CẢM ỨNG HÌNH THÀNH RỄ TÓC Ở ĐẬU XANH BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes ĐỂ LÀM VẬT LIỆU TẠO CÂY CHUYỂN GEN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CẢM ỨNG HÌNH THÀNH RỄ TÓC Ở ĐẬU XANH BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium rh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CẢM ỨNG HÌNH THÀNH RỄ TÓC Ở ĐẬU XANH BẰNG

VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes ĐỂ LÀM

VẬT LIỆU TẠO CÂY CHUYỂN GEN

Sinh viên thực hiện: MAI THỊ THANH LIÊN Niên khóa: 2011 – 2013

Tháng 12/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CẢM ỨNG HÌNH THÀNH RỄ TÓC Ở ĐẬU XANH BẰNG

VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes ĐỂ LÀM

VẬT LIỆU TẠO CÂY CHUYỂN GEN

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

Tháng 12/2013

LỜI CẢM ƠN

Để có thể bước đi trên con đường tri thức, con vô cùng biết ơn công lao to lớn

của ba mẹ Ba mẹ luôn là người quan tâm, lo lắng và chứa đầy tình yêu thương đối với

con Ba mẹ đã khuyến khích để con có nghị lực, cố gắng học tập cho thật tốt

Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Lãnh

đạo Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và môi trường, Bộ môn Công nghệ sinh học

và tất cả các cán bộ của Viện và Bộ môn đã tạo thuận lợi cho em trong quá trình học

tập và thực hiện đề tài

Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, em đã được sự giúp đỡ, hướng

dẫn, hỗ trợ và động viên từ quý thầy cô cùng các bạn Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc

và chân thành đến:

Cô Tôn Bảo Linh, người đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt kiến thức với sự

nhiệt tình và tận tâm giúp em thực hiện tốt công việc của mình Cô đã tạo mọi điều

kiện tốt nhất có thể cho em trong quá trình làm đề tài

Cô Trần Thị Lệ Minh vì những hỗ trợ vật chất và tinh thần trong quá trình em

thực hiện đề tài

Cảm ơn bạn Anouck và Maxime đã phụ giúp tôi trong một khoảng thời gian và

các bạn Hường, Sang, Sương, Tiên, Vinh đã giúp đỡ và động viên những khi tôi cần

Các thành viên lớp LT11SH, những người bạn đã cùng chia sẻ những niềm vui

và cả những khó khăn trong quá trình học tập

TÓM TẮT

Chuyển gen qua trung gian Agrobacterium là công cụ hiệu quả nhất và được sử

dụng rộng rãi để tạo ra thực vật biến đổi di truyền Phương pháp này ít tốn kém và đơn giản, dễ thực hiện hơn so với các phương pháp khác cùng với khả năng chuyển gen ổn

định, tạo sinh khối lớn Đối tượng thí nghiệm là đậu xanh (Vigna radiata (L.)

Wilczek), một cây trồng quan trọng ở nhiều nước nhiệt đới và cận nhiệt đới nhưng thiệt hại về năng suất, chất lượng rất lớn do các yếu tố bất lợi từ môi trường và đặc biệt

là côn trùng phá hoại trong lưu trữ Vì vậy, đề tài “Cảm ứng hình thành rễ tóc ở đậu

xanh bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes để làm vật liệu tạo cây chuyển gen” được thực hiện để tối ưu hóa phương thức chuyển đổi thông qua A rhizogenes nhằm

tạo cơ sở cho mục tiêu chuyển các gen mong muốn về sau

Hạt đậu xanh TN 182 được sử dụng làm nguồn vật liệu ban đầu cho thí nghiệm Các yếu tố quan trọng như là chủng vi khuẩn, thời gian lây nhiễm và thời gian đồng nuôi cấy, tuổi mẫu cấy đã được nghiên cứu Các mẫu lá mầm đã cắt bỏ trục phôi được

lây nhiễm với các chủng A rhizogenes ICPB TR7, 18912, ATCC 15834, ATCC

11325, là những chủng vi khuẩn hoang dại với 3 cách thức lây nhiễm khác nhau Vi

khuẩn A rhizogenes chủng ATCC 15834 thuộc dòng agropine là lựa chọn tốt nhất cho

quá trình cảm ứng tạo rễ tóc đậu xanh Đồng thời, các mẫu cấy được ngâm trong dịch khuẩn 5 phút cũng là phương pháp được lựa chọn đối với cách thức lây nhiễm vi khuẩn Sự kết hợp đó tạo ra 53,08% mẫu cảm ứng rễ với chất lượng tốt

Theo kết quả thí nghiệm, thời gian lây nhiễm 15 phút được coi là tối ưu cho sự bám dính của vi khuẩn trên bề mặt tế bào thực vật (65,09% mẫu cảm ứng rễ tóc) Ba ngày đồng nuôi cấy cần thiết cho sự vận chuyển T-DNA vào tế bào thực vật và sự biểu hiện của chúng để hình thành kiểu hình rễ tóc (60,91%) Mẫu cấy 2 ngày tuổi (53,94%

mẫu cảm ứng rễ tóc) mẫn cảm với Agrobacterium hơn so với mẫu cấy 3 ngày

(45,84%) và 4 ngày tuổi (31,07%) Khả năng tăng trưởng nhanh, phân nhánh nhiều của rễ tóc được chứng minh trên môi trường rắn không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng Mô sẹo cảm ứng 100% và tốt hơn trên môi trường MS cơ bản bổ sung 0,1 mg/l 2,4 D và 0,4 mg/l kinetin so với nghiệm thức còn lại

SUMMARY

Agrobacterium mediated genetic transformation is the most effective tool and

widely used to generate genetically modified plants This method is less expensive, more simple and feasible than others along with the stable transgenic ability

Experimental subject is mungbean (Vigna radiata (L.) Wilczek), an important pulse

crop in many tropical and subtropical countries but crop losses often occur due to environmental disadvantages and especially insect pest attack during storage Thus, the

thesis “Induce hairy root formation in mung bean by Agrobacterium rhizogenes to make material create transgenic plants” was carried out to optimize the A rhizogenes

mediated transformation protocol on mungbean and provide the basic for target transfer the desired genes later

Seeds of TN 182 mung bean were used as original material for experiments Important factors like bacteria strains, infection and co-cultivation time, explants age were studied Cotyledonary node explants were removed embryonic axis and infected

with A rhizogenes strains IPCB TR7, 18912, ATCC 15834, ATCC 11325, are type bacteria strains along with three different infection mannor Agrobacterium rhizogenes strain ATCC 15834 with belongs to agropine-type is the best choice for

wild-mung bean hairy root induction Simultaneously, explants soaking in bacterial suspensions is the method of choice for bacteria infection This combination generated 53.08% of explants induced hairy roots with good quality

According to research results, infection time 15 minutes was considered optimal for bacteria attachment to the surface of the plant cells (65.09% explants induced hairy root) Three day co-cultivation were required for transport of T-DNA into plant cells and expression to form hairy root phenotype (60.91%) Two day old

explants (53.94%) were more susceptible to Agrobacterium than explants of 3 day old

(45.84%) and 4 day old (31.07%) The ability fast growing, multiple branching of hairy roots was substantiated on solid medium not supplemented with growth regulators Callus induction rate from assumed transformed hairy roots was 100% and better on basal MS medium was supplemented with 0.1 mg/ml 2,4 D and 0.4 mg/l kinetin than the other treatment

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMARY iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về cây đậu xanh 3

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại đậu xanh 3

2.1.2 Đặc điểm thực vật học cây đậu xanh 3

2.1.3 Tầm quan trọng của cây đậu xanh 4

2.1.4 Tình hình sản xuất cây đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam 5

2.2 Vi khuẩn Agrobacterium rhizognenes 6

2.2.1 Phân loại 6

2.2.2 Giới thiệu về Agrobacterium rhizognenes 6

2.2.3 Cơ sở phân tử và sinh lý của sự hình thành rễ tóc 7

2.2.4 Các gen rol của Ri plasmid 9

2.2.5 Cơ chế chuyển T-DNA từ vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào thực vật 10

2.3 Một số nghiên cứu chuyển gen qua trung gian Agrobacterium ở đậu xanh 11

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 15

3.2 Vật liệu 15

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 15

3.2.2 Dụng cụ và thiết bị 15

3.2.3 Môi trường nuôi cấy 15

3.3 Phương pháp nghiên cứu 16

3.3.1 Giai đoạn chuẩn bị nguyên vật liệu 16

3.3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cảm ứng tạo rễ tóc đậu xanh 16

3.3.3 Kiểm tra khả năng tăng trưởng và cảm ứng tạo mô sẹo từ rễ tóc đậu xanh 20

3.3.4 Phương pháp xử lý thống kê 21

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 Giai đoạn chuẩn bị mẫu để chuyển gen 22

4.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cảm ứng tạo rễ tóc đậu xanh 23

4.3 Kiểm tra khả năng tăng trưởng và cảm ứng tạo mô sẹo từ rễ tóc đậu xanh 34

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38

5.1 Kết luận 38

5.2 Đề nghị 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4 D: 2,4-Dichlorophenolxyacetic Acid

ATCC: American Type Culture Collection

BAP: 6-Benzyl aminopurine

bp: base pair

CAEA: cotyledon attached with embryonal axis

cs: cộng sự

IAA: Indole-3-acetic acid

IBA: Indole-3-butyric acid

ICPB: International Collection of Phytopathogenic Bacteria

nptII: neomycin phosphotransferase

OD: Optical Density

PCR: Rolymerase Chain Reaction

RB: Right Border

Ri-plasmid: Root inducing plasmid

T-DNA: Transfer Deoxiribonucleic Acid

Ti-plasmid: Tumor inducing plasmid

TSS: T-DNA transfer stimulator sequence

vir: Virulence

YMB: Yeast Mannitol Broth

WHR: Wide host range

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Các nghiệm thức lây nhiễm vi khuẩn A rhizogenes vào lá mầm đậu xanh 18

Bảng 3.2 Các nghiệm thức xác định ảnh hưởng của 2,4 D và kinetin lên sự cảm

ứng mô sẹo từ rễ tóc đậu xanh 21

Bảng 4.1 Kết quả cảm ứng tạo rễ tóc ở lá mầm đậu xanh in vitro của các chủng

vi khuẩn A rhizogenes và cách thức lây nhiễm khác nhau 24

Bảng 4.2 Kết quả cảm ứng tạo rễ tóc ở lá mầm đậu xanh in vitro với các thời gian

lây nhiễm A rhizogenes khác nhau 28

Bảng 4.3 Kết quả cảm ứng tạo rễ tóc ở lá mầm đậu xanh in vitro với các thời

gian đồng nuôi cấy khác nhau 30

Bảng 4.4 Kết quả cảm ứng tạo rễ tóc ở lá mầm đậu xanh in vitro độ tuổi khác nhau 33

Bảng 4.5 Kết quả cảm ứng tạo mô sẹo từ rễ tóc đậu xanh 36

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cây đậu xanh 3

Hình 2.2 Vi khuẩn Agrobacterium 6

Hình 2.3 Cấu trúc Ri plasmid của A rhizogenes 9

Hình 4.1 Hạt đậu xanh TN 182 và sau 2 ngày tuổi kể từ ngày ủ hạt 22

Hình 4.2 Khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 22

Hình 4.3 Kết quả cảm ứng tạo rễ tóc đậu xanh ở các chủng khuẩn A rhizogenes và cách thức lây nhiễm khác nhau 26

Hình 4.4 Mẫu cấy sau 10 ngày kể từ ngày lây nhiễm A rhizogenes chủng ATCC 15834 27

Hình 4.5 Kết quả cảm ứng tạo rễ tóc đậu xanh ở các thời gian lây nhiễm khác nhau 29 Hình 4.6 Kết quả cảm ứng tạo rễ tóc đậu xanh ở các thời gian đồng nuôi cấy khác nhau 32

Hình 4.7 Kết quả cảm ứng tạo rễ tóc đậu xanh ở các độ tuổi mẫu cấy khác nhau 34

Hình 4.8 Rễ đối chứng và rễ tóc trên môi trường MS rắn 35

Hình 4.9 Mô sẹo xốp và mô sẹo chắc 37

Hình 4.10 Mô sẹo được cảm ứng từ rễ tóc sau 14 ngày nuôi cấy 37

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Chuyển gen qua trung gian Agrobacterium là phương pháp hiệu quả nhất và

được sử dụng rộng rãi để tạo ra thực vật biến đổi gen Phương pháp này ít tốn kém và đơn giản, dễ thực hiện hơn so với biến nạp gen bằng súng bắn gen, xung điện hay vi tiêm đồng thời khả năng chuyển gen ổn định và cho hiệu quả cao Việc sử dụng vi

khuẩn Agrobacterium rhizogenes cho mục đích chuyển gen giúp mang lại lượng sinh

khối lớn đó là rễ tóc trên môi trường không cần bổ sung chất điều hòa sinh trưởng,

nó có thể được dùng trong sản xuất các hợp chất thứ cấp hoặc như là một nguồn vật liệu cho tái sinh một số lượng lớn cây chuyển gen hay sản xuất protein ngoại bào Mặc dù việc biến đổi di truyền ở cây họ đậu rất khó khăn do tần suất tái sinh thấp nhưng cũng đã có những tiến bộ đáng kể trong việc phục hồi cây chuyển gen qua

Agrobacterium ở một vài loài cây họ đậu trong đó có đậu xanh

Đậu xanh là một cây họ đậu quan trọng ở châu Á, có giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao Ở nước ta, cây đậu xanh có vị trí quan trọng trong cơ cấu luân canh, xen canh và gối vụ Đặc biệt ở các tỉnh Bắc Trung Bộ, Đông Nam Bộ và Tây Nguyên, đậu xanh đã trở thành cây trồng chính trong sản xuất vụ hè Tình hình sản xuất, tiêu thụ và chế biến đậu xanh ở nước ta đang có chiều hướng gia tăng nhờ khai thác được một số ưu điểm quan trọng của cây đậu xanh Đó là khả năng cung cấp dinh dưỡng cao, dễ tiêu hóa Thân đậu xanh dùng làm phân hữu cơ góp phần cải tạo đất, tăng độ phì nhiêu Ngoài ra, đây còn là một loại cây giúp cải thiện tình trạng nitơ trong đất hoặc phá vỡ chu kì sâu bệnh trong điều kiện luân canh, xen canh Tuy nhiên, chúng nhạy cảm đối với nấm, vi khuẩn, vi rút gây bệnh, không chịu mặn và hạn hán, năng suất và chất lượng đậu xanh bị suy giảm nghiêm trọng bởi ảnh hưởng của sâu, cỏ dại, thiệt hại nặng nề nhất là sau khi thu hoạch cũng như trong quá trình cất trữ bởi sự phá hoại của côn trùng (mọt đậu)

Để giảm tác hại của những yếu tố trên nhằm tăng năng suất và chất lượng đậu xanh cùng với mục tiêu giảm lượng thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ và kỹ thuật canh tác làm đất tối thiểu ngày càng càng phổ biến trong nền nông nghiệp hiện đại thì chúng ta cần đến kĩ thuật di truyền để cải thiện gen đậu xanh Tuy nhiên, việc nghiên cứu

chuyển gen vào cây đậu xanh ở nước ta vẫn còn hạn chế Do vậy, tối ưu hóa các yếu tố

ảnh hưởng đến quy trình chuyển gen thông qua Agrobacterium là rất cần thiết Với

mục đích xây dựng một quy trình chuyển gen thích hợp sử dụng vi khuẩn

Agrobacterium, làm cơ sở cho mục tiêu chuyển những gen mang tính trạng mong

muốn vào đậu xanh, cùng những điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và phương pháp khả thi, đề tài “Cảm ứng hình thành rễ tóc ở đậu xanh bằng vi khuẩn

Agrobacterium rhizogenes để làm vật liệu tạo cây chuyển gen” được thực hiện

1.2 Yêu cầu của đề tài

Xác định được một vài thông số ảnh hưởng đến hiệu quả cảm ứng tạo rễ tóc như chủng vi khuẩn, cách thức lây nhiễm, thời gian lây nhiễm, thời gian đồng nuôi cấy

và độ tuổi của mẫu cấy

Tạo mô sẹo từ rễ tóc đậu xanh

1.3 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cảm ứng tạo rễ tóc ở lá mầm đậu

xanh in vitro để tối ưu hóa quy trình chuyển gen vào đậu xanh thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

Kiểm tra khả năng tăng trưởng của rễ tóc so với rễ không chuyển gen và khảo sát khả năng tạo mô sẹo từ rễ tóc làm bước đầu cho quá trình tái sinh thành cây đậu xanh chuyển gen

Hình 2.1 Cây đậu xanh

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về cây đậu xanh

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại đậu xanh

Đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) có bộ nhiễm sắc thể 2n = 22, là loại

cây ăn hạt, thân thảo Theo Vavilov, đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ, được phân bố

rộng rãi ở các nước Đông và Nam Á, khu vực Đông Dương Dạng dại của V radiata

cũng được tìm thấy ở Madagasca, bên bờ Ấn Độ Dương, Đông Phi (Nguyễn Đăng Khôi, 1997 – trích dẫn bởi Hoàng Thị Thao, 2010)

Cây đậu xanh thuộc ngành Magnoliopyta, lớp Magnoliopsida, bộ Fabales, họ

Fabaceae, chi Vigna Chi Vigna là một trong những chi lớn của họ đậu, bao gồm 7 chi phụ là: Vigna, Haydonia, Plectropic, Macrohynchus,

Ceratotropic, Lasionspron, Sigmoidotrotopis Đậu xanh

theo quan điểm lấy hạt của nhân dân ta bao gồm các loại

thuộc hai chi phụ là Vigna và Ceratotropic Chi phụ

Ceratotropic còn được gọi là nhóm đậu châu Á mang những

đặc điểm điển hình thể hiện ở mức độ cao nhất cho Vigna

(Trần Đình Long và Lê Khả Tường, 1998)

2.1.2 Đặc điểm thực vật học cây đậu xanh

Đậu xanh là loại cây trồng cạn thu quả và hạt Rễ đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ chính và các rễ phụ Rễ chính ăn sâu khoảng 20 – 30 cm, có khi sâu tới 70 – 100 cm Rễ phụ thường gồm 30 – 40 rễ, dài khoảng 20 – 25 cm (Trần Văn Lài, 1993 – trích dẫn bởi Hoàng Thị Thao, 2010) Đặc biệt do rễ đậu xanh có khả năng sống

cộng sinh với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium nên từ các kẽ nhánh rễ, nhất là sát rễ

chính hình thành các nốt sần Các nốt sần có khả năng cố định nitơ thường có kích thước 4 – 5 mm, màu đỏ, hồng hay nâu Trung bình mỗi vụ, một hecta đậu xanh có thể

bù lại cho đất tương ứng 85 - 107 kg nitơ làm cho đất tơi xốp hơn (Nguyễn Đăng Khôi, 1997 – trích dẫn bởi Nguyễn Thị Luyện, 2009)

Thân đậu xanh thuộc loại thân thảo, mọc thẳng đứng hoặc hơi nghiêng, thân yếu có màu xanh hay tím tùy thuộc kiểu gen và lớp lông mịn màu nâu sáng, cao khoảng 40 – 70 cm, đường kính trung bình từ 8 – 12 mm Thân cây gồm 7 – 8 đốt

Thân phân cành muộn và có trung bình từ 10 - 12 cành, một số giống có từ 9 – 10 cành (Trần Đình Long và Lê Khả Tường, 1998)

Lá thuộc loại lá kép mọc cách, có ba lá chét Lá thật hoàn chỉnh gồm lá kèm, cuống lá và phiến lá Cả hai mặt lá đều có lông bao phủ Trên thân chính có 7 – 8 lá

thật (Trần Đình Long và Lê Khả Tường, 1998)

Hoa đậu xanh là hoa lưỡng tính mọc thành chùm trên các trục hoa Mỗi trục hoa

có thể phát triển thành hai hàng hoa mọc đối nhau, các hoa trên hàng xếp liên tục với nhau tạo cho hoa có hình dạng co rút Khi mới hình thành hoa có hình cánh bướm, màu xanh tím, khi nở màu vàng (Trần Đình Long và Lê Khả Tường, 1998)

Quả đậu xanh thuộc loại quả giáp, hình trụ, dạng tròn, hơi dẹp, dài từ 8 – 10

cm, đường kính từ 4 – 6 mm, có hai gân nổi rõ dọc theo hai bên cạnh quả Quả chín có màu vàng, nâu hoặc đen Một cây trung bình có khoảng 20 - 30 quả, mỗi quả có từ 5 –

10 hạt Trên vỏ quả được bao phủ một lớp lông mịn (Đường Hồng Dật, 2006; Nguyễn Mạnh Chính và Nguyễn Mạnh Cường, 2008 - trích dẫn bởi Hoàng Thị Thao, 2010)

Hạt đậu xanh có hình dạng khá phong phú như hình trụ, trụ hơi cạnh, ovan, tròn, thoi, tam giác Vỏ hạt màu xanh lục, xanh mỡ, xanh tối hay vàng rơm Ruột có màu trắng, vàng hay xanh nhạt (Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp, 1996) Một hạt đậu có 2 tử diệp (lá mầm) Lá mầm chiếm khoảng 90% khối lượng hạt, chúng được cấu tạo từ những tế bào lớn thành mỏng, giữa các tế bào là các khoảng trống Phôi chiếm khoảng 3% khối lượng toàn hạt, gồm 2 phần chính là chồi mầm và rễ mầm, phôi là phần phát triển thành cây non khi hạt nảy mầm

2.1.3 Tầm quan trọng của cây đậu xanh

Đậu xanh là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao, đứng hàng thứ ba sau đậu tương và lạc Về dinh dưỡng, hạt đậu xanh là nguồn thực phẩm giàu đạm (24 - 28%), ngoài ra còn có lipid khoảng 1,3%, glucid 60,2% và các chất khoáng như Ca,

Fe, Na, K, P cùng nhiều loại vitamin hòa tan trong nước như vitamin B1, B2, C Protein hạt đậu xanh chứa đầy đủ các amino acid không thay thế như leucine, isoleucine, lysine, methyonine, valine Lá non và ngọn của cây đậu xanh có thể được dùng để làm rau, muối dưa Thân lá non cây đậu xanh dùng làm thức ăn cho chăn nuôi, còn thân lá già đem phơi khô, nghiền nhỏ làm bột dự trữ cho gia súc (Trần Đình Long và Lê Khả Tường, 1998)

Hạt đậu xanh được dùng để chế biến ra nhiều loại thực phẩm ngon, bổ, hấp dẫn như các loại bột dinh dưỡng, các loại bánh, chè, xôi đậu và một số đồ uống Cây đậu xanh có thời gian sinh trưởng ngắn, khả năng sinh trưởng mạnh, mỗi chu kỳ sinh trưởng kéo dài từ 60 - 90 ngày Mặt khác, yêu cầu kỹ thuật canh tác đơn giản, vốn đầu

tư ít, thu hồi nhanh, có thể trồng nhiều vụ trong một năm Do đó, cây đậu xanh có thể được trồng xen, trồng gối, luân canh trên nhiều loại đất canh tác khác nhau Trồng đậu xanh còn có tác dụng trong cải tạo và bồi dưỡng đất Đậu xanh là nguồn đạm sinh học quan trọng trong cơ cấu cây trồng luân canh bởi hệ rễ đậu xanh có các nốt sần chứa các vi khuẩn cộng sinh có khả năng cố định nitơ từ khí trời, cung cấp một phần đạm cho cây và để lại lượng đạm đáng kể trong đất sau khi thu hoạch Vì vậy, đất sau khi trồng đậu xanh sẽ trở nên tơi xốp và giàu dinh dưỡng hơn (Phạm Văn Thiều, 1997 - trích dẫn bởi Hoàng Thị Thao, 2010) Đậu xanh còn có giá trị trong y học, hạt có vị ngọt, tính mát nên có công dụng thanh nhiệt, giải độc (http://www.ykhoa.net)

2.1.4 Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam

Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới ngày một tăng Đặc biệt trong những năm gần đây do nhu cầu của con người về dinh dưỡng protein thực vật tăng nhanh đã làm thúc đẩy việc sản xuất đậu xanh phát triển mạnh

Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau quả Châu Á có bộ sưu tập giống đậu xanh với khoảng 6.000 mẫu giống, trong đó có những giống cho năng suất cao từ 18 – 25 tạ/hecta Theo kết quả điều tra của trung tâm này, trên thế giới có khoảng 20 nước sản xuất đậu xanh, trong đó Thái Lan, Ấn Độ, Trung Quốc, Pakistan, Philippin, Srilanca được coi là những trọng điểm về diện tích, năng suất và sản lượng (Nguyễn Thị Luyện, 2009)

Năm 2002 – 2006, diện tích trồng đậu xanh khoảng 928.000 ha, sản lượng đạt hơn 6.445 triệu tấn Ấn Độ là nước trồng nhiều nhất với 15.000 ha, chiếm trên 70% diện tích đậu xanh toàn cầu, sản lượng đạt 420.000 tấn, năng suất đạt 2.800 kg/ha (2008) Thái Lan là nước sản xuất lớn thứ hai và đứng đầu về xuất khẩu đậu xanh với sản lượng 92.000 tấn (2008), chiếm khoảng 40% sản lượng thế giới Nước nhập khẩu nhiều đậu xanh nhất là Nhật Bản với 80 tấn/năm và Hoa Kỳ 50 tấn/năm

Ở Việt Nam, đậu xanh được gieo trồng ở nhiều địa phương trên cả nước, việc sản xuất trong nước chủ yếu để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng của người dân như làm giá, làm bánh Các sản phẩm làm từ đậu xanh rất phong phú nhưng hiện nay chỉ một số ít

sản phẩm có chất lượng ổn định và có thương hiệu lâu năm trên thị trường như bánh đậu xanh là một đặc sản của tỉnh Hải Dương

Ngày nay, đậu xanh có xu hướng gia tăng về diện tích và sản lượng do nhu cầu sử dụng Để đạt được kết quả tốt cần có các phương pháp lai tạo, áp dụng kỹ thuật di truyền để tạo ra các giống mới có năng suất cao, chống chịu được các điều kiện khắc nghiệt của môi trường

2.2 Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

2.2.2 Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes

Agrobacterium rhizogenes (trước đây được gọi là Phytomonas rhizogenes) như là

một tác nhân gây bệnh thực vật với triệu chứng rễ tóc hoặc bệnh thảm rễ

Agrobacterium rhizogenes là vi khuẩn gram âm, sống trong đất, hình que, có tính di động, không sinh bào tử, thuộc chi Agrobacterium Vi khuẩn A rhizogenes có quan hệ rất gần với A tumefaciens là tác nhân gây khối u sần trên cây

Đến nay, những hiểu biết cơ bản về cơ chế phân tử của sự biến nạp gen thực vật

bởi những thành viên của chi Agrobacterium đều là dựa trên những nghiên cứu mở rộng sử dụng A tumefaciens Quá trình lây nhiễm được xem như là tương tự nhau trong cả 2 loài Agrobacterium rhizogenes lây nhiễm vào tế bào thực vật ở vị trí vết thương do A rhizogenes bị thu hút bởi hợp chất phenol được tiết ra từ những tế bào bị tổn thương Ri plasmid của A rhizogenes sẽ xâm nhập vào tế bào thực vật và một đoạn

nhỏ của Ri plasmid là T-DNA sẽ được chuyển và gắn vào bộ gen của tế bào thực vật Theo cách này T-DNA được duy trì ổn định trong bộ gen mà nó chuyển vào Từ vùng

bị nhiễm sẽ tạo ra những rễ nhánh bất thường gọi là rễ tóc Những rễ này có đặc điểm

là phát triển ăn nghiêng, phân nhánh nhiều, tăng trưởng nhanh (Tepfer, 1984;

Hình 2.2 Vi khuẩn Agrobacterium

(http://commtechlab.msu.edu)

Balandrin và cs, 1985; Charlwood và Charlwood, 1991; Flores và cs, 1999 - trích dẫn

bởi Veena và Taylor, 2007) Một đặc tính quan trọng của rễ tóc là chúng có khả năng

phát triển in vitro trong điều kiện không có các yếu tố kích thích tăng trưởng (Rao và

Ravishankar, 2002) Những đặc tính này làm cho rễ tóc trở thành một công cụ được sử

dụng rộng rãi trong việc sản xuất các hợp chất thứ cấp, khảo sát chức năng gen, và

nghiên cứu sinh học rễ nói chung

Vi khuẩn A rhizogenes có một vùng DNA lõi được bảo tồn cao thiết yếu cho sự

hình thành rễ tóc (Filetici và cs, 1987) Các chủng A rhizogenes có thể được phân loại

vào nhiều nhóm phụ khác nhau dựa trên kiểu opine mà chúng sản xuất ra Trong đó,

hai nhóm chính là các chủng thuộc dòng agropine (ví dụ như A4, 15834, HRI,

LBA9402, 1855) cảm ứng rễ để tổng hợp agropine, mannopine và các axit tương ứng,

và dòng mannopine (ví dụ như 8196, TR7, TR101) cảm ứng rễ để sản xuất mannopine

và các axit tương ứng (Rhodes và cs, 1990 – trích dẫn bởi Sevón và cs, 2002) Ngoài

ra, còn có dòng cucumopine (đại diện là chủng 2659) và mikimopine (đại diện là

chủng 1724) Mikimopine và cucumopine là những chất đồng phân lập thể, nhưng

không có tính tương đồng giữa các gen tổng hợp opine ở mức độ nucleotide Trong số

các dòng A rhizogenes khác nhau thì K47, K599 và HRI là các dòng gây độc cao có

khả năng lây nhiễm cho nhiều loài thực vật khác nhau

2.2.3 Cơ sở phân tử và sinh lý của sự hình thành rễ tóc

Quá trình hình thành rễ tóc có thể được chia thành 4 bước: kích hoạt, xử lý,

sự di chuyển của DNA từ vi khuẩn vào tế bào thực vật, và sau đó là sự cảm ứng

hình thành rễ và tăng trưởng Trong đó, 3 bước đầu tiên được hiểu nhiều hơn nhờ

các nghiên cứu sâu ở A tumefaciens chủng C58 Sự lây nhiễm và chuyển gen bằng

A rhizogenes như thế nào sau đó dẫn tới kiểu hình của sự hình thành rễ tóc và sự

tăng sinh vẫn còn chưa hiểu rõ

Ri plasmid của A rhizogenes có cấu trúc tương tự với Ti plasmid của

A tumefaciens, cả hai đều có kích thước lớn (200 – 800 kb) Các cơ chế của sự hoạt

hóa và vận chuyển T-DNA từ vi khuẩn vào tế bào thực vật được bảo tồn giữa 2 loại

plasmid Trong cả Ri và Ti plasmid, hai bên T-DNA có đoạn lặp lại dài khoảng 25

bp, được gọi là trình tự biên (Yadav và cs, 1982) T-DNA mang một nhóm gen vir

gây độc và gen dị hóa opine, biểu hiện ở tế bào thực vật chuyển gen là sự phát triển

bất tận của mô và sự sản xuất opine, các dẫn xuất amino acid hầu như được vi khuẩn

sử dụng độc quyền như là nguồn carbon và nitrogen (Guyon và cs, 1980) Chúng chứa các gen chịu trách nhiệm cho xử lý, bám dính và chuyển T-DNA đến tế bào thực vật, và cho chuyển hóa các opine trong mô thực vật (Chilton và cs, 1982)

Mặc dù tương tự nhau trong thành phần cơ bản và cơ chế chuyển gen nhưng

Ri và Ti plasmid vẫn tồn tại một số khác biệt (Moriguchi và cs, 2001) Ví dụ như vùng T-DNA của Ti plasmid chứa các gen tổng hợp auxin, cytokinin và opine trong khi Ri plasmid chỉ mang các gen tổng hợp auxin và opine, gây ra hiệu quả tác động

khác nhau lên thực vật Ri plasmid của A rhizogenes không chứa trình tự overdrive được tìm thấy trong Ti plasmid của A tumefaciens Trình tự overdrive 24 bp với 1

trình tự trung tâm 8 bp được bảo tồn nằm liền kề biên phải trên Ti plasmid (Shurvinton và Ream, 1991) và được biết là làm gia tăng hiệu quả hình thành khối u bằng cách tăng cường xử lý biên T-DNA Trong khi đó, biên phải TR của Ri plasmid

có một trình tự lặp lại 8 bp gọi là trình tự kích thích vận chuyển T-DNA (TSS), nó tăng cường hiệu quả chuyển T-DNA vào hệ gen thực vật (Hansen và cs, 1992) TSS gồm 12 lần lặp lại trình tự 5-TGCCTTCG-3 ở các chủng dòng mikimopine, 6 lần lặp lại trình tự 5-ATTAGTTC-3 ở các chủng dòng mannopine, 5 lần trình tự 5-TTGTTCAA-3 ở các chủng dòng agropine, và 16 lần trình tự 5-GTTCGTCA-3 ở các

chủng A rhizogenes dòng cucumopine

Một sự khác biệt nữa là việc thiếu gen virE1 và virE2 trong Ri plasmid và bộ gen A rhizogenes (Moriguchi và cs, 2001; Hogdes và cs, 2004) VirE2 là một protein liên kết với DNA chuỗi đơn, và virE1 là chất tiết đi kèm của nó Chức năng của virE2 là bảo vệ T-DNA sợi đơn khỏi sự phá hủy của nuclease (Rossi và cs, 1996) và

thúc đẩy sự xâm nhập nhân của nó trong tế bào thực vật (Yusibov và cs, 1994; Rossi

và cs, 1996; Zupan và cs, 1996; Gelvin, 1998) Các gen virE rất quan trọng cho sự phát sinh bệnh của A tumefaciens nhưng không phải là thiết yếu cho sự cảm ứng rễ tóc (Moriguchi và cs, 2001) Vi khuẩn A rhizogenes chứa gen GALLS trên Ri plasmid, có thể thay thế chức năng của gen virE2 trong A tumefaciens Cả GALLS

và virE2 đều chứa trình tự định vị nhân và một tín hiệu tiết loại IV đầu C Tuy nhiên,

cơ chế mà protein GALLS có thể thay thế chức năng VirE2 trong A rhizogenes vẫn

chưa được biết đến

Tất cả các chủng A rhizogenes đều chứa một vùng T-DNA trên Ri plasmid mang những gen liên quan đến khởi xướng và phát triển rễ (gen rol), các gen liên quan

đến sinh tổng hợp opine, và các gen chưa rõ chức năng (Slightom và cs, 1986) Một

T-DNA thứ 2 có thể xuất hiện chứa những gen liên quan đến sự tổng hợp auxin (aux1 hoặc iaaM và aux2 hoặc iaaH) cùng với các gen chưa rõ chức năng khác Ri plasmid

với hai T-DNA (TL và TR) được gọi là “slipt” T-DNA Ri plasmid của các chủng sản xuất cucumopine và mannopine chỉ có

một vùng T-DNA, chủng sản xuất

agropine có một split T-DNA, mỗi vùng

có kích thước khoảng 15-20 kb Cả TL

-DNA và TR-DNA đều được chuyển và

tích hợp một cách độc lập vào bộ gen cây

chủ, việc chuyển TL-DNA là cần thiết cho

sự cảm ứng rễ tóc (Phelep và cs, 1991;

Nilsson và Olsson, 1997; Sevon và

Oksman-Caldentey, 2002)

2.2.4 Các gen rol của Ri plasmid

Các gen liên quan đến cảm ứng rễ tóc đều nằm trên TL-DNA (Cardarelli và cs, 1987) TL-DNA của Ri plasmid dòng agropine có chứa 4 locus rolA, rolB, rolC, rolD tương ứng với các khung đọc mở ORF 10, 11, 12, 15 Ba gen rolA, rolB, rolC đóng vai trò quan trọng nhất trong cảm ứng rễ tóc Đặc biệt, rolB có vẻ là quan trọng nhất trong quá trình phân biệt các tế bào chuyển đổi, trong khi rolA và rolC cung cấp với

các chức năng phụ trợ (Palazón và cs, 1997 – trích dẫn bởi Sevón và cs, 2002)

TR-DNA chỉ thấy trong Ri plasmid của A rhizogenes dòng agropine chứa các gen (aux1, aux2, RolB TR, mas1, mas2 và ags) kiểm soát quá trình tổng hợp opine

và auxin (Christey, 2001) Các gen aux không đóng vai trò thiết yếu cho sự sản xuất

rễ tóc (Cardarelli và cs, 1987) Các dòng A rhizogenes sản xuất các opine như

mannopine, cucumopine, hay mikimopine chuyển một đoạn T-DNA đơn tương đồng với TL-DNA của agropine nhưng không có gen rolD (Meyer và cs, 2000; Christey,

2001) T-DNA của các chủng sản xuất cucumopine và mannopine không có các gen

aux mà chỉ có gen rol và đủ cho việc tạo ra kiểu hình rễ tóc (Veena và Taylor, 2007)

Hình 2.3 Cấu trúc Ri plasmid của

A rhizogenes (Veena và Taylor, 2007)

Gen rolA được tìm thấy trên tất cả các Ri plasmid Tuy nhiên, chỉ có một nửa

số protein đầu N được bảo tồn cao trong các chủng A rhizogenes được nghiên cứu (Britton và cs, 2008) RolA đóng vai trò quan trọng trong sự hình thành rễ tóc và có

liên quan đến sự mất cân bằng hormon thực vật như làm giảm auxin, cytokinin,

giberellin và axit abscisic (Dehio và cs, 1993) Trình tự gen rolA của nhiều dòng A rhizogenes khác nhau dài khoảng 279 – 423bp (Meyer và cs, 2000)

RolB là gen gây độc quan trọng nhất, biểu hiện một mình rolB cũng đủ để cảm ứng rễ tóc (Britton và cs, 2008) Phụ thuộc vào dòng vi khuẩn, gen rolB có

kích thước từ 762 – 837 bp và mã hóa một protein 259 – 279 amino acid (Meyer

và cs, 2000) Sự biểu hiện của rolB ở mức độ thích hợp cần thiết cho rễ tóc tăng

trưởng vì mức độ biểu hiện cao hay thấp sẽ làm suy yếu sự tăng trưởng của những

cơ quan này (Tanaka và cs, 2001)

Gen rolC từ các Ri plasmid khác nhau tương tự về kích thước với khoảng 540

bp và mã hóa protein có 179 - 181 amino acid Sự biểu hiện của rolC ảnh hưởng đến

sự cân bằng của các cytokinin dạng tự do và kết hợp, cũng như auxin và gibberellins

(Estruch và cs, 1991b; Nilsson và cs, 1993b, 1996a, b) Biểu hiện của rolC cũng làm

giảm đáng kể mức độ axit abscisic (ABA), polyamine, và ethylene (Nilsson và cs, 1996a; Martin-Tanguy 1996, 2001 - trích dẫn bởi Veena và Taylor, 2007)

Gen rolD chỉ được tìm thấy trong T-DNA của Ri plasmid dòng sản xuất

agropine Nó có kích thước 1.032 bp và mã hóa một protein có 344 amino acid (Meyer và cs, 2000), đó là một enzyme ornithine cyclodeaminase xúc tác chuyển hóa

ornithine thành proline Sự biểu hiện của rolD trong cây chuyển gen sẽ kích thích ra

hoa sớm, tăng số lượng hoa và có thể có liên quan đến năng suất của cây Thêm vào

đó, sự tích lũy proline có thể là một phản ứng bảo vệ liên quan đến stress Bên cạnh

các gen rol, T-DNA của Ri plasmid còn chứa một vài ORF mà sự có mặt của nó ảnh

hưởng tới sản xuất rễ tóc như là ORF 3, 8 và 13 (Veena và Taylor, 2007)

2.2.5 Cơ chế chuyển T-DNA từ vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào thực vật

Các vùng T-DNA của cả A tumefaciens và A rhizogenes đều nằm ở bên cạnh

trình tự biên và các điểm kết thúc của T-DNA đã hợp nhất trong genome thực vật nằm sát với các trình tự này Trình tự liên ứng của biên T-DNA là GGCAGGATATTC/GA/G

GT/GTCTAAA/TT/C Hầu hết các nghiên cứu cơ chế chuyển T-DNA từ Agrobacterium vào tế bào thực vật đã được tiến hành ở A tumefaciens Việc loại bỏ biên phải của Ti-

plasmid dòng nopaline đã làm mất sự hình thành khối u, nhưng khi đoạn oligonucleotid tương đồng với biên phải được tạo dòng với sự định hướng chính xác với Ti plasmid thiếu biên phải thì sự hình thành khối u lại được phục hồi, cho thấy rằng các trình tự lặp lại 25 bp phân cực và tác động cis

Sự tiếp xúc của Agrobacterium với các hợp chất giải phóng từ mô thực vật bị tổn thương đã làm cho vùng vir của Ti plasmid phiên mã Trong quá trình này một

chất có hoạt tính hóa học cao và đặc trưng đã được nhận biết là acetosyringone

Gen virA và gen virC được biểu hiện ở vi khuẩn sinh trưởng sinh dưỡng mặc dù gen virC chỉ được phiên mã ở mức độ thấp Khi Agrobacterium gặp dịch rỉ của các

tế bào thực vật bị tổn thương, hoặc acetosyringone tinh khiết, sản phẩm của gen

virA (có thể liên kết với màng) sẽ nhận diện và tương tác với acetosyringone và truyền tín hiệu ngoại bào vào trong tế bào này làm hoạt hóa sản phẩm của gen virC Sau đó protein VirC đã biến đổi làm cho hoạt hóa các gen virB, C, D và E không hoạt động và làm tăng cường sự phiên mã của gen virC

Sự cảm ứng gen vir xảy ra nhờ sự xuất hiện các điểm đứt sợi đơn trong các

trình tự biên 25 bp nằm ở mép của T-DNA (Stachel và Zambryski, 1986; Albright, 1987) và sự xuất hiện phân tử sợi đơn mạch thẳng tương ứng với T-DNA Các sản

phẩm của operon virD có hoạt tính endonuclease (Yanofsky, 1986) Bằng một cơ

chế tương tự sự tiếp hợp của vi khuẩn, T-DNA được chuyển sang tế bào thực vật và xen một cách ổn định vào DNA nhân (Stachel và Zambryski, 1986) Sự kiện này có

thể liên quan đến protein được mã hóa bởi operon virE (Winans, 1987) (Trần Quốc

Dung và cs, 2006)

2.3 Một số nghiên cứu chuyển gen qua trung gian Agrobacterium ở đậu xanh

Những nghiên cứu về chuyển gen qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium đã

được thực hiện trên nhiều loài thực vật khác nhau cả cây lương thực và cây dược liệu như khoai tây, khoai lang, thuốc lá, đậu nành, cà độc dược, thanh hao và nhân

sâm Tuy nhiên, những nghiên cứu chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium vào

cây đậu xanh vẫn còn rất hạn chế không chỉ ở trong nước mà ở cả nước ngoài, đặc

biệt là chuyển gen bằng A rhizogenes Pal và cộng sự (1991) là người đầu tiên phục hồi thể biến nạp trên sự chọn lọc kanamycin từ lá mầm của đậu xanh được ủ với vi khuẩn A tumefaciens

Tazeen và Mirza (2004) đã sử dụng A tumefaciens chủng C58C1 (pGV2260) chứa vector nhị phân p35SGUSINT với gen chọn lọc nptII và gen chỉ thị gus cho khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến chuyển gen qua trung gian Agrobacterium ở V radiata

giống NM92 (khả năng nảy mầm tốt hơn so với giống NCM 209 và NM98) Vi khuẩn được tăng trưởng qua đêm ở 28 - 300C trong môi trường YEB chứa 50 mg/l kanamycin và ampicillin Dùng kanamycin 50 mg/l để chọn lọc các tế bào chuyển đổi Kết quả đưa ra là biểu hiện GUS tạm thời cao nhất (70%) ở pH môi trường đồng nuôi cấy bằng 5,8 sau 3 ngày đồng nuôi cấy ở mẫu cấy 2 ngày tuổi Giá trị pH 5,7 cũng cho kết quả tốt nhưng thấp hơn nữa hiệu quả chuyển đổi sẽ giảm, đặc biệt ở pH 5,0 không có sự biểu hiện GUS Kéo dài thời gian đồng nuôi cấy quá 3 ngày làm giảm tần suất chuyển đổi Mẫu cấy 4 và 6 ngày tuổi cho phần trăm biểu hiện GUS tạm thời tương ứng là 50% và 30% Mật độ tế bào vi khuẩn OD560 = 1 được coi là tối

ưu cho tỷ lệ chuyển đổi cao nhất (36,36% biểu hiện GUS), biểu hiện GUS tạm thời giảm khi giá trị OD thấp hoặc cao hơn đặc biệt thấp nhất (5,8%) là ở OD bằng 1,5 Các mẫu cấy lá sơ cấp cho thấy hiệu quả chuyển đổi cao (80%) trong khi trụ hạ diệp (60%) hoặc rễ (40%) Theo Tazeen và Mirza, Jaiwal và cs cũng đã báo cáo kết quả tương tự (1998, 2001) Mẫu trụ hạ diệp, lá sơ cấp, rễ sau lây nhiễm cũng đã được sử dụng để tái sinh thành cây chuyển gen nhưng hiệu quả thấp

Trong năm 2004, Suraninpong và cộng sự cũng báo cáo nghiên cứu “Chuyển

gen qua trung gian Agrobacterium ở đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek)” Plasmid pCAMBIA 1301-choA với gen chọn lọc hpt và gen gusA được chuyển vào vi khuẩn

A rhizogenes chủng K599 và A tumefaciens chủng EHA105 để đưa gen choA

(cholesterol oxidase) kháng côn trùng vào đậu xanh Nghiên cứu cũng thực hiện với

chủng vi khuẩn chưa biến nạp plasmid mang gen choA Hạt giống KPS 1 và SUT 1

được khử trùng và nuôi trên môi trường MS Lá mầm 2 ngày tuổi của giống KSP1 được tiêm và đồng nuôi cấy 3 ngày với vi khuẩn rễ tóc cho khả năng sản xuất rễ nhánh cao nhất (96,23%, trung bình 10 rễ trên mỗi mẫu) trong khi nghiệm thức 5 và 7 ngày tuổi thì hiệu quả tương ứng là 75,47% và 42,86% Đồng nuôi cấy ở 240C và chuyển sang môi trường MB (chứa 500 µg/ml timentin) là 280C dưới 16 giờ chiếu sáng Kết

quả cuối cùng thu được 13,25% dòng dương tính GUS Chuyển gen với A tumefaciens

EHA105 pCAMBIA 1301-choA, mẫu 2 ngày tuổi nuôi trên MB chứa 2 µg/ml BAP 4 ngày trước khi lây nhiễm cho hiệu quả chuyển đổi cao nhất (31,25%) Đồng nuôi cấy

và nuôi cấy được nuôi lần lượt ở 250C và 25±30C Nghiên cứu này cho thấy rằng acetosyringone không dẫn đến tỷ lệ chuyển đổi cao ở đậu xanh mặc dù rễ sản xuất nhiều, tăng trưởng nhanh ở nồng độ 100 µM acetosyringone kết hợp với 5 hoặc 10 µg/ml BAP nhưng không có sự hoạt động của GUS Ngoài ra, 250C giúp tăng cường biểu hiện GUS tạm thời trong khi nhiệt độ càng cao sẽ ức chế sự vận chuyển T-DNA

Nghiên cứu “Hiệu quả chuyển gen đậu xanh được tăng cường bằng việc sử dụng các mẫu lá sơ cấp” đã được thực hiện bởi Mahalakshmi và cộng sự (2006) Tác giả đã sử dụng phương pháp tái sinh trực tiếp từ mẫu cấy được lây nhiễm vi khuẩn để tạo cây chuyển gen Hạt giống K-851 được khử trùng và cho nảy mầm trên môi trường B5 với 3% đường sucrose và 0,7% agar, nuôi ở điều kiện 16 giờ chiếu sáng, 25±10C,

độ ẩm 75%, cường độ ánh sáng 60 μE/m2.s Các mẫu lá từ cây 10 ngày tuổi được

ngâm trong 5 phút với huyền phù vi khuẩn A tumefacien chủng C58 có A600 bằng 0,6, thấm trên giấy lọc vô trùng và đồng nuôi cấy trong 2 ngày Sau đó, chúng được chuyển đến môi trường tạo chồi (SIM) đã khảo sát trước đó chứa 200 mg/l cefotaxime trong 1 tuần để loại bỏ vi khuẩn và phục hồi mẫu cấy Tiếp tục chuyển mẫu vào môi trường SIM với tác nhân chọn lọc là hygromycin trong 4 tuần rồi đến môi trường tạo rễ (RIM) Phân tích GUS được thực hiện sau đồng nuôi cấy 3 tuần với 70% biểu hiện GUS Các nhà nghiên cứu cũng đã chứng minh sự ổn định của gen chuyển thông qua phân tích PCR cây chuyển gen T0 và cây thế hệ T1

“Chuyển gen qua trung gian Agrobacterium ở đậu xanh (Vigna radiata (L.)

Wilczek)” là công trình nghiên cứu của Islam và Islam năm 2010 Hạt đậu xanh giống BINA-5 được cho nảy mầm trên môi trường WA (Water Agar) không đường Hai loại mẫu cấy sử dụng là lá mầm 1 ngày tuổi đến 2 ngày tuổi và CAEA (lá mầm kèm trục phôi) từ hạt đã khử trùng bề mặt cho nảy mầm qua đêm Chúng được lây

nhiễm với A tumefaciens chủng LBA 4404 chứa plasmid nhị thể pBI121 với các gen đánh dấu là gusA và neomycinphosphotransferase (nptII) Hiệu quả biểu hiện

GUS cao nhất được thu nhận ở mẫu CAEA sau 45 phút ngâm trong dịch khuẩn với

OD600 bằng 1,3 và 3 ngày đồng nuôi cấy Sau đó mẫu cấy cũng đã được cảm ứng chồi và rễ để tái sinh thành cây chuyển gen

Năm 2012, Yadav và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu “Tối ưu hóa chuyển

gen qua trung gian Agrobacterium ở mẫu cấy nốt lá mầm của Vigna radiata” Chồi

được tái sinh trực tiếp từ nốt lá mầm được tạo vết thương bằng kim tiêm và lây

nhiễm A tumefaciens chủng LBA 4404 (pTOK233) có vector nhị phân pCAMBIA

2301 chứa gen nptII, gus và annexin 1 bj cho thấy hoạt động GUS mạnh hơn so với

chủng EHA105 và C58C1 Khi thí nghiệm với dịch khuẩn có OD 0,5 - 1,5, pH môi trường 5,8 thì giá trị OD 0,8 cho hiệu quả chuyển đổi cao nhất Theo tác giả, Jaiwal

và cộng sự (1998, 2001) cũng đã báo cáo kết quả tương tự Mật độ tế bào vi khuẩn từ

106 - 109 tế bào/cm3 được khảo sát và cho thấy hiệu quả chuyển đổi tăng theo nồng

độ lên 108 tế bào/cm3 Thời gian lây nhiễm, thời gian đồng nuôi cấy, tuổi mẫu cấy, nồng độ acetosyringone, môi trường lây nhiễm đều được thử nghiệm Kết quả là 15 phút ngâm trong dịch khuẩn, 3 ngày đồng nuôi cấy, mẫu từ cây 3 ngày tuổi, acetosyringone ở nồng độ 100 mM và sử dụng môi trường MSB5 được thấy là cho kết quả tốt nhất Ngoài ra, nuôi mẫu cấy trên môi trường tái sinh trước khi lây nhiễm

2 – 3 ngày cũng đóng vai trò trong nâng cao hiệu quả chuyển đổi và phản ứng tái sinh Tái sinh cây chuyển gen thu được sau 80 ngày trên môi trường cảm ứng chồi chứa 100 mg/l kanamycin và 250 mg/l cefotaxime và tạo rễ trên ½ MSB5 Biểu hiện của gen GUS được phát hiện trong cả cây T0 và T1 Ngoài ra vẫn còn một vài nghiên

cứu khác nhưng chủ yếu vẫn là sử dụng vi khuẩn A tumefaciens

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ ngày 1/6/2013 đến ngày 1/12/2013 tại Bộ môn Công nghệ sinh học và Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, khu phố 6, phường Linh Trung, Quận Thủ Đức, Thành phố

Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đậu xanh TN 182 sản xuất bởi Công ty TNHH – TM Trang Nông, Bình Chánh, Thành phố Hồ Chí Minh Chọn những hạt có kích thước đồng đều nhau để thực hiện các thí nghiệm trong đề tài

Vi khuẩn A rhizogenes chủng ICPB TR7, 18912, ATCC 11325, ATCC 15834

là những chủng vi khuẩn nguyên thủy không mang plasmid tái tổ hợp do TS Trần Thị

Lệ Minh, Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh cung cấp

3.2.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường YMA để nuôi cấy vi khuẩn và môi trường YMB lỏng để tăng sinh

vi khuẩn A rhizogenes

Môi trường MB5 là môi trường khoáng đa lượng và vi lượng MS (Murashige

và Skoog, 1962) được cải biên để môi trường giàu vitamin hơn bằng cách thay thế thành phần vitamin trong MS thành vitamin B5 của Gambrog và cộng sự (1968) dùng

để nuôi mẫu cấy cảm ứng rễ tóc sau khi đồng nuôi cấy mẫu với vi khuẩn A rhizogenes

và nuôi tăng sinh rễ tóc

Môi trường MS (bổ sung chất điều hòa sinh trưởng) dùng để nuôi mẫu rễ tóc đậu xanh cho cảm ứng tạo mô sẹo

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Giai đoạn chuẩn bị nguyên vật liệu

 Mẫu đậu xanh

Quy trình khử trùng hạt áp dụng theo quy trình của Nguyễn Thị Luyện (2009)

bao gồm 2 bước Bước đầu là khử trùng hạt ngoài buồng cấy, hạt đậu xanh được rửa

bằng nước máy, sau đó rửa sạch bằng xà phòng rồi tráng lại nhiều lần bằng nước cất

Sau đó là bước khử trùng trong buồng cấy, hạt đậu xanh được khử trùng bằng cồn 70%

trong 1 phút, tráng lại bằng nước cất khử trùng 2 lần Ngâm hạt trong dung dịch Javen

60% trong 20 - 25 phút, sau đó rửa bằng nước cất khử trùng 3 lần

Hạt đã khử trùng được ngâm trong nước cất vô trùng qua đêm rồi tiếp tục nuôi

ở nhiệt độ phòng, trong điều kiện ánh sáng tự nhiên Sau 2 ngày nuôi cấy, khi hạt nảy

mầm lộ ra 2 lá mầm, dùng dao cấy loại bỏ hết trục phôi (chứa chồi mầm, trụ hạ diệp và

rễ mầm) sẽ được mẫu lá mầm dùng cho thí nghiệm

 Vi khuẩn A rhizogenes

Vi khuẩn A rhizogenes được giữ giống trên môi trường YMB rắn, 4 tuần cấy

chuyền một lần Chọn một khuẩn lạc đơn nuôi trong ống falcon 50 ml có chứa 30 ml

môi trường YMB lỏng, lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày Đo độ hấp

thu ánh sáng của dịch khuẩn ở bước sóng 600 nm Khi giá trị OD đạt 0,5 – 1,0 thì tiến

hành thí nghiệm (1 OD tương đương khoảng 3 x 109 vi khuẩn/ml)

3.3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cảm ứng tạo rễ tóc đậu xanh

Thí nghiệm 1: Xác định chủng vi khuẩn A rhizogenes và cách thức lây nhiễm

thích hợp vào lá mầm đậu xanh

Trong quá trình biến đổi di truyền thực vật qua trung gian vi khuẩn

A rhizogenes có rất nhiều yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả cảm ứng tạo rễ

tóc, trong đó có ảnh hưởng của các chủng A rhizogenes khác nhau Vậy để tìm ra

chủng vi khuẩn cho kết quả cảm ứng rễ tóc tối ưu trong những chủng có được và cách

thức lây nhiễm thích hợp, thí nghiệm được thực hiện với 4 chủng ICPB TR7, 18912,

ATCC 11325, ATCC 18534 và 3 cách lây nhiễm Lá mầm đậu xanh 2 ngày tuổi được

dùng làm nguyên liệu ban đầu cho quá trình cảm ứng tạo rễ tóc

Các mẫu lá mầm đậu xanh in vitro được loại bỏ vỏ và cắt để loại bỏ trục phôi

cũng đồng thời là tạo được vết thương cho mẫu, sau đó lây nhiễm A rhizogenes theo 3

cách Cách thứ nhất, dùng kim tiêm tạo khoảng 5 đến 6 vết thương ở mặt dưới lá mầm

rồi nhúng mẫu cấy vào dung dịch vi khuẩn Cách thứ hai, dùng dao cấy tạo 3 đến 4 vết thương dài khoảng 0,2 – 0,3 cm rồi tiến hành tương tự như phương pháp tiêm Cách thứ ba, mẫu không được tạo thêm vết thương và được ngâm trong dịch vi khuẩn 5 phút Sau khi xử lý tạo vết thương, lây nhiễm khuẩn, lá mầm được đặt vào đĩa petri chứa lớp giấy thấm được làm ẩm bởi nước cất vô trùng Các đĩa petri được đặt hoàn toàn trong tối, đồng nuôi cấy 3 ngày Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu được chuyển vào nuôi cấy trên 20 ml môi trường MB5 rắn có bổ sung cefotaxime (250 mg/l) để loại

bỏ vi khuẩn tránh gây cản trở cho sự phát triển của mẫu và cảm ứng tạo rễ tóc trong điều kiện ánh sáng tự nhiên, tất cả đều ở nhiệt độ phòng Các đối chứng được thực hiện tương tự nhưng ngâm mẫu trong YMB lỏng thay cho dịch khuẩn

Thí nghiệm gồm 2 yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên Có 12 nghiệm thức và mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại gồm 3 đĩa petri đường kính 9 cm Mỗi đĩa cấy 20 mẫu lá mầm Chỉ tiêu theo dõi là tỷ lệ mẫu sống, tỷ

lệ mẫu cảm ứng tạo rễ tóc, số rễ tóc trung bình tạo ra trên một mẫu và chiều dài rễ sau

8 ngày kể từ khi lây nhiễm A rhizogenes Đếm số lượng rễ theo số rễ chính mọc ra từ

mẫu lá mầm, không đếm rễ nhánh Chiều dài rễ được tính bằng đơn vị centimet và được đo từ gốc đến đỉnh của rễ tóc Chất lượng rễ được đánh giá dựa trên chiều dài rễ

và quan sát đặc điểm rễ như khả năng sinh trưởng nhanh hay chậm, rễ to hay nhỏ Chất lượng tốt được quy định cho rễ dài, to khỏe, sinh trưởng mạnh Chất lượng kém được quy định cho rễ có chiều dài ngắn hơn, đường kính rễ nhỏ hớn, dễ chết do cảm ứng tại các vị trí vết thương với kích thước nhỏ Các chỉ tiêu theo dõi được tính toán theo các công thức như sau:

Số rễ tóc trung bình trên một mẫu (rễ) =

Số mẫu cảm ứng tạo rễ tóc

Bảng 3.1 Các nghiệm thức lây nhiễm vi khuẩn A rhizogenes vào lá mầm đậu xanh

18912

18912

18912 ATCC 11325 ATCC 11325 ATCC 11325 ATCC 15834 ATCC 15834 ATCC 15834

Tạo vết thương bằng kim và nhúng dịch khuẩn Tạo vết thương bằng dao và nhúng dịch khuẩn Ngâm mẫu trong dịch khuẩn 5 phút Tạo vết thương bằng kim và nhúng dịch khuẩn Tạo vết thương bằng dao và nhúng dịch khuẩn Ngâm mẫu trong dịch khuẩn 5 phút Tạo vết thương bằng kim và nhúng dịch khuẩn Tạo vết thương bằng dao và nhúng dịch khuẩn Ngâm mẫu trong dịch khuẩn 5 phút Tạo vết thương bằng kim và nhúng dịch khuẩn Tạo vết thương bằng dao và nhúng dịch khuẩn Ngâm mẫu trong dịch khuẩn 5 phút

Thí nghiệm 2: Xác định thời gian lây nhiễm A rhizogenes thích hợp cho quá

trình cảm ứng tạo rễ tóc đậu xanh

Trong các nghiên cứu về cảm ứng tạo rễ tóc, mỗi tác giả sử dụng một thời gian nhúng mẫu trong dung dịch vi khuẩn khác nhau tùy theo chủng vi khuẩn và đối tượng thực vật Ví dụ như Mannan và cộng sự (2009) cho thấy biểu hiện GUS tối đa

khi cho lây nhiễm Artemisia absiunthium với A tumefaciens chủng C58C1 trong 5

phút Còn theo nghiên cứu của Hoàng Thị Thanh Minh (2011), ngâm mẫu lá đậu

phộng 20 phút trong dịch khuẩn A rhizogenes chủng ATCC 15834 cho hiệu quả cảm

ứng rễ tóc cao (90,89% mẫu cảm ứng rễ) Vì vậy, thí nghiệm này được tiến hành nhằm tìm thời gian ngâm mẫu trong dịch khuẩn mà tạo được rễ tóc nhiều nhất ở lá

mầm đậu xanh Sau thí nghiệm 1, chọn chủng vi khuẩn A rhizogenes và cách thức

lây nhiễm thích hợp cho các thí nghiệm tiếp theo

Lá mầm 2 ngày tuổi được cắt loại bỏ trục phôi và ngâm trong dịch vi khuẩn với các khoảng thời gian khác nhau là 5, 10, 15 và 20 phút Thời gian đồng nuôi cấy là 3 ngày Sau đó, loại bỏ vi khuẩn bằng cách bổ sung 250 mg/l kháng sinh cefotaxime vào môi trường MB5 nuôi cấy mẫu cảm ứng rễ tóc Đối chứng thực hiện tương tự nhưng

không ngâm mẫu trong dịch khuẩn mà ngâm trong môi trường YMB để tiếp tục khẳng định sự không xuất hiện của rễ khi không có sự tiếp xúc giữa mẫu đã cắt trục phôi và vi khuẩn

Thí nghiệm gồm 1 yếu tố, bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên Có 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại gồm 3 đĩa petri Mỗi đĩa 20 mẫu cấy Đồng nuôi cấy trong tối, nuôi cấy cho sự tăng trưởng của mẫu và cảm ứng rễ tóc trong điều kiện ánh sáng tự nhiên, ở nhiệt độ phòng Chỉ tiêu theo dõi là tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo rễ tóc, số rễ tóc trung bình tạo ra trên một mẫu sau 8 ngày

kể từ khi lây nhiễm vi khuẩn A rhizogenes Cách ghi nhận tương tự thí nghiệm 1

Thí nghiệm 3: Xác định ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên quá trình

cảm ứng tạo rễ tóc đậu xanh

Một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen bằng

Agrobacterium vào tế bào thực vật là thời gian đồng nuôi cấy Thí nghiệm được tiến

hành nhằm tìm thời gian đồng nuôi cấy cho hiệu quả chuyển gen tạo rễ tóc cao nhất

Từ thí nghiệm 2, chọn thời gian lây nhiễm vi khuẩn thích hợp cho cảm ứng tạo rễ tóc ở

lá mầm đậu xanh in vitro Thời gian đồng nuôi cấy được bố trí lần lượt là 1, 2, 3, 4 và

5 ngày Sau đó, mẫu được chuyển sang môi trường MB5 bổ sung 250 mg/l cefotaxime

để loại bỏ vi khuẩn và cung cấp dinh dưỡng cho mẫu cảm ứng rễ tóc

Thí nghiệm gồm 1 yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên Có 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại gồm 3 đĩa petri đường kính

9 cm Mỗi đĩa cấy 20 mẫu lá mầm Đồng nuôi cấy hoàn toàn trong tối, nuôi cấy cho sự tăng trưởng của mẫu trong điều kiện ánh sáng tự nhiên, ở nhiệt độ phòng Chỉ tiêu theo dõi là tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo rễ tóc, số rễ tóc trung bình tạo ra trên một

mẫu sau 8 ngày kể từ khi lây nhiễm vi khuẩn A rhizogenes

Thí nghiệm 4: Xác định ảnh hưởng của độ tuổi lá mầm đậu xanh in vitro đến

quá trình cảm ứng tạo rễ tóc

Thí nghiệm này được tiến hành nhằm tìm số ngày tuổi của lá mầm đậu xanh sau khi ủ hạt thích hợp giúp cảm ứng tạo rễ tóc tốt nhất Sau thí nghiệm 1, 2 và 3, chủng vi khuẩn, cách thức lây nhiễm, thời gian lây nhiễm và thời gian đồng nuôi cấy cho hiệu quả chuyển đổi tốt nhất được áp dụng cho quá trình cảm ứng tạo rễ tóc Mầm đậu xanh

2, 3 và 4 ngày tuổi được dùng làm nguyên liệu để xác định ảnh hưởng của độ tuổi

mẫu Thời gian đồng nuôi cấy là 3 ngày, loại bỏ vi khuẩn bằng kháng sinh cefotaxime (250 mg/l) pha trong môi trường MB5 nuôi mẫu sau khi đồng nuôi cấy

Thí nghiệm gồm 1 yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên Có 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại gồm 3 đĩa petri đường kính

9 cm Mỗi đĩa 20 mẫu Đồng nuôi cấy trong tối, nuôi cấy cho sự tăng trưởng của mẫu trong điều kiện ánh sáng tự nhiên, nhiệt độ phòng Chỉ tiêu theo dõi là tỷ lệ mẫu sống,

tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo rễ tóc, số rễ tóc trung bình trên một mẫu sau 8 ngày kể từ khi

lây nhiễm A rhizogenes Cách ghi nhận tương tự các thí nghiệm trước

3.3.3 Kiểm tra khả năng tăng trưởng và cảm ứng tạo mô sẹo từ rễ tóc đậu xanh

Thí nghiệm 5: Kiểm tra khả năng tăng trưởng của rễ tóc đậu xanh

Kiểu hình rễ tóc là sự biểu hiện của việc tái tổ hợp các gen từ T-DNA (các gen

rol và cả gen aux đối với Ri plasmid dòng agropine) vào trong tế bào thực vật Bên

cạnh đó, rễ tóc có đặc tính phát triển nhanh, phân nhánh nhiểu trên môi trường không

có chất điều hòa sinh trưởng và không hướng đất đã được khẳng định trên nhiều loài thực vật và trên nghiên cứu sinh lý rễ tóc Vì vậy, trước tiên có thể kiểm tra sơ bộ khả năng tăng trưởng của rễ tóc so với rễ đậu xanh không chuyển đổi trên môi trường không bổ sung auxin từ đó so sánh hoạt tính auxin của chúng Thí nghiệm được thực hiện với 2 loại mẫu, mỗi loại 3 đĩa petri và mỗi đĩa 5 mẫu Mẫu rễ tóc được cấy chuyền trên môi trường MB5 rắn bổ sung cefotaxime 250 mg/l mỗi tuần một lần để khảo sát khả năng tăng trưởng và loại trừ hoàn toàn vi khuẩn Sau 2 tuần, mẫu được chuyển sang môi trường MB5 không có kháng sinh nuôi trong 1 tuần và kết quả sẽ

được ghi nhận Mẫu sạch khuẩn A rhizogenes có thể được dùng làm nguồn vật liệu cho ly trích DNA để thực hiện PCR khuếch đại vùng gen rol Mẫu đối chứng là chóp

rễ đậu xanh sau 3 ngày kể từ khi ủ hạt không lây nhiễm với vi khuẩn A rhizogenes

được nuôi trên môi trường MB5 không bổ sung kháng sinh Theo dõi hình thái và

khả năng phân nhánh của rễ tóc so với rễ đậu xanh in vitro

Thí nghiệm 6: Xác định ảnh hưởng của 2,4 D và kinetin lên sự cảm ứng mô sẹo

từ rễ tóc đậu xanh

Từ rễ tóc được tạo ra trong quá trình chuyển gen nhờ vi khuẩn A rhizogenes,

nó được sử dụng như là nguồn vật liệu ban đầu cho quá trình tái sinh thành cây đậu xanh chuyển gen trong đó việc tạo mô sẹo là bước đầu tiên Các nhà nghiên cứu thường sử dụng 2,4 D trong việc cảm ứng mô sẹo để tạo cây chuyển gen ví dụ như

Kaviraj và cộng sự (2006) sử dụng 2,4 D để tạo mô sẹo từ lá sơ cấp của đậu xanh Ngoài ra, họ còn sử dụng α-NAA kết hợp với kinetin và BAP để tái sinh và tạo cây đậu xanh hoàn chỉnh (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Luyện, 2009) Katavic và Jelaska (1991) cũng đưa ra kết quả 2,4 D cảm ứng tạo mô sẹo từ các dòng rễ tóc bí ngô tốt hơn IBA, NAA Đồng thời, dựa trên kết quả nghiên cứu cảm ứng tạo mô sẹo từ rễ đậu xanh của Mai Thị Thúy Tình (2012), thí nghiệm được tiến hành với 2 nghiệm thức sử dụng 2,4 D và kinetin trên môi trường MS có bổ sung 250 mg/l cefotaxime nhưng với sự thay đổi trong nồng độ các chất điều hòa tăng trưởng nhằm kiểm tra khả năng tạo mô sẹo của rễ tóc đậu xanh và so sánh với kết quả đưa ra từ rễ không chuyển đổi

Thí nghiệm gồm 2 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 1 đĩa petri với mỗi đĩa là 5 mẫu với 3 lần lặp lại Mẫu rễ được cắt với kích thước 0,8 đến 1 cm và được nuôi trên môi trường tạo mô sẹo trong điều kiện tối hoàn toàn ở nhiệt độ phòng Chỉ tiêu theo dõi là tỷ lệ mẫu hình thành mô sẹo, đường kính tính bằng đơn vị milimet và đặc điểm của mô sẹo sau 14 ngày nuôi cấy Mẫu đối chứng là rễ tóc được nuôi trên môi trường

MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng

Bảng 3.2 Các nghiệm thức xác định ảnh hưởng của 2,4 D và kinetin lên sự cảm ứng

mô sẹo từ rễ tóc đậu xanh

NT6.1

NT6.2

0,05 0,10

0,4 0,4

3.3.4 Phương pháp xử lý thống kê

Số liệu thu được từ kết quả của các thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm MSTATC (Đại học Michigan, Hoa Kỳ), trắc nghiệm phân hạng dạng LSD hoặc Ducan Kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình đối với thí nghiệm 2 yếu tố và dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD – Standard deviation) đối với thí nghiệm 1 yếu tố

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Giai đoạn chuẩn bị mẫu để chuyển gen

Chuẩn bị mẫu cấy: sau 2 ngày ủ mẫu, khả năng nảy mầm của hạt tương đối đồng đều, sẽ được dùng làm nguồn vật liệu ban đầu cho thí nghiệm 1, 2 và 3 Đối với thí nghiệm 4 sau khi thực hiện nghiệm thức 2 ngày tuổi, mẫu sẽ được ủ tiếp tục đến ngày thứ 3 và thứ 4 để dùng làm vật liệu thí nghiệm

Chuẩn bị dịch khuẩn: tất cả các chủng A rhizogenes đã cho thấy độ đục tốt

trên môi trường YMB lỏng Khuẩn lạc của chủng ICPB TR7 trên môi trường YMB

rắn có màu trắng, nhỏ, nhiều và ít chất nhầy, đối với 3 chủng vi khuẩn A rhizogenes

còn lại thì khuẩn lạc trắng đục có nhiều chất nhầy bao quanh, đặc biệt là chủng

18912, chất nhầy lan rộng Khuẩn lạc của ATCC 15834 to tròn, còn đối với chủng ATCC 11325 thì nhỏ hơn Dịch khuẩn đạt OD từ 0,5 đến 1,0 sau 2 ngày nuôi cấy lắc

Hình 4.2 Khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes A: IPCB TR7 B:

18912 C: ATCC 11325 D: ATCC 15834

Hình 4.1 Hạt đậu xanh TN 182 (A) và sau 2 ngày kể từ ngày ủ hạt (B)

4.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cảm ứng tạo rễ tóc đậu xanh

Thí nghiệm 1: Xác định chủng vi khuẩn A rhizogenes và cách thức lây nhiễm

thích hợp vào mầm đậu xanh in vitro

Cả 4 chủng vi khuẩn A rhizogenes sử dụng trong thí nghiệm đều thành công

trong việc cảm ứng tạo rễ tóc bởi vì 100% mẫu đối chứng không cảm ứng tạo được rễ tóc Đối với mẫu lá mầm đậu xanh, sự cảm ứng rễ tóc xảy ra trong một thời gian ngắn

vì chỉ sau khoảng 4 đến 5 ngày kể từ khi lây nhiễm vi khuẩn, rễ tóc đã bắt đầu xuất hiện Sự khác nhau từ một tuần đến hơn một tháng phụ thuộc vào các loài thực vật khác nhau Có sự xuất hiện khối u ở vị trí bị thương nhưng rất ít Thời gian đầu mới hình thành, rễ có màu trắng, sau khoảng 3 đến 4 ngày tiếp theo rễ dần dần chuyển sang màu nâu vàng nhạt và màu sắc đậm dần theo thời gian, rễ nhỏ, mềm nhưng dai và

phân nhánh nhiều Hình thái này tương tự như rễ tóc của Vigna vexillata (đậu ván)

(Chandran và Potty, 2007) Trung bình thường có 1 – 2 rễ tóc trên 1 mẫu lá mầm Số

lượng rễ tóc tối đa trên 1 mẫu quan sát được là 8 rễ Rễ tóc được cảm ứng bởi A rhizogenes ổn định về di truyền và hóa sinh

Kết quả bảng 4.1 cho thấy khả năng cảm ứng rễ tóc ở V radiata L khác nhau giữa các chủng A rhizogenes khác nhau Chủng ATCC 15834 thuộc dòng agropine và

được phân loại là chủng có phổ vật chủ rộng WHR (Rhodes và cs, 1987 – trích dẫn bởi Karmarkar và cs, 2001) cho thấy có tỷ lệ mẫu cảm ứng rễ tóc cao nhất phù hợp với kết luận dòng agropine cảm ứng rễ tóc mạnh nhất của Chandran và Potty năm 2007 cũng như Hu và Du năm 2006 Chủng vi khuẩn IPCB TR7 thuộc dòng mannopine cho kết quả cao thứ hai (46,36% mẫu cảm ứng rễ và trung bình có 2,07 rễ/mẫu) nhưng sự khác biệt là không có ý nghĩa so với chủng ATCC 15834 Vì vậy, có thể chọn một trong hai chủng khuẩn này cho tạo rễ tóc ở đậu xanh Trong khi đó, chủng vi khuẩn ATCC

11325 (thuộc dòng nopaline) là chủng cảm ứng yếu nhất với 29,89% mẫu cảm ứng rễ tóc và số rễ tóc trung bình trên một mẫu là 1,71, đồng thời cũng khác biệt không có ý nghĩa với chủng 18912 (33,20% mẫu tạo rễ và trung bình 1,61 rễ trên một mẫu) Như

vậy, hiệu quả cảm ứng tạo rễ tóc của 4 chủng A rhizogenes giảm dần theo thứ tự

ATCC 15834, ICPB TR7, 18912, ATCC 11325 Sự khác nhau về khả năng cảm ứng

tạo rễ tóc của các chủng A rhizogenes trên các thực vật chủ khác nhau cũng đã được

báo cáo (Giri, 2001; Lee, 2010 – trích dẫn bởi Pakdin và cs, 2013)