BIẾN NẠP GEN CHUYỂN HÓA ACID BÉO OMEGA 3 (GEN GmFAD3) VÀO VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS VÀ BƯỚC ĐẦU CHUYỂN GEN VÀO CÂY MÈ (SESAMUM INDICUM L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VÕ THỊ THUÝ HUỆ BIẾN NẠP GEN CHUYỂN HÓA ACID BÉO OMEGA (GEN GmFAD3) VÀO VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS VÀ BƯỚC ĐẦU CHUYỂN GEN VÀO CÂY MÈ (SESAMUM INDICUM L.) Chuyên ngành: trồng trọt Mã số: 60.62.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NƠNG NGHIỆP Hướng dẫn khoa học: TS BÙI MINH TRÍ Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 12/2009 BIẾN NẠP GEN CHUYỂN HÓA ACID BÉO OMEGA (GEN GmFAD3) VÀO VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens VÀ BƯỚC ĐẦU CHUYỂN GEN VÀO CÂY MÈ (Sesamum indicum L.) VÕ THỊ THUÝ HUỆ Hội đồng chấm luận văn Chủ tịch Thư ký Phản biện Phản biện Uỷ viên TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH HIỆU TRƯỞNG LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tôi tên Võ Thị Thuý Huệ sinh ngày 30 tháng 10 năm 1980 Nơi sinh Châu Thành – Bến Tre, Ông Võ Văn Hai Bà Nguyễn Thị Kim Thoại Tốt nghiệp tú tài Trường phổ thông trung học Châu Thành A, tỉnh Bến Tre năm 1998 Tốt nghiệp đại học hệ quy Trường Đại học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, năm 2004 Từ năm 2004 đến công tác Trường ĐH Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tình trạng gia đình: chồng Nguyễn Minh Quang, năm kết hôn 2007 Chổ nay: 51/3, đường 24, khu phố 7, phường Linh Đông, quận Thủ Đức-Tp Hồ Chí Minh Điện thoại: 01265359935 Email: thuyhue@hcmuaf.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Ký tên VÕ THỊ THUÝ HUỆ LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến: Q Thầy Cơ trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh tận tâm hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho suốt thời gian học tập Thầy Bùi Minh Trí tận tình hướng dẫn tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Giáo sư Anders S Carlsson giúp đỡ thời gian thực nghiên cứu Thuỵ Điển Chương trình hợp tác nghiên cứu Việt Nam – Thụy Điển/Sida-Sarec tạo điều kiện cho tơi thực nghiên cứu Q Nhà trường, khoa Nơng học Phòng Sau đại học tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khố học Gia đình, bạn, đồng nghiệp động viên, chia sẻ góp ý cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu TÓM TẮT Đề tài: “Biến nạp gen chuyển hóa acid béo Omega (gen GmFAD3) vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens bước đầu chuyển gen vào mè (Sesamum indicum L.) ” thực Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Môi trường, Trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Đại học Nông nghiệp (SLU)- Thuỵ Điển Mục tiêu đề tài biến nạp plasmid Ubi GmFAD3 vào hai dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens GV3101, GV2260 sử dụng hai dòng vi khuẩn để chuyển gen GmFAD3 vào mè Kết cho thấy sau biến nạp xung điện 2.5 kV plasmid Ubi GmFAD3 hồn tồn hợp vào hai dòng vi khuẩn GV3101 GV2260, kết kiểm chứng kỹ thuật giải trình tự DNA Sử dụng hai dòng vi khuẩn vừa biến nạp để chuyển gen vào mè kỹ thuật nhúng hoa Thí nghiệm chuyển gen thực giai đoạn phát triển khác nụ hoa Hạt thu từ chuyển gen sàng lọc kháng sinh kanamycin Nồng độ kanamycin thích hợp cho chọn lọc mè chuyển nạp gen 75mg/L Chất kết dính bề mặt silwet L-77 cho hiệu chuyển gen cao nồng độ 0,05% Tỉ lệ chuyển gen cao (14,4%) chủng vi khuẩn thời điểm nụ hoa 20 ngày sau nhúng hoa nở Dòng vi khuẩn GV2260 cho tần số chuyển gen 5,1% cao gấp hai lần so với dòng GV3101 80% mè T1 kháng kanamycin (75mg/L) cho kết dương tính thực phản ứng khuếch đại PCR gen npt II Phân tích PCR cho thấy diện gen GmFAD3 gen mè T1 Sự diện hai gen npt II GmFAD3 mè T1 kháng kanamycin cho thấy chuyển thành cơng tồn đoạn T-DNA vào gen mè SUMMARY The thesis “Transformation of GmFAD3 gene into Agrobacterium and the initial step to create the transgenic sesame” was carried out at Research Institute for Biotechnology and Environment, Nong Lam University and Swedish University of Agriculture –(SLU)- Sweden The objective of the thesis was to transform UbiGmFAD3 plasmid into two Agrobacterium strains (GV3101 and GV2260) and the use of these strains in creating transgenic sesame Results shown that after transformation in pulsed electric field at 2.5 kV, UbiGmFAD3 plasmid including FAD3 gene was completely intergrated into two A.tumefaciens strains (GV3101 GV2260) as indicated by DNA sequencing The two bacterial strains were, then used to deliver GmFAD3 gene into sesame plants using floral dipping technique Sesame plants at different flowering stages were used for floral dipping experiments The matured seeds obtained from the experimented plants were screened for transformants The concentration of kanamycin suitable for selection of putative transformants was 75mg/L Highest successful transformation was achieved when silwet L-77 was added to the dipping medium at concentration of 0.05%(v/v) The best transformation frequency of 14.4% was recorded for flowers that opened 20 days after dipping The bacterial strain GV2260 gave more than twice as many transformants as GV3101 did and reached an overall transformation frequency of 5.1% Up to 6.8% of the T1 plants that survived on kanamyicin added medium gave positive signal as indicated by PCR amplification of the npt II gene The presence of npt II and GmFAD3 genes as confirmed by PCR in the seedling resistance to kanamycin shown successful transfer of the complete T-DNA into the plant genome MỤC LỤC Nội dung Trang Trang chuẩy y i Lý lịch cá nhân ii Lời cam đoan iii Lời cảm tạ iv Tóm tắt v Summary vi Mục lục vii Danh sách chữ viết tắt xi Danh sách hình xii Danh sách bảng xiii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục tiêu đề tài .2 1.3 Giới hạn đề tài .2 Chương TỔNG QUAN 2.1 Nguồn gốc phân bố mè 2.2 Phân loại đặc điểm thực vật học mè 2.3 Công dụng giá trị kinh tế 2.3.1 Công dụng 2.3.2 Giá trị dinh dưỡng 2.4 Tình hình sản xuất mè Thế giới Việt Nam 2.5 Tổng quan dầu thực vật acid béo 2.5.1 Acid béo omega .8 2.5.2 Các nguồn acid béo n-3 2.5.3 Sinh tổng hợp acid béo triacylglycerol hạt 12 2.6 Thàh phần acid béo hạt mè 12 2.7 Biến đổi thành phần acid béo mè 14 2.8 Các nghiên cứu chuyển gen mè…………………………………… 15 2.9 Thành phần gen chuyển nạp 17 2.9.1 Promoter 17 2.9.2 Gen thông báo (reporter gene) 17 2.9.3 Chỉ thị chọn lọc (selectable marker) 18 2.10 Các vector 18 2.10.1 Vector đồng nhập (cointergrating vector)………………………………… 19 2.10.2 Vector hai nguồn (binary vector)……………………………………….… 19 2.11 Các phương pháp chuyển nạp gen phổ biến………………………………….20 2.11.1 Chuyển nạp gen vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .21 2.11.2 Chuyển nạp gen phương pháp PEG (polyethylene glycol) 25 2.11.3 Chuyển nạp gen phương pháp sử dụng xung điện (electroporation) 25 2.11.4 Chuyển nạp gen phương pháp bắn gen (biolistic)…………………….25 2.12 Tình hình nghiên cứu trồng chuyển gen Việt Nam Thế giới… 26 2.12.1 Tình hình nghiên cứu trồng chuyển gen Việt Nam………………… 26 2.12.2 Tình hình nghiên cứu trồng chuyển gen Thế giới…………………27 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 3.1 Địa điểm nghiên cứu 30 3.2 Vật liệu thí nghiệm 30 3.2.1 Giống mè 30 3.2.2 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens gen chuyển nạp 30 3.2.3 Hoá chất………………………….……………………………………………… 31 3.2.3.1 Hoá chất dùng quy trình chuyển gen 31 3.2.3.2 Hố chất dùng li trích DNA 33 3.2.3.3 Hoá chất dùng phản ứng PCR .33 3.2.4 Thiết bị dụng cụ 33 3.3 Phương pháp thí nghiệm .34 3.3.1 Biến nạp plasmid pHTS Ubi GmFAD3 vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ………………………………… …………………………… 34 3.3.1.1 Plasmid vi khuẩn biến nạp .34 3.3.1.2 Biến nạp plasmid pHTS Ubi GmFAD3 vào dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 34 3.3.1.3 Kiểm tra sản phẩm vi khuẩn sau biến nạp 35 3.3.2 Thiết lập qui trình biến nạp vi khuẩn vào mè 36 3.3.2.1 Chuẩn bị mè trước chuyển gen .36 3.3.2.2 Thiết lập quy trình chuyển gen………………………………………… 37 3.3.3 Sàng lọc kháng sinh 38 3.3.4 Phản ứng PCR khuếch đại gen GmFAD3 39 3.3.4.1 Li trích DNA .39 3.3.4.2 Phản ứng PCR .40 3.3.4.3 Điện di…………………………………………………………………… 41 3.4 Dự kiến kết đạt 42 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………….………….…….43 4.1 Biến nạp plasmid pHTS Ubi GmFAD3 vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens….………………………………………………………………43 4.2 Kiểm tra sản phẩm vi khuẩn sau biến nạp……………………………… 44 4.2.1 Kết cắt giới hạn enzyme Hind III………………………………….44 4.2.2 Kết giải trình tự đoạn gen GmFAD3…………………………………….45 4.3 Chuyển gen vào mè thông qua vi khuẩn Agrobacterium…………………….48 3.1 Thử nghiệm khả kháng tự nhiên giống mè Exel kanamycin………………………………………………………… 48 4.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình chuyển gen kỹ thuật nhúng hoa….50 4.3.2.1 Ảnh hưởng nồng độ Silwet L-77………………………………………… 50 4.3.2.2 Ảnh hưởng tuổi nụ hoa thời điểm chủng vi khuẩn Agrobacterium………………………………………………………………….….51 4.3.2.3 Dòng vi khuẩn thử nghiệm…………………………………………………54 4.3 Kiểm tra chuyển nạp gen………………………………………………… 54 10 4.3.2.3 Dòng vi khuẩn thử nghiệm Kết bảng 4.3 cho thấy có khác biệt hiệu chuyển gen hai dòng vi khuẩn Agrobacterium GV3101 GV2260 Dòng vi khuẩn GV2260 cho tần số chuyển gen 5,1% cao gấp hai lần so với dòng GV3101 Dựa vào kết này, dòng GV2260 xem hiệu cho chuyển gen giống mè Exel Bảng 4.5: Sự biến đổi tần số chuyển gen khác biệt dòng vi khuẩn Chủng vi khuẩn GV3101 GV2260 1.001 1.391 Số hạt kháng kanamycin 20 71 Tỉ lệ kháng kanamycin (%) 2,0 5,1 Số hạt chọn lọc với kanamycin 4.3 Kiểm tra chuyển nạp gen Cây mè giống mè Exel mơi trường chọn lọc có kanamycin 75mg/L xem thể giả định chuyển nạp gen Các thể giả định kiểm tra số phương pháp như: phân tích PCR, giải trình tự gen so sánh với đối chứng dương (plasmid DNA), phân tích protein để kết luận chắn chúng thể chuyển nạp gen bền vững gài gen ngoại lai vào gen Ở nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành phân tích PCR để kiểm tra diện gen npt II gen GmFAD3 mè chuyển gen giả định Hình 4.10: Cây mè chuyển gen giả định lii 4.4 Phân tích PCR kiểm tra xuất gen nptII GmFAD3 mè Chúng thực sàng lọc phân tử PCR để khẳng định diện gen chuyển vào chuyển gen gốc hệ tạo từ gốc Kết phân tích cho thấy số 15 T1 sống sót mơi trường kanamycin có 12 (chiếm 80%) cho kết khuếch đại PCR dương tính với npt II, đoạn gen khuếch đại có kích thước 750bp phù hợp với sản phẩm dự đoán cặp primer L N P S1 S2 S3 750bp 250bp L N N P S4 S5 750bp 250bp Hình 4.10: Kết điện di PCR mè chuyển gen giả định với cặp mồi khuếch đại đoạn gen npt II L: thang chuẩn (Ladder) N: đối chứng âm P: đối chứng dương (Plasmid Ubi GmFAD3) S1-S5: mè chuyển gen giả định liii Kết PCR sử dụng cặp mồi GmFAD3 4s P7 35S 322r để khuếch đại phần đoạn gen GmFAD3 promoter 35S khuếch đại đoạn có kích thước 950bp GM FAD3 4s P7 35S 322r 950bp 950bp Hình 4.11: Điện di sản phẩm PCR từ 10 mè kháng kanamycin Đoạn gen có kích thước 950bp (ở giếng: 2-6, 8-9, 11,12) khuếch đại Dòng: DC - đối chứng âm (cây mè không chuyển gen); 2: đối chứng plasmid (Ubi GmFAD3); 1, 3-5, 7-12: mè chuyển gen nhúng hoa; L: DNA marker Kết PCR dương tính với gen nptII chứng tỏ gen chuyển hợp vào gen kháng kanamycin Các mẫu DNA đối chứng âm (cây không chuyển gen) không cho sản phẩm PCR mong muốn Sự diện gen xác định PCR hầu hết mè kháng kanamycin cho thấy chuyển thành cơng tồn đoạn T-DNA vào gen trồng liv Từ kết thông số đạt được, đưa sơ đồ sau: Hạt mè E.coli mang plasmid Ubi GmFAD3 Khử trùng Cây in vitro Tách chiết biến nạp Trồng điều kiện cách ly Khảo sát nồng độ kanamycin Hình thành nụ hoa Agrobacterium mang plasmid Ubi GmFAD3 Chuyển gen npt II,GmFAD3 Hạt mè chuyển gen Chọn lọc thể chuyển gen môi trường Kanamycin Cây chuyển gen giả định PCR Cây chuyển gen T1 Hình 4.12: Sơ đồ quy trình chuyển gen kỹ thuật nhúng hoa vào mè thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens lv Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Dựa vào kết nghiên cứu chúng tơi có số kết luận Biến nạp plasmid Ubi GmFAD3 vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Biến nạp thành công plasmid pHTS Ubi GmFAD3 vào dòng vi khuẩn A tumefaciens GV3101 GV2260 Chuyển nạp gen vào mè - Nồng độ kanamycin thích hợp cho chọn lọc mè chuyển nạp gen 75mg/L - Chất kết dính bề mặt silwet L-77 cho hiệu chuyển gen cao nồng độ 0,05% - Tỉ lệ chuyển gen cao chủng vi khuẩn thời điểm nụ hoa 20 ngày sau nở (nụ hoa 20 NTN) - Đã tiến hành phân tích PCR để kiểm tra diện gen npt II gen GmFAD3 gen : + Trong số 15 T1 sống sót mơi trường kanamycin có 12 (chiếm 80%) mè kháng kanamycin (75mg/L) cho kết dương tính với gen nptII + Phân tích PCR cho thấy diện gen GmFAD3 gen mè chuyển gen giả định Đề nghị - Tiếp tục tiến hành thí nghiệm nhằm xác định tuổi nụ hoa thích hợp cho việc chủng vi khuẩn - Theo dõi trồng vườn ươm, ghi nhận sinh trưởng phát triển đến hoa tạo - Phân tích hàm acid béo omega3 dầu hạt mè chuyển gen để so sánh với dầu hạt mè không chuyển gen phương pháp sắc ký lvi TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 2004 Di truyền phân tử Nhà xuất Nơng nghiệp, TP Hồ Chí Minh Nguyễn Mạnh Chinh Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007 Trồng-chăm sóc phòng trừ sâu bệnh đậu phộng, mè Nhà xuất nông nghiệp Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển (2003) Tạo hông (Paulownia fortunei) chuyển gen kháng sâu thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Tuyển tập Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội, 16-17/12/2003 Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Đức Lượng, 2002 Công nghệ gen NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM Nguyễn Tiến Mạnh, 1995 Kinh tế có dầu Nhà xuất Nông Nghiệp Tạ Quốc Tuấn Trần Văn Lợt, 2006 Kỹ thuật trồng thâm canh mè Nhà xuất nông nghiệp Nguyễn Văn Uyển, 1996 Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật Tập I, II Nhà xuất Nông nghiệp Nguyễn Phước Nhuận, Đỗ Hiếu Liêm, Huỳnh Thị Bạch Yến, 2003.Giáo trình sinh hóa học Nhà xuất Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh TIẾNG NƯỚC NGỒI Ashri A 1989 Sesame In: Oil Crops of the World: their breeding and utilization (Eds G Robbelen, R K Downey & A Ashri) McGraw Hill, NY, pp 375-387 10 Ashri A 1998 Sesame Breeding In: Plant breeding reviews Vol 16 (Eds J Janick) John Wiley and Sons, Somerest, NJ Pp 179-228 lvii 11 Baydar H., Turgut I & Turgut K 1999 Variation of certain characters and line selection for yield, oil, oleic, and linoleic acids in the Turkish sesame (Sesamum indicum L.) populations Turkish journal of agriculture and forestry 23: 431-441 12 Benard R., John E 1993 Method in plant molecular biology and biotechnology CRC Press 13 Bechtol N., Jolivet S., Voisin R., Pelletier G 2003 The endosperm and the embryo of the Arabidopsis thaliana are independently transformed through infiltration by Agrobacterium tumefaciens Transgenic Res 12: 509-517 14 Beatrice Ang’iyo Were 2006 Genetic improvement of oil quality in sesame (Sesanum indicum L.): Assembling tools Docteral thesis Moi University, Kenya 15 Brar G S 1982 Variations and correlations in oil content and fatty acid composition of sesame Indian journal of agricultural science 52: 434439 16 Burton J W., Miller J F., Vick B A., Scarth R & Holbrook K C.C 2004 Altering fatty acid composition in oil seed crops Pp 273-306 In: advances in Agronomy Vol 84 (Ed D L Sparks) Elsevier Academic Press, Amsterdam 17 Clough S & Bent A., 1998 Floral dip: a simplified method for Agrobacterium mediated transformation of arabidopsis thaliana The plant journal 16, 753-743 18 Chung M H., Chen M K & Pan S M 2000 Floral spray transformation can efficiently generate arabidopsis transgenic plants Transgenic research 9, 471-476 19 Desfeux C., Clough SJ., Bent AF 2000 Female reproductive tissues are the primary target of Agrobacterium transformation by the Arapidopsis floral-dip method Plant Physiol 123: 895-904 lviii 20 Egnin M., Mora A & Prakash C S 1998 Factors enhancing Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer in peanut (Arachis hypogaea L.) In vitro cellular developmental biology-plant 34: 310-318 21 Enríquez-Obregón G A., Vázquez-pádrdon R I., Prieto-sansonov D l., de la Riva G A & Selman-Housein, G; 1998 Herbicide resistant sugarcane (Saccharum officinarum L.) plants by Agrobacterium-mediated transformation Planta 206, 20-27 22 Feldmann K A & Marks M D 1987 Agrobacterium-mediated transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana: a non-tissue culture approach Molecular and general genetics 208:1-9 23 Frank j 2005 Beyond vitamin E supplementation: An alternative strategy to improve vitamin E status Journal of plant physiology 162: 834-843 24 Hellens R., Mullineaux P & Klee, H., 2000 A guide to Agrobacterium binary Ti vectors Trends in plant science 5: 446-451 25 Hewezi T., Perrault A., Alibert G & Kallerhoff J 2002 Dehydrating immature embryo split apices and rehydrating with Agrobacterium tumefaciens: A new method for genetically transforming recalcitrant sunflower Plant molecular biology reporter 20: 335-345 26 Jacobsen J H 2007 Modern technologies in plant biotechnology Genetic Engineering Manual for plant genetic engineering course Hannover University, 26 pages 27 Jones P.G., Sutton J.M 1997 Plant molecular biology essential techniques John Wiley & Sons, England 28 Jin U H., Lee J W., Chung Y.S., Lee J H., Yi Y B., Kim Y K., Hyung N M., Pyee J H & Chung, C H 2001 Characterisation and temporal expression of omega 6- fatty acid desaturase cDNA from sesame (Sesamum indicum L.) seeds Plant science 161: 935- 941 lix 29 Jin U H., Chun J.A., Han M.O., Lee J.W., Yi Y B., Lee S W & Chung C H 2005 Sesame hair root cultures for extra-cellular production of a recombinant fungal phytase Process biochemistry 40: 3754-3762 30 Jung K M., Sheop S J., Han C C., Ho, P J., In H N., Sul S N., Ho C S & Chung S M 2004 Sesame seed biotechnology: temporal and seedspecific regulation of a sesame (Sesamum indicum) microsomal oleic acid desaturase (FAD2) gene 16th Plant lipid symposium, 1-4 June 2004, Budapest, Hungary Progamme and Adstracts of presentations P 71 31 Kamal-Eldin A & Appelqvist L A 1994 Variation in fatty acid composition of the different acyl lipid in seed oils from four Sesamum species Journal of the American oil chemist’ society 71:135-139 32 Kevan M.A., Gartland, Michael R Dcey 1995 Agrobacterium protocols Humana Press, Totowa, New Jersey 33 Khan M R., Rashid H., Ansar M & Chaudry Z 2003 High frequency shoot regeneration and Agrobacterium-mediated DNA transfer in Canola (Brassica napus) Plant cell tissue and organ culture 75: 223-231 34 Lee M 2007 DNA extraction from small leaves 35 Luciani Baldoni and Eddo Rugini 2002 Fruit and vegetable technology 1st edition, CRC press and woohead publising limited, 333 pages 36 31 Monica A H 1996 Plant molecular genetic Longman 37 Miyahara Y., Hibasami H., Katsuzaki H., Imai, K & Komiya, T 2001 Sesamolin from sesame seed inhibits proliferation by inducing apoptosis in human lymphoid leukemia Molt 4B cells International journal of molecular medicine 7: 269-371 38 Muthuswamy P & Thangavelu S 1993 Capsule position and maturity stage on seed weight, oil content and yield in Sesamum genotypes Madras agricultural journal 80: 706-708 39 Ohlrogge J & Browse T 1995 Lipid biosynthesis Plant cell 7: 957-970 lx 40 Okuley J., Lightner J., Feldmann K., Yada N., Lark E & Browse J 1994 Arabidopsis FAD2 gene codes the enzyme that is essential for polyunsaturated lipid synthesis Plant cell 6: 147-158 41 Pighin J 2003 “Transgenic crops: How genetics is providing new ways to envision agriculture” 42 43 Qing CM., Fan L., Lei Y., Bouchez D., Tournuer C., Yan L., Robaglia C 2000 Transformation of Pachkoi (Brassica rapa L ssp chinensis) by Agrobacterium infiltration Molecular Breeding 6:67-72 44 Slabas A.R., Simon J.W & Brown A.P 2001 Biosynthesis and regulation of fatty acids and triglycerides in oil seed rape Current status and future trends European journal of lipid science and technology 103: 455-466 45 Taskin K M., Ercan A G & Turgut K 1999 Agrobacterium tumefaciens – mediated transformation of sesame (Sesamum indicum L.) Turkish journal of botany 23: 291-295 46 Timms R.E 2005 fractional crystallisation – the fat modification process for the 21st century European journal of lipid science and technology 107:: 48-57 47 Tran Thi Dung, Le Tan Duc, Nguyen Huu Ho and Nguyen Van Uyen, 2006 Agrobacterium – Mediated transformation of Cry1Ac gene to tobacco (Nicotiana tabacum L.) and evaluation of Heliothis armigera resistance In Proceeding of International Workshop on Biotechnology in Agriculture Nong Lam University, Ho Chi Minh city, October 20 – 21, 2006, pp 156 – 160 48 Trieu A T., Burleighet S H., Kardailsky I V., Maldonado-Mendoza I E., Versaw W K., Blaylock L A., Shin H., Chiou T J., Katagi H., Dewbre, G R., Weigel D & Harrison m J 2000 Transformation of Medicago truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium The plant journal 22: 531-554 lxi 49 Uzun B., Ulger S & Cagirgan M I 2002 Comparision of determinate and indeterminate types of sesame for oil content and fatty acid composition Turkish journal of agriculture and forestry 26: 269-274 50 Voelker T & Kinney A 2001 Cariations in the biosyhthesis of seed storage lipids Annual reviews of plant physiology and plant molecular biology 52: 335-361 51 Were B A., Lee M 2001 Variation in seed oil content and fatty acid composition of Sesamum indicum L and its wild relatives in Kenya Jounal of the Swedish seed association 184: 178-183 52 Yermanos D M., Hemstreet S., Saleed W & Huskar, C K 1972 Oil content and composition of the seed in the world collection of sesame introductions Journal of the American oil chemist’ society 49: 20-23 53 Yukawa Y., Takaiwa F., Shoji, K., Masuda K & Yamada K 1996 Structure and expression of two seed-specific cDNA clones encoding stearoyl-acyl carrier protein desaturase from sesame, Sesamum indicum L Plant and cell physiology 37: 201-205 54 http:// www.quiagen.com/ProtocolFeedback 55 http://en.wikipedia.org/wiki/Ti_plasmid (This page was last modified on 28 August 2009 at 23:02) 56 http://vietnews24.com/news ( September th, 2009) 57 http://www.ibt.ac.vn lxii PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH CÂY MÈ TRONG Q TRÌNH NGHIÊN CƯU Hình 1: Cây mè thực chuyển gen Hình 2: Cây mè chuyển gen hình thành quả, hạt lxiii Protocol ly trích plasmid (kit Miniprep) lxiv lxv lxvi ... đường 24, khu phố 7, phường Linh Đông, quận Thủ Đức-Tp Hồ Chí Minh Điện thoại: 01265359935 Email: thuyhue@hcmuaf.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan công trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết luận văn... phẩm vi khuẩn sau biến nạp 35 3.3.2 Thi t lập qui trình biến nạp vi khuẩn vào mè 36 3.3.2.1 Chuẩn bị mè trước chuyển gen .36 3.3.2.2 Thi t lập quy trình chuyển gen…………………………………………... cải thi n giống trồng phương pháp lai tạo truyền thống tiến hành rộng rãi Trong công cụ công nghệ sinh học có giá trị cho việc phát triển giống phạm vi lồi chưa khai thác ứng dụng nhiều thi u