:

- Phôi vô tính giúp cho công tác vi nhân giống và sản xuất với số lượng lớn thực vật

bằng bioreactor

- Tạo hạt nhân tạo

- Là nguyên liệu cho việc chuyển gen ở thực vật

- Công nghệ nuôi cấy tế bào trần [8]

1.5.2 Giới thiệu về PLBs

Trong nuôi cấy lan in vitro thường dùng đến thuật ngữ protocorm dùng để chỉ các

cấu trúc chuyển tiếp giữa sự nảy mầm và cây con, có hình cầu hay hình trứng, với một

số lông hấp thu đơn bào ở phần gốc và một mô phân sinh ngọn ở đỉnh Protocorm của phần lớn lan biểu sinh nhiệt đới có khả năng phát triển thành chồi trực tiếp và lớp tiền

bì (protoderm) xuất hiện sớm trong sự biệt hóa phôi [21]

PLBs là thuật ngữ dùng để chỉ các cá thể có cấu trúc tương tự protocorm được hình thành từ mô sẹo nuôi cấy in vitro Quá trình hình thành PLBs có thể thu được bằng cách

cắt nhỏ các protocorm hay các bộ phận khác nhau của cây như : lá, chồi, chóp rễ, phát hoa… và cấy lên môi trường tạo PLBs Sự hình thành PLBs bằng hình thức nuôi cấy in

Hình 1.4 PLBs được hình thành từ phương pháp tTCL

1.6 Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Thực vật cần các chất hữu cơ như protein, glucid, lipid…để cấu tạo nên tế bào,

mô, và cung cấp năng lượng cho hoạt động sống Bên cạnh đó, chúng còn cần các chất

vai trò rất quan trọng trong việc điều chỉnh các quá trình sinh trưởng, phát triển và các hoạt động sinh lý khác của thực vật Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật là những

có tác dụng điều tiết (kích thích hay ức chế) quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật Chính vì vậy, chúng có vai trò hết sức quan trọng trong nuôi cấy mô Các

chất điều hòa sinh trưởng thường được sử dụng là:

nhiều mặt lên các quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng của thực vật, sự sinh trưởng của quả, tạo quả không hạt, kích thích sự tạo thành rễ hoặc phối hợp với cytokinine để kích thích tạo mô sẹo

- Cytokinine: Thường sử dụng BA, kinetin hoặc nước dừa trong nuôi cấy mô

Hiệu quả sinh lý đặc trưng nhất là kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ, ảnh hưởng

rõ rệt lên sự phân hóa cơ quan thực vật, đặc biệt là phân hóa chồi Cytokinine làm yếu

trong một số trường hợp còn ảnh hưởng lên sự nảy mầm của hạt và củ

- Giberellin: Có tác dụng kích thích sự kéo dài lóng do sự phân chia của tế bào thân và kích thích sự tăng trưởng lá ở nồng độ cao Ngoài ra còn kích thích sự nảy

1.7 Một số chất hữu cơ dùng trong nuôi cấy in vitro

Nguồn carbon (sucrose, glucose hay fructose) là thành phần rất quan trọng trong

môi trường nuôi cấy in vitro

Khoai tây: Khoai tây được sử dụng làm nguồn carbohydrate bổ sung bên cạnh thành phần đường saccharose cho chồi và cây trong điều kiện in vitro Trong 100g khoai tây có chứa 17,47g carbohydrate; 0,78g đường, các thành phần vi lượng như Ca,

Fe, Mg, Zn, vitamin B6, thiamin…

Thành phần chuối xiêm chín gồm tinh bột chuyển thành đường gần như hoàn toàn, rất giàu Mg, Ca, P… Trong 100g chuối chứa 22,84g cacbonhidrat; 12,23g đường; 0,031mg Thiamin nên được dùng làm nguồn carbohydrate

Nước dừa: nước dừa được dùng làm nguồn cung cấp chất điều hòa sinh trưởng hỗ

trợ cho các chất điều hòa sinh trưởng tinh sạch Thành phần nước dừa đa dạng, phong phú, chủ yếu là các acid amin như Glycine, Tryptophan, Lysine…, các chất điều hòa sinh trưởng ở dừa non gồm: Auxin, nhiều loại cytokinin, Gas và ABA; dừa già gồm: Auxin, ABA, salicylic acid [23]

Cơm dừa (nhũ dừa, sữa dừa): có nhiều công trình nghiên cứu những hợp chất có trong nước dừa, một dạng phôi nhũ lỏng từ Coos nucifera Nước dừa là chất lỏng lấy

từ dừa non Khi dừa già chất lỏng này sẽ tạo thành chất sánh đặc gọi là sữa dừa Nước dừa chính là phần được sử dụng như sữa dừa ở môi trường nuôi cấy mô [10]

Bã đậu phộng: bã đậu phộng (bánh dầu phộng) là phần xác hạt đậu phộng sau khi được ép lấy dầu Thành phần bánh dầu sau khi đã ép lấy dầu vẫn còn protein, carbohydrate, chất xơ…

1.8 Một số công trình nghiên cứu về lan Dendrobium in vitro

1.8.1 Trong nước

trưởng đến quá trình nuôi cấy in vitro của hai giống lan Dendrobium và Cymbidium

Kết quả cho thấy môi trường bổ sung TDZ nồng độ 1 mg/l và NAA nồng độ 0,5 mg/l

có khả năng nhân giống in vitro cao nhất: từ 1 mẫu cấy sau 90 ngày đã cho 10,22 chồi,

9,44 phôi soma và 10,44 protocorm [8]

Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2009) đã tiến hành nhân giống lan Dendrobium

anosmum, Dendrobium mini bằng phương pháp nuôi cấy mô và nghiên cứu các loại giá thể trồng lan Dendrobium mini thích hợp và cho hiệu quả cao Kết quả đối với

chồi: Chồi lan Dendrobium mini phát triển và nhảy chồi rất tốt trên môi trường có bổ

sung 1 mg/l BA: đạt 3,8 chồi, chồi cao 1,26 cm sau 2 tháng nhân chồi Môi trường MS/2 + 0,2 mg/l NAA cho kết quả ra rễ tốt đối với lan Dendrobium mini Sau 2 tháng,

chồi lan tạo rễ tốt thành cây hoàn chỉnh để đưa ra vườn ươm Sau 4 tháng nuôi cấy đã

cho ra được cây lan con Dendrobium mini hoàn chỉnh có thể đưa ra ngoài vườn trồng

[5]

Nguyễn Thanh Tùng và cộng sự (2010) đã áp dụng phương pháp nuôi cấy lát

mỏng tế bào trong nhân giống in vitro cây lan hoàng thảo thân gãy (Dendrobium

aduncum) Kết quả cho thấy môi trường MS bổ sung kinetin 3,0 mg/l kết hợp với NAA 0,3 mg/l cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất đạt 5,67 chồi/mẫu sau 6 tuần nuôi cấy Các chồi phát triển tốt thu được từ các thí nghiệm trên có thân mập, chiều cao

bổ sung NAA từ 0,5 - 2,0 mg/l để khảo sát khả năng hình thành rễ Kết quả cho thấy

nồng độ NAA 2,0 mg/l là thích hợp nhất cho việc tạo rễ in vitro (9,18 rễ/chồi) sau 4

tuần nuôi cấy [19]

1.8.2 Trên thế giới

Dendrobium moschatum trên môi trường có bổ sung kết hợp BA và NAA tại các nồng

độ (BA =0,0.5mg/l;1.0mg/l;2.0mg/l;3.0mg/l) với (NAA = 0; 0.5mg/l; 1.0mg/l;

2.0mg/l; 3.0mg/l) và kết quả thu được cao nhất tại môi trường có bổ sung BA = 3.0mg/l và NAA = 2.0mg/l là 8,4 protocorm

5,0mg/l) kết hợp với NAA (nồng độ từ 0 đến 2,0mg/l), kết quả công thức bổ sung BA

nuôi cấy [23]

Talukder và cộng sự (2003) đã nuôi cấy chồi lan Dendrobium trên môi trường có

kết quả công thức bổ sung BA nồng độ 2,5mg/l và NAA nồng độ 0,5mg/l có số chồi cao nhất (1,9 chồi) sau 40 ngày nuôi cấy [22]

Dendrobium Candidum cho thấy khả năng tái sinh chồi tốt nhất đạt được trên môi

chồi/mẫu)

Panjan sujjaritthurakarn và Kamnoon kanchanapoom (2011) đã đánh giá sự hình thành PLB (protocorn-like body) trực tiếp từ cơ quan cây Dendrobium mini bằng cách sử

17,6 hoặc 22 μM (tương đương với 1,2,3,4 hoặc 5 mg/l) và TDZ nồng độ 4.5, 9, 13,5,

18 hoặc 22,5 μM (tương đương với 1, 2, 3, 4 hoặc 5 mg/l) trong bình tam giác 100 ml, được lắc vòng với vận tốc lắc 120 vòng/phút Sau 9 tuần nuôi cấy, môi trường MS bổ

3.6 PLB/ mỗi protocorm ban đầu

CHƯƠNG 2

V ẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 V ật liệu

2.1.1 Vật liệu nuôi cấy

Giống lan sử dụng nghiên cứu trong đề tài này là giống Dendrobium mini lai

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị: Cân phân tích, máy đo pH, bếp điện, tủ cấy vô trùng, tủ sấy, tủ lạnh để

trữ hóa chất, nồi hấp autoclave, máy cất nước, máy lắc

Dụng cụ: chai thủy tinh 100ml; bình tam giác (250ml, 500ml); cốc thủy tinh (100ml, 250ml, 500ml, 1000ml); bình định mức (20ml, 100ml, 250ml, 500ml); đĩa petri; ống đong; pipetman; đũa thủy tinh; dao cấy; kẹp dài 25 – 30cm; đèn cồn; bình xịt cồn; bông gòn không thấm và các dụng cụ khác

2.1.3 Hóa ch ất

thực vật Thành phần hóa chất pha môi trường MS:

- Khoáng đa lượng KNO3, NH4NO3, CaCl2.2H2O, MgSO4.7H2O, FeSO4.7H2O,

2.2 Môi trường và điều kiện nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy là môi trường MS bổ sung 30g/l sucrose; 30g/l khoai tây (*)

, 20% nước dừa, 0,5g/l than hoạt tính 6,5g/l agar (khi nuôi cấy trên môi trường rắn); pH

= 5,9 (được điều chỉnh bằng NaOH 2% hay HCl 2%) Môi trường được hấp khử trùng

2.3 N ội dung nghiên cứu

Khảo sát quy trình khử trùng mẫu

Khảo sát môi trường cảm ứng tạo chồi

Khảo sát môi trường nhân chồi Dendrobium mini lai trong điều kiện in vitro

Khảo sát môi trường tạo cây lan con Dendrobium mini lai hoàn chỉnh trong điều

kiện in vitro

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Nội dung 1: Khảo sát phương pháp khử trùng mẫu

Thí nghi ệm 1: Khảo sát phương pháp khử trùng mẫu

 V ật liệu

Chồi non của cây lan con Dendrobium mini lai ngoài nhà lưới cao 3 – 10 cm Môi trường nuôi cấy: MS bổ sung 30g/l sucrose, 30g/l khoai tây, 20% nước dừa, 6,5g/l agar, 0,5g/l than hoạt tính pH điều chỉnh ở mức 5,8

Hóa chất khử trùng: xà phòng, cồn 70o, nước cất vô trùng

 B ố trí thí nghiệm

Thí nghiệm gồm 8 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức cấy 3 bình, mỗi bình 6 mẫu

Tổng số bình là 24 bình Tổng số mẫu là 144 mẫu Số lần lặp lại thí nghiệm là 3 lần.Trong các nghiệm thức, thời gian khử trùng với cồn 70o là không thay đổi; khử trùng với nồng độ Javenvà thời gian khử trùng là khác nhau

B ảng 2.1 Nồng độ Javen và thời gian khử trùng mẫu

5 70% 10 phút

Chồi lan non rửa bằng xà phòng, cồn 70o

,Javen và rửa lại bằng nước cất vô trùng 4-5 lần; sau đó cắt bỏ phần dập, tách bỏ cuống lá Các lát mỏng khoảng 2 - 3 mm cắt

từ mẫu sạch sau đó được đặt trên môi trường nuôi cấy

Quy trình khử trùng chung được thực hiện theo sơ đồ sau:

Chuyển mẫu vào tủ cấy vô trùng

Chồi lan non ngoài vườn sạch bệnh cao từ 3 – 10 cm Cắt tận gốc, rửa dưới vòi nước sạch bụi đất

Cắt bớt lá và bao lá của chồi

Lắc với xà phòng Lifebuoy trong 10 phút Rửa sạch xà phòng bằng nước cất Lắc với nước cất vô trùng 3 lần

Lắc với cồn 70o

trong 1 phút

Lắc với nước cất vô trùng 3 - 4 lần

Lắc với Javen với nồng độ và thời gian khác nhau

Lắc với nước cất vô trùng 3 - 4 lần

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình khử trùng mẫu

 Ch ỉ tiêu theo dõi

Tỉ lệ mẫu sống (%)

2.4.2 Nội dung 2: Khảo sát các loại môi trường nuôi cấy cảm ứng tạo chồi lan

Dendrobium mini lai

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng thành phần các loại môi trường nuôi cấy cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai

 V ật liệu

Chồi cây in vitro

Môi trường nuôi cấy: môi trường MS (Murashige – Skoog, 1962), môi trường

có bổ sung 30g sucrose; 30g khoai tây; 20% nước dừa; 0,5g/l than hoạt tính; 6,5g agar;

pH môi trường điều chỉnh mức 5,8

 B ố trí thí nghiệm

MS, môi trường Gamborg B5 và môi trường WPM Quan sát và ghi nhận kết quả Mỗi môi trường cấy 3 bình, mỗi bình 6 mẫu Tổng số bình là 9 bình Tổng số

mẫu là 54 mẫu Số lần lặp lại thí nghiệm là 3 lần

 Ch ỉ tiêu theo dõi