NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA CHO PROTEIN VỎ (CP) CỦA VIRUS KHẢM VÀNG (CYMBIDIUM MOSAICVIRUS) VÀO PROTOCORM LAN DENDROBIUM SONIA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Mà HÓA CHO PROTEIN VỎ (CP) CỦA VIRUS KHẢM VÀNG (CYMBIDIUM MOSAICVIRUS) VÀO PROTOCORM LAN DENDROBIUM SONIA Ngành học Sinh viên Niên khóa : CƠNG NGHỆ SINH HỌC : NGUYỄN THỊ THANH THẢO : 2009 – 2013 Tháng 06/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Mà HÓA CHO PROTEIN VỎ (CP) CỦA VIRUS KHẢM VÀNG (CYMBIDIUM MOSAICVIRUS) VÀO PROTOCORM LAN DENDROBIUM SONIA Hướng dẫn khoa học ThS NGUYỄN XUÂN DŨNG Sinh viên thực NGUYỄN THỊ THANH THẢO Tháng 06/2013 LỜI CÁM ƠN Con xin gửi lời chi ân đến bố mẹ đấng sinh thành, dưỡng dục, đồng hành ủng hộ suốt thời gian qua Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm, Ban giám đốc Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ chí Minh Q thầy, mơn Cơng Nghệ Sinh Học trường Đại học Nông Lâm Cùng anh, chị thuộc phòng Cơng Nghệ Sinh Học Thực vật Trung tâm Cơng Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Nguyễn Xuân Dũng người vơ tận tình dạy dỗ hướng dẫn em thực đề tài suốt thời gian vừa qua Em xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè người giúp đỡ, ủng hộ, động viên suốt thời gian em làm đề tài Tp Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng năm 2013 Sinh viên thực Nguyễn Thị Thanh Thảo i TÓM TẮT Bệnh virus gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng phát triển lan chưa có thuốc đặc trị Do đó, việc tạo giống lan có khả kháng virus vấn đề cấp thiết nay, phương pháp quan tâm để tạo lan kháng virus kỹ thuật chuyển gen RNAi thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciensđược nghiên cứu đề tài ‘‘Nghiên cứu chuyển gen mã hóa cho protein vỏ (cp) virus khảm vàng (cymbidium mosaicvirus) vào protocorm lan dendrobium sonia’’ Trong nghiên cứu này, chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58 mang vector chuyển gen thực vật pK7GWIWG2(II)/CP-CyMV, chứa cấu trúc RNAi gen mã hóa cho protein vỏ (CP) virus CyMV,được lây nhiễm đồng nuôi cấy với protocorm lan Dendrobium Sonia ngày Các protocorm sau lây nhiễm khử khuẩn cefotaxime 300 mg/l sàng lọc sơ mẫu giả định chuyển gen với kanamycin 500 mg/l DNA gen ly trích từ protocorm giả định chuyển gen sử dụng cho phản ứng PCR với cặp mồi đoạn gen để xác định protocorm có mang gen mục tiêu Kết cho thấy có mẫu DNA ly trích từ protocorm cho sản phẩm khuếch đại phù hợp kích thước với đoạn gen mục tiêu Điều chứng tỏ protocorm chuyển gen mục tiêu vào DNA gen ii SUMMARY Viral diseasescausedserious impacton the growthanddevelopmentoforchidsandstill nocure The creation of virus resistant orchidsisone of thepressing problemstoday, andAgrobacteriumtumefaciens mediated RNAi transgenictechnique is one ofthese methodsaremost interestedtocreatevirus resistant orchid “Transgenic research coding for envelope protein (cp) yellow mosaic virus (Cymbidium mosaic virus) in Dendrobium sonia protocorm” Inthis study, AgrobacteriumtumefaciensC58carryingplanttransgenicvector pK7GWIWG2(II) /CP-CyMV, bearingRNAi structuresofcoat protein gene(CP) ofCyMV, is infectedwithprotocormofDendrobiumSoniafor 4days Theprotocormdisinfectedafterinfectionwithcefotaxime300mg/landpreliminary screeningfor transgenicprotocorm withkanamycin500mg/l.GenomicDNAextractedfromtransgenicprotocormusedforPCRr eaction withprimersoftarget gene to identifyprotocormsthat have targetgene The resultsshowed thatamplifiedproduct of6samplesof protocorm extractedDNAhave size similar tothetarget gene This proves thattarget gene hasbeeninserted into genomic DNAof theseprotocorms Key words: orchids, protocorm, A.tumefaciens, D.Sonia, cost protein, CyMV, transgenic iii MỤC LỤC Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách hình viii Danh sách bảng biểu đồ ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Nội dung thực yêu cầu đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung lan Dendrobium Sonia 2.1.1 Nguồn gốc 2.1.2 Phân loại 2.1.3 Đặc điểm hình thái 2.2 Giới thiệu sơ lược vi khuẩn Agrobacterium 2.2.1 Phân loại 2.2.2 Đặc điểm hình thái vi khuẩn Agrobacterim 2.2.3 Cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium 2.3 Tổng quan virus khảm vàng 10 2.3.1 Đặc điểm hình thái cấu trúc 10 2.3.2 Tác hại, triệu chứng biểu CyMV lan 11 2.3.3 Tình hình nghiên cứu chuyển gen lan 13 2.4 Cơ chế chuyển gen thông qua Agrobacterium 15 2.5 Tổng quan RNA can thiệp 19 2.5.1 Giới thiệu RNA can thiệp 19 2.5.2 Một số khái niệm 21 2.5.3 Cơ chế hoạt động 24 2.5.4 Ứng dụng RNAi việc tạo trồng kháng virus 22 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 iv 3.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 24 3.2 Nội dung nghiên cứu 24 3.3 Vật liệu nghiên cứu 24 3.3.1 Vật liệu 24 3.3.2 Trang thiết bị dụng cụ 25 3.3.3 Hóa chất 25 3.3.4 Điều kiện thí nghiệm 25 3.4 Phương pháp nghiên cứu 26 3.4.1 Nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn 26 3.4.2 Chuyển gen CP vào protocorm 26 3.4.3 Sàng lọc protocorm kháng sinh Kanamycin 27 3.4.4 Phương pháp phát gen mục tiêu 28 3.5 Xử lý thống kê 29 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Chuyển gen CP vào protocorm 30 4.1.1 Giai đoạn đồng nuôi cấy 30 4.1.2 Giai đoạn khử khuẩn 31 4.2 Sàng lọc mẫu giải định chuyển gen 32 4.2.1 Ảnh hưởng nồng độ kanamycin 32 4.2.2 Sàng lọc mẫu giả định chuyển gen 33 4.3 Kiểm tra diện gen mục tiêu 35 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 5.1 Kết luận 36 5.2 Đề nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 v DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT A.tumefacien Agrobacterium tumefacien AS Acetosyringone CyMV Cymbidium mosaic virus DNA Deoxyribonucleic acid dsRNA double strand RNA hpRNA hairpin RNA ihpRNA hpRNA lặp lại với trình tự intron LB Left border LB Right Border MS Murashige and Skoog PCR Polymerase Chain Reaction PEG Polyethylene glycol PLB Protocorm like body Pri- mRNA primary- mRNA RB Right border RdRp RNA dependent RNA polymerase RISC RNA – incluced silencing complex RNAi RNA inteference siRNA small interfeing RNA T-DNA Tranferred DNA Ti-plasmid Tumor inducing plasmid Vir Virulence vi DANH SÁCH CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ VÀ HÌNH Bảng 4.1 Tỷ lệ chết protocorm môi trường kháng sinh 32 Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ chết protocorm môi trường kháng sinh 33 Hình 2.1LanDendrobium Sonia Hình 2.2 Vi khuẩn Agrobacterium kính hiển vi Hình 2.3 Cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium Hình 2.4Cấu trúc Ti-Plasmid Hình 2.5Vị trí Ti-plasmid tế bào vi khuẩn Hình 2.6 Cấu trúc dạng opine Hình 2.7Hình dạng virus CyMV 10 Hình 2.8 Cấu trúc gen virus CyMV 11 Hình 2.9Triệu chứng vệt hoại tử hoa lan Cattleya 12 Hình 2.10 Triệu chứng khảm vàng lan Hồ điệp 12 Hình 2.11 Sự thay đổi màu hoa petunia sau chuyển gen 19 Hình 2.12 Cơ chế hoạt động RNAi 22 Hình 3.1 Cấu trúc vector pK7GWIWG2(II)/CP-CyMV 24 Hình 4.1Protocorm lanDendrobiumSonia sau ngày nuôi cấy 30 Hình 4.2Protocorm Dendrobium Sonia mơi trường khử khuẩn 31 Hình 4.3Protocorm lanDendrobiumSonia mơi trường sàng lọc 34 Hình 4.4 PCR phát gen CP mẫu giả định chuyển gen 35 vii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Dendrobium giống lớn thứ hai họ lan (Orchidaceae), có phân bố rộng từ vùng nhiệt đới đến cận nhiệt đới, thích hợp điều kiện khí hậu Việt Nam Trong đó, Dendrobium Sonia lồi lan lai có hoa đẹp, màu tím, ưa chuộng loại lan cắt cành chủ lực Việt Nam nói chung Thành phố Hồ Chí Minh nói riêng Tuy nhiên, lanDendrobium Sonia hoa lan nói chung dễ mắc loại bệnh gây hại, đặc biệt bệnh virus Bệnh virus gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng phát triển lan chưa có thuốc đặc trị Do đó, việc tạo giống lan có khả kháng virus vấn đề cấp thiết nay, phương pháp quan tâm để tạo lan kháng virus chuyển gen Mặc dù phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens thường sử dụng để chuyển gen thuộc lớp hai mầm Tuy nhiên, gần có nhiều nghiên cứu cho thấy sử dụng vi khuẩn để chuyển gen mầm.Với mục tiêu thu nhận dòng tế bào lan Dendrobium có khả kháng virus khảm vàng, đề tài “Nghiên cứu chuyển gen mã hóa cho protein vỏ (CP) virus khảm vàng (Cymbidyum mosaic virus) vào protocorm lan Dendrobium Sonia”được thực 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Xác định nồng độ kháng sinh kanamycin thích hợp cho việc sàng lọc mẫu chuyển gen; Thu số mẫu protocorm có mang gen mục tiêu 1.3 Nội dung thực - Cấy chuyền tạo nguồn mẫu protocorm lan, lây nhiễm vi khuẩn mang vector chuyển gen RNAi vào protocorm - Khử khuẩn cho protocorm sau lây nhiễm kháng sinh cefotaxime; Thử nghiệm nồng độkanamycin thích hợp tiến hành sàng lọc mẫu chuyển gen mơi trường có bổ sung kanamycin - Kiểm tra diện gen mục tiêu mẫu giả định chuyển gen bằngPCR 3.3.4 Phát gen mục tiêu mẫu giả định chuyển gen  Ly trích DNA tổng số Các mẫu chuyển gen sau sàng lọc mơi trường kháng sinh kanamycin thích hợp 6-8 tuần tách phần ly trích DNA tổng số, sử dụng kit ly trích DNA DNeasy Plant Mini Kit (50) (QIAGEN, Đức) Các bước ly trích thực theo quy trình sau: Tách khoảng 100 mg mẫu tủ cấy vô trùng, cho mẫu vào tube 1.5 ml., Thêm nitơ lỏng nghiền lát mẫu Thêm 400 μl buffer AP1 μl RNase A Solution, votex sau ủ khơ 65oC 10 phút Đảo mẫu khoảng 2-3 lần suốt trình ủ Thêm 130 μl buffer AP2, giữ lạnh nước đá phút ly tâm 14000 vòng/phút phút Hút dịch lỏng bỏ vào cột lọc thô QIAshredder Mini spin đem ly tâm 14000 vòng/phút phút.Chuyển dịch lỏng sang ống mới, tránh hút phải mảnh vỡ tế bào.Thêm 1.5 lần thể tích buffer AP3/E trộn Hút 650 μl dung dịch bước thứ cho sang cột DNeasy Mini Spin ly tâm8000 vòng/phút phút, hút bỏ dịch lỏng Lặp lại bước hết mẫu dung dịch bước Thêm 500 μl buffer AW ly tâm 8000 vòng/phút phút Tiếp tục thêm 500 μl buffer AW ly tâm 14000 vòng/phút phút, sau lấy đầu lọc bỏ sang eppendorf 10 Thêm 100 μl buffer AE ủ nhiệt độ thường phút 11 Ly tâm 8000 vòng/phút phút bảo quản -20oC  Thực phản ứng PCR Các mẫu ly trích sử dụng để làm mẫu phản ứng PCR phát gen mục tiêu 28 Quy trình chạy luân nhiệt phát gen CP Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ Biến tính ban đầu 95 oC phút Biến tính 95 oC 15 giây 30 Bắt cặp 55 oC 30 giây 30 Tổng hợp 72 oC phút 30 Tổng hợp cuối 72 oC 10 phút Ổn định oC Thành phần cho phản ứng PCR phát gen CP Thành phần Thể tích sử dụng PCR masterr mix 12,5 μl Nước tinh khiết 10,5 μl F CP1.CyMV 0,5 μl R CP1.CyMV 0,5 μl DNA mẫu μl Tổng cộng 25 μl 3.4.Xử lý thống kê Các số liệu thu thập xử lý thống kê phần mềm SPSS 29 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1.Chuyển gen CP vào protocrom thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 4.1.1 Giai đoạn đồng nuôi cấy Sau ngày nuôi cấy môi trường đồng nuôi cấy (MS + 0,3 mg/l BA + mg/l NAA + 100 M Acetosyringone),vi khuẩn phát triển tạo thành vòng khuẩn màu trắng bao quanh protocorm trường hợp lây nhiễm (ngâm) với vi khuẩn Trái lại, mẫu khơng lây nhiễm hồn tồn khơng có xuất vòng khuẩn Protocorm hai trường hợp lây nhiễm không lây nhiễm với vi khuẩn tăng trưởng bình thường mơi trường đồng ni cấy hồn tồn khơng có khác biệt hai trường hợp (Hình 4.1) a b Hình 4.1 Protocorm lan Dendrobium Sonia tăng trưởng mơi trường đồng nuôi cấy sau ngày nuôi cấy (a)đối chứng (protocorm khôngđược ngâm với vi khuẩn); (b) lây nhiễm (protocorm ngâm với vi khuẩn) Giai đoạn lây nhiễm đóng góp vai trò quan trọng thành cơng thí nghiệm chuyển gen qua trung gian vi khuẩn A.tumefaciens Các yếu tố liên quan đến hoạt động vi khuẩn tăng trưởng mẫu cấy cần kiểm soát hợp lý để đảm bảo cho trình lây nhiễm diễn thuận lợi Trong hầu hết trường hợp, luôn tồn đối lập hoạt động vi khuẩn tăng trưởng mẫu cấy Vi khuẩn hoạt động gây ảnh hưởng đến tăng trưởng mẫu 30 cấy n lại làm giảm khả k chhuyển gen Trái lại, ự hoạt động g mạnh củaa vi khuẩẩn làm tăng khhả chuuyển gen nhhưng đồng thời ức ứ chế tăăng trưởnng mẫu cấyy Vì vậy, điều quan trọọng phải thiết t lập mộột quy trình lây nhiễm đạt đượcc cân bằn ng theo hướ ớng có lợi đối vớ ới hiệu chuyển geen kết thu đượcc thí nghiệm n y thể hiệện điềều nêu vừa đảm đ bảo đư ược hoạt động vi v khuẩn cũnng tăăng trưởng mẫu cấấy (protocorm) 4.1.22 Giai đoạn n khử khuẩẩn Các pro otocorm sauu lâyy nhiễm vớ ới vi khuẩnn chuyyển sang nnuôi cấy t môi trrường khử khuẩn (MS S + 0,3 mgg/l BA + mg/l NAA A + 300 mg/l m ceforrtaxime) đểể loại bỏ vi khuẩn Sauu ngày nuuôi cấy trênn mơi trườnng này, khơơng thấy phhát triển c vòng kkhuẩn bao quanh prootocorm vàà hầu hết protoocorm sống Một M số prootocorm tiếpp tục tăng trưởng (giaa tăng kích k thước) môii trường khử khuẩn đếến 14 ngày Tuy nhiên,, bên cạnh c protocoorm tiếp tục t tăng trư ưởng cóó số prootocorm chếết (Hình 4.22) a b Hình 4.2Prrotocorm laan Dendrobbium Soniaa tăng trưở H ởng môôi t trường khử khuẩn; (a) sau s ngày nuôi n cấy, (b) 14 ngày nuôôi cấy hường, tthí nghiệm chuyển geen, để loại hồn tồnn vi Thơng th khuẩẩn giaai đoạn lây nhiễm cầnn có nồồng độ cefootaxime vừaa có khả năăng diệt hoàn h toàn vi v khuẩn vừ ừa đảm bảo khả n sống ccủa mô Tuyy nhiên lựa chọnn đượcc cân nhắc theo hướngg ưu tiên chho việc loạại vi khuẩn Một nồng độ cefottaxime loạii hoànn toàn vi kkhuẩn với tỷ t lệ mẫu ssống không g cao dễ dààng đượcc chấp nhânn nồng n độ chho tỷ lệ mẫuu sống caoo có khả diệt d 31 khuẩn thấp Nồng độ cefotaxim sử dụng thí nghiệm đáp ứng yêu cầu đặt có khả loại trừ hoàn toàn vi khuẩn sau giai đoạn lây nhiễm, đồng thời trì khả sống protocorm tỷ lệ chấp nhận (khoảng từ từ 50 đến 80%) 4.2 Sàng lọc mẫu giả định chuyển gen 4.2.1 Ảnh hưởng nồng độ kháng sinh kanamycin lên khả sống protocorm Sau 10 ngày nuôi cấy, tất protocorm sống môi trường bổ sung kanamycin tất nồng độ Tuy nhiên, sau 20 ngày nuôi cấy, bắt đầu có hiên tượng chết protocorm xảy mơi trường có diện kanamycin từ 400 đến 700 mg/l với tỷ lệ mẫu chết đạt cao nồng độ kanamycin 700 mg/l (36,67%) Ở thời điểm 40 ngày nuôi cấy, tượng chết protocorm xảy mạnh mẽ Trên tất môi trường có diện kanamycin có protocorm chết với tỷ lệ định đạt giá trị cao nồng độ kanamycin 700 mg/l Bảng 4.1 Tỉ lệ chết protocorm sau 20 ngày nuôi cấy Nồng độ kanamycin (mg/l) Tỷ lệ mẫu chết theo thời gian (%) 10 ngày 20 ngày 0,00 (0,71) 40 ngày 0,00 (0,71) 0,00 (0,71) 0,00 (0,71) 100 0,00 (0,71) 0,00 (0,71) 200 0,00 (0,71) 0,00 (0,71) 3,33a (1,55) 300 0,00 (0,71) 0,00 (0,71) 3,33a (1,55) 400 0,00 (0,71) 10,00ab (2,82) 23,33b(4,19) 500 0,00 (0,71) 13,33b (3,67) 43,33b(6,61) 700 0,00 (0,71) 36,67c (4,44) 93,33c(9,67) Các giá trị theo sau chữ cột không kí tự biểu thị khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 0,05 Các số liệu ngoặc đơn số liệu chuyển đổi theo phương thức a  0,5 với a số liệu thật 32 100 90 80 70 % 60 50 10 ngày 40 20 ngày 30 40 ngày 20 10 0 100 200 300 400 500 700 mg/l Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ chết protocorm môi trường kháng sinh (%) Kanamycin thường sử dụng để sàng lọc chuyển gen thí nghiệm chuyển gen thực vật Mơ cấy chưa chuyển gen (khơng có gen kháng kanamycin) chết sau khoảng thời gian nuôi cấy định mơi trường có bổ sung kháng sinh Tùy thuộc vào nồng độ kháng sinh môi trường nuôi cấy mà mô cấy không phát triển, phát triển chậm hay chết hoàn toàn sau khoảng thời gian khác Chỉ có mơ cấy chuyển gen thành cơng (có mang gen kháng kanamycin) tồn phát triển mơi trường có diện chất Tuy nhiên, sử dụng nồng độ kháng sinh thấp hay cao cho kết không tốt, làm ảnh hưởng đến hiệu chọn lọc mô chuyển gen gây lãng phí Vì vậy, cần tìm nồng độ kanamycin thích hợp cho mục tiêu chọn lọc mơ chuyển gen Trong thí nghiệm này, hiệu gây chết protocorm nồng độ kanamycin sử dụng phân chia tương đối rõ thành trường hợp: thấp (100-300 mg/l), trung bình (400-500 mg/l) cao (700 mg/l) Các nồng độ kanamycin hiệu thấp khơng phù hợp cho mục đích chọn lọc nồng độ hiệu trung bình sử dụng để sàng lọc sơ giai đoạn mẫu trước chuyển sang sàng lọc thức với nồng độ hiệu cao 4.2.2 Sàng lọc mẫu giả định chuyển gen Các protocorm sau loại vi khuẩn chuển sang môi trường sàng lọc mẫu giả định chuyển gen (MS + 0,3 mg/l BA + mg/l NAA + 500 33 mg/l cefortaxime) Quá trình sàng lọc với kanamycin dự kiến thực hai giai đoạn Giai đoạn đầu tiến hành sàng lọc với kanamycin nồng độ 500 mg/l (đây nồng độ đánh giá có hiệu gây chết protocorm mức trung bình thí nghiệm trên) Mặc dù nồng độ này, việc sàng lọc khơng đạt hiệu cao (có thể bỏ sót số protocorm chuyển gen có sức sống mạnh) đảm bảo chắn protocorm mang gen mục tiêu có sức sống yếu khơng bị giết chết giai đoạn đầu áp lực nồng độ kháng sinh có áp lực gây chết cao (700 mg/l) Giai đoạn tiến hành sàng lọc với kháng sinh nồng độ 700 mg/l Kết sau 60 ngày nuôi cấy môi trường có bổ sung kanamycin 500 mg/l, hầu hết mẫu trường hợp đối chứng không chuyển gen chết Trái lại, trường hợp có chuyển gen, bên cạnh số mẫu chết số mẫu sống (hình 4.2) Các mẫu sống trường hợp xem mẫu giả định chuyển gen tạm thời Để khẳng định chắn, cần phải sàng lọc tiếp giai đoạn hai áp lực kháng sinh cao trước tiến hành kiểm tra diện gen mục tiêu Tuy nhiên, giới hạn thời gian nghiên cứu nên tạm thời bỏ qua giai đoạn sàng lọc thứ hai tiếp tục thực việc kiểm tra diện gen mục tiêu A B Hình 4.3Protocorm lan DendrobiumSonia ni cấy môi trường sàng lọc sau 60 ngày (A) Đối chứng (không chuyển gen) , (B) Chuyển gen 34 a 44.3 Kiểm tra t diện ggen mục tiêêu Các proto ocorm thu sau ggiai đoạn sààng lọc, đư ược ly trích DNA thhực phản ứng PCR với cặp mồi F C CP1.CyMV V R CP11.CyMV Đây cặp mồi m đượcc sử dụng để đ phân lậpp đoạn gen mục tiêu lààm nguồn vvật liệu choo việc thiếtt kế vecto or chuyển gen g thực vật v pK7GW WIWG2(II)/C CP-CyMV Nếu kết q PCR bằằng cặp mồi m ch ho kết dương tínhh sản phhẩm khuếchh đại có kícch thước đúúng theo tính tốn t protocorrm tương ứng ứ chhắn có manng gen mụcc tiêu Kết q tính tốn t lý ý thuyết choo thấy sản pphẩm khuếcch đại đúngg có kích thước khoảảng 450 bp; b thựcc tế thu băăng vị tríí khoảng giiữa 400 500bp so vvới thangg chuẩn Nhhư vậy, cácc protocorm m tương ứngg với vị trí có băng DN NA chhắn có mang m gen mụ ục tiêu (Hìnnh 4.3) 10 500bbp 400bp Hình 4.3 Kết quảả điện di sảản phẩm PC CR phát hiệện gen mục tiêu g định chuuyển gen, Đối mẫu giả địịnh chuyển 1-6 Mẫu giả chứng khơng chuyyển gen, Đối chứng âm khơng có mẫu; 9: Đối D chứng dương (khuẩẩn lạc vi khuuẩn mang geen mục tiêu),, 10,Thang DNA Kết cho thấấycấu trúc gen mục tiiêu đượcc chuyển thhành công vào v protoocorm Tuy nhiên kết qquả bước đầầu cho thấyy có hiệnn diện gen g mục tiêu DNA D protocorm, p cần phải thhực cácc thí nghiệm m tiếp theoo để chứnng minh ch ho hoạt động cấu trúc gen g troong dò òng protocoorm chuyyển gen 35 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Nồng độ kháng sinh kanamycin 500 700 mg/l phù hợp cho việc sàng lọc protocorm chuyển gen Cấu trúc chuyển gen RNAi gen CP từ virus CyMV chuyển thành công vào protocorm lan Dendrobium Sonia chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58 thông qua giai đoạn đồng nuôi cấy ngày môi trường bổ sung acetosyringone 100 M; khử khuẩn với cefotaxime 300 mg/l sàn lọc với kanamycin 500 mg/l 5.2 Đề nghị Tiếp tục thí nghiệm để thu lan chuyển gen có khả kháng virus CyMV: - Ni cấy tăng sinh protorm có gen chuyển thành lan hoàn chỉnh - Kiểm tra hoạt độn gen mục tiêu lan chuyển gen - Đánh giá khả kháng virus lan chuyển gen 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bùi Trí Bửu, Nguyễn Thị Lang 2004 Di truyền phân tử, NXB Nơng Nghiệp, Tp.HCM Chu Hồng Hà, Phạm Thị Vân, Lê Trần Bình 2009 Tạo trồng chuyển gen kháng bệnh virus kỹ thuật RNAi Báo cáo Hội nghị quốc gia sinh vật biến đổi gen quản lý an toàn sinh học, 19-28 Dương Công Kiên.2002 Nuôi cấy mô thực vật NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh Đỗ Năng Vịnh 2007 Công nghệ can thiệp RNA (RNAi) gây bất hoạt gen tiềm ứng dụng to lớn Tạp chí cơng nghệ sinh học 5: 265-275 Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu 2012 Cơng nghệ gen NXB Nơng Nghiệp Nguyễn Văn Uyển 1995 Những phương pháp CNSH thực vật tập NXB Nông Nghiệp Nguyễn Văn Uyển 1996 Những phương pháp CNSH thực vật tập NXB Nông Nghiệp Phạm Thành Hổ 2006 Di truyền học NXB Giáo Dục Trần Hợp 2000 Phong lan Việt Nam NXB Văn Hóa Dân Tộc Tài liệu nước 10 Advina L Julkifle, Xavier Rathinam, Uma Rani Sinniah and Sreeramanan 2010 Optimisation of Transient Green Fluorescent Protein (GFP) Gene Expression in Phalaenopsis Violacea Orchid Mediated by Agrobacterium Tumefacient-mediated Transformation System Australian Journal of Basic and aplied sciences 4: 3424-3432 11 Baulcombe D 2004 RNA silencing in plants Nature431: 356-363 12 Bipna Rani Shrestha, Dong Poh Chin, Ken Tokuhara, Masahiro Mii 2010 Agrobacterium-madiated Tranformation of vanda using protocorm-like bodies, AsPac J Mol Biol Biotechnol 18:225-228 13 Dong Poh Chin, Kei-Ichiro Mishiba, Masahiro Mii 2010 Agrobacterium-mediated Transformation of protocorm-like bodiesin Cymbidium, Plant Cell Rep 21:735-743 14 Dong Poh Chin, Kei-ichiroo Mishiba, Masahiro Mii 2007 Agrobacterium-mediated transformation of protocorm-like bodies in Cymbidium Plant Celll Rep 26:735-743 15 Gelvin S.B 2003 Agrobacterium-mediated plant Transformation: the Biology behind the "Gene-Jockeying Tool", Microbiology and molecular biology reviews 67:16-37 16 Gottula J and Fuchs M 2009 Toward a Quarter Century of Pathogen-Derived Resistance and Practical Approaches to Plant Virus Disease Control Advances in Virus Research 75:161-183 37 17 Navalinskiene R.J Samuitiene M 2005 Viral diseases of flower plants 16 Identification of viruses affecting orchids (Cymbidium Sw.) Biologija: 29-34 18 Reddy D V R., Sudarshana M R., Fuchs M., Rao N C and Thottappilly G., 2009 Genetically Engineered Virus-Resistant Plants in Developing Countries: Current Status and Future Prospects Advances in Virus Research 75: 185-220 19 Rinaldi Sjahril, Dong Poh Chin, Raham Sher Khan, Saburo Yamamura, Ikuo Nakamura, Yoshimiki Amemiya, Masahiro Mii 2005 Transgenic Phalaenopsis Plant with resistance to Erwinia carotovora produced by introducing wasabi defensin gene using Agrobacterium method Plant Biotechnology 23:191-194 20 S Men, X Ming, Y Wang, R Liu, C Wei, Y Li.2002 Genetic transformation of two species of orchid by biolistic bombardment Plant Cell Rep 21:592-598 21 Shuzhen Men, Xiaotian Ming, Rongwei Liu, Chunhong Wei & Yi Li 2003 Agrobacterium-mediated genetic Transformation of a Dendrobium orchid Plant Cell, Tissue And Organ Culture 75: 63-71 22 Wong S.M., Chng C.G., Lee Y.H., Tan K and Zettler F.W 1994 Incidence of cymbidium mosaic and odontoglossum ringspot viruses and their significance in orchid cultivation in Singapore Crop protection 13: 235-239 Tài liệu từ Internet 23 http://sinhhocvietnam.com.vn 24 http://elering.hueuni.edu.vn/ /htm/c4.htm 25 http://img207.imageshack.us/img207/1924/agobacterimbmp3au.th.ijg 26 http://faculty.washington.edu/cemills/aequorea.html 27 http://grove.ufl.edu/jbjones/agrobacterium%20lecture%202006.doc 28 http://vi.wikipedia.org/wiki/Can_thi%E1%BB%87p_ARN 38 PHỤ LỤC Môi trường Murashige & Skoog (1962) Khoáng đa lượng Hàm lượng (mg/l) NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.4 H2O 370 K H2PO4 170 Khoáng vi lượng Hàm lượng (mg/l) H3PO3 6,20 MnSO4.4H2O 22,30 ZnSO4 4H2O 8,60 KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Fe-EDTA Hàm lượng (mg/l) FeSO4.7H2O 27,8 NaEDTA 37,3 Vitamin Morel & Wetmore (1951) Panthothenat decalciium Meso-inositol 100 Acid nicotinique Pyrydoxin – HCl Thiamin Bioyin 0,001 39 Đường sacharose: 30 g/l Agar: g/l pH 5,8 Môi trường Luria-Bertania (LB) Bacto trytone 10 g/l Bacto Yeast Extract g/l NaCl 10 g/l Nước cất 1000 ml pH 7,0 Bảng xử lý thống kê SBSS 3.1 Bảng xử lý thống kê cho thí nghiệm kanamycin sau 20 ngày nuôi cấy ANOVA Tyle Sum Squares Between Groups 48,324 Within Groups 30,870 Total 79,194 of df Mean Square F 8,054 3,653 14 2,205 20 Post Hoc Tests Homogeneous Subsets Tyle Duncan Kana mycin N Subset for alpha = 0,05 100 0,7100 200 0,7100 300 0,7100 400 500 2,8267 3,6700 700 4,4467 Sig 0,7100 0,135 2,8267 0,225 40 Sig 0,021 Tyle Duncan Kana mycin N Subset for alpha = 0,05 100 0,7100 200 0,7100 300 0,7100 400 500 2,8267 3,6700 700 4,4467 Sig 0,7100 0,135 2,8267 0,225 Means for groups in homogeneous subsets are displayed 3.2 Bảng xử lý thống kê cho thí nghiệm kanamycin sau 40 ngày nuôi cấy ANOVA Tyle Sum of Squares df Mean Square F Sig 17,687 000 Between Groups 214,012 35,669 Within Groups 28,233 14 2,017 Total 242,245 20 Post Hoc Tests 41 Homogeneous Subsets Tyle Duncan Kanam ycin N Subset for alpha = 0.05 7100 100 7100 200 1.5533 300 1.5533 400 4.1967 500 6.6100 700 Sig 9.6700 513 056 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed 42 ... MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Mà HÓA CHO PROTEIN VỎ (CP) CỦA VIRUS KHẢM VÀNG (CYMBIDIUM MOSAICVIRUS) VÀO PROTOCORM LAN DENDROBIUM SONIA Hướng dẫn khoa học... kháng virus kỹ thuật chuyển gen RNAi thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciensđược nghiên cứu đề tài ‘ Nghiên cứu chuyển gen mã hóa cho protein vỏ (cp) virus khảm vàng (cymbidium mosaicvirus) vào. .. khảm vàng, đề tài Nghiên cứu chuyển gen mã hóa cho protein vỏ (CP) virus khảm vàng (Cymbidyum mosaic virus) vào protocorm lan Dendrobium Sonia được thực 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Xác định nồng