NHÂN GIỐNG CÂY KIỂNG LÁ THIÊN LONG

Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng tạo sẹo của mẫu lá cây Thiên Long in vitro gồm 7 nghiệm thức là 7 loại môi trường có thành phần cơ bản là MS có bổ sung các chất

BỘ GIÁO D

ỌC NÔNG MÔN CÔN

A LUẬ

Y KIỂNG ẰNG KỸ

học:

n thực hiện óa:

2011

-12/2013

ĐÀO TẠO HÀNH PHỐ

MINH

P

laonema sp.)

BỘ GIÁO D

ỌC NÔNG MÔN CÔN

A LUẬ

Y KIỂNG ẰNG KỸ

LỜI CÁM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiệt tình của Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh, quý thầy cô, cán bộ và giáo viên hướng dẫn

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, qúy thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học đã tận tình giảng dạy và cung cấp những kiến thức cần thiết, bổ ích để tôi có thể hoàn thành tốt quá trình học tập và thực tập của mình

Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh, cám ơn tập thể cán bộ, nhân viên, kỹ thuật viên của Phòng Công nghệ sinh học thực vật thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh, đã nhiệt tình hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập tại Trung tâm

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Phan Diễm Quỳnh và KS Nguyễn Hoàng Quân đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến tất cả người thân, bạn bè, những người luôn bên cạnh động viên, tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành quá trình học tập

Xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên thực hiện Đinh Thành Tiến

TÓM TẮT

Kiểng lá Thiên Long là loại kiểng lá mới với bộ lá đẹp, sức sống tốt, dễ chăm sóc, thích hợp cho việc trang trí trong nhà cũng như sân vườn Kiểng lá thường được nhân giống theo phương pháp truyền thống nên số lượng cây nhân ra rất ít chưa đủ để đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng, cũng vì thế giá thành của cây khá cao Vì thế chúng tôi tiến hành nhân giống vô tính cây Thiên Long để tìm ra quy trình sản xuất nhằm đảo bảo số lượng và chất lượng cây cho thị trường Những kết quả đạt được: Thí nghiệm xác định nồng độ chất khử trùng thích hợp để tạo nguồn mẫu cây kiểng

lá Thiên Long sạch ban đầu gồm 3 nghiệm thức là 3 nồng độ javel từ 33,33% đến 66,67% trong thời gian 30 phút được tiến hành trên đối tượng đoạn thân cây Thiên Long có mang chồi ngủ Kết quả ở nồng độ Javel 50% trong thời gian 30 phút cho kết quả khử trùng tốt nhất

Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng tạo sẹo của mẫu lá

cây Thiên Long in vitro gồm 7 nghiệm thức là 7 loại môi trường có thành phần cơ bản

là MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng BA (0 – 1,5 mg/l) phối hợp với NAA (

0 – 0,3 mg/l) Kết quả ở môi trường bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BA (1,0 mg/l)

phối hợp với NAA (0,1 mg/l) thích hợp nhất cho việc tạo sẹo từ lá cây Thiên Long in vitro (64,75% mẫu tạo sẹo, trọng lượng tươi (2,59 gr), mô sẹo chắc và xanh có khả

năng tái sinh chồi cao sau 8 tuần nuôi cấy)

Thí nghiệm khảo sát sảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng tái sinh chồi từ

mô sẹo của cây măng tây in vitro gồm 7 nghiệm thức là 7 loại môi trường có thành

phần cơ bản là MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng với các nồng độ thay đổi khác nhau BA (0 – 3,0mg/l) phối hợp với NAA ( 0 – 0,3 mg/l) Sau 4 tuần nuôi cấy trong môi trường có bổ sung BA 3,0 mg/l phối hợp với NAA 0,1 mg/l cho kết quả tỷ lệ bật chồi cao nhất (89,05%) với số lượng chồi trung bình 7,34 chồi/mẫu cấy

Từ khóa: Kiểng lá Thiên Long, in vitro, nhân giống, mô sẹo

SUMMARY

Aglaonema sp species is a new kind of ornamental plants, which has beautiful

leaves, vitality, easy to take care, suitable for indoor decoration as well as a garden terrace Ornamental plants are usually propagated according to traditional methods, the number of trees that very few so it not enough to satisfy the requirement of consumers, therefore it has relatively high prices So we carried out the project that propagated Aglaonema plants to find out the production process in order to ensure the quality and quantity for markets Some results obtained:

The experiment was determined the suitable concentration of disinfectant to

create the original cleaned explants of Aglaonema sp This experiment included 3

treatments that is 3 different concentration of javel (from 33.33% to 66.67%) and

performed on Aglaonema sp nodes holding dormant lateral buds The optimal

sterilization was achieved on javel 50% concentration in 30 minute

The experiment was investigated the effect of BA and NAA on callus formation

from leaves explants of Aglaonema sp in vitro, which consist the basic culture

medium MS supplemented with different concentrations of growth regulator BA (0 –

1.5 mg/l) and NAA (0 – 0.3 mg/l), was performed in 7 treatments As a result, in vitro,

the medium supplemented with BA (1.0 mg/l) and NAA (0.1 mg/l) was the most

suitable for callus formation from Aglaonema sp leaves (64.75% callus formation,

weight 2.59 gram, the callus hard and green has high shoot regeneration ability after 8 weeks incubation)

The experiment was tested the influences of BA and NAA to shoot regeneration

from callus of Aglaonema sp in vitro, which included 7 types MS media

supplemented with various concentrations of growth regulator BA (0 – 3.0 mg/l) and NAA (0 – 0.3 mg/l) After 4 weeks of culture, the medium containing BA 3.0 mg/l and NAA 0.1 mg/l caused the highest shoot initiation frequency (89.05%) and average number of shoots (7.34 shoots per explant)

Keyword: Aglaonema sp., in vitro, propagation, callus

MỤC LỤC

Trang Lời cám ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh mục chữ viết tắt vii

Danh mục bảng viii

Danh mục hình ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây kiểng lá Thiên Long 3

2.1.1 Phân loại 3

2.1.2 Nguồn gốc phân bố 3

2.1.3 Đặc tính thực vật học của cây kiểng lá Thiên Long 3

2.1.4 Đặc điểm chung của họ ráy (Araceae) 4

2.1.5 Một số loài đại diện 4

2.1.5.1 Cây Phú quý 4

2.1.5.2 Cây Bạch mã hoàng tử 4

2.1.5.3 Cây Ngọc Ngân 5

2.1.5.4 Cây Vạn niên thanh 5

2.1.5.5 Cây Lan ý mỹ 5

2.1.5.6 Cây Hồng môn 6

2.1.6 Tình hình nghiên cứu về cây kiểng lá trên thế giới và trong nước 7

2.1.7 Tình hình sản xuất, kinh doanh hoa kiểng của một số nước trên thế giới và khu vực Đông Nam Á 7

2.1.8 Tình hình phát triển hoa kiểng ở Việt Nam 8

2.1.8.1 Tình hình phát triển hoa, cây kiểng tại thành phố Hồ Chí Minh 9

2.2 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 10

2.2.1 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

2.2.1.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 11

2.2.1.2 Nuôi cấy mô sẹo 11

2.2.1.3 Nuôi cấy tế bào đơn 11

2.2.1.4 Nuôi cấy protoplast – chuyển gen 11

2.2.1.5 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội 12

2.2.2 Các giai đoạn nhân giống in vitro 12

2.2.2.1 Giai đoạn chuẩn bị 12

2.2.2.2 Giai đoạn tái sinh mẫu nuôi cấy 12

2.2.2.3 Giai đoạn nhân nhanh chồi 12

2.2.2.4 Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh 12

2.2.2.5 Giai đoạn đưa cây ra đất 13

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng nhân giống invitro 13

2.2.3.1 Mẫu nuôi cấy 13

2.2.3.2 Sự vô trùng mẫu trong nuôi cấy 14

2.2.3.3 Điều kiện nuôi cấy 14

2.2.3.4 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 15

2.2.4 Thành phần hoá học của môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 15

2.2.4.1 Auxin 16

2.2.4.2 Cytokinin 17

2.2.4.3 Gibberellin 19

2.2.4.4 Abscisic acid (ABA) 20

2.2.4.5 Ethylene 21

2.2.5 Lợi ích của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật 22

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 23

3.2 Vật liệu thí nghiệm 23

3.2.1 Đối tượng thí nghiệm 23

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 23

3.2.3 Môi trường nuôi cấy 23

3.2.4 Điều kiện nuôi cấy 23

3.4 Phương pháp thí nghiệm 24

3.4.1 Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ javel thích hợp để khử trùng mẫu cấy 24

3.4.1.1 Mục đích 24

3.4.1.2 Phương pháp thí nghiệm 24

3.4.1.3 Bố trí thí nghiệm 24

3.4.1.4 Chỉ tiêu theo dõi 24

3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA lên khả năng tạo mô sẹo của cây Thiên Long in vitro 25

3.4.2.2 Phương pháp thí nghiệm 25

3.4.3.3 Bố trí thí nghiệm 25

3.4.2.4 Chỉ tiêu theo dõi 25

3.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo cây kiểng lá Thiên Long 25

3.4.3.2 Phương pháp thí nghiệm 25

3.4.3.3 Bố trí thí nghiệm 26

3.4.3.4 Chỉ tiêu theo dõi 26

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

4.1 Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ javel thích hợp để khử trùng mẫu cấy 27

4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA lên khả năng tạo mô sẹo của cây Thiên Long in vitro 29

4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo cây kiểng lá Thiên Long 33

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36

5.1 Kết luận 36

5.2 Đề nghị 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

PHỤ LỤC 39

GA3: Gibberellin A3 (Gibberellic acid)

IBA: Indole – 3 – butyric acid

Kinetine: 6 – Furfurylamino purine

MS: MS medium (Murashige và Skoog, 1962)

NAA: α – Naphthaleneacetic acid

PVD: Polyvidon

TDZ: Thidiaruzon

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Kế hoạch phát triển hoa, cây kiểng đến năm 2015 (đvt:ha) 10 Bảng 3.1 Nồng độ javel sử dụng khử trùng mẫu cấy 24 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BA và NAA lên khả năng tạo mô sẹo

cây kiểng lá Thiên Long 25

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của BA và NAA lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo

cây kiểng lá Thiên Long 26

Bảng 4.1 Tỷ lệ mẫu sống vô trùng sau 2 tuần nuôi cấy đoạn thân

mang chồi ngủ của Thiên Long trên môi trường MS 28

Bảng 4.2 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến việc tạo sẹo

lá Thiên Long in vitro 30

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của BA và NAA đến sự tái sinh chồi từ

mô sẹo của cây kiểng lá Thiên Long 33

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Kiểng lá Thiên Long (Aglaonema sp.) 3

Hình 2.2 Một số loại kiểng lá 6 Hình 4.1 Biểu đồ thể hiện tỷ lệ mẫu sống vô trùng sau 2 tuần nuôi cấy

đoạn thân mang chồi ngủ của Thiên Long trên môi trường MS 28

Hình 4.2 Đoạn thân Thiên Long mang chồi ngủ trên môi trường MS 29 Hình 4.3 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng

đến việc tạo sẹo lá Thiên Long 30

Hình 4.4 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng

đến sự phát triển mô sẹo Thiên Long in vitro 31

Hình 4.5 Mô sẹo lá Thiên Long trên môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh

trưởng cảm ứng tạo mô sẹo 32

Hình 4.6 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của BA và NAA đến sự tái sinh chồi từ mô

sẹo của cây kiểng lá Thiên Long 34

Hình 4.7 Ảnh hưởng của BA và NAA đến tỷ lệ mẫu bật chồi

từ mô sẹo Thiên Long 35

Hoa kiểng không những là một nhu cầu tinh thần của người dân, mà còn là một ngành kinh tế nông nghiệp sinh thái đô thị mang lại lợi nhuận cao góp phần vào việc tăng trưởng kinh tế, nó đã trở thành hàng hóa mang lại lợi nhuận cao, tạo công ăn việc làm cho hàng ngàn lao động Sản xuất hoa kiểng mang đặc điểm thâm canh với cường

độ cao trên cùng diện tích đất, cho phép sử dụng hiệu quả đất đai, thu hút nhiều nguồn vốn đa dạng trong nhân dân Đặc biệt nhu cầu tiêu thụ hoa kiểng các loại từ các nhà hàng, khách sạn, cơ quan công sở, các công trình xây dựng mới cũng góp phần thúc đẩy mạnh phát triển ngành hoa kiểng

Kiểng lá rất phong phú về màu sắc và chủng loại, nó bao gồm những loại cây có

bộ lá đẹp, nhiều màu sắc và có tuổi thọ cao Ưu điểm của kiểng lá là nhỏ gọn, không chiếm nhiều diện tích, không đòi hỏi khắt khe các điều kiện môi trường cũng như kỹ thuật chăm sóc mà vẫn có thể toát lên được vẻ đẹp và sự sang trọng

Kiểng lá bao gồm nhiều giống khác nhau như: Hồng Đào, Hồng Ngân, Phú Quý, Vạn Lộc, Thiên Nga Mỗi loại kiểng lá sở hữu một vẻ đẹp riêng nhờ bộ lá độc đáo của

mình Trong đó cây kiểng lá Thiên Long có tên khoa học là Aglaonema sp và được du

nhập vào Việt Nam từ Thái Lan, là một giống kiểng lá mới thuôc họ Ráy (Araceae), với đặc điểm có bộ lá đẹp, sức sống tốt, dễ chăm sóc, thích hợp cho việc trang trí trong nhà cũng như sân vườn

Hiện nay ở các nhà vườn thường nhân giống cây Thiên Long theo phương pháp truyền thống bằng cách kích thích các chồi bên phát triển từ đó chiết ra và chăm sóc thành cây mới, nên số lượng cây nhân ra rất ít chưa đủ để đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng, cũng vì thế giá thành của cây khá cao Do đó, để đáp ứng nhu cầu về cây

giống của thị trường trong nước hiện nay cần có một quy trình nhân giống in vitro cây Thiên Long hoàn chỉnh mới mong đáp ứng đủ nhu cầu cần thiết

Xuất phát từ thực tế trên đề tài “Nhân giống cây kiểng lá Thiên Long (Alaonema sp.) bằng kỹ thuật in vitro” được thực hiện nhằm đáp ứng nhanh và bền vững số lượng

cây giống cho thị trường hoa kiểng

1.2 Yêu cầu của đề tài

Xác định được ảnh hưởng của nồng độ các chất khử trùng nhằm tạo nguồn mẫu vô trùng ban đầu và ảnh hưởng của các chất đều hòa sinh trưởng thực vật lên quá trình phát sinh hình thái trong quy trình nhân giống cây kiểng lá Thiên Long bằng kỹ thuật nuôi

cấy mô tế bào, làm cơ sở cho việc hình thành quy trình nhân giống in vitro cây kiểng lá

Thiên Long, góp phần giải quyết những khó khăn của thực tiễn sản xuất giống

1.3 Nội dung thực hiện

Xác định nồng độ chất khử trùng thích hợp để tạo nguồn mẫu sạch ban đầu Xác định nồng độ BA và NAA thích hợp đến khả năng tạo mô sẹo của cây

Thiên Long in vitro

Xác định nồng độ BA và NAA thích hợp để tạo chồi tái sinh từ mô sẹo cây Thiên Long

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây Thiên Long

2.1.3 Đặc tính thực vật học của cây kiểng lá Thiên Long

Kiểng lá Thiên Long là cây thân thảo thấp, sống lâu năm Cây có lá mọc tập trung trên mặt đất, lớn, xếp so le Phiến lá hình đầu tên và chia thùy hình tim ở gốc, dài, rộng, nhẵn ở

cả hai mặt, mặt trên màu xanh lục sậm láng bóng xen kẽ những đốm màu đỏ hồng, gân lá hình lông chim màu đỏ hồng mặt dưới màu nhạt hơn Cuống dài, mảnh mềm, hơi lõm ở mặt trên, ½ phía gốc cuống lõm sâu ở mặt trên thành hình lòng máng tạo thành 2 cánh mỏng ở hai bên mép, gốc cuống màu hồng nhạt đến trắng và nở rộng ôm vào nhau

Thiên Long có hoa rất nhỏ, tập hợp thành cụm hoa bông mo đơn Hoa cái ở dưới, hoa đực ở trên, cách nhau bởi một đoạn không có hoa Phía ngoài cụm hoa có 1

mo lớn bao bọc, lúc còn non cuộn lại

2.1.4 Đặc điểm chung của họ ráy (Araceae)

Cây thân cỏ sống lâu năm mọc trên đất, có thân rễ hay thân leo, bò trên vách đá, trên thân các cây gỗ khác Lá mọc từ gốc của thân rễ (ráy) hay mọc cách trên thân leo (ráy leo) Lá to, gồm bẹ, cuống và phiến, phiến lá nguyên hay chia thùy

Hoa rất nhỏ, tập hợp thành cụm hoa bông mo đơn, trục nạc Hoa cái ở dưới, hoa đực ở trên, cách nhau bởi một đoạn không có hoa, và tận cùng là một đoạn trục khác thường có màu Phía ngoài cụm hoa có 1 mo (lá bắc) lớn bao bọc, lúc còn non cuộn lại, màu sặc sỡ có tác dụng thu hút sâu bọ Hoa lưỡng tính hoặc đơn tính, ở hoa lưỡng tính thường có bao hoa đầy đủ, còn hoa đơn tính phần lớn là hoa trần Nhụy gồm 3 lá noãn hợp (có khi còn 1), bầu trên, 3 ô mỗi ô chứa 1 noãn Quả mọng hay quả đóng, chứa 1 đến nhiều hạt giàu nội nhũ

2.1.5 Một số loài đại diện

2.1.5.1 Cây Phú quý

Phú quý có tên khoa học Aglaonema hybrid ‘Pride of Sumatra’ là giống cây lai có

nguồn gốc từ Indonesia với đặc điểm thân cây màu trắng hồng, lá cây xanh bóng đôi khi ửng vàng, viền ngoài của lá là màu đỏ chạy bao quanh lá cũng là nét riêng của loại cây này mà không thể nhầm lẫn với bất kỳ cây nào khác Bộ rễ cây to khỏe với thật nhiều rễ con dài

khoảng 4 – 6 cm màu trắng ngà (trồng khoảng 02 – 03 tháng thì rễ cây sẽ chuyển sang màu

xanh non) Cây Phú quý đẻ nhánh rất nhanh, chiều cao toàn bộ cây là khoảng 35 – 40 cm Cây Phú quý là loài cây thích ánh sáng dịu nhẹ, độ chiếu sang cần thiết từ 10 – 30% ánh sáng mặt trời Cây chỉ chịu được độ chiếu sáng tối đa là 40% Độ ẩm phù hợp từ 50 – 70%, cây sẽ sinh trưởng và phát triển rất tốt Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của cây là 28 – 30°C (ban ngày) và 20 – 22°C (ban đêm), khi nhiệt độ quá cao sẽ

có hiện tượng tẩy lá, màu sắc lá trở nên nhợt nhạt và biến mất sắc đỏ

2.1.5.2 Cây Bạch mã hoàng tử

Châu Á nhiệt đới Là loài cây mọc thành bụi, gần như không có thân (các lá thay thế cho thân cây), cây thường xanh, sống lâu năm, đạt chiều cao khi trưởng thành

lá 60 – 90 cm Lá lớn, dạng thuôn nhọn hai đầu, chiều dài khoảng 15 – 25 cm, rộng khoảng 7,5 cm, lá màu xanh cẩm thạch xen lẫn là những vệt màu kem hay trắng nổi bật Một ít giống cây có lá màu bạc vệt trắng cũng rất được ưu chuộng Cuốn lá dài, màu trắng, mềm mảnh Nhiều cuốn lá tập hợp lại tạo thành thân giả của cây Cụm hoa dạng mo nhỏ trên cuốn chung mập mạp, mo màu trắng

Bạch mã hoàng tử là loài cây ưa không khí mát ẩm Nhiệt độ thích hợp cho cây phát triển nằm từ 18 – 24°C Cây không thể chịu lạnh, màu sắc của lá rất nhạy cảm với nhiệt độ lạnh, nếu sống trong điều kiện dưới 13°C, trên lá sẽ xuất hiện có đốm vàng, nâu, lá sẽ nhanh chống rụng và gây chết cây

2.1.5.3 Cây Ngọc ngân

Ngọc ngân có tên khoa học Dieffenbachia picta (Lodd.) Schott có nguồn gốc

xuất xứ từ khu vực Neotropical gồm phần phía nam của Mexico, bán đảo Baja California, miền nam Florida, tất cả các đảo Caribbean và Nam Mỹ Là loài cây thân thảo, thuộc loại thường xanh sống lâu năm, thân dày, có lá thay thế Lá hình bầu dục giống ngọn giáo, mọc không đối xứng, màu xanh đốm trắng, cuốn lá đầy bao bọc một phần thân cây

Ngọc ngân là loài cây chịu nắng tốt nhất trong các loài cây lá màu, cây phát triển trong điều kiện đủ ánh sáng nhưng không tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời và các nguồn nhiệt như lò sưởi Nhiệt độ thích hợp cho cây từ 18 – 24°C từ 20°C đến 30°C, cây có thể tồn tại trong thời gian ngắn khi nhiệt độ xuống đến 12°C nhưng sẽ xảy ra hiện tượng rụng lá và lâu dài sẽ giết chết cây Nói chung khả năng chịu lạnh kém khi biên độ nhiệt vượt qua ngưỡng dưới 20°C Nhiệt độ dưới 5°C có thể cây không sống nổi

2.1.5.4 Cây Vạn niên thanh

Vạn niên thanh có tên khoa học Dieffenbachia sp là loài xanh quanh năm, xuất

xứ từ rừng nhiệt đới Bắc Nam Mỹ và Tây Ấn. Với đặc điểm cây cao 1 – 2,5 m, hoa có

lá bắc màu xanh hay vỏ bao được gọi là mo, xung quanh cụm hoa trung tâm có nhiều hoa nhỏ Lá lớn, hình ellip hay hình quả trám, dài 30 – 45 cm, nhiều gân giữa nổi bật, với đốm trắng, kem hay vàng, hay xanh toàn bộ. Cây thường được trồng trong nhà hay ngoài trời vì có bộ lá đẹp làm cảnh.  

Cây ưa môi trường ấm, ẩm và nửa râm Cây chịu được rét, nhiệt độ không dưới 15°C Vạn niên thanh là loài thực vật nhiệt đới, nhưng khả năng chịu bóng tốt, phát triển mạnh khi tiếp nhận ánh sáng lọc vào mùa xuân và múa hè và mùa thu

2.1.5.5 Cây Lan ý mỹ

Lan ý mỹ có tên khoa học Spathiphyllum’Sensation’ có nguồn gốc từ Nam Mỹ là

cây trồng trang trí lâu năm với đặcđiểm bộ lá dài từ 12 – 65 cm, rộng từ 3 – 25 cm Hoa nở trong búp hình mo, đường viền xung quanh búp dài từ 10 – 30 cm, màu trắng,

hơi vàng, hoặc hơi lục Hoa màu tuyết trắng đến màu xanh xám, hình thành trên đỉnh

cúa các nhánh và tồn tại cùng với lá rất lâu Hoa nở trong tháng ấm đầu năm, từ đầu

xuân cho đến cuối mùa thu

Lan ý thuộc nhóm cây trồng nhiệt đới, chúng cần độ ẩm trong môi trường cao,

nhưng không nên ẩm ướt quá lâu và không để chậu ngập trong nước

2.1.5.6 Hồng môn

Hồng môn có tên khoa học là Anthurium andreanum có nguồn gốc xuất xứ từ

Colombia là loài thân cỏ mọc thành bụi sống lâu năm, lá có phiến hình tim, cuống dài

Bông mo trên cuống dài, dạng phiến nở rộng, có hình tim màu đỏ, trục hoa vàng

Hồng môn là cây ưa mát và độ ẩm cao (từ 70 – 80%) Nhiệt độ thích hợp từ 18 –

20°C Ở nhiệt độ thấp hơn 15oC, cây phát triển kém, còn cao hơn 30°C, lá cây vàng và

có thể chết Hồng môn không chịu được ánh nắng trực tiếp, ánh sáng thích hợp là 50%

hoặc thấp hơn Vì vậy trồng hồng môn nên làm giàn che để hạn chế ánh nắng trực tiếp

Hình 2.2 Một số loại kiểng lá

a: Cây Phú Quý (Aglaonema hybrid ‘Pride of Sumatra’) (http://nguyenvu.bang.vn) 

b: Cây Bạch Mã Hoàng Tử (Aglaonema hybrid) (http://www.cayxanhsadec.com.vn) 

c: Cây Ngọc Ngân (Dieffenbachia picta (Lodd.) ) (http://cuahangcaycanh.com) 

d: Vạn Niên Thanh (Dieffenbachia sp) (http://caycanh.dos.vn) 

e: Lan Ý Mỹ (Spathiphyllum’Sensation’) (http://l.f13.img.vnecdn.net) 

f: Hồng Môn (Anthurium andreanum) (http://hatgionghanoi.com) 

a b c

2.1.6 Tình hình nghiên cứu về cây kiểng lá trên thế giới và trong nước

Những năm qua, nhiều công trình nghiên cứu về cây kiểng lá trong và ngoài nước Năm 2007, Chen và Yeh Cục Trồng trọt, Đại học Quốc gia Đài Loan đã tiến

hành nghiên cứu loại bỏ nhiễm khuẩn bằng cách bổ sung kháng sinh trong vô mẫu in vitro cây Aglaonema Schott ‘White Tip’ Kết quả cho thấy tỉ lệ nhiễm khuẩn và hóa

nâu các chồi nách giảm đối với những cây không được tưới nước trong 2 tháng khi tiến hành vô mẫu và được xử lý với 200 mg/l Streptomycin

Nhóm tác giả Nguyễn Văn Hiếu và công sự (2009), Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp Hồ Chí Minh nhân giống ba loại kiểng lá là Lan ý mỹ, Dứa diệp phúc và Lục

đế đỏ từ đốt thân Kết quả cho thấy tỉ lệ mẫu sống vô trùng cao nhất với javel ½ Sự tạo chồi tốt nhất trên môi trường MS bổ sung BA 1,5 mg/l kết hợp với NAA 0,3 mg/l (Lan ý mỹ), MS bổ sung BA 3,0 mg/l kết hợp với NAA 0,1 mg/l (Dứa diệp phúc), còn đối với cây Lục đế đỏ thì môi trường thích hợp cho sự hình thành mô sẹo là MS bổ sung BA 5,0 mg/l kết hợp với NAA 0,1 mg/l Bên cạnh đó, hiệu quả của hệ thống ngập chìm tạm thời trên sự nhân chồi cũng được ghi nhận

Năm 2011, Mariani và cộng sự Viện Công nghệ Bandung, Indonesia tiến hành vi

nhân giống Aglaonema var Cochin bằng cách sử dụng các chồi bên Kết quả với 2

chồi ban đầu sau 5 lần cấy chuyền (10 tuần) trên môi trường MS có bổ sung 1,5mg/l TDZ và 3 BAP có thể thu được 1000 chồi mới Cây con ra rễ và phát triển trên môi trường MS có chứa 3 mg/l IBA

Liew và cộng sự Khoa Sinh học, Đại học Airlangga, Indonexia (2012), nghiên

cứu tạo mô sẹo từ lá cây Aglaonema sp var Lipstik Kết quả cho thấy sau 16 tuần

nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 5 mg/l IAA kết hợp với 5 mg/l BAP hoặc 8 mg/l IAA kết hợp với 5 mg/l BAP thì có sự hình thành mô sẹo với màu sắc rất rõ ràng, có hình cầu với kết cấu bở

2.1.7 Tình hình sản xuất, kinh doanh hoa kiểng của một số nước trên thế giới và khu vực Đông Nam Á

Theo Quyết định số 718/QĐ-UB ngày 25 tháng 02 năm 2004 thì tình hình sản xuất kinh doanh hoa kiểng trên thế giới ngày càng phát triển một cách mạnh mẽ Kim ngạch mậu dịch về hoa kiểng tiếp tục gia tăng Theo thống kê của Trung tâm thương mại Quốc tế thì những năm 50 kim ngạch mậu dịch hoa kiểng trên thế giới

chưa đến 3 tỷ USD, nhưng đến 1985 đã lên đến 15 tỷ USD và tiếp tục tăng nhanh đến năm 1990 là 30,5 tỷ USD Đến nay đã xấp xỉ 100 tỷ USD và tiếp tục tăng 10% mỗi năm Dự kiến những năm đầu thế kỷ 21, kim ngạch mậu dịch hoa kiểng thế giới có thể lên đến 200 tỷ USD/năm

Sản lượng hoa kiểng trên thế giới tăng trưởng bình quân 10% năm Hiện có trên 50 nước sản xuất hoa kiểng với qui mô lớn Về lĩnh vực giá trị, Hà Lan, Mỹ, Nhật Bản, Ý, Đức và Canada là nhà sản xuất kiểng hoa và kiểng lá lớn nhất Nhưng

về mặt diện tích, Trung Quốc và Ấn Độ lại là nước có diện tích lớn nhất, khu vực châu Á Thái Bình Dương là vùng có diện tích sản xuất hoa kiểng chiếm 77% tổng diện tích trồng hoa kiểng thế giới

Tại khu vực Đông Nam Á ngày nay hoa kiểng cũng phát triển rất mạnh Tại Malaysia, chính phủ đã quy hoạch 300 ha ở bang Zohor và giao cho Hiệp hội Hoa lan tổ chức ở đây thành khu “Trung tâm sản xuất hoa kiểng xuất khẩu” Ngành trồng hoa của Đài Loan cũng đang tăng nhanh tốc độ 15 – 20% Hiện đã có diện tích trồng hoa 10.172 ha đạt doanh thu hàng năm 9,3 tỷ Đài tệ (Quyết định số 718/QĐ-UB ngày 25 tháng 02 năm 2004)

Diện tích phát triển cây kiểng lá ngày càng mở rộng Kiểng lá ở Thái Lan được trồng để xuất khẩu sang thị trường Nhật, Mỹ, Thụy Điển, Ý Lá kiểng dùng để trang trí đi kèm với hoa, hoặc chưng trong nhà, ngoài vườn tạo không gian xanh tự nhiên Quy mô mỗi nhà vườn khoảng 5 – 10 ha Theo tính toán của người trồng kiểng lá, mỗi năm một cây có thể cho 12 lá, giá xuất khẩu là 6 bath/1 lá (tương đương 45.000 VNĐ) Như vậy, doanh số xuất khẩu hàng năm của họ có thể đạt 1 tỷ đồng/ha

2.1.8 Tình hình phát triển hoa kiểng ở Việt Nam

Ở cả nước Việt Nam nói chung và thành phố Hồ Chí Minh nói riêng trong vòng 10 năm gần đây kinh doanh hoa kiểng đã phát triển khá mạnh, sản xuất đa dạng nhiều chủng loại, với những vùng hoa kiểng lớn như : Nam Định, Hải Phòng, Bình Định, Đà Nẵng, Đà lạt (Lâm Đồng), Biên Hoà (Đồng Nai), thành phố Hồ Chí Minh, Sa Đéc (Đồng Tháp), Chợ Lách, Cái Mơn (Bến Tre)

Tại khu vực phía Nam, Lâm Đồng là tỉnh có diện tích trồng hoa và sản lượng hoa lớn nhất cả nước, là nguồn cung cấp hoa chủ yếu cho thị trường thành phố Hồ Chí Minh

Tham gia sản xuất, kinh doanh hoa kiểng gồm nhiều thành phần kinh tế (cá thể, tập thể, nhà nước, liên doanh, 100% vốn đầu tư nước ngoài), đã góp phần giải quyết lao động việc làm và thu hút vốn của nhân dân, của các thành phần kinh tế đem lại một hiệu quả kinh tế xã hội thiết thực trong bối cảnh ngành nông nghiệp hiện nay

2.1.8.1 Tình hình phát triển hoa, cây kiểng tại thành phố Hồ Chí Minh

Theo báo cáo tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa, cây kiểng phục vụ tết Nguyên đán Quý Tỵ 2013 trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh thì diện tích sản xuất hoa, cây kiểng trên địa bàn thành phố 6 tháng đầu năm 2013 đạt 1.314 ha, tăng 4,8% so với cùng kỳ; trong đó diện tích sản xuất phục vụ Tết Nguyên đán Quý Tỵ năm 2013 là 1.207 ha, tăng 2,9% so với cùng kỳ Diện tích tăng tập trung vào hoa nền, hoa lan, bonsai và cây kiểng

Về công tác sưu tập, nhập nội, chọn tạo và nhân giống hoa kiểng tại Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh trong 6 tháng đầu năm 2013, sưu tập được 5 giống kiểng lá, 8 giống lan rừng, 2 giống hoa nền mới Lũy kế từ khi thực hiện chương trình đến nay, Trung tâm đã sưu tập và tuyển chọn 212 giống hoa, cây kiểng các loại, trong đó, có 84 giống kiểng lá, 17 giống hoa nền, 75 giống lan Dendrobium,

01 giống lan Mokara, 05 giống lan Cattleya và 30 giống lan rừng Trong đó, các giống kiểng lá mới gồm Thiên long, Vạn lộc, Thiên phú, Huyết long, Tuyết trắng, Hạnh

phúc, Ái hồng, Má hồng đào đang được thực hiện nhân giống bằng kỹ thuật in vitro

Kế hoạch 6 tháng cuối năm 2013 tiếp tục tập trung triển khai Chương trình phát triển hoa, cây kiểng; Chương trình mục tiêu phát triển giống cây, giống con chất lượng cao trên địa bàn thành phố giai đoạn 2011 – 2015 đã được Ủy ban nhân dân thành phố phê duyệt tại Quyết định số 3330/QĐ – UBND ngày 04/7/2011 và Quyết định số 5997/QĐ – UBND ngày 09/12/2011, phấn đấu đến cuối năm 2013 diện tích hoa, cây kiểng trên địa bàn thành phố đạt 2.060 ha

Định hướng thực hiện chương trình đến năm 2015 trong Chương trình phát triển hoa, cây kiểng trên địa bàn TPHCM giai đoạn 2011 – 2015 ban hành theo Quyết định số 3330/QĐ-UBND ngày 04/7/2011 của Ủy ban nhân dân thành phố Hồ Chí Minh, mục tiêu đến năm 2015 đạt 2.100 ha hoa, cây kiểng, trong đó diện tích hoa lan đạt 400 ha; nâng cao chất lượng, hiệu quả sản xuất kinh doanh, nâng cao khả năng cạnh tranh của sản xuất hoa, cây kiểng trên địa bàn thành phố, đáp ứng thị trường trong nước và hướng tới xuất khẩu

Đến năm 2015 đưa vào sản xuất 4 – 5 giống hoa kiểng mới Lập quy hoạch làng nghề hoa kiểng nằm trong quy hoạch phát triển làng nghề nhà vườn kết hợp du lịch sinh thái tại huyện Củ Chi 70% hộ trồng hoa lan có qui mô sản xuất từ 5.000 m2 trở lên có áp dụng cơ giới hóa (hệ thống tưới phun sương tiết kiệm nước) Phấn đấu thành lập mới từ 10 hợp tác xã, 15 tổ hợp tác trong lĩnh vực hoa, cây kiểng Phấn đấu đến năm 2015, diện tích hoa, cây kiểng đạt 2.100 ha, tăng 190 ha so với năm 2010

Bảng 2.1 Kế hoạch phát triển hoa, cây kiểng đến năm 2015 (đvt: ha) 

Hoa nền Hoa, kiểng lâu năm

(Quyết định số 3330/QĐ-UBND ngày 04/7/2011 của Ủy ban nhân dân thành phố Hồ Chí Minh)

2.2 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nhân giống in vitro là thuật ngữ mô tả các

phương thức nuôi cáy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng Môi trường có các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng (Dương Công Kiên, 2002)

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các

mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng Trước kia người ta dùng phương pháp này để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hưởng của các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy Hiện nay, các nhà khoa học sử dụng hệ thống nuôi cấy mô thực vật để nghiên cứu tất cả các vấn đề liên quan đến sinh học, sinh hóa học di truyền và cấu trúc thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật cũng mở rộng tiềm năng nhân giống vô tính đối với các loại cây quan trọng, có giá trị

về mặt kinh tế và thương mại trong đời sống hàng ngày của con người

2.2.1 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.1.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dưỡng khoáng vô cơ

và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp Từ một đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi Chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ để trở thành một cây hoàn chỉnh Cây con được chuyển ra đất dần dần thích nghi và phát triển bình thường

2.2.1.2 Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân hóa của các tế bào đã phân hóa Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện diện của auxin Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo

Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với các loại thực vật không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ Từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma lại cao hơn

2.2.1.3 Nuôi cấy tế bào đơn

Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào đơn Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tăng sinh khối

Với các cơ chất thích hợp được bổ sung vào trong môi trường tế bào có khả năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được tách ra và trải trên môi trường thạch Khi môi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành từng cụm tế bào mô sẹo Khi môi trường thạch có tỷ lệ cytokinin auxin thích hợp, tế bào đơn có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh

2.2.1.4 Nuôi cấy protoplast – chuyển gen

Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, có sức sống và duy trì đầy đủ các chức năng sẵn có Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh (tính toàn thế ở thực vật) Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng

dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng Quá trình dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài

2.2.1.5 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội

Hạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp tạo thành mô sẹo

Mô sẹo này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội (Dương Công Kiên, 2002)

2.2.2 Các giai đoạn nhân giống in vitro

2.2.2.1 Giai đoạn chuẩn bị

Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in vitro Mục

đích của giai đoạn này là phải tạo được nguyên liệu thực vật vô trùng để đưa vào nuôi cấy Mẫu đưa từ bên ngoài vào phải đảm bảo các yêu cầu tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, tốc độ sinh trưởng nhanh Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ và thời gian xử lý diệt khuẩn Vật liệu thường được chọn và đưa vào nuôi cấy là đỉnh sinh trưởng, chồi nách, hoa tự, hoa, đoạn thân, mảnh, lá, rễ

2.2.2.2 Giai đoạn tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng sự phát triển của mô nuôi cấy Quá trình này được điều khiển chủ yếu bằng các chất điều hòa sinh trưởng (tỷ lệ auxin/cytokinin) đưa vào môi trường nuôi cấy

Tuy nhiên bên cạnh đó cũng phải quan tâm đến tuổi của mẫu đem vào nuôi cấy Thường các mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn những mô đã chuyển hoá

2.2.2.3 Giai đoạn nhân nhanh chồi

Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số cao nhất Chính vì thế giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình nuôi cấy Để tăng hệ số người ta thường đưa vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm men, kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp Tuỳ thuộc vào đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng cách kích thích

sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát triển của các chồi nách hoặc thông qua việc tạo thành cây từ phôi vô tính

2.2.2.4 Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định các chồi được chuyển sang môi trường ra rễ Thường sau 2 – 3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoại này người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm auxin, là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo

rễ phụ từ mô nuôi cấy Trong nhóm này các chất IAA, IBA, NAA, 2.4 – D được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất để tạo rễ cho chồi

2.2.2.5 Giai đoạn đưa cây ra đất

Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình và nó quyết định khả năng ứng dụng

của quá trình nhân giống invitro trong thực tiễn sản xuất Đây là giai đoạn chuyển

cây từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng hoàn toàn Do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp để cây có thể đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong ruộng sản xuất (Ngô Xuân Bình và cs, 2003)

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng nhân giống in vitro

2.2.3.1 Mẫu nuôi cấy

Murashige (1974) ghi nhận sự quan trọng của chọn lựa mẫu cấy thích hợp và chỉ cho thấy hầu hết những cơ quan có thể dùng để nuôi cấy mô Điều quan trọng cho thấy một số nhân tố khi chọn lọc mẫu bao gồm kiểu gen, cơ quan được chọn lọc, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khoẻ của mẫu và nguồn mẫu

 Kiểu gen

Kiểu gen ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy Với loài thuốc lá được sử dụng như cây kiểu mẫu, Cheng và Smith (1973) ghi nhận sự khác nhau giữa các genom qua nuôi cấy sinh trưởng mô lõi Hơn nữa, Jaramillo và Summers (1990) ghi nhận kiểu di truyền ảnh hưởng đến số lượng và đường kính mô sẹo qua nuôi cấy hạt

phấn cà chua Lycopersycon esculentum Mill

 Chọn cơ quan

Murashige (1974) cho rằng hầu hết các loại cơ quan và mô đều có khả năng

sử dụng nuôi cấy in vitro Ông cho rằng mẫu nuôi cấy khác nhau ở các loài khác

nhau, như ở Petunia dùng chồi đỉnh để nuôi cấy, theo Doerschung và Miller (1976) cho rằng chồi mầm thích hợp làm mẫu nuôi cấy ở các cây nẩy mầm từ hạt

 Tuổi và sinh lý

Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của mẫu nuôi cấy cho thấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hoá tế bào và tuổi sinh lý Có nhiều nghiên cứu khác nhau vế ảnh hưởng của tuổi sinh lý mẫu nuôi cấy, theo Pierik (1970) ghi nhận rễ phát sinh trên lá non và không phát sinh trên lá già

 Mẫu in vitro

Trong những năm gần đây, nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu in vitro có khả

năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên đồng ruộng hay trong vườn ươm như ở cây Azalea (Economou và Read,1986) Tuy nhiên, Lu và cộng sự (1991) ghi nhận nuôi cấy túi phấn đạt tỷ lệ thành công cao khi nuôi cấy túi phấn trên cây đồng ruộng

 Sức sống của mẫu

Điều cần thấy rằng mẫu cây mẹ có ảnh hưởng rất quan trọng đến nuôi cấy in vitro Morel (1952, 1955) nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để loại virus sản xuất những cây

sạch bệnh và điều này nói lên rằng cần phải cẩn thận chọn mẫu nuôi cấy nhất là đối

với những cây bệnh (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng,2002)

2.2.3.2 Sự vô trùng mẫu trong nuôi cấy

Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng, vitamin, rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn nhiều so với các tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy bị nhiễm bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày sẽ phủ đầy vi khuẩn hoặc nấm,khi đó mô nuôi cấy sẽ chết dần thí nghiệm phải bỏ đi

Có 3 nguồn nhiễm tạp chính:

 Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối

 Trên bề mặt hoặc bên trong mô nuôi cấy tồn tại các sợi nấm, bào tử vi khuẩn

 Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn theo bụi lên môi trường

2.2.3.3 Điều kiện nuôi cấy

 Nhiệt độ

Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy mô là 20 – 27oC Theo Murashige (1974), nhiệt

độ ảnh hưởng sâu sắc đến sinh trưởng và phát triển cây in vitro qua những tiến trình

sinh lý như hô hấp hay hình thành tế bào hay cơ quan

 Cường độ ánh sáng

Cường độ ánh sáng là một nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đến khả

năng nuôi cấy in vitro cây có lá xanh Ảnh hưởng của ánh sáng hình như có liên hệ với các

loài, có loài chịu ánh sáng cao, ánh sáng trung bình và ánh sáng thấp hay tối (Papachatzi và

cộng sự, 1981; Miller và Murashige, 1976; Thorpe và Murashige, 1970) Việc nuôi cấy in vitro tốt nhất trong điêu kiện ánh sáng 1000 lux (trích dẫn bởi Dương Công Kiên, 2002)

 Quang kỳ và chất lượng ánh sáng

Thời gian chiếu sáng ảnh hưởng sâu sắc đến những đáp ứng sinh lý ở cây trồng

Chất lượng ánh sang ảnh hưởng trực tiếp đến cây in vitro, vì ánh sáng cao hơn

ánh sáng đỏ hay ánh sáng đỏ có ảnh hưởng đến những biến đổi sinh lý trên cây như ra

hoa, chế độ dinh dưỡng và những hiện tượng khác như tăng sinh chồi in vitro

 Các chất khí

Thành phần chất khí trong bình nuôi cấy có ảnh hưởng đến sinh trưởng cây in vitro O2, CO2 và ethylen là những thành phần chất khí được khảo sát nhiều trong môi trường nuôi cấy Ẩm độ cũng được quan tâm đến, do ảnh hưởng đến quá trình làm khô mẫu nuôi cấy

2.2.3.4 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp trong nuôi cấy mô là rất cần thiết Vì

mỗi loại cây trồng khác nhau đều yêu cầu một hàm lượng dinh dưỡng khác nhau Mặt khác, môi trường còn thay đổi tuỳ thuộc vào sự phân hoá của mô cấy, tuỳ theo trường hợp duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hay tái sinh cây hoàn chỉnh Việc lựa chọn môi trường cần dựa vào tài liệu đã cho cùng đối tượng nuôi cấy hoặc thăm dò qua một số môi trường đã cho để xác định môi trường thích hợp cho mẫu nuôi cấy Các môi trường đều được thành lập từ một số thành phần chính với nguyên tắc có sự cân bằng các yếu tố trong môi trường

2.2.4 Thành phần hoá học của môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm một

số thành phần cơ bản sau:

Các nguyên tố đa lượng, bao gồm các loại muối của nitrogen, potassium, calcium, phosphorus, magnesium và sulfur Đây là sáu nguyên tố chính cần thiết cho sinh trưởng của thực vật bậc cao

Các nguyên tố vi lượng, bao gồm các loại muối của sắt, kẽm, mangan, boron, copper, molybdenum và cobalt ở dạng vết

Các phụ gia hữu cơ, một lượng nhỏ các loại vitamin (myo-inositol, thiamine, nicotinic acid, pyridoxine, riboflavin), các amino acid (thường cho phép bỏ qua nhưng trong một số trường hợp đặc biệt thì có thể dùng), và các phụ gia hữu cơ không xác định khác (malt, dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein, nước dừa)

Nguồn carbon thường sử dụng sucrose làm nguồn carbon thay cho nguồn carbon được thực vật cố định từ khí quyển bằng quang hợp Trong đa số các thí nghiệm nuôi cấy, tế bào thực vật đã mất khả năng quang hợp Glucose cũng thường được đưa vào môi trường và cho hiệu quả tương đương sucrose, trong khi fructose cho hiệu quả kém hơn

Các tác nhân làm rắn (tạo gel) môi trường Thường sử dụng là agar, một loại polysaccharide thu được từ một số loài tảo thuộc ngành tảo đỏ (Rhodophyta) Một

số hợp chất khác cũng được thử nghiệm thành công như alginate, phytagel, methacel và gel-rite

2.2.4.1 Auxin

Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng rất thường xuyên trong nuôi cấy mô – tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù

tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được sử dụng phối hợp với các cytokinin

Auxin là hợp chất có nhân indole, có công thức nguyên là C10H9O2N Auxin gồm có hai loại là auxin có nguồn gốc nội sinh do thực vật tạo ra (IAA), và auxin tổng hợp do con người tạo ra (IBA; NAA; 2,4 – D) IAA tổng hợp được sử dụng trong nuôi cấy mô nhưng nó dễ bị biến tính trong môi trường nuôi cấy và nhanh chóng thoái biến ở trong mô Tuy nhiên những đặc tính này có thể trở nên hữu dụng bởi vì trong cây IAA cùng với cytokinin sau khi cảm ứng sự hình thành mô sẹo sẽ kích thích sự tạo chồi hoặc phôi khi hàm lượng của nó trong mô giảm dần IAA thường được sử dụng phối hợp với các chất điều hòa sinh trưởng khác để kích thích

sự phát sinh hình thái trực tiếp Tùy theo mục đích thí nghiệm mà người ta có thể

sử dụng các hợp chất giống auxin khác được tổng hợp và nó có những hoạt động hơi khác với auxin như: IBA, 2,4 – D, NAA 2,4 – D thường được sử dụng phối hợp với cytokinin để cảm ứng sự tạo mô sẹo và huyền phù tế bào và nó sẽ được thay thế bởi IBA hay NAA để kích thích sự phát sinh hình thái IBA và NAA là loại auxin thích hợp trong nuôi cấy chồi IAA và IBA nhạy cảm với nhiệt độ và bị phân hủy trong quá trình hấp tiệt trùng và IAA không ổn định trong môi trường nuôi cấy cho dù nó được lọc qua màng lọc vô trùng Nồng độ của IAA có thể giảm

đi 10 lần trong 4 tuần nuôi cấy ở trong tối nếu không được bổ sung thêm, tốc độ

phân hủy của auxin ở ngoài sáng xảy ra nhanh hơn đặc biệt trong môi trường MS IBA ổn định trong môi trường hơn là IAA, mức độ giảm của IBA thấp Còn NAA

và 2,4 – D không bị biến tính trong môi trường nuôi cấy Ngoài ra, còn có một số auxin khác nhưng chúng rất ít được sử dụng như: 2,4,5 – T, 4 – CPA, MPCA, NOA, Dicamba, Picloram

Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nó tùy thuộc vào nồng độ và tác động bổ trợ của chúng với các chất điều hòa tăng trưởng khác

Auxin tác động lên sự kéo dài tế bào Hiệu quả này là sự nối tiếp cho sự gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nước vào bên trong tế bào, sức căng của thành tế bào giảm đi và tế bào tự kéo dài ra

Auxin thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng một sự phóng thích ion H+ Ion này gây ra một hoạt tính acid chịu trách nhiệm làm giảm tính đề kháng của thành tế bào bởi sự hấp thu ion K+

Auxin tác động lên các quá trình chuyển hóa, đặc biệt nhất là trên sự tổng hợp ARN ribosome

Auxin kích thích sự phân chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trình hình thành

mô sẹo và sự hình thành rễ bất định Auxin cũng ức chế sự phát triển của chồi nách và

sự hình thành phôi sinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy mô sẹo

Tất cả cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo giai đoạn phát triển của chúng Auxin được tổng hợp ở lá non, trong các chồi đang hoạt động, ở phát hoa, ở các quả còn non và lưu thông từ đỉnh xuống phía dưới với một sự phân cực rõ ràng được nhìn thấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non Nhưng trong quá trình vận chuyển này, chúng bị oxy hóa do hoạt động của các enzyme auxin - oxidase, điều này cho thấy nồng độ auxin luôn cao hơn ở những vùng tổng hợp ra chúng

Đối với một số loài, auxin cần cho sự hình thành rễ của các cành giâm (Võ Thị Bạch Mai, 2004)

2.2.4.2 Cytokinin

Cytokinin là một trong nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật Cytokinin ít có ảnh hưởng trên một thực vật nguyên vẹn và nó có hiệu quả trong việc kích thích sự sinh tổng hợp protein

Cytokinin được phát hiện sau auxin và gibberellin Người ta biết rằng trong môi trường nuôi cấy, việc bổ sung cytokinin sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự phân chia tế