NHÂN GIỐNG CÂY MĂNG TÂY (Asparagus officinalis) BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NHÂN GIỐNG CÂY MĂNG TÂY Asparagus officinalis BẰNG KỸ THUẬT IN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NHÂN GIỐNG CÂY MĂNG TÂY (Asparagus officinalis)

BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: ĐỖ NGỌC CƯỜNG Niên khóa: 2011 - 2013

12/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NHÂN GIỐNG CÂY MĂNG TÂY (Asparagus officinalis)

BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO

KS NGUYỄN HOÀNG QUÂN

12/2013

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng và nỗ lực của bản thân, tôi đã được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô giáo, bạn bè, người thân và các cơ quan đơn vị

Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo đã trực tiếp giảng dạy, trang bị những kiến thức bổ ích cho tôi trong suốt thời gian qua

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh và tập thể cán bộ công nhân viên phòng Công nghệ sinh học Thực vật đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian làm khóa luận tốt nghiệp

Đặc biệt tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS Phan Diễm Quỳnh và

KS Nguyễn Hoàng Quân đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo trong Bộ môn Công nghệ sinh học đã chân thành đóng góp ý kiến quý báu cho khóa luận tốt nghiệp của tôi được hoàn thiện hơn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả người thân, bạn bè, những người luôn bên cạnh động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận

Sinh viên thực hiện

Đỗ Ngọc Cường

TÓM TẮT

Măng tây là loại thực phẩm có trong các bữa ăn hàng ngày của mỗi gia đình Ngoài ra, măng tây cũng là vị thuốc để phòng và trị bệnh ở người Vì thế trên thị trường măng tây có nhu cầu tiêu thụ rất lớn Tuy nhiên phương pháp gieo trồng còn gặp nhiều hạn chế, không đủ đáp ứng cho thị trường trong và ngoài nước Nên đề

tài “Nhân giống cây măng tây (Asparagus officinalis) bằng kỹ thuật in vitro” thực

hiện Kết quả thu được

Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của phương pháp xử lý hạt trước khi khử trùng đến khả năng sống của mẫu hạt măng tây gồm 4 nghiệm thức là 4 phương pháp xử lý hạt khác nhau, giữ nguyên hạt, cắt hạt, ngâm nước ấm ở 600C và ngâm HCL 37% Kết quả thu được hạt ngâm nước ấm ở 600C thích hợp nhất cho việc tăng khả năng hình

thành cây măng tây in vitro từ mẫu hạt sau 4 tuần nuôi cấy

Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng tạo sẹo của mẫu

thân cây măng tây in vitro gồm 7 nghiệm thức là 7 loại môi trường có thành phần cơ

bản là MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng NAA với các nồng độ khác nhau (0; 1,0; 1,5; 2,0mg/l) phối hợp với BA (0; 0,1; 0,3mg/l) Kết quả đạt được, môi trường

bổ sung chất điều hòa sinh trưởng NAA (2,0 mg/l) phối hợp với BA (0,1 mg/l) thích

hợp nhất cho việc tạo sẹo từ thân cây măng tây in vitro (100% mẫu tạo sẹo, trọng

lượng tươi (3,56 gr), chất lượng sẹo tốt sau 6 tuần nuôi cấy)

Thí nghiệm khảo sát sảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng tái sinh chồi từ

mô sẹo của cây măng tây in vitro gồm 7 nghiệm thức là 7 loại môi trường có thành

phần cơ bản là MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng với các nồng độ thay đổi khác nhau (0; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) BA phối hợp với ( 0; 0,1; 0,5 mg/l) NAA Kết quả đạt được, môi trường có bổ sung BA 2,0 mg/l phối hợp với NAA 0,1 mg/l cho số chồi cao nhất ( 4.06 chồi) và cây sinh trưởng phát triển tốt sau 4 tuần nuôi cấy

Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng nhân chồi cây

măng tây in vitro gồm 7 nghiêm thức là 7 loại môi trường có thành phần cơ bản là MS

có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng với các nồng độ thay đổi khác nhau (0; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) BA và ( 0; 0,1; 0,5 mg/l) IBA Kết quả đạt được, môi trường có bổ sung BA 2,0 mg/l phối hợp với IBA 0,1 mg/l cho hệ số nhân chồi cao nhất ( 7,36 lần) và chiều cao chồi đạt 1,50 cm và cây sinh trưởng phát triển tốt sau 4 tuần nuôi cấy

Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của NAA đến quá trình ra rễ của cây măng tây in

vitro gồm 7 nghiệm thức là 7 loại môi trường có thành phần cơ bản là MS có bổ sung

chất điều hòa sinh trưởng NAA (0; 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1,0; 1,5 mg/l) Kết quả đạt được, môi trường có bổ sung NAA 0,7 mg/l cho tỷ lệ chồi ra rễ cao nhất (100%), số rễ trung bình/cây (3,92 rễ), chiều dài trung bình/rễ (4,22 cm) sau 4 tuần nuôi cấy

Đề tài này đã xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cây măng tây có thể áp

dụng để nhân nhanh giống măng tây phục vụ cho sản xuất trên quy mô lớn

Từ khóa: măng tây, nhân giống, mô sẹo

SUMMARY

Asparagus is a kind of food in the daily diet of every family Additionally, asparagus is also medicine for prevention and treatment of human disease So it has wide requirement in the market However, planting methods still have many restrictions, not enough to satisfy domestic and foreign markets Therefore the topic

"In vitro propagation of Asparagus officinalis " was carried out The results obtained

as follow

The experiment was investigated an efficient of seed processing method before sterilization to viability of seed 4 treatments were 4 different methods: preserved seeds, cut seeds, soaked in warm water 600C and soak in 37% HCL As a result, the seeds were soaked in warm water 600C, which were the most appropriate for the increasing formation in vitro Asparagus from seed samples after 4 weeks of culture The experiment was tested the efficient of different concentration of growth

regulator (BA and NAA) on callus formation from stem explants in vitro, which

consists the basic culture medium MS supplemented with various concentration of growth regulator (0, 1.0, 1.5, 2.0mg/l NAA and 0, 0.1, 0.3 mg/l BA), was performed in

7 treatments The best result was achieved on the medium containing 2.0 mg/l

α-naphthaleneacetic acid (NAA) and 0.1 mg/l N6-benzyladenine (BA) (100% callus formation, 3.56g, high quality callus after 6 weeks incubation)

The experiment was identified the influences of BA and NAA on shoot regeneration from callus of Asparagus in vitro, which consists basal media supplemented growth regulator with different concentration (0, 1.0, 1.5, 2.0 mg/l BA and 0, 0.1, 0.5 mg/l NAA), was designed in 7 treatments Optimal shoot regeneration was achieved on the medium supplemented 2.0 mg/l BA and 0.1 mg/l NAA, which has highest number of shoots (4.06 shoots) and well developed plants after 4 weeks incubation

The experiment was investigated the effect of BA and NAA on multiplication of

shoots of Asparagus in vitro 7 treatments are 7 types of MS medium supplemented

with various concentrations of growth regulation (0, 1.0, 1.5, 2.0 mg/l BA and 0, 0.1, 0.5 mg/l IBA) The result obtained, the medium containing 2.0 mg/l BA and 0.1 mg/l IBA that created the highest coefficients of shoot multiplication (7.36 times), length of shoots (1.50 cm) and well developed plant after 4 weeks incubation

The experiment was tested how NAA affect to rooting of Asparagus in vitro

Different concentrations of growth regulation NAA (0, 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 1.0, 1.5 mg/l) were added into MS medium in 7 treatments For optimization of rooting, basal medium were supplemented with 0.7 mg/l NAA that provided the highest rooting frequency (100%), number of roots per plant (3.92 roots), average length of roots (4.22 cm) after 4 weeks incubation

This project was established in vitro propagation protocol that can be applied to

Asparagus propagated to serve on large-scale production

Keyword: Asparagus officinalis, propagation, callus

MỤC LỤC

Lời cám ơn i

Tóm tắt ii

Summary iv

Mục lục vi

Danh mục chữ viết tắt ix

Danh mục bảng x

Danh mục hình xi

Chương 1 Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Nguồn gốc và đặc tính sinh thái 3

2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ măng tây trên thế giới và trong nước 4

2.2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ măng tây trên thế giới 4

2.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ măng tây trong nước 5

2.3 Phân loại và đặc điểm thực vật 5

2.3.1 Phân loại 5

2.3.2 Đặc điểm thực vật 6

2.4 Giá trị kinh tế và giá trị dinh dưỡng của cây măng tây 7

2.4.1 Giá trị kinh tế 7

2.4.2 Giá trị dinh dưỡng 7

2.5 Nhân giống cây trồng in vitro 8

2.5.1 Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật 8

2.5.2 Lợi ích của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật 9

2.5.3 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 9

2.5.4 Giai đoạn nhân giống in vitro 10

2.5.5 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật 12

2.6 Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây măng tây trong nước và trên thế giới 13

2.6.1 Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây măng tây ở Việt Nam 13

2.6.2 Những nghiên cứu nuôi cấy mô cây măng tây trên thế giới 13

Chương 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 15

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 15

3.2 Vật liệu nghiên cứu 15

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 15

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 15

3.2.3 Môi trường nuôi cấy 16

3.2.4 Điều kiện nuôi cấy 16

3.3 Phương pháp nghiên cứu 16

3.3.1 Thí nghiệm 1 ảnh hưởng của phương pháp xử lý hạt trước khi khử trùng đến khả năng sống của mẫu hạt măng tây 16

3.3.2 Thí nghiệm 2 Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng tạo sẹo 17

3.3.3 Thí nghiệm 3 Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng tái sinh 17

3.3.4 Thí nghiệm 4 Khảo sát ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi 18

3.3.5 Thí nghiệm 5 Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ 19

3.4 Phương pháp xử lý số liệu 19

Chương 4 Kết quả và thảo luận 20

4.1 Thí nghiệm 1 Ảnh hưởng của phương pháp xử lý hạt trước khi khử trùng đến khả năng sống của mẫu hạt măng tây 20

4.2 Thí nghiệm 2 Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng tạo sẹo 21

4.3 Thí nghiệm 3 Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng tái sinh 25

4.4 Thí nghiệm 4 Khảo sát ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi 27

4.4.5 Thí nghiệm 5 Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ 29

Chương 5 Kết luận và đề nghị 32

5.1 Kết luận 32

5.2 Đề nghị 32

Tài liệu tham khảo 33

Phụ lục 35

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MS: Murashige and Skoog, 1962

BA: Benzyl adenine

IAA: Indol acetic acid

IBA: Indol butyric acid

NAA: Naphtyl acetic acid

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Tình hình sản xuất măng tây trên thế giới năm 2009 4

Bảng 3.1 Phương pháp xử lý hạt trước khi khử trùng đến tỷ lệ nảy mầm của mẫu hạt măng tây 16

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BA và NAA đến quá trình tạo sẹo 17

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng tái sinh chồi 18

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân chồi 18

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ 19

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của việc xử lý hạt trước khi khử trùng đến tỷ lệ nảy mầm của mẫu hạt măng tây 20

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của BA và NAA đến quá trình tạo sẹo 22

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng tái sinh chồi 26

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi 27

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ 30

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cây măng tây 3

Hình 3.1Hạt măng tây 15

Hình 4.1Ảnh hưởng của việc sử lý hạt trước khi khử trùng đến khả năng sống của mẫu hạt măng tây 21

Hình 4.2 Mẫu măng tây in vitro 21

Hình 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến trọng lượng tươi mô sẹo 24

Hình 4.4 Mô sẹo phát sinh trên môi trường MS sau 6 tuần nuôi cấy 25

Hình 4.5 Ảnh hưởng nồng độ BA và NAA đến khả năng tái sinh chồi 26

Hình 4.6 Tái sinh chồi trên môi trường MS sau 4 tuần nuôi cấy 27

Hình 4.7 Ảnh hưởng của nồng độ BA và IBA đến hệ số nhân chồi 29

Hình 4.8 Nhân chồi trên môi trường MS sau 4 tuần nuôi cấy 29

Hình 4.9 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ 31

Hình 4.10 Tạo rễ trên môi trường MS sau 4 tuần nuôi cấy 31

Rau măng tây là một loại cây trồng khá mới đối với người dân Việt Nam, tuy nhiên trên thế giới nó đã được biết đến từ khoảng 300 năm trước Công Nguyên Đó là một loại cây thân thảo lâu năm có khả năng thích ứng với nhiều vùng sinh thái khác nhau

và được trồng nhiều nơi trên thế giới

Rau măng tây trên thị trường được sử dụng ở nhiều dạng, không chỉ dùng măng tươi mà còn là nguyên liệu cho công nghệ đồ hộp, là mặt hàng xuất khẩu có giá trị kinh tế cao Ngoài ra, cây măng tây còn là cây dược liệu giàu dược tính, có tác dụng tốt trong phòng trị đường tiêu hóa, tiểu đường, suy gan, thận, chống lão hóa, tăng cường sinh lực

Ở nước ta, hiện nay măng tây được trồng thử nghiệm ở nhiều nơi Đông Anh (Hà Nội), Kiến An (Hải Phòng) Ở miền Nam trồng ở Củ Chi, Bình Phước, Đồng Nai,

Bà Rịa Vũng Tàu Điều kiện khí hậu miền Nam rất thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của măng tây, cho thu hoạch quanh năm và cho năng suất cao Đây là một lợi thế để tạo nguồn sản phẩm đáp ứng nhu cầu trong nước và hướng tới xuất khẩu Vì là cây trồng mới có nhu cầu dinh dưỡng đòi hỏi rất nghiêm ngặt và khả năng kháng sâu bệnh rất yếu nên quy mô trồng măng tây còn hạn chế chưa đáp ứng được nhu cầu rất lớn của thị trường Bên cạnh đó, để đáp ứng nhu cầu thực tế về việc cung cấp thực phẩm và dược liệu với số lượng lớn thì cần phải có nguồn giống măng tây có năng suất cao mà không mất đi đặc tính của cây mẹ cũng như việc bảo tồn loại cây này Việc nâng cao hiệu quả kinh tế sản xuất măng tây, hiện nay đã có nhiều mô hình trồng măng tây ra đời nhưng chủ yếu chỉ làm theo phương pháp truyền thống là gieo từ hạt Tuy nhiên, phương pháp này gặp một số khó khăn như:

thời gian nẩy mầm từ hạt dài, tỷ lệ cây giống nẩy mầm thấp, nếu để hạt làm giống thì giống có khả năng thái hóa Để khắc phục vấn đề này và góp phần làm tăng giá trị cây măng tây trồng ở địa bàn thành phố Hồ Chí Minh nên đề tài “Nhân giống

cây măng tây (Asparagus officinalis) bằng kỹ thuật in vitro” được thực hiện

1.2 Yêu cầu

Đánh giá tỷ lệ nảy mầm của cây măng tây khi vô mẫu bằng các phương pháp khác nhau và chọn lựa môi trường nuôi cấy thích hợp để xây dựng qui trình nuôi

cấy in vitro cây măng tây hoàn chỉnh

1.3 Nội dung thực hiện

Xác định phương pháp tối ưu vô mẫu măng tây từ hạt

Khảo sát nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thích hợp đến quá trình tạo sẹo, tái sinh

chồi, nhân chồi và tạo rễ cây măng tây in vitro

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nguồn gốc và đặc tính sinh thái

Cây Măng tây (Asparagus) (xem hình

2.1), có nguồn gốc ở bờ biển phía tây

Châu Âu (từ miền bắc Tây Ban Nha tới

phía bắc Ai-Len, Anh và phía tây bắc

nước Đức nên chúng ta quen gọi là cây

măng tây để phân biệt với măng ta (măng

tre) và đã được trồng ở Aswan (Ai Cập)

khoảng 20.000 năm trước đây Người ta

đã dùng măng tây như một loại rau và

thuốc men, do hương vị tinh tế và nhiều

dược tính có lợi của nó, được sử dụng

trên một vùng của Ai Cập có niên đại 3000 năm trước Công nguyên Ở thời cổ đại, nó được biết đến ở Syria và ở Tây Ban Nha (Pam và Brunning, 2010)

Theo Wade (2001), cây măng tây được Alexxander phát hiện vào khoảng 300 năm trước Công nguyên có nguồn gốc từ vùng Trung Đông và đem về trồng đầu tiên ở Hy Lạp, sau đó được trồng ở Roma

Theo Boswell, Surtevant và Vavilov thì nguồn gốc của măng tây là Địa Trung Hải và Tiểu Á (Palaniswami và Peter, 2008) Đầu tiên, măng tây chỉ được biết với tính năng như một loại thảo dược dùng làm thuốc để chữa các bệnh về tim, phù thũng, đau răng Sau đó, cũng chính người Hy Lạp đã sử dụng măng tây như một loại rau cao cấp vào những năm 200 trước Công nguyên Ở Việt Nam măng tây du nhập vào những năm 1970, được trồng ở nhiều tỉnh thành trong cả nước

Nhiệt độ thích hợp cho cây măng tây nảy mầm là khoảng 25-300C Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của cây măng tây là 18,3 – 29,50C, ngoài ngưỡng nhiệt độ này

sẽ ức chế cây sinh trưởng Măng tây có thể chịu được lạnh nhưng dưới 100C cây ngừng phát triển, thích hợp với những vùng có cường độ sáng mạnh, là cây ưa ẩm có

Hình 2.1 Cây măng tây

https://encryptedtbn3.gstatic.com/images

độ ẩm thường xuyên đạt từ 80 – 85% sẽ kích thích măng tây ra nhiều chồi non mềm

ngọt, nhưng độ ẩm không khí cao sẽ làm cây mềm yếu dễ nhiễm bệnh

Măng tây thích hợp với các loại đất cát pha hoặc thịt nhẹ, tơi xốp, có khả năng

thoát nước tốt, pH thích hợp từ 6,5 – 7,5 hoặc trung tính (Mai Thị Phương Anh, 2001)

Măng tây được trồng ở cả vùng đồng bằng và vùng núi, thích hợp nhất là ở độ cao

600-900m so với mực nước biển Ngoài ra, măng tây còn có khả năng chịu mặn và

sương gió, những vùng có độ mặn tương đối cao cây vẫn giữ được năng suất

2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ măng tây trên thế giới và trong nước

2.2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ măng tây trên thế giới

Hiện nay diện tích trồng măng tây trên thế giới khoảng 200.000 ha, trong đó

Châu Á là khu vực trồng măng tây lớn nhất thế giới Một số nước trồng măng tây

với diện tích lớn là Trung Quốc, Mỹ, Đức, Peru, Mexico, Tây Ban Nha Trong đó

lớn nhất là Trung Quốc (57.000 ha), đến Mỹ và Đức ( 20.000 ha)

Năng suất măng tây trên thế giới dao động rất lớn, những nước có năng suất

thấp nhất là Iran (1,4 tấn/ha/năm), Peru (14 tấn/ha/năm) Còn lại đa số các nước đạt

năng suất từ 3 -6 tấn/ha/năm

Bảng 2.1 Tình hình sản xuất măng tây trên thế giới năm 2009

Khu vực, quốc gia Diện tích (ha) Năng suất (tấn/ha)

Nguồn : www.calif-asparagus-seed.com

Theo FAO - 2009 tổng sản lượng măng tây sản xuất trên thế giới đạt 1.331.955

tấn Trung Quốc là nước có sản lượng lớn nhất đạt 587.392 tấn, chiếm 44,1% tổng

lượng măng tây của thế giới, kế đó là Peru 190.470 tấn, chiếm 14,3%, Mỹ chiếm

7,7%, Đức chiếm 5,5%, Tây Ban Nha chiếm 4,2% và các nước còn lại là 19,1%

Hiện nay sản phẩm măng tây lưu hành trên thị trường ở 3 dạng: măng tươi, măng

bảo quản đông lạnh và sản phẩm măng đóng hộp Có 8 nước tham gia xuất khẩu măng

tây tươi, 2 nước có thị phần cao nhất đó là Peru 67.089 tấn và Mexico 47.657 tấn

2.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ măng tây trong nước

Ở Việt Nam, cây măng tây đã du nhập vào từ những năm 1960 – 1970 nhưng ngày đó do không tìm được thị trường nên cây măng tây không thể phát triển được Đến năm 1988 một Việt kiều Đức đã mang 500g hạt giống măng tây về trồng thử ở Đà Lạt, khi đó cây măng tây được sử dụng với giá trị như là hoa cắt cành khi cây vừa 2 – 2,5 tháng tuổi, từ đó hình thành nên một thị trường trồng cây măng tây để cắt là kiểng trang trí Mãi đến năm 2005, cây măng tây mới thực sự

có mặt trở lại ở Việt Nam đúng với giá trị thật của nó (Benson và Lê Hồng Triều, 2009) Một số vùng ở miền bắc đã trồng măng tây để xuất khẩu như Đông Anh (Hà Nội), Kiến An (Hải Phòng) nhưng năng suất không cao, khoảng 3 -4 tấn/ha

Do khí hậu miền Bắc có mùa đông lạnh, cây chỉ cho thu hoạch măng vào cuối mùa xuân và mùa hè, thời gian thu hoạch trong năm chỉ kéo dài 4-5 tháng

Ở miền Nam từ cuối năm 2005, măng tây được đưa về trồng thử nghiệm ở huyện Củ Chi thành phố Hồ Chí Minh Điều kiện khí hậu thích hợp cho cây sinh trưởng và phát triển quanh năm Trong một năm có thể khai thác từ 8-9 tháng, năng suất đạt 10-15 tấn/ha/năm Hiện nay nhiều người dân ở miền tây cho biết măng tây được tiêu thụ ở Thành phố Hồ Chí Minh với giá 60.000 đồng/kg (măng loại 1), còn loại 2, loại 3 được bán tại địa phương với giá 35.000 – 40.000 đồng/kg

2.3 Phân loại và đặc điểm thực vật

Vĩ (Iridales), trong khi các hệ thống khác, đặc biệt là hệ thống phân loại của APG lại đưa hai bộ Orchiadales và Iridales vào trong bộ Apararagales Bộ này được đặt

tên theo chi Asparagus (măng tây) (Wikipedia, 2012)

Theo Mai Thị Phương Anh (2001), một loài măng tây (có thể là Asparagus

officinalis altilis nhưng có khả năng nhiều hơn là A.martimus) đã được trồng trong

vườn rau của người La Mã Từ các loài măng tây hoang dại chỉ có A.officinalis là loài

trồng trọt cho rau xanh Loài A.Springeri là loài có tính chống chịu cao với nấm

Fusarium spp nhưng không lai được với A.officinalis

Hầu hết các giống được trồng hiện nay là các giống thuộc loài A.Officinalis với

một số đặc điểm hình thái học khác nhau kể cả tính thích ứng với từng địa phương

2.3.2 Đặc điểm thực vật

Măng tây là cây dạng bụi, thân thảo, lá kim Cây có hoa đơn tính màu vàng, quả màu đỏ, vỏ hạt cứng, thích hợp vùng khí hậu nhiệt đới Hạt măng tây có thể nẩy mầm ở 200C, dưới 150C hạt không nảy mầm Theo Bailey thì măng tây là một chi lớn (khoảng 150 loài) dạng cây thân thảo lưu niên có thân gỗ leo, mềm, được trồng hầu như cho mục đích lấy cành lá làm cây cảnh Cây cao khoảng 1,3 – 3,8 mét, có thể sống từ 15 – 20 năm, khi cây mọc cao thân ngã màu xanh và phân cành nhiều (Trích dẫn bởi Mai Thị Phương Anh, 2001) Lá măng tây thuộc loại lá không phát triển, thoát nước ít nên có khả năng chịu hạn, rễ chính rất ngắn và chết ngay sau khi hạt nẩy mầm, chỉ có rễ trụ đứng thẳng, các rễ khác mọc ngang tạo thành một hệ chùm rễ Măng được hình thành gần rễ trụ, đây là nơi tập trung chất dinh dưỡng khi cây còn non ( Nguyễn Thị Sao, 2008)

Măng tây là cây đơn tính biệt chu, nhị hoa đực và nhị hoa cái không hoàn chỉnh, chỉ có một số ít trong số các hoa đậu quả được Các hoa cái có dấu tích của nhị đực nhưng không có khả năng sinh hạt phấn Hoa măng tây được sinh ra trên các cành mới, và đạt được độ thành thục trước khi cành mang hoa thành thục Các cây hoa đực thường cho nhiều măng, sống lâu hơn và sản lượng măng cao hơn cây hoa cái khoảng 25% nhwung chất lượng măng kém hơn Quả măng tây thuộc loại quả mọng, đường kính trung bình từ 8 – 9 mm, có 3 ngăn, mỗi ngăn có 2 hạt, khi chín quả có màu đỏ, hạt có màu đen, vỏ rất cứng đường kính trung bình 1 - 3 mm,

40 – 60 hạt/g (Nguyễn Thị Sao, 2008)

Cây thường cho măng theo đợt, đợt đầu tiên thu măng khi cây từ 4-6 tháng tuổi cao khoảng 1 - 1,5 m thì tiến hành bấm ngọn để hạn chế chiều cao và bắt đầu thu măng Trong năm đầu mỗi đợt thu hoạch kéo dài 2 - 3 tuần Sau đó nghĩ dưỡng cây chủng bị cho đợt thu hoạch tiếp theo, thời gian nghỉ từ 25 - 40 ngày tùy thuộc vào tình trạng cây mẹ Sang năm thứ hai mỗi đợt thu hoạch kéo dài 4 - 6 tuần Năm thứ 3 thời gian thu hoạch mỗi đợt từ 6 – 8 tuần hoặc có thể lâu hơn tùy thuộc vào cây mẹ

2.4 Giá trị kinh tế và giá trị dinh dưỡng của cây măng tây

2.4.1 Giá trị kinh tế

Măng tây là một loại rau cao cấp có giá trị dinh dưỡng lớn mang lại lợi ích kinh tế đáng kể Nó không chỉ là nguyên liệu cho công nghiệp đồ hộp và là một mặt hàng xuất khẩu có giá trị được trồng ở rất nhiều nước trên thế giới như Châu Âu, Châu Á, và Châu Mỹ Ở Mỹ măng tây chiếm vị trí thứ mười trong các loại rau (FAO – 2009) Thị trường nhập khẩu măng tây xanh của thế giới hiện nay đã lên đến hàng trăm ngàn tấn/năm, và vẫn còn tăng cao thêm mỗi năm, chỉ yếu là thị trường các nước Châu

Âu, Nhật Bản, Thái Lan, Singapore, Australia, Đài Loan (Lê Hồng Triều, 2009)

Ở các nước láng giềng, tính đến năm 2007 người Thái Lan đã trồng được khoảng 2.000 hecta và ở Trung Quốc (các tỉnh Sơn Đông, Sơn Tây, Phúc Kiến) nông dân đã trồng được khoảng 65.000 hecta cây măng tây với sản lượng trên 500.000 tấn măng tươi/năm (tăng 25% so với năm 2006) (công ty TNHH DV Thiên Hưng, 2011) Để tiếp tục duy trì và phát triển thêm sản lượng đang cung cấp cho thị trường xuất khẩu trên thế giới, hiện nay các nước có trồng cây măng tây xanh vẫn còn tiếp tục mở rộng thêm diện tích trồng cây trên đất mới mỗi năm

để luân phiên trẻ hóa, thay thế dần từng phần các diện tích đất cũ đã trồng cây măng tây xanh 4 - 6 năm trước đây

Bước vào thời kỳ hội nhập kinh tế, ở nước ta hiện nay các nhà hàng và khách sạn cũng đã bắt đầu có nhu cầu tiêu thụ sản phẩm măng tây xanh, và ngày càng tăng lên rất nhiều

2.4.2 Giá trị dinh dưỡng

Măng tây là một loại rau cao cấp so giá trị dinh dưỡng cao Măng tây trồng với mục đích thu hoạch lấy chồi măng non làm thực phẩm dinh dưỡng cao cấp (ăn tươi, hấp, luộc, trụng sơ, chiên xào, lẩu, nước ép, sinh tố), lấy cành lá làm kiểng, lấy măng thân rễ làm dược liệu, mỹ phẩm, trà thanh nhiệt, lấy phế liệu làm thức ăn gia súc Măng tây có hàm lượng dinh dưỡng khá cao gồm: 83% nước + 17% chất khô; trong đó có 2,2% đạm protein, 1,2% đường glucid, 2,4% chất cellulose, 0,6% tro, 21% các chất khoáng như kali, magie, canxi, sắt, kẽm, selenium, đồng, phosphor Ngoài ra chúng còn có nhiều loại vitamin quan trọng như vitamin K, C, A, B6, B1, B2 và các chất khác

Cây măng tây rất giàu dược tính Từ những năm 500 – 200 trước Công nguyên, người Hy Lạp và người La Mã cổ đại đã biết sử dụng măng tây xanh làm thuốc trị bệnh táo bón và suy gan, thận Từ rễ cây măng tây, người Pháp đã bào chế ra Sirop Desciness có tác dụng lợi tiểu, là một loại biệt dược đã được đưa vào dược điển và sử dụng rộng rãi (Công ty TNHH DV Thiên Hưng, 2011)

2.5 Nhân giống cây trồng in vitro

2.5.1 Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một nghành khoa học trẻ nằm trong sinh lý thực vật Ở nước ta ngành này mới được chứ ý và phát triển khoảng 15 - 20 năm trở lại đây Trong công tác giống cây trồng, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được phát triển những cơ sở lý thuyết về tế bào học và cơ sở sinh lý thực vật học như Nguyễn Văn Uyển (1993) và một số nhà nuôi cấy mô nước ngoài đã khẳng định

- Đó là tính toàn thể của mô và tế bào thực vật, cho phép tái sinh được cây hoàn chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào mô cấy tách rời Đây là một điểm rất quan trọng, bởi vì trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện được những kỹ thuật tiên tiến cho việc chon, cải thiện và cả lai tạo giống cây trồng

- Khả năng hấp thu DNA ngoại lai vào tế bào bằng công nghệ gen

- Khả năng sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất thụ khi lai xa

- Khả năng loại trừ virus bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tạo các dòng vô tính sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính Vấn đề này được các nhà khoa học khai thác

để phục tráng các giống khoai tây, cây ăn trái (cam, quýt)

- Khả năng dùng chồi nách, các thể chồi protocorm vào nhân giống vô tính với tốc độ cực nhanh cây trồng phục vụ sản xuất: cây lương thực (khoai tây, măng tây), cây cảnh (phong lan), cây lâm nghiệp (bạch đàn)

- Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm, khả năng trao đổi Quốc tế các nguồn gen sạch bệnh dưới dạng cây nuôi trong ống nghiệm

- Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn và hạt, từ đó tạo ra các dòng đồng hợp tử tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn được chu trình lai tạo

- Khả năng nuôi cấu tế bào thực vật như nuôi cấy vi sinh vật và qua đó khả năng ứng dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao phục vụ công tác tạo giống

- Kỹ thuật nuôi cấy protoplast và khả năng dung hợp protoplast tái sinh cây hoàn chỉnh từ các protoplast lai

- Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài và ở nhiệt độ thấp không mấy tính toàn thế của tế bào

Đồng thời nuôi cấy mô tế bào cũng tạo những cơ sở cho quá trình nghiên cứu di truyền thực vật, vai trò chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Ngày nay, cùng với công nghệ gen, nuôi cấy mô tế bào là một phần quan trọng không thể thiếu, thúc đẩy việc ứng dụng công nghệ sinh học trong ngành kinh tế Hai nhiêm vụ lớn của công nghệ sinh học thực vật ở nước ta từ nay tới 2020 là: tạo ra các giống cây trồng mới bằng phương pháp công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là công nghệ gen và nhân nhanh các giống, dòng ưu việt bằng kỹ thuật

nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.5.2 Lợi ích của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo Trần Văn Minh (2003), nhân giống bằng nuôi cấy mô có những lợi điểm sau: Tạo ra cây con đồng nhất và giống như cây mẹ Phần này giống như nhân giống vô tính Đối với các cây trồng thuộc nhóm thụ phấn chéo như phần lớn các loài cây ăn trái, các cây con sinh ta từ hạt không hoàn toàn đồng nhất, và có thể không giống như cây mẹ, trong trường hợp này nhân giống vô tính có lợi điểm hơn nhân giống qua hạt

So với các kiểu nhân giống vô tính thông thường (chiết, hom), nhân giống bằng nuôi cấy mô có ưu điểm là có thể nhân một số lượng cây con lớn từ một các thể ban đầu trong thời gian ngắn

Có thể tạo ra cây con sạch bệnh nhờ áp dụng việc chọn lọc vật liệu ban đầu một cách chặt chẽ hoặc làm cho vật liệu ban đầu trở nên sạch bệnh Không chiếm nhiều diện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh Một giống cây quý có thể được nhân ra nhanh chóng để đưa vào sản xuất Việc trao đổi giống được dễ dàng

2.5.3 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.5.3.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Một trong những phương thức sinh trưởng để đạt được mục tiêu trong nuôi cấy tế bào

và mô thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên) Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuối cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp

Từ đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi Chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ

để trở thành cây hoàn chỉnh Cây con được chuyển ra đất dần dần thích nghi và phát triển bình thường

2.5.3.2 Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân hóa

tế bào đã phân hóa Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện diện của auxin Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo

2.5.3.3 Nuôi cấy tế bào đơn

Khi mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẽ gọi là tế bào đơn

Tế bào đơn được chọn lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tăng sinh khối Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được tách

ra và trải trên môi trường thạch Khi môi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành cụm tế bào mô sẹo Khi môi trường thạch có tỷ lệ cytokinin - auxin thích hợp, tế bào đơn có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh

2.5.3.4 Nuôi cấy Protoplast – chuyển gen

Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn tách lớp vỏ cellulose, trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia

và tái sinh thành cây hoàn chỉnh

Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng Quá trình dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài

2.5.3.5 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội

Hạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp tạo thành mô sẹo

Mô sẹo này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội (Lê Văn Hoàng, 2005)

2.5.4 Giai đoạn nhân giống in vitro

Theo Trần Văn Minh (1994), sự thành công của việc nhân giống in vitro chỉ đạt

được khi trải qua các giai đoạn

2.5.4.1 Giai đoạn 1 Khử trùng mô nuôi cấy

Đây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống in

vitro Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùng để đưa

vào nuôi cấy in vitro

Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên Tuy vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chắn sẽ đạt kết quả

2.5.4.2 Giai đoạn 2 Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy Quá trình này được điều chỉnh chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin, cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy Thường môi non, chưa phân hóa có khả năng tái sinh cao hơn mô trưởng thành đã chuyên hóa sâu Người ta cũng còn nhận thấy rằng mẫu cấy trong thời gian sinh trưởng nhanh của cây trong mùa sinh trưởng cho kết quả khả quan trong tái sinh chồi

2.5.4.3 Giai đoạn 3 Nhân nhanh

Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình Để tăng hệ số nhân, ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokynin) các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm men kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp Tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành qua các cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính

2.5.4.4 Giai đoạn 4 Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ thường 2 - 3 tuần, từ những chồi riêng lẽ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin là nhóm hormone thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy

2.5.4.5 Giai đoạn 5 Đưa cây ra đất

Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quá

trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này

trong thực tiễn sản xuất

2.5.5 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Theo Dương Công Kiên, 2003 chất điều hòa sinh trưởng thực vật hay hormones sinh trưởng là các hợp chất hữ cơ (gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hơp nhân tạo) Chúng có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật Tuy nhiên, các hormones sinh trưởng chỉ làm tăng cường quá trình trao đổi chất mà không tham gia trực tiếp vào quá trình trao đổi chất Nó không thể dùng để thay thế chất dinh dưỡng Hormones sinh trưởng gây nên tác dụng mạnh

mẽ với một lượng vô cùng bé lên trao đổi chất của tế bào, ở nồng độ cao chúng có thể hoạt động như chất kìm hãm Trong thành phần môi trường nuôi cấy, các hormones sinh trưởng làm việc như chiếc chìa khóa đóng mở sự hoạt động của gen, điều khiển sự phát sinh hình thái và tổng hợp các hoạt chất Tác dụng của hormones sinh trưởng liên quan đến hiện tượng kìm hãm và cảm ứng tổng hợp enzyme trong cơ thể thực vật, hoạt hóa các bộ phận của phân tử DNA Mỗi một hormones sinh trưởng đều mang một chức năng riêng, nhưng trong cơ thể của thực vật, để điều khiển những hoạt động của thực vật, chúng tham gia vào thường không phải là một mà là vài chất Tùy mỗi giai đoạn nuôi cấy, giai đoạn phát triển của thực vật, sự kết hợp các chất này có khác nhau Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài chúng tôi sử dụng các chất thuộc nhóm auxin và cytokinin

2.5.5.1 Auxin

Tác dụng sinh lý của auxin chủ yếu làm tăng thể tích của tế bào, kích thích sự hình thành rễ, kìm hãm sự sự sinh trưởng của chồi bên, kìm hãm sự rụng hoa, rụng quả Auxin hoạt hóa các hợp chất cao phân tử (protein, cellulose, pectin) và ngăn cản sự phân giải chúng Auxin được xem là hormone thực vật quan trọng nhất vì chúng có vai trò rất cơ bản trong quá trình phối hợp sinh trưởng và biệt hóa tế bào cần thiết cho sự phát triển bình thường của thực vật Auxin cùng với một số chất điều chỉnh khác đảm bảo cho sự tạo thành khối các tế bào đang phân chia thành cơ thể thực vật hoàn chỉnh

Trong nuôi cấy mô thường sử dụng các chất như indol acetic acid (IAA); naphthyl acetic acid (NAA); 2,4 – D Dichloropenol acetic acid ( 2,4 – D); indol butyric acid (IBA)

2.5.5.2 Cytokinin

Bao gồm các nhóm chất như 6-Benzylaaminopurin (BAP) ; kinetin (Ki); zeatin (Z); thidiazuron (TDZ) Cytokinin có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của tế bào cấy mô

và làm tăng tốc độ phân bào Khi ở nồng độ cao, nó có tác dụng kích thích sự tạo chồi, đồng thời ức chế sự phân hóa rễ của mô cấy

Cytokinin có hiệu quả rất rõ trên sự phân chia của tế bào, trong quá trình này cytokinin cần thiết nhưng chúng không có hiệu quả nếu vắng mặt auxin Trong một tỷ lệ giữa cytokinin và auxin thì có kích thích tạo chồi hay tạo rễ, thông thường cytokinin cao hơn auxin thì kích thích tạo chồi, Và ngược lại, auxin cao hơn cytokinin thì kích thích sự tạo rễ

Trong cơ thể thực vật cytokinin có tác dụng rất lớn là tăng cường sự tổng hợp DNA

và protein, kích thích quá trình trao đổi chất

Tóm lại, cytokinin giúp duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định

hướng tế bào trong con đường phân hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho nuôi cấy in vitro

2.6 Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây măng tây trong nước và trên thế giới 2.6.1 Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây măng tây ở Việt Nam

Măng tây khi cho nhân giống bằng hạt thường cho hệ số nhân thấp Mặt khác, nếu nhân giống theo phương pháp truyền thống liên tục trong nhiều năm sẽ làm lây lan các mầm bệnh có sẵn trong hạt, tăng lượng virus tích lũy trong hạt, và có thể truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác Để khắc phục được nhược điểm trên người ta

đã sử dụng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào

Cây măng tây là một đối tượng mới của phương pháp nuôi cấy mô ở nước ta Hiện nay, mới chỉ có một vài nghiên cứu bước đầu đưuọc thực hiện và cho kết quả

Năm 2008, Nguyễn Cao Bảo Quang dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Trương Thị Bích Phượng ở Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Huế đã tiến hành nghiên

cứu môi trường nhân nhanh cây măng bằng phương pháp in vitro Nguyễn Cao Bảo Quang đã sử dụng thân cây măng in vitro để làm vật liệu nghiên cứu, đã xác định môi

trường tạo sẹo tốt đối với cây măng tây là môi trường MS bổ sung 0,4 mg/l BA + 1,80 mg/l NAA Môi trường tốt nhất cho quá trình nhân nhanh là MS + 2,5 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA đạt hệ số nhân chồi 9,15 Môi trường tốt nhất cho quá trình tạo cây hoàn chỉnh là MS + 0,4mg/l IBA + 2g/l than hoạt tính Thuần dưỡng cây măng tây trên giá thể xơ dừa và phủ bằng khay mủ có lỗ thoáng khí cho tỷ lệ sống cao nhất

2.6.2 Những nghiên cứu nuôi cấy mô cây măng tây trên thế giới

Nuôi cây môi cây măng tây trên thế giới đã đạt được nhiều thành công trong khoảng hơn 20 năm trở lại đây Theo các nguồn tài liệu, các nghiên cứu về nuôi cấy

mô cây măng tây được các nhà khoa học trên thế giới bắt đầu tiến hành từ năm

1988 và đã thu được nhiều thành công

Khi nuôi cấy đoạn thân măng tây trên môi trường MS có bổ sung IBA, NAA với các nồng độ khác nhau, Doolaree (1993) đã đưa ra kết luận rằng khi nồng độ NAA

là 1.28 mg/l thì khả năng tạo mô sẹo cao nhất Các mô sẹo này được khảo sát trên môi trường MS có chứa 2,5% sucrose và bổ sung từ 0,5 - 2,5mg/l BA thì cho khả năng tái sinh cao với nồng độ 1,55 mg/l BA Đến năm 1996, Benmoussa và cộng sự

đã đưa ra kết luận rằng khi bổ sung 2,2 mg/l BA thì cho hệ số nhân chồi măng tây đạt cao nhất (6,24 lần) Khi các chồi tạo thành có chiều cao khoảng 2-3cm tiếp tục cấy chuyển sang môi trường MS bổ sung từ 0 – 3 mg/l IBA thì thấy các chồi xuất hiện rễ Rễ xuất hiện nhiều nhất ở nồng độ 0,65 mg/l IBA

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 03 năm 2013 đến tháng 09 năm tại phòng Công nghệ sinh học thực vật của Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố

Hồ Chí Minh Địa chỉ km 1900, Quốc lộ 1A, Phường Trung Mỹ Tây, Quận 12,

Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành trên hạt giống Măng tây (Asparagus officinalis) có

nguồn gốc từ Thái Lan do Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh cung cấp

Hình 3.1 Hạt Măng tây 3.2.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

Thiết bị: Tủ vô trùng, nồi hấp, máy đo pH , cân điện tử, máy lạnh, nhiệt kế, ẩm

kế, kệ đặt bình, đèn huỳnh quang

Dụng cụ: pince, kéo, dao cấy, chai, lọ thủy tinh, đèn cồn, đĩa petri

3.2.3 Môi trường nuôi cấy

- Môi trường MS

- Môi trường bổ sung (BA, NAA, IBA) có nồng độ thay đổi tùy theo mục đích

của từng thí nghiệm Môi trường được điều chỉnh về pH 5,8 ± 0,05, hấp khử trùng

bằng autoclave ở 1atm (1210C) trong 20 phút

3.2.4 Điều kiện nuôi cấy

Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày

Cường độ ánh sáng: 2000 – 3000 lux

Nhiệt độ 25 ± 20C, Độ ẩm : 60 – 70%

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Thí nghiệm 1 Ảnh hưởng của phương pháp xử lý hạt trước khi khử trùng

đến khả năng sống của mẫu hạt măng tây

- Phương pháp tiến hành: Hạt măng tây được rửa sạch với xà bông rồi chuyển

vào bình tam giác Mẫu được xử lý bằng việc ngâm với nước ấm từ 650C trong 12

giờ, cắt hạt, không cắt hạt, ngâm với HCl 37% trong 10 phút và được bố trí thành

từng nghiệm thức Sau đó rửa mẫu lại bằng nước cất vô trùng 3 lần chuyển mẫu

sang bình tam giác vô trùng và chuyển vào tủ cấy thực hiện thao tác khử trùng

mẫu cấy trong điều kiện vô trùng Mẫu cấy được lắc với cồn 700 trong 45 giây,

sau đó lắc với javel và nước tỉ lệ 1:2 bổ sung 3 giọt Tween lắc trong 10 phút Sau

khi mẫu được khử trùng xong được cấy vào môi trường MS

- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được tiến hành với mẫu hạt, 4 nghiệm thức, mỗi

nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại 12 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm cấy 1 mẫu

Tổng số mẫu thí nghiệm là 144

Chỉ tiêu theo dõi:

- Tỷ lệ mẫu sống (%) = (Tổng số mẫu sống/ tổng số mẫu thí nghiệm) x 100

- Chỉ tiêu trên được theo dõi trong 4 tuần nuôi cấy

Bảng 3.1 Phương pháp xử lý hạt trước khi khử trùng đến tỷ lệ nảy mầm của mẫu hạt măng tây

Nghiệm thức Môi trường Xử lý hạt Mẫu/ống

3.3.2 Thí nghiệm 2 Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng tạo sẹo

- Phương pháp tiến hành: những cây măng tây được đánh giá tốt ở thí nghiệm

1 được cắt đoạn thân thành những đoạn dài 1cm cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau (0; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) và BA (0; 0,1; 0,3 mg/l) Quá trình nuôi cấy mô sẹo được thực hiện trong điều kiện tối hoàn toàn trong 10 ngày sau khi cấy Sau đó chuyển những mẫu mô sẹo này sang điều kiện ánh sáng nhẹ để kích thích mẫu tạo thêm diệp lục tố

- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD,

gồm 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 3 chai, mỗi chai

3 mẫu, tổng số mẫu thí nghiệm là 189

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BA và NAA đến quá trình tạo sẹo

Nghiệm

thức

Môi trường

Chất điều hòa sinh trưởng

Chỉ tiêu theo dõi:

- Tỷ lệ mẫu tạo sẹo (%): (tổng số mẫu tạo sẹo/ tổng số mẫu nuôi cấy) x 100

- Hình thái và màu sắc sẹo măng tây

- Trọng lượng (gram) sẹo sau 3 tuần và 6 tuần: cân lần lượt các mô sẹo của từng

nghiệm thức bằng cân phân tích trong điều kiện hoàn toàn vô trùng

- Các chỉ tiêu trên được theo dõi sau 3 và 6 tuần nuôi cấy

3.3.3 Thí nghiệm 3 Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng tái sinh

- Phương pháp tiến hành: những mẫu mô sẹo được đánh giá tốt ở thí nghiệm 2 cấy

trên môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật với các nồng độ thay đổi khác nhau (0; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) BA và (0; 0,1; 0,5 mg/l) NAA

- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD,

gồm 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 3 chai, mỗi chai

3 mẫu, tổng số mẫu thí nghiệm là 189

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng tái sinh chồi

Nghiệm

thức

Môi trường

Chất điều hòa sinh trưởng

Chỉ tiêu theo dõi

- Tỷ lệ mẫu bật chồi là tỷ lệ mẫu mô sẹo xuất hiện chồi (%): (tổng số mẫu bật chồi/ tổng số mẫu của mỗi nghiệm thức) x 100

- Số chồi/ mẫu cấy (chồi): tổng số chồi tạo thành/tổng số mẫu mô sẹo nuôi cấy ban đầu

- Thời gian theo dõi thí nghiệm là 4 tuần sau cấy

3.3.4 Thí nghiệm 4 Khảo sát ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân

nhanh chồi

- Phương pháp tiến hành: những cụm chồi được đánh giá tốt ở thí nghiệm 3 cấy trên môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật với các nồng độ thay đổi khác nhau (0; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) BA và (0; 0,1; 0,5 mg/l) IBA

- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, gồm 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 3 chai, mỗi chai

3 mẫu, tổng số mẫu thí nghiệm là 189

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân chồi

Nghiệm

thức

Môi trường

Chất điều hòa sinh trưởng

(mg/l)

Số mẫu/ chai Tổng

mẫu Nồng độ BA Nồng độ IBA